JP6851983B2 - デポー形成及びデポー非形成ワクチンを使用して免疫応答を強化する方法 - Google Patents

デポー形成及びデポー非形成ワクチンを使用して免疫応答を強化する方法 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
[0001]本出願は、その全体で本明細書中に参考として組み込まれている、２０１５年５月１日に出願の米国仮出願第６２／１５５，６７７号の利益及び優先権を主張するものである。
分野
[0002]本発明は、一般に、免疫応答を強化する方法、特に、デポー形成ワクチン及びデポー非形成ワクチンを使用したプライム−ブースト戦略を含む方法に関する。
背景
[0003]免疫療法、特に癌の免疫療法では、ワクチン抗原に対して十分に強力な免疫応答を生じさせることが大きな障害である。癌ワクチン抗原に対する免疫応答は、多くの場合、腫瘍内で免疫回避の機構として源を発する免疫寛容機構によって妨げられている（Ｋｉｍら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００７）。
[0004]ペプチドなどの、高度に精製された及び合成の抗原は、多くの場合は免疫原性が乏しく、したがって、頑強な免疫応答を促進するためにアジュバントなどの免疫刺激剤を必要とする（Ｉｒｖｉｎｅ、Ｎａｔ Ｍａｔｅｒ、２０１３）。この要件は、水性緩衝液、又はモンタニド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）ＩＳＡ５１ ＶＧ油を用いた水中油乳濁液、又はモンタニドＩＳＡ５１ ＶＧ油及びＴＬＲ作用剤アジュバントを用いた水中油乳濁液のいずれか中で調製したＮＹ−ＥＳＯ−１（８１−１００）ペプチドで免疫化した卵巣癌患者において実施した臨床治験において実証された（Ｔｓｕｊｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ、２０１３、Ｓａｂｂａｔｉｎｉら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎ Ｒｅｓ、２０１２）。この治験では、水性緩衝液中のこのペプチドを用いてワクチン接種した患者は、抗原特異的な抗体産生又は抗原特異的なＣＤ８＋若しくはＣＤ４＋Ｔ細胞によって検出されるように、抗原特異的免疫応答を発生しなかった（ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、細胞内染色、及び四量体染色によってアッセイ）。しかし、ＴＬＲ作用剤アジュバントを用いて又は用いずにモンタニドＩＳＡ５１ ＶＧ油乳濁液で免疫化した患者は、抗原に対して強力なＢ細胞及びＴ細胞免疫応答を発生した。モンタニドＩＳＡ５１油中水乳濁液は抗原のデポー効果をもたらし、その乳濁液がｉｎ ｖｉｖｏで分解されるにつれて、ｉｎ ｖｉｖｏ安定性を増加させて抗原を免疫系へとゆっくり放出した。免疫応答の維持及び検出は、モンタニドＩＳＡ５１油中水乳濁液ワクチンを用いた免疫化の反復を必要とした。
[0005]他のモンタニド油ベースの配合物（Ｋａｒｋａｄａら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、２０１０）は、単一の免疫化で、癌ワクチン抗原に対する迅速、強力、及び持続性のある抗原特異的免疫応答を誘導することができる。
[0006]免疫応答の維持、たとえば腫瘍に誘導される免疫抑制の状況下におけるものは、多くの場合、複数回のブースト免疫化を必要とする。油ベースの配合物をブースター免疫化に使用することができるが、そのようなワクチン配合物を用いた免疫系の再刺激は、強力な全身性免疫応答と持続性の抗原デポーの組合せが原因で、ワクチン部位で増加した問題ある反応をもたらす場合がある。これはそのようなワクチンを使用した臨床治験における一般的な観察結果であり、文書化されている（Ｓｔｉｌｌｓ、ＩＬＡＲ、２００５、Ｓａｂｂａｔｉｎｉら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎ Ｒｅｓ、２０１２）。
[0007]本開示では、本発明者らは、１つ又は複数の抗原に対する免疫応答を強化する新規方法、及び記載した方法において使用することができるワクチン組成物を報告する。
概要
[0008]一実施形態では、本開示は、対象において抗原に対する免疫応答を強化する方法であって、
（ｉ）少なくとも１回の用量の、疎水性担体中に１つ又は複数の抗原を含むデポー形成ワクチンを対象に投与するステップと、
（ｉｉ）続いて、少なくとも１回の用量の、１つ又は複数の抗原を含むデポー非形成ワクチンを対象に投与するステップと
を含む、方法に関する。
[0009]別の実施形態では、本開示は、抗原に対する免疫応答を強化するための、デポー非形成ワクチンと組み合わせたデポー形成ワクチンの使用であって、少なくとも１回の用量の、抗原及び疎水性担体を含むデポー形成ワクチンが、抗原を含むデポー非形成ワクチンの前に投与するためのものである、使用に関する。
[0010]別の実施形態では、本開示は、１つ又は複数の抗原及び疎水性担体を含むデポー形成ワクチンを含む少なくとも１つの容器と、１つ又は複数の抗原を含むデポー非形成ワクチンを含む少なくとも１つの容器とを含むキットに関する。
[0011]別の実施形態では、本開示は、それぞれが１つ又は複数の抗原、ヘルパーＴエピトープ、アジュバント、及び脂質を含む少なくとも２つの容器と、疎水性担体を含む少なくとも１つの容器と、水性担体を含む少なくとも１つの容器とを含み、抗原、ヘルパーＴエピトープ、アジュバント、及び脂質の少なくとも１つの容器が、疎水性担体を用いて再溶解してデポー形成ワクチンを調製するためのものであり、抗原、ヘルパーＴエピトープ、アジュバント、及び脂質の少なくとも１つの容器が、水性担体を用いて再溶解してデポー非形成ワクチンを調製するためのものであるキットに関する。
[0012]別の実施形態では、本開示は、本明細書中に記載の方法において使用するための、１つ又は複数の抗原及び疎水性担体を含むデポー形成ワクチンと、１つ又は複数の抗原を含むデポー非形成ワクチンとの組合せに関する。
[0013]他の態様では、本発明の実施形態及び特長は、以下の説明を添付の特許請求の範囲及び図面と併せて参照することによって当業者に明らかとなるであろう。
[0014]以下の図は、本発明の実施形態を例としてのみ例示する。
油ベースの（第１群）又は水性ベースの（第２群）の配合物のいずれか中に含有される抗原をワクチン接種したＨＨＤ−ＤＲ１マウスのＩＦＮ−ガンマＥＬＩＳＰＯＴ応答を例示する図である。免疫応答は、ＩＦＮ−ガンマＥＬＩＳＰＯＴプレート中で、ペプチドなし（バックグラウンド）、又は無関係のＨＬＡ−Ａ２制限ペプチド（ＡＬＭＥＱＱＨＹＶ、配列番号１）若しくはサバイビンＨＬＡ−Ａ２制限ペプチド（ＳｕｒＡ２．Ｍ、ＬＭＬＧＥＦＬＫＬ、配列番号２）をローディングした同系の樹状細胞でリンパ節細胞を刺激することによって、ワクチン接種の８日後に測定した。統計分析は二元ＡＮＯＶＡによって行い、ボンフェローニ事後検定でＳｕｒＡ２．Ｍペプチドに対する応答を無関係のペプチドに対する応答と比較した。＊＊＊ｐ＜０．００１、ＮＳ（有意でない）ｐ＞０．０５。 油ベースのワクチン中で配合したサバイビンペプチドでプライミングし、その後、油ベースのワクチン（第１群）又は水性ベースのワクチン（第２群）のどちらか中のサバイビンペプチドでブーストした、ＨＨＤ−ＤＲ１マウスのＩＦＮ−ガンマＥＬＩＳＰＯＴ応答を例示する図である。免疫応答は、ＩＦＮ−ガンマＥＬＩＳＰＯＴプレート上で、培地（バックグラウンド）、又はＨＬＡ−Ａ２制限サバイビンペプチド（ＳｕｒＡ２．Ｍ、ＬＭＬＧＥＦＬＫＬ、配列番号２）若しくは無関係のＨＬＡ−Ａ２制限ペプチド（ＡＬＭＥＱＱＨＹＶ、配列番号１）で脾細胞を刺激することによって、ブースト免疫化の８日後に測定した。統計分析は二元ＡＮＯＶＡによって行い、ボンフェローニ事後検定でＳｕｒＡ２．Ｍペプチドに対する応答を無関係のペプチドに対する応答と比較した。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 油ベースのワクチンでプライミングし、油ベースのワクチン又は水性ワクチンでブーストし、同時に規則的なシクロホスファミド治療を行ったマウスのＩＦＮ−ガンマ応答を例示する図である。すべてのマウスを規則的なシクロホスファミド（２０ミリグラム／キログラム／日）で１週間オン、１週間オフ処理し、０、２１、及び４２日目にワクチン接種した。第１群のマウスには、油ベースのワクチンを３回ワクチン接種した。第２群のマウスには、油ベースのワクチンを２回、及び水性ワクチンを１回ワクチン接種した。第３群のマウスには、油ベースのワクチンを１回、水性ワクチンを２回ワクチン接種した。免疫応答は、ＩＦＮ−ガンマＥＬＩＳＰＯＴプレート上で、培地（バックグラウンド）、又はＨＰＶ１６Ｅ７４９−５７ペプチド（Ｒ９Ｆ、ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ、配列番号３）若しくは無関係のペプチド（ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ、配列番号４）で脾細胞を刺激することによって、最後の免疫化の８日後（５０日目）に測定した。結果は平均応答±ＳＥＭとして示す。統計分析は一元ＡＮＯＶＡによって行い、チューキー事後検定で群の応答をＲ９Ｆペプチドと比較した。 マウスモデルにおける癌の治療のための、油ベースのワクチン、水性ワクチン、及び規則的なシクロホスファミドを用いた治療の有効性を例示する図である。研究０日目にマウスにＣ３腫瘍を移植した。第１群のマウスは治療しないままであった。第２〜４群のマウスは、研究５日目から開始して、１週間オン及び１週間オフを交互に、規則的なシクロホスファミド（２０ｍｇ／ｋｇ／日）で治療した。また、これらの群は、研究の１２、３３、及び５４日目にもワクチン接種した。第２群のマウスには、油ベースのワクチンを３回ワクチン接種し、第３群のマウスには、油ベースのワクチンを２回、及び水性ワクチンを１回ワクチン接種し、第４群のマウスには、油ベースのワクチンを１回、水性ワクチンを２回ワクチン接種した。図４Ａは平均腫瘍体積／群±ＳＥＭを示す。図４Ｂはパーセント生存を示す。 油ベースのワクチンによって誘導された免疫応答を維持する又は増加させるためにブースト免疫化が必要であることを示す図である。マウスに、ＳｕｒＡ２．Ｍペプチド（ＬＭＬＧＥＦＬＫＬ、配列番号２）を含有する油ベースのワクチンを１回（第１群）又は２回（第２群）をワクチン接種した。免疫応答は、最後の免疫化の８日後にＩＦＮ−ガンマＥＬＩＳＰＯＴによって検出した。第３群のマウスには、ＳｕｒＡ２．Ｍペプチドを含有する油ベースのワクチン２回ワクチン接種し、免疫応答を最後の免疫化の２７日後にＩＦＮ−ガンマＥＬＩＳＰＯＴによって検出した。無関係のＨＬＡ−Ａ２制限ペプチド（ＡＬＭＥＱＱＨＹＶ、配列番号１）又は培地のみ（バックグラウンド）が陰性対照として役割を果たした。統計分析は一元ＡＮＯＶＡによって行い、チューキー事後検定でそれぞれの群のＳｕｒＡ２．Ｍ刺激に対する応答を比較した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。 免疫応答をプライミングするためのＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃ（油）、次いで免疫応答をブースト及び維持するためのＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃ（水性）の安全性及び免疫原性を評価するための、第Ｉｂ相臨床治験の設計を示す図である。ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃ（油）を研究の０及び２８日目に投与した（０．２５ミリリットル用量）。ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃ（水性）を研究の５６、８４、及び１１２日目に投与した（０．５０ミリリットル用量）。低用量シクロホスファミド（５０ミリグラム用量、１日２回、Ｂａｘｔｅｒ）は、経口投与によって１４日毎に７日間の連続した日の間与え、最初のワクチン接種の７日前（研究の−７日目）に開始し、１９週間後に完了する。血液試料を最初のワクチン接種（ベースライン）の前、その後、研究の０、２８、４２、５６、８４、及び１１２日目に採取して、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離及び凍結保存した。また、のちの可能な時点でも血液試料を採取した。ＰＢＭＣは、ＥＬＩＳＰＯＴ及び多量体フローサイトメトリーを含めた免疫学的アッセイに使用した。 免疫応答が研究０〜１１２日目に、ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃ（油）をワクチン接種し、ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃ（水性）でブーストした対象０３〜２８において検出されたことを示す図である。図６に概要を示すように、対象を低用量シクロホスファミド、ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃ（油）（黒矢印）、及びＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃ（水性）（白抜き矢印）で治療した。免疫応答は、ＩＦＮ−ガンマＥＬＩＳＰＯＴ（Ａ）、並びに研究の０、２８、４２、５６、８４、及び１１２日目に採取した血液から単離したＰＢＭＣを使用したＳｕｒＡ２．Ｍに特異的なＴ細胞（Ｂ）の多量体染色によって測定した。 免疫応答が研究０〜１１２日目に、ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃ（油）をワクチン接種し、ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃ（水性）でブーストした対象０３〜３０において検出されたことを示す図である。図６に概要を示すように、対象を低用量シクロホスファミド、ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃ（油）（黒矢印）、及びＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃ（水性）（白抜き矢印）で治療した。免疫応答は、ＩＦＮ−ガンマＥＬＩＳＰＯＴ（Ａ）、並びに研究の０、２８、４２、５６、８４、及び１１２日目に採取した血液から単離したＰＢＭＣを使用したＳｕｒＡ１．Ｔに特異的なＴ細胞（Ｂ）の多量体染色によって測定した。
詳細な説明
[0023]強力且つ延長された免疫応答の発生は、特に癌の免疫療法及び／又は強力な細胞性免疫応答の発生のために、多くの場合はワクチンの反復投与を必要とする。免疫学者の大きな課題は、顕著な有害作用なしに免疫応答を強化し免疫寛容機構を回避するワクチン及び投与方法の開発であった。多少の成功はあったものの、本明細書中に記載の「免疫原性の弱い抗原」などの特定の抗原が、現在のワクチン接種手法に問題を引き起こすことが明らかとなった。また、たとえば癌などの特定の種類の疾患は、多くの場合、慣習的なワクチン及び従来の投与戦略によって特徴的に生じる細胞性及び液性の免疫に抵抗することができる。
[0024]免疫応答の維持、たとえば腫瘍に誘導される免疫抑制の状況下におけるものは、多くの場合、複数回の免疫化を必要とする。しかし、油ベースの配合物を用いた免疫系の再刺激は、強力な全身性免疫応答と持続性の抗原デポーの組合せが原因で、ワクチン注射部位で増加した問題ある反応をもたらす場合がある。そのようなワクチンを使用した臨床治験における一般的な観察結果であり、文書化されている（Ｓｔｉｌｌｓ、ＩＬＡＲ、２００５、Ｓａｂｂａｔｉｎｉら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎ Ｒｅｓ、２０１２）。
[0025]また、本発明者らは、卵巣癌の第Ｉ相研究において、サバイビン抗原を含有するモンタニドＩＳＡ５１ベースのワクチンの反復注射の後に、免疫化部位で有害事象も観察した。本発明者らは、注射部位反応は、ワクチンを置いた部位でのＴ細胞及び他の免疫細胞の持続性の浸潤によって媒介されることを見出した。これらの注射部位の免疫反応は、臨床的に有用なワクチン及びワクチン投与戦略の開発において困難をもたらす。
[0026]本開示は、対象において抗原に対する免疫応答を強化するための方法及びワクチンを提供する。開示する方法はワクチン接種の改変された戦略を含み、これには、デポー形成ワクチンでプライミングすることで、頑強な抗原特異的免疫応答を誘導し、さらには注射部位反応を低下させ（デポー形成ワクチンの疎水性の構成成分、たとえば油によって主に媒介される）、同じ抗原を含有するデポー非形成ワクチン配合物を用いた免疫応答を維持及び／又はブーストすることが含まれる。デポー非形成（たとえば水性）ワクチンは免疫応答をプライミングすることができなかった一方で、本発明者らは驚くべきことに、事前にデポー形成（たとえば油ベースの）ワクチンでプライミングした対象において免疫応答を維持する、さらにはブーストすることが可能であることを見出した。これらの結果は、マウス及びヒトの臨床治験のどちらの前臨床研究においても実証されている。
[0027]一実施形態では、本明細書中に開示する方法は、（ｉ）少なくとも１回の用量の、疎水性担体中に１つ又は複数の抗原を含むデポー形成ワクチンを対象に投与するステップと、（ｉｉ）続いて、少なくとも１回の用量の、１つ又は複数の抗原を含むデポー非形成ワクチンを対象に投与するステップとを含む。一実施形態では、対象はワクチン中の抗原に対して事前の免疫応答は有さない。
[0028]本明細書中で使用する「強化する」又は「強化すること」とは、抗原に対する免疫応答がより有効となる、又は有害事象の強度及び／又は期間が回避される、無効となる、若しくは軽減されることを意味する。「より有効」とは、免疫応答が、対象の事前の免疫応答状態と比較して、対象に有利となるように、増強、上昇、改善、強化、又は延長されていることを意味する。
[0029]一部の実施形態では、「強化する」とは、抗原に対する免疫応答の誘導、誘発、又は発生において改善された有効性が存在することを意味する。本明細書中で使用する「改善された有効性」、「有効性を改善させる」などとは、疾患又は障害の治療においてワクチンをより有効にすることができる、対象の免疫応答における任意の変化又は変更をいう。一部の実施形態では、このことは、免疫応答の見かけを加速させること、及び／又は免疫応答の持続性若しくは強度を改善させることを含み得る。
[0030]一部の実施形態では、「強化する」とは、デポー形成ワクチンを用いた免疫化によって事前にプライミングした対象において、抗原特異的なリコール応答を誘導、強化、又は延長させる能力をいう。抗原への最初の曝露の際に起こるプライミングした免疫応答に対して、リコール免疫応答とは、抗原に対する２回目及び／又は続く曝露の際に起こる免疫応答であり、プライム免疫化によって事前に生じさせた免疫応答を再確立させるものである。
[0031]一部の実施形態では、「強化する」とは、デポー形成ワクチンを用いた免疫化によって事前にプライミングした対象において、抗原特異的免疫応答を維持及び／又はブーストする能力をいう。「維持及び／又はブーストする」とは、事前に誘導した免疫応答が、対象に有利となるように、増強、上昇、改善、強化、又は延長されていることを意味する。
[0032]一部の実施形態では、「強化する」とは、有害事象の発生率を低下させる能力をいう。たとえば、一実施形態では、免疫応答の強化は、デポー形成ワクチンの単一又は反復投与によって引き起こされる注射部位反応の発生率の低下を含み得る。本実施形態では、免疫応答は、デポー形成ワクチンを用いて免疫応答をプライミングすること、並びにデポー非形成ワクチンを用いて免疫応答を維持及び／又はブーストすることによって強化し得る。
[0033]本明細書中に開示する方法において使用することができるデポー形成及びデポー非形成ワクチンを以下に記載する。特に適切な実施形態では、デポー形成ワクチンは、水を含まない又は実質的に水を含まない、油ベースのワクチンであり、デポー非形成ワクチンは水性ワクチンである。
[0034]デポー形成ワクチンの少なくとも１又は２回のプライム用量の投与が、デポー非形成ワクチンによって維持及び／又はブーストすることができる免疫応答を生じるために十分であることが、驚くべき且つ予想外に見いだされた。水性ベースのワクチン（すなわちデポー非形成ワクチン）は多くの場合、特に癌の分野において、又は免疫原性の弱い抗原の投与において、免疫応答を生じるように作用しないことが知られているため、このことは驚くべきである。このことは、水性ベースのワクチンは抗原特異的免疫応答を生じることができなかった（第２群）一方で、同じ抗原を有する油ベースのワクチン（すなわちデポー形成ワクチン）は抗原特異的免疫応答を誘導することができた（第１群）ことが観察された、本明細書中の実施例１及び図１によって強調されている。
[0035]しかし、１又は２回のプライム用量の油ベースのデポー形成ワクチンを、同じ油ベースのワクチン又は水性ベースのワクチンのどちらかでブーストする前に投与する実施例２及び３では、水性ベースのワクチンが免疫応答を維持及び／又はブーストするために十分な配合物であったことが見いだされた（図２及び３を参照）。実際、図３では、油ベースのワクチンを用いた１つのみのプライム用量の後、２回のブースト用量の水性ベースのワクチンが、すべてのワクチン接種を油ベースのワクチンを使用して行った治療群と同等の免疫応答を生じたことが示されている（それぞれ第３群及び第１群を比較）。
[0036]これらの驚くべき且つ予想外の結果は、腫瘍成長からの保護において有効な治療上の利点につながることが見いだされた。実施例４は、油ベースのワクチンを用いたプライミング、その後、同じ抗原を含有する水性ベースのワクチンを用いたブーストが、すべてのワクチン接種が油ベースのワクチンである治療と比較して、同等又はより良好な腫瘍成長からの保護をもたらすことを実証している（それぞれ第４群及び第２群を比較、図４Ａ及び４Ｂ）。
[0037]反復ブースター免疫化を投与することの重要性は、ワクチンによって誘導された抗原特異的免疫応答は、ブーストなしでは時間と共に減退することを実証している実施例５によってさらに強調されている。図５に示すように、免疫応答は、ブースターワクチン接種の投与後、２７日間以内に顕著に降下した。このことは、免疫応答を維持及び／又はブーストするために、さらなるブースター免疫化が重要であることを確立している。
[0038]また、本発明者らは、ヒト臨床治験によって、本明細書中に開示する方法が、驚くべきことに、ＨＬＡ−Ａ１及びＨＬＡ−Ａ２陽性対象における抗原特異的免疫応答の誘導及び維持／ブーストにおいて有効であることを実証した。実施例６〜８では、例示的なデポー形成ワクチン（ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃ（油））が、ＨＬＡ−Ａ１＋及びＨＬＡ−Ａ２＋ヒト対象のどちらにおいても、ワクチン抗原に対する事前の免疫応答なしで、免疫応答をプライミングすることができた。続く例示的なデポー非形成ワクチン（ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃ（水性））を用いたブースト免疫化は、これらの免疫応答を上昇したレベルでも維持することができた（図６〜８）。
[0039]デポー形成ワクチンを用いてプライミングすること、続いてデポー非形成ワクチンを用いて免疫応答を維持及び／又はブーストすることによって、デポー形成ワクチンに対する注射部位反応の発生率も低下するはずである。デポー非形成ワクチン（たとえば水性ベースのワクチン）はデポー形成ワクチン（たとえば油ベースのワクチン）よりも素早く注射部位からクリアランスされ、それによって注射部位反応を潜在的に軽減させる。さらに、脂質両親媒性物質がデポー形成及びデポー非形成ワクチンの両方で使用されている本開示の実施形態では、デポー非形成ワクチン中に存在する脂質が抗原提示細胞の誘引物質として作用し得る。
[0040]プライム用量のデポー形成ワクチン後にデポー非形成ワクチンを受けた、例中に概要を示した患者では、実際に、すべての注射部位反応は穏やかであり（グレード１）、紅班、そう痒症、硬結、及び疼痛からなっていたことが観察された。また、これらの部位反応の大多数は、特に注射部位が水性配合物を受けた場合は２〜３カ月後に完全に回復していた。
[0041]免疫応答を強化する方法
[0042]対象において免疫応答を強化する本発明の方法は、少なくとも１回の用量の、疎水性担体中に１つ又は複数の抗原を含むデポー形成ワクチンと、続いて、少なくとも１回の用量の、１つ又は複数の抗原を含むデポー非形成ワクチンとの組み合わせた投与を含む。
[0043]デポー形成ワクチンを本明細書中以下に記載する。デポー形成ワクチンの特に適切な実施形態は、水を含まない又は実質的に水を含まない、油ベースのワクチンである。
[0044]一般的には、少なくとも１回の用量のデポー形成ワクチンのそれぞれは、１つ又は複数の抗原に対する免疫応答を誘導することができるプライム用量である。本明細書中で使用する「プライム用量」とは、ワクチンが１つ又は複数の抗原に対する免疫応答を開始する能力をいう。これは、抗原に対する既存の免疫応答を維持及び／又はブーストするリコール免疫応答と対照的である。本明細書中で使用する用語「プライム用量」は、デポー形成ワクチンを使用した抗原の初回投与（たとえば１回目の曝露）を包含するだけでなく、やはり抗原に対する免疫応答を開始させるために使用する１つ又は複数の続く投与も、これらの投与がデポー非形成ワクチンの初回投与の前である限りは包含し得ることを理解されたい。
[0045]抗原に対する免疫応答を誘導するためにデポー形成ワクチンのプライム用量の投与の回数、期間、及び間隔を決定することは、当業者の能力範囲内にある。これらの特長は、たとえば、使用する抗原、免疫応答（液性若しくは細胞性）、及び／又は治療する疾患若しくは障害に依存し得る。
[0046]一部の実施形態では、少なくとも１回の用量のデポー形成ワクチンは１、２、３、４、又は５回の用量である。より詳細な実施形態では、少なくとも１回の用量のデポー形成ワクチンは１又は２回の用量であり、さらなる実施形態では１回の用量のみである。用量の数は、抗原に対する免疫応答を誘導するために十分であるべきである。
[0047]デポー形成ワクチンの投与の間隔は、免疫応答の誘導の顕著な減退が起こらないよう、十分に近いべきである。一部の実施形態では、初回用量のデポー形成ワクチンの後、デポー形成ワクチンのそれぞれの後続用量を、直前の用量の約１日、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、又は１０週間以内に投与する。より詳細な実施形態では、デポー形成ワクチンのそれぞれの後続用量を、直前の用量の約１日、１週間、２週間、３週間、又は４週間以内に投与し、さらなる実施形態では、直前の用量の約３又は４週間後に投与する。
[0048]初回用量から最終用量までの、デポー形成ワクチンを投与し得る期間は、抗原に対する免疫応答を開始させるために十分であるが、デポー形成ワクチンに対する注射部位反応などの有害作用に遭遇するほど長くないべきである。一部の実施形態では、デポー形成ワクチンのプライム用量の初回から最終用量までの期間は、０日間（すなわち単回投与）、１週間、２週間、３週間、４週間（１カ月間）、２カ月間、又は３カ月間である。より詳細な実施形態では、期間は３又は４週間である。
[0049]一部の実施形態では、デポー形成ワクチンのプライム用量と併せて、デポー形成ワクチンは、プライム用量として使用されない別の時点で対象に追加で投与し得る。たとえば、デポー形成ワクチンは、デポー非形成ワクチンを用いた治療過程の間、又はその後に投与し得る。これらの実施形態では、デポー形成ワクチンは維持又はブースト用量として使用される。これらの追加の用量のデポー形成ワクチンの投与の回数、期間、及び間隔を決定することは、当業者の能力範囲内にある。一部の実施形態では、回数、期間、及び間隔は、用量の数が抗原に対する免疫応答を開始又は誘導する能力に基づかないことを除いて、デポー形成ワクチンのプライム用量について上述したものと同じであり得る。
[0050]本明細書中に開示する方法では、デポー非形成ワクチンは少なくとも１回の用量のデポー形成ワクチンに続けて投与する。「続いて投与する」又は「〜に続けて投与する」とは、デポー非形成ワクチンを、少なくとも１回の用量のデポー形成ワクチンの後のある時点に投与することを意味する。一部の実施形態では、「続いて投与する」とは、デポー非形成ワクチンは、少なくとも何らかの測定可能又は検出可能なレベルの抗原に対する免疫応答が検出できるまでは投与しないことを意味する。
[0051]一般的には、少なくとも１回の用量のデポー非形成ワクチンのそれぞれは、１つ又は複数の抗原に対する免疫応答を維持及び／又はブーストすることができる維持又はブースト用量である。本明細書中で使用する「維持又はブースト用量」とは、１つ又は複数の抗原に対する免疫応答を維持、延長、及び／又は増強する、ワクチンの能力をいう。免疫応答が以前に観察又は測定されたものと同じレベルで維持される必要はない。本明細書中で使用する、免疫応答を「維持及び／又はブーストする」ことには、免疫応答が、対象に治療上の利点をもたらすために十分なレベルで維持される実施形態が包含される。ワクチン投与の間に免疫応答の強度が、場合によっては検出不可能又は測定不可能なレベルにまで減少する期間が存在し得ることを理解されたい。そのような場合、免疫応答を「維持及び／又はブーストする」こととは、抗原に対する既存の免疫応答からリコール応答を有効に誘導する、デポー非形成ワクチンの能力をいう。
[0052]抗原に対する免疫応答を維持及び／又はブーストするためにデポー非形成ワクチンの維持又はブースト用量の投与の回数、期間、及び間隔を決定することは、当業者の能力範囲内にある。これらの特長は、たとえば、使用する抗原、免疫応答（液性若しくは細胞性）、及び／又は治療する疾患若しくは障害に依存し得る。
[0053]一部の実施形態では、少なくとも１回の用量のデポー非形成ワクチンは１、２、３、４、又は５回の用量である。別の実施形態では、少なくとも１回の用量のデポー非形成ワクチンは連続的な反復投薬である。「連続的な反復投薬」とは、治療を中断する判断が下されるまで、デポー非形成ワクチンの投与が任意の回数の投与の間続くことを意味する。連続的な反復投薬の期間中、デポー非形成ワクチンの投与の頻度（間隔）を変化させ得る。一実施形態では、少なくとも１回の用量のデポー非形成ワクチンは、１日１回、週に１回、２週間に１回、３週間に１回、又は月に１回の連続的な反復投薬である。
[0054]デポー非形成ワクチンの投与は、抗原に対するリコール応答を誘導することが可能に保たれるように、十分に近い間隔であるべきである。一部の実施形態では、初回用量のデポー非形成ワクチンの後、デポー非形成ワクチンのそれぞれの後続用量を、直前の用量の約１日、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、又は１０週間以内に投与する。より詳細な実施形態では、デポー形成ワクチンのそれぞれの後続用量を、直前の用量の約１日、１週間、２週間、３週間、又は４週間以内に投与し、さらなる実施形態では、直前の用量の約３又は４週間後に投与する。
[0055]初回用量のデポー非形成ワクチンは少なくとも１回の用量のデポー形成ワクチンに続けて投与する。デポー形成ワクチンの少なくとも１回の投与が初回用量のデポー非形成ワクチンの前に起こる限りは、デポー形成ワクチンのプライム用量及び維持又はブースト用量のデポー非形成ワクチンの投与が重複していてもよい。
[0056]最終プライム用量のデポー形成ワクチン及び初回用量のデポー非形成ワクチンは、抗原に対するリコール応答を誘導することが可能に保たれるように、十分に近い間隔であるべきである。一部の実施形態では、本明細書中の方法は、デポー非形成ワクチンの初回の維持又はブースト用量を、デポー形成ワクチンの最終プライム用量の約１日、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、又は１０週間以内に投与することを含む。より詳細な実施形態では、デポー非形成ワクチンの初回の維持又はブースト用量は、デポー形成ワクチンの最終プライム用量の約１日、１週間、２週間、３週間、又は４週間以内、さらなる実施形態では約３週間以内に投与する。
[0057]初回用量から最終用量までの、デポー非形成ワクチンを投与し得る期間には、特定の疾患又は障害の治療のためなどに対象がそれを必要している任意の期間が包含され得る。一部の実施形態では、デポー形成ワクチンの初回から最終用量までの期間は、０日間（すなわち単回投与）、１週間、２週間、３週間、１カ月間、２カ月間、３カ月間、６カ月間、９カ月間、１２カ月間、２年間、３年間、４年間、５年間、又はそれより長い。
[0058]一実施形態では、本明細書中に開示する方法は、２回の用量のデポー形成ワクチンを、デポー非形成ワクチンを投与する前に投与することを含む。実施例２に示すように、２回のプライム用量（０及び２１日目）のデポー形成ワクチンは、デポー形成ワクチン又はデポー非形成ワクチンのどちらかによって後にブーストすることができる（８４日目）抗原特異的免疫応答を誘導するために十分である。実施例６〜８（図６）に示すように、２回のプライム用量（０及び２８日目）のデポー形成ワクチンは、デポー非形成ワクチンによって後に維持／ブーストすることができる（５６、８４、及び１１２日目）抗原特異的免疫応答を誘導するために十分である。
[0059]一実施形態では、本明細書中に開示する方法は、１回のみの用量のデポー形成ワクチンを、デポー非形成ワクチンを投与する前に投与することを含む。実施例１（第１群）及び実施例３（第３群）に示すように、１回のプライム用量のデポー形成ワクチンは、デポー非形成ワクチンによって後にブーストすることができる抗原特異的免疫応答を誘導するために十分である（実施例３）。
[0060]本明細書中に開示する方法の一実施形態では、プライム用量のデポー形成ワクチンを０日目及び２１日目に投与する。別の実施形態では、プライム用量のデポー形成ワクチンを０日目及び２８日目に投与する。
[0061]本明細書中に開示する方法の一実施形態では、プライム用量のデポー形成ワクチンを０日目及び２１日目に投与し、デポー非形成ワクチンを少なくとも４２日目に投与する。本実施形態では、デポー非形成ワクチンの投与は、４２日目の後は３週間に１回継続してもよい。
[0062]本明細書中に開示する方法の一実施形態では、プライム用量のデポー形成ワクチンを０日目及び２８日目に投与し、デポー非形成ワクチンを少なくとも５６日目に投与する。本実施形態では、デポー非形成ワクチンの投与は、５６日目の後は４週間１回続けてもよい。
[0063]本明細書中に開示する方法の一実施形態では、プライム用量のデポー形成ワクチンを０日目のみに投与する。
[0064]本明細書中に開示する方法の一実施形態では、プライム用量のデポー形成ワクチンを０日目のみに投与し、デポー非形成ワクチンを少なくとも４２日目に投与する。本実施形態では、デポー非形成ワクチンの投与は、４２日目の後は３週間に１回続けてもよい。
[0065]ＤＮＡ複製を妨げる薬剤
[0066]また、本明細書中に開示する方法は、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤を投与することも含み得る。特定の実施形態では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤は、本明細書中に開示する方法を癌の治療又は予防において使用する場合に投与する。
[0067]そのような薬剤及びその使用方法の例示的な実施形態は、たとえば国際公開第２０１４／１５３６３６号に記載されている。
[0068]本明細書中で使用する表現「ＤＮＡ複製を妨げる」には、細胞のＤＮＡをコピーする（すなわち複製する）生物学的プロセスを防止、阻害、又は遅延させる任意の作用が包含されることを意図する。当業者は、ＤＮＡ複製を防止、阻害、又は遅延させるための様々な機構、たとえば、ＤＮＡ架橋結合、ＤＮＡのメチル化、塩基置換などが存在することを理解されよう。本発明による方法には、当分野で知られている任意の手段による、ＤＮＡ複製を妨げる任意の薬剤の使用が包含される。例示的な一実施形態では、それだけには限定されないが、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤は薬物である。
[0069]一実施形態では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤とは、非化学療法的である用量で使用した場合に、免疫系を変調してワクチン応答を増強させる意図で、免疫系の細胞においてＤＮＡ複製に選択的に影響を与えることができるものである。「非化学療法的」とは、薬剤の用量が、悪性又は癌性の細胞及び組織を直接且つ選択的に破壊するために使用されるものよりも低い用量であることを意味する。
[0070]ＤＮＡ複製を妨げる薬剤の他の実施形態には、免疫系の迅速に分裂中の細胞を選択的に標的化する能力を有しており、ＤＮＡ複製を妨害してプログラム細胞死を引き起こす薬剤が含まれる。そのような薬剤の目的は、免疫系の細胞を変調してワクチン応答を増強させることである。そのような薬剤は、典型的には、化学療法的であると予想されず、ヒトにおける使用に許容されると考えられる用量で使用する。免疫細胞を選択的に標的化することの目的は、ＤＮＡ複製を標的とする薬物が除去された際に迅速な増殖を誘導する目的で、免疫抑制細胞の数を低下させること、及び／又は免疫応答の媒介に関与している有用な免疫細胞を枯渇させることであり得る。
[0071]細胞死をもたらすＤＮＡ複製の妨害は、それだけには限定されないが、ＤＮＡ架橋結合の形成（たとえば、アルキル化剤、白金化合物などによる）、ＤＮＡのメチル化（すなわちメチル化剤による）、塩基置換（すなわちヌクレオシド類似体による）を含めた数々の機構によって引き越し得る。例示的な薬剤及びその機構は、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ｃａｂｎｅｒ Ｂ．Ａ．、第５版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、米国ペンシルベニア州、２０１１）に記載されている。
[0072]一実施形態では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤はアルキル化剤である。アルキル化剤には、それだけには限定されないが、シクロホスファミド、テモゾロミド、イホスファミド、マフォスファミド、メルファラン、ブスルファン、ベンダムスチン、ウラムスチン、カルムスチン、又はビス−クロロエチルニトロソ尿素（ＢＣＮＵ）、クロラムブシル、マイトマイシンＣ、及びその誘導体、活性代謝物、又は代謝中間体が含まれる。適切な誘導体は、たとえば、それだけには限定されないが、パリホスファミド（たとえばイホスファミドの誘導体）であり得る。
[0073]別の実施形態では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤は白金化合物である。白金化合物には、それだけには限定されないが、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、及びその誘導体が含まれる。
[0074]別の実施形態では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤はメチル化剤である。メチル化剤には、それだけには限定されないが、テムゾロミド（ｔｅｍｚｏｌｏｍｉｄｅ）、プロカルバジン、及びダカルバジン、並びにその誘導体が含まれる。
[0075]別の実施形態では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤はヌクレオシド類似体である。ヌクレオシド類似体の非限定的な例には、ゲムシタビン、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）、及びその誘導体が含まれる。
[0076]別の実施形態では、トポイソメラーゼＩ、トポイソメラーゼＩＩ、又はＤＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡ複製に重大な酵素を阻害することによってＤＮＡ複製を間接的に阻害する任意の薬物も使用し得る。そのような薬物には、たとえば、それだけには限定されないが、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ミトキサントロン、エトポシド、テニポシド、トポテカン、カンプトテシン、イリノテカン、アシクロビル、及びガンシクロビルが含まれる。
[0077]ＤＮＡ複製を妨害し、本発明の方法において使用し得る例示的な薬剤には、それだけには限定されないが、以下の表１に列挙するものが含まれる。当業者には理解されるように、これらは使用し得る薬剤の例である。さらなる薬剤には、たとえば、同様の機構によってＤＮＡ複製を妨げる及び／又は同様の官能基を有する、任意の薬物又は化合物が含まれる。
[0078]
Figure 0006851983
Figure 0006851983
[0079]特定の実施形態では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤は、ナイトロジェンマスタードアルキル化剤、又はその任意の中間代謝物若しくは活性代謝物である。ナイトロジェンマスタードは非特異的なＤＮＡアルキル化剤である。ナイトロジェンマスタードは、アミン窒素によるクロライドの分子内置換によって環状アミニウムイオン（アジリジニウム環）を形成する。その後、このアジジリウム（ａｚｉｄｉｒｉｕｍ）基は、グアニン塩基上のＮ−７求核性中心を攻撃することによってＤＮＡをアルキル化することができる。第２の塩素の置換の際、第２のアルキル化ステップが起こり、その結果、鎖間架橋結合（ＩＣＬ）の形成がもたらされる。これらの病変はＤＮＡの複製及び転写などの基礎的な代謝プロセスを遮断するため、これらは細胞毒性が高い。
[0080]本発明の方法には、任意のそのような非特異的なナイトロジェンマスタードＤＮＡアルキル化剤の使用が包含される。特に適切なナイトロジェンマスタードアルキル化剤には、たとえば、それだけには限定されないが、シクロホスファミド、パリホスファミド、ベンダムスチン、及びイホスファミドが含まれ得る。
[0081]イホスファミドはナイトロジェンマスタードアルキル化剤である。イホスファミドのＩＵＰＡＣ名はＮ−３−ビス（２−クロロエチル）−１，３，２−オキサザホスフィナン−２−アミド−２−オキシドである。イホスファミドは一般的にイフェックス（Ｉｆｅｘ）（登録商標）として知られる。イホスファミドの化学構造は以下の通りである。
Figure 0006851983
[0082]パリホスファミドは、安定性のためにアミノ酸リシンと共有結合している、イホスファミドの活性代謝物である。パリホスファミドは、ＧＣ塩基対を介してＤＮＡを不可逆的にアルキル化及び架橋結合し、修復不可能な７原子の鎖間架橋結合、ＤＮＡ複製の阻害、及び／又は細胞死をもたらす。パリホスファミドはジマフォス（Ｚｙｍａｆｏｓ）（登録商標）としても知られる。
[0083]ベンダムスチンは別のナイトロジェンマスタードアルキル化剤である。ベンダムスチンのＩＵＰＡＣ名は４−［５−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］−１−メチルベンズイミダゾール−２−イル］ブタン酸であり、一般的にトレアキシン（Ｔｒｅａｋｉｓｙｍ）（登録商標）、リボムスチン（Ｒｉｂｏｍｕｓｔｉｎ）（登録商標）、レヴァクト（Ｌｅｖａｃｔ）（登録商標）、及びトレアンダ（Ｔｒｅａｎｄａ）（登録商標）と呼ばれる。ベンダムスチンの化学構造は以下の通りである。
Figure 0006851983
[0084]また、本発明の方法には、ＤＮＡアルキル化剤の中間代謝物及び／又は活性代謝物、詳細には本明細書中に記載のナイトロジェンマスタードＤＮＡアルキル化剤の中間代謝物及び／又は活性代謝物の使用も包含される。そのような代謝物には、それだけには限定されないが、アルドホスファミド、４−ヒドロキシシクロホスファミド、４−ヒドロキシイホスファミド、クロルアセトアルデヒド、及びホスファミドマスタードが含まれる。
[0085]さらなる実施形態では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤は、本明細書中に記載のアルキル化剤、白金化合物、メチル化剤、又はヌクレオシド類似体の任意の適切な薬学的に許容される塩、エステル、互変異性体、立体異性体、ラセミ混合物、溶媒和物、水和物、又はプロドラッグであり得る。
[0086]特定の実施形態では、本発明の方法において使用するためのＤＮＡ複製を妨げる薬剤はシクロホスファミドである。シトホスファンとしても知られるシクロホスファミド（Ｎ，Ｎ−ビス（２−クロロエチル）−１，３，２−オキサザホスフィナン−２−アミン２−オキシド）はナイトロジェンマスタードアルキル化剤である。シクロホスファミドの化学構造は以下の通りである。
Figure 0006851983
[0087]また、シクロホスファミドは、エンドキサン（Ｅｎｄｏｘａｎ）（登録商標）、シトキサン（Ｃｙｔｏｘａｎ）（登録商標）、ネオサール（Ｎｅｏｓａｒ）（登録商標）、プロシトックス（Ｐｒｏｃｙｔｏｘ）（登録商標）、及びレヴィミューン（Ｒｅｖｉｍｍｕｎｅ）（登録商標）の登録商標でも知られており、そのように呼ばれている。シクロホスファミドと同じクラスの他のナイトロジェンマスタードアルキル化剤には、それだけには限定されないが、パリホスファミド、ベンダムスチン、及びイホスファミドが含まれる。
[0088]シクロホスファミド（ＣＰＡ）は典型的には静脈輸液を介して投与するプロドラッグであるが、非経口及び経口投与することもでき（ｄｅ Ｊｏｎｇｅ，Ｈｕｉｔｅｍａら、２００５）、その生体利用度の違いはわずかである（Ｊｕｍａ，Ｒｏｇｅｒｓら、１９７９）。ＣＰＡは、肝臓中のＰ４５０酵素による酸化によって、その活性代謝物である４−ヒドロキシ−ＣＰＡ及びアルドホスファミドへと変換される（Ｅｍｍｅｎｅｇｇｅｒ，Ｓｈａｋｅｄら、２００７、２０１１）。ＣＰＡの活性代謝物は脂質可溶性であり、受動拡散によって細胞内に入る。細胞内４−ＯＨ−ＣＰＡはホスホルアミドマスタードへと自発的に分解し、これが最終活性代謝物である。ホスホルアミドマスタードは、ＤＮＡ複製を阻害して細胞死をもたらす鎖内及び鎖間のＤＮＡ架橋結合並びにＤＮＡ−タンパク質の架橋結合を触媒する（ｄｅ Ｊｏｎｇｅ，Ｈｕｉｔｅｍａら、２００５）。ホスホルアミドマスタードは、細胞質のアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）によるカルボキシホスファミド（ｃａｒｂｏｘｙｐｈｏｓｈｐｈａｍｉｄｅ）への酵素的変換によって排除される（Ｅｍｍｅｎｅｇｇｅｒ，Ｓｈａｋｅｄら、２００７、２０１１）。
[0089]低いレベルのＡＬＤＨを有する細胞はＣＰＡ代謝物を蓄積し、その効果に対してより感受性がある傾向にあり、実際、ＡＬＤＨの腫瘍上方制御はＣＰＡ耐性の１つの機構である（Ｚｈａｎｇ，Ｔｉａｎら、２００５）。ＡＬＤＨ以外に、低い細胞内ＡＴＰレベルは特定の細胞種に対するＣＰＡ選択性にも関連づけられている（Ｚｈａｏ，Ｃａｏら、２０１０）。高用量、典型的には１〜５ｇ／ｍ２の範囲では、ＣＰＡの効果は、細胞種にかかわらず迅速に分裂中の細胞に対して最も細胞毒性があり、ほとんどの造血細胞は迅速に分裂しているため、ＣＰＡは骨髄抑制性である（Ｂｒｕｃｅ，Ｍｅｅｋｅｒら、１９６６、Ｓｍｉｔｈ及びＳｌａｄｅｋ、１９８５）。
[0090]ＣＰＡ及びその代謝物の全身クリアランスは５〜９時間で変動し、親のピーク血漿レベルも患者間で相当に変動し（３〜１１時間）、これは個人間の代謝の遺伝的な相違を反映している（Ｃｏｈｅｎ，Ｊａｏら、１９７１、Ｍｏｕｒｉｄｓｅｎ，Ｆａｂｅｒら、１９７４）。ＣＰＡの反復投与は、代謝に関与している酵素の活性を増加させることによって排出半減期を短縮させることが報告されているが（Ｄ’Ｉｎｃａｌｃｉ，Ｂｏｌｉｓら、１９７９）、これが活性代謝物の代謝の活性をもたらすかどうかは分かっておらず（ｄｅ Ｊｏｎｇｅ，Ｈｕｉｔｅｍａら、２００５）、特に低用量においてそうである（Ｅｍｍｅｎｅｇｇｅｒ，Ｓｈａｋｅｄら、２００７）。
[0091]ヒトからネズミの研究への用量の変換は、以下の方程式を使用して計算する。
ヒト用量（ｍｇ／ｋｇ）＝動物Ｋｍ
動物用量（ｍｇ／ｋｇ）＝ヒトＫｍ
[0092]式中、定数のマウスＫｍ値は３であり、ヒトＫｍ値は３７である（Ｒｅａｇａｎ−Ｓｈａｗ，Ｎｉｈａｌら、２００８）。
[0093]過去２０年間の間、低用量ＣＰＡは、その免疫変調及び抗血管形成の効果について評価を受けてきた。高用量ＣＰＡとは対照的に、低用量のＣＰＡ、典型的には１００〜３００ｍｇ／ｍ２は幅広い細胞毒性活性を欠くが、免疫系の細胞を選択的に変調することによって、及び腫瘍微小環境内の血管形成も低下させることによって、免疫媒介性の腫瘍排除を増強させると考えられている。低用量ＣＰＡの作用機構及び使用は、たとえば国際公開第２０１４／１５３６３６号にさらに記載されている。
[0094]一実施形態では、本明細書中に開示する方法は、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤を投与することを含む。
[0095]ＤＮＡ複製を妨げる薬剤は、典型的には免疫変調効果をもたらすために十分な量で投与する。本明細書中で使用する表現「免疫変調効果」とは、免疫系及び／又は免疫系の細胞の１つ又は複数の側面を変更する（変調する）、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤の能力をいう。一実施形態では、「免疫変調効果をもたらすために十分な量」とは、免疫系の細胞においてＤＮＡ複製に選択的に影響を与えることができる、薬剤の量である。たとえば、薬剤の量は、免疫系の迅速に分裂中の細胞を選択的に標的化してプログラム細胞死を引き起こすために十分な量であり得る。
[0096]「免疫変調効果をもたらすために十分な量」とは、本明細書中で「低用量」の量と互換性があるように言及し得る。ＤＮＡ複製を妨げる薬剤がアルキル化剤シクロホスファミドである本発明の特定の実施形態に関して、表現「低用量」とは、典型的には、３００ｍｇ／ｍ２以下、たとえば２５〜３００ｍｇ／ｍ２、より詳細には１００〜３００ｍｇ／ｍ２などであるシクロホスファミドの用量をいう。一実施形態では、低用量の量のシクロホスファミドは、１０、２５、５０、７５、又は１００ｍｇ ＢＩＤ（１日２回）である。特定の実施形態では、低用量の量のシクロホスファミドは５０ｍｇ ＢＩＤである。本明細書中に包含される、「低用量」の量のＤＮＡ複製を妨害する他の薬剤は、当業者に知られている、又はルーチン的な技術によって決定することができる。
[0097]特定の実施形態では、本明細書中に開示する方法は、１サイクルの低用量の規則的なシクロホスファミドを含む。本開示の目的のために、「規則的な」とは、通常用量の量より低い、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤（たとえばシクロホスファミド）の頻繁な投与をいうことを意味する。本明細書中で使用する用語「通常用量の量」とは、たとえば、それだけには限定されないが、（ｉ）従来の投薬スケジュールを介した、確立された最大耐量（ＭＴＤ）若しくは標準の用量、又は（ｉｉ）低用量の単一ボーラス量がＤＮＡ複製を妨げる特定の薬剤について確立されている場合は、その低用量の量のいずれかをいい得る。
[0098]規則的な投薬では、従来の投薬スケジュールを介して投与するであろう量と同じ、より低い、又はより高い、一定期間にわたる累積用量を、最終的に投与し得る。特に適切な実施形態では、これは、通常用量の量と比較して投与する量を減少する一方で、投薬を実施するタイムフレームを延長する及び／又は投与の頻度を増加することによって達成する。たとえば、３００ｍｇ／ｍ２のＤＮＡ複製を妨げる薬剤のという低用量の量を典型的に投与する場合（たとえば単一ボーラス注射による）、規則的なレジメンは、頻繁な低用量を投与することによって、数日間の期間にわたって同じ量を投与することを含み得る。
[0099]本明細書中に開示する方法の一実施形態では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤（たとえばシクロホスファミド）を用いた規則的な治療には、たとえば、２、３、４、５、６、若しくは７日間、又はそれより長い連続的な日数の期間などの一定期間にわたる、薬剤の毎日の低用量投与が包含されることを意図する。これらの規則的な投薬の日数の間、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤は、頻繁な定期的な間隔又は変動する間隔で提供し得る。たとえば、一実施形態では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤の用量を１、２、３、４、６、８、１２、又は２４時間毎に投与し得る。別の実施形態では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤の用量を２、３、又は４日毎に１回投与し得る。特定の実施形態では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤の用量を１日２回投与し得る。
[00100]一部の実施形態では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤を用いた規則的な治療の期間中に中断又は空白が存在し得る。このように、規則的な治療は、オン及びオフの投与期間を交互に行う周期的な様式で起こり得る。詳細には、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤を、１日１回、交互する１週間間隔で対象に投与する間隔が適切である。たとえば、１週間の期間のＤＮＡ複製を妨げる薬剤の投与の後に１週間の治療の一時停止が続き、このサイクルが繰り返される。
[00101]したがって、一実施形態では、本明細書中に開示する方法は、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤を、１日１回、２週間毎に開始する７日間の連続した日数の期間の間、対象に投与することを含む。本実施形態の特定の態様では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤の投与をデポー形成ワクチンの初回投与の約７日前に開始する。本実施形態のさらなる一態様では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤を、それぞれの投与日に５０ｍｇ ＢＩＤ（１日２回）の用量で投与し得る。
[00102]本明細書中に開示する方法の一実施形態では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤は、デポー形成ワクチン及び／又はデポー非形成ワクチンのそれぞれの投与の間の一時中断期間中にプライム剤として投与し得る。
[00103]当業者には理解されるように、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤、並びにデポー形成及びデポー非形成ワクチンの投与の頻度及び期間は、上述したパラメータ内で、任意の所定の対象について所望に応じて調節し得る。考慮し得る要因には、たとえば、ワクチン中の１つ又は複数の抗原の性質、疾患又は障害の種類、対象の年齢、体調、体重、性別、及び食習慣、並びに他の要因が含まれる。
[00104]ＤＮＡ複製を妨げる薬剤は、任意の適切な送達手段及び任意の適切な投与経路によって投与し得る。一実施形態では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤は、丸薬、錠剤、又はカプセルの形態などで、経口投与する。一代替実施形態では、薬剤を注射（たとえば静脈内）によって投与する。本明細書中に開示する方法の特定の実施形態では、薬剤はシクロホスファミドであり、経口投与する。
[00105]本明細書中に開示する方法の特定の実施形態では、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤はシクロホスファミドである。
[00106]チェックポイント阻害剤
[00107]また、本明細書中に開示する方法は、免疫応答チェックポイント阻害剤を投与することも含み得る。
[00108]本明細書中で使用する「免疫応答チェックポイント阻害剤」とは、１つ又は複数のチェックポイントタンパク質を完全に又は部分的に低下、阻害、妨害、又は変調する任意の化合物又は分子をいう。チェックポイントタンパク質はＴ細胞の活性化又は機能を調節する。たとえば、ＣＴＬＡ−４並びにそのリガンドＣＤ８０及びＣＤ８６、ＰＤ−１並びにそのリガンドＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２などの、数々のチェックポイントタンパク質が知られている。チェックポイントタンパク質は、Ｔ細胞応答の共刺激性又は阻害性の相互作用を司っている。チェックポイントタンパク質は、自己寛容並びに生理的免疫応答の期間及び大きさを調節及び維持する。本明細書中、用語「免疫応答チェックポイント阻害剤」は「チェックポイント阻害剤」と互換性があるように使用され得る。
[00109]一部の実施形態では、免疫応答チェックポイント阻害剤は、プログラム死−リガンド１（ＰＤ−Ｌ１であり、Ｂ７−Ｈ１、ＣＤ２７４としても知られる）、プログラム死１（ＰＤ−１、ＣＤ２７９）、ＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５４）、ＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣ、ＣＤ２７３）、ＬＡＧ３（ＣＤ２２３）、ＴＩＭ３（ＨＡＶＣＲ２、ＣＤ３６６）、４１ＢＢ（ＣＤ１３７）、２Ｂ４、Ａ２ａＲ、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１６０、ＣＤ２２６、ＣＤ２７６、ＤＲ３、ＧＡＬ９、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＩＣＯＳ（誘導性Ｔ細胞共刺激分子）、ＫＩＲ、ＬＡＩＲ１、ＬＩＧＨＴ、ＭＡＲＣＯ（コラーゲン様構造を有するマクロファージ受容体）、ＰＳ（ホスファチジルセリン）、ＯＸ−４０、ＳＬＡＭ、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＶＴＣＮ１、又はその任意の組合せの阻害剤である。
[00110]一部の実施形態では、免疫応答チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、又はその任意の組合せの阻害剤である。
[00111]一部の実施形態では、免疫応答チェックポイント阻害剤はＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−１の阻害剤である。一実施形態では、ＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−１の阻害剤は、抗ＰＤ１又は抗ＰＤＬ１抗体、たとえば、それだけには限定されないが、国際公開第２０１５／１０３６０２号に記載のものなどであり得る。たとえば、一実施形態では、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピジリズマブ、ＢＭＳ−９３６５５９（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ、識別番号ＮＣＴ０２０２８４０３を参照）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（Ｒｏｃｈｅ、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ、識別番号ＮＣＴ０２００８２２７を参照）、ＭＤＸ１１０５−０１（Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ、識別番号ＮＣＴ００７２９６６４を参照）、ＭＥＤＩ４７３６（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ、識別番号ＮＣＴ０１６９３５６２を参照）、及びＭＫ−３４７５（Ｍｅｒｃｋ、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ、識別番号ＮＣＴ０２１２９５５６を参照）から選択され得る。一実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ＲＭＰ１−４若しくはＪ４３（ＢｉｏＸＣｅｌｌ）、又はそのヒト若しくはヒト化対応物であり得る。
[00112]一部の実施形態では、免疫応答チェックポイント阻害剤はＣＴＬＡ−４の阻害剤である。一実施形態では、ＣＴＬＡ−４の阻害剤は、たとえば、それだけには限定されないが、イピリムマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）又はＢＮ１３（ＢｉｏＸＣｅｌｌ）などの抗体であり得る。別の実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、ＵＣ１０−４Ｆ１０−１１、９Ｄ９、若しくは９Ｈ１０（ＢｉｏＸＣｅｌｌ）、又はそのヒト若しくはヒト化対応物であり得る。
[00113]１つ又は複数の免疫応答チェックポイント阻害剤は任意の適切な経路によって投与し得る。一部の実施形態では、１つ又は複数の免疫応答チェックポイント阻害剤の投与経路は、非経口、粘膜の、経口、舌下、経皮、局所、吸入、鼻腔内、エアロゾル、腹腔内、腫瘍内、眼内、気管内、直腸内、胃内、経膣、遺伝子銃によるもの、真皮パッチ、又は点眼剤若しくは洗口液の形態である。一実施形態では、免疫応答チェックポイント阻害剤を皮下注射によって投与し得る。
[00114]当業者には理解されるように、免疫応答チェックポイント阻害剤の投与の頻度及び期間は、任意の所定の対象について所望に応じて調節し得る。考慮し得る要因には、たとえば、特定のチェックポイント阻害剤の性質及び種類、ワクチン中の１つ又は複数の抗原の性質、疾患又は障害の種類、対象の年齢、体調、体重、性別、及び食習慣、並びに他の要因が含まれる。
[00115]一部の実施形態では、１つ又は複数の免疫応答チェックポイント阻害剤は、デポー形成ワクチン及び／又はデポー非形成ワクチンの前、後、又はそれと同時に投与し得る。一実施形態では、免疫応答チェックポイント阻害剤は、初回投与に続く時点に、デポー形成ワクチンと共に投与し得る。本実施形態の態様では、免疫応答チェックポイント阻害剤は、デポー非形成ワクチンの初回投与の前又は後の時点に投与し得る。
[00116]一実施形態では、免疫応答チェックポイント阻害剤の投与をデポー形成ワクチンの初回投与と同じ日に開始してもよく、それ以降は所望のスケジュールで投与し得る。一実施形態では、所望のスケジュールは、１、２、３、４、６、８、１２、若しくは１８時間毎、１、２、３、４、５、若しくは６日毎、又は１、２、３、若しくは４週間毎の免疫応答チェックポイント阻害剤の投与であり得る。一実施形態では、所望のスケジュールは３日毎に１回であり得る。
[00117]免疫応答チェックポイント阻害剤の投与期間中に中断又は空白が存在し得る。このように、投与は、オン及びオフの投与期間を交互に行う周期的な様式で起こり得る。
[00118]ワクチン組成物
[00119]本明細書中で使用する用語「ワクチン」、「ワクチン組成物」、又は「組成物」は、内容に応じて互換性があるように使用され得る。
[00120]本発明によるワクチン組成物は、治療上有効な量で対象に投与し得る。本明細書中で使用する、本明細書中に開示するデポー形成又はデポー非形成ワクチンのどちらかに適用される「治療上有効な量」とは、対象において免疫応答を刺激、誘導、維持、ブースト、又は増強するために有効な、ワクチン又は活性成分（たとえば１つ又は複数の抗原）の量を意味する。一部の実施形態では、治療上有効な量のワクチンは、特定の疾患又は障害の治療において、対象において臨床反応を誘導することができる量である。ワクチンの治療上有効な量の決定は、特に本明細書中に提供する開示に鑑みて、当業者の能力範囲内に十分ある。治療上有効な量は、対象の状態、重量、性別、及び年齢などの様々な要因に応じて変動し得る。
[00121]本明細書中に記載の方法及びキットにおいて使用する本発明のワクチン組成物は２つの異なる種類のものである。１つ目の種類は「デポー形成ワクチン」であり、２つ目の種類は「デポー非形成ワクチン」である。
[00122]（ｉ）デポー形成ワクチン
[00123]「デポー形成ワクチン」とは、対象に投与した際、ワクチン及びその構成成分（たとえば、抗原、ヘルパーＴエピトープ、アジュバントなど）が一定期間の間ワクチン注射部位に局在して留まり、対象の身体全体にわたって迅速に分散されないことを意味する。このことは、本明細書中で「デポー効果」と呼び、注射部位からの、抗原、又は抗原及び１つ若しくは複数の他のワクチン構成成分の実質的な放出が長期間起こらない。抗原又は抗原と１つ若しくは複数の他のワクチン構成成分が注射部位に留まる期間は、デポー効果がどのように達成されるかに依存し得る。本明細書中で使用する用語「デポー形成ワクチン」とは、概して、抗原又は抗原と１つ若しくは複数の他のワクチン構成成分の実質的な割合が、抗原及び他の構成成分をデポー非形成ワクチン中で投与した場合よりも長い期間、注射部位に保たれることを意味する。デポー非形成ワクチンは本明細書中以下に記載されている。
[00124]一実施形態では、用語「デポー形成ワクチン」とは、抗原又は抗原と１つ若しくは複数の他のワクチン構成成分の実質的な割合（たとえば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）が、少なくとも約３６時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１４４時間、１６８時間、又は１９２時間の間、注射部位に局在して留まることを意味する。一実施形態では、抗原又は抗原と１つ若しくは複数の他のワクチン構成成分の１％未満、２％、３％、４％、又は５％が、デポー形成ワクチンの投与の２４時間以内に注射部位から放出される。一実施形態では、抗原又は抗原と１つ若しくは複数の他のワクチン構成成分の少なくとも８０％が、投与後の少なくとも約４８時間の間、注射部位に局在して留まる。一実施形態では、抗原又は抗原と１つ若しくは複数の他のワクチン構成成分の少なくとも６０％が、投与後の少なくとも約７２時間の間、注射部位に局在して留まる。
[00125]ワクチン組成物の放出動力学は、当分野で知られている様々な手段によって決定することができる。一例として、生理的条件を模倣するために、ワクチン組成物の試料（たとえば５００μｌ）をリン酸緩衝液（たとえば、１ｍｌ、１０ｍＭ、ｐＨ７．４）のバイアルに添加することができる。バイアルは、３７℃に保ち、水性層のアリコートと取り出し、水性環境中でのワクチン構成成分の存在を分析すること（たとえばＨＰＬＣによる）によって、適切な間隔で試験することができる。
[00126]デポー形成ワクチンは、ワクチン構成成分をたとえば油などの疎水性担体中で配合することによって調製し得る。そのような担体（たとえば油）の連続的な疎水性相はワクチン接種した対象の水性環境と非混和性となり、注射部位でデポー効果をもたらすであろう。ワクチン構成成分をどのように疎水性担体中で配合し得るかの実施形態を以下に記載する。抗原をどのように疎水性担体中で混和性にし得るかの説明は、たとえば、ヘルパーＴエピトープ、アジュバントなどの他のワクチン構成成分にも適用及び使用し得ることが理解されよう。
[00127]（ｉｉ）疎水性担体中でのワクチン構成成分の配合
[00128]抗原及び他のワクチン構成成分を、水を排除した油などの疎水性担体を有する配合物中に可溶化する能力には、慣用の水性系及び抗原を親水性相中に懸濁させる他の系を超えるいくつかの利点がある。
[00129]抗原を無水環境中で配合することは、加水分解、熱変性、及び光感受性に関してその安定性を増加させる。ワクチン開発に関して、抗原を疎水性担体中に保つことは、注射部位で素早く分散するその傾向を減少させ、免疫系がワクチン構成成分を能動的に取り込むことを強要し、したがってその免疫原性を促進する。典型的な条件下では、親水性抗原は疎水性担体に溶解せず、これは、２つの間に存在する高い表面張力に基づく。しかし、抗原の、油配合物などの完全に疎水性の環境内への取り込みを促進する方法はいくつか存在する。
[00130]したがって、一実施形態では、本明細書中に開示するデポー形成ワクチンの１つ又は複数の抗原は、１つ又は複数の抗原が疎水性担体中で混和性であるように十分に疎水性である、又は十分に疎水性にする。
[00131]本明細書中で使用する「十分に疎水性」とは、抗原が疎水性担体と適合性を有することを意味する。適合性は様々な手段によって決定し得るが、一般的に、抗原は、疎水性担体中で混和性である場合に疎水性担体と適合性を有する。本明細書中の内容において「混和性」とは、抗原が疎水性担体中に再懸濁、溶解、又は他の様式で分配されることができることを意味する。典型的には均一な溶液が生じるが、本開示の目的のためには、抗原が疎水性担体内に再懸濁、溶解、又は他の様式で分配される限りは、均一な溶液が形成されることは必要ではない。また、本開示のため、及び抗原／疎水性担体の組合せ次第で、抗原のうちのわずか（たとえば、１％未満、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、又は１０％）が再懸濁又は溶解し得ない可能性もあるが、それでも抗原は混和性であると考え得る。
[00132]混和性を決定することができる様々な手段が当分野で知られている。一般的には、混和性は光学的に決定する。抗原が疎水性担体中で混和性である場合、生じる液体は透明である。透明度は裸眼又は器具の使用によって測定することができる。裸眼で見える曇り又は粒子が存在しない場合、抗原は疎水性担体中で混和性であると考えられる。当業者には理解されるように、混和性は抗原の濃度に伴って変動する場合があり、抗原の濃度が高ければ高いほど、曇り又は目に見える粒子の存在の可能性が高くなる。したがって、一部の実施形態では、本明細書中で使用する用語「混和性」とは、抗原の治療上有効な量又は濃度が、疎水性担体中に再懸濁、溶解、又は他の様式で分配されることができることを意味する。
[00133]第１の実施形態では、目的の抗原は天然に疎水性であり、油などの疎水性担体への直接の溶解を可能にし得る。それだけには限定されないが、この特徴を示す最も一般的な抗原の一部は、特定の分子結合部位及びポケットを構築するもの、又はタンパク質の膜貫通ドメインを構成するものである。シグナルペプチド及び膜貫通ドメインは、その疎水性性質及び配列が原因で複数のＭＨＣ対立遺伝子と結合する能力を有する、疎水性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープに富んでいることが見いだされている（Ｋｏｖｊａｚｉｎら、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２０１１、４８（８）：１００９）。高い割合の疎水性アミノ酸残基を含有する抗原は、標準の水性ワクチン配合物中でのその配合の問題が原因で、一般的にはワクチン設計において過小評価されている。本明細書中に開示するワクチン配合物は、天然に疎水性である１つ又は複数の抗原を含み得る。
[00134]第２の実施形態では、抗原の疎水性は、抗原自体への修飾によって増加させ得る。それだけには限定されないが、そのような修飾の一例は、リポペプチド類をもたらすタンパク質脂質化である。タンパク質脂質化の方法には、それだけには限定されないが、Ｎ末端のミリストイル化（Ｒｅｓｈら、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ、１９９９、１４５１：１）、Ｃ末端へのコレステロールの付着（Ｋａｒｐｅｎら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２００１、２７６：１９５０３）、Ｃ末端又はその付近のシステイン残基のＳ−プレニル化（Ｚｈａｎｇら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９９６、６５：２４１）、及びタンパク質全体にわたるシステインのＳ−パルミトイル化（Ｓｍｏｔｒｙｓら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ、２００４、７３：５５９）が含まれる。これらのタンパク質は、多くの場合、脂質部分の増加した疎水性を引き受ける。より最近では、Ｐａｍ２Ｃｙｓ／Ｐａｍ３Ｃｙｓ（Ｍｏｙｌｅら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００８、１５（５）：５０６）、パルミチン酸（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９２、７６（４）：５９３）、及び他のリポアミノ酸（Ｈａｙｍａｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００２、８０：１７８）などの、アジュバント活性を有する脂質を付着させる選択肢が調査されている。本明細書中に開示するワクチン配合物は、脂質化によって修飾された１つ又は複数の抗原を含み得る。
[00135]また、疎水性担体中の抗原の混和性を増加させるために、疎水性イオン対合を使用して抗原を疎水性分子、化合物、又は複合体と非共有結合で複合体化することもできる。手短に述べると、疎水性イオン対合とは、抗原の対イオンを荷電有機担体分子で置き換えることによって疎水性担体中の抗原の溶解度を増加させる方法である。欧州特許第１１５０７１０号では、正荷電の抗原とサポニン又はサポニン複合体などの負荷電の有機担体分子との間の静電気的会合を介して免疫原性複合体を形成した。この手法は、その単純性及び材料の要求の低さが理由で、疎水性分子と共有結合させることよりも好まれる場合がある。これは、ナノ粒子の疎水性区画内のタンパク質のローディング及び安定性を増強させるために使用する場合がある（Ｙｏｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００１、９０（２）：１９４）。本明細書中に開示するワクチン配合物は、疎水性分子、化合物、又は複合体と非共有結合又は共有結合で複合体化した１つ又は複数の抗原を含み得る。
[00136]上記技法は、抗原の疎水性を増加させるための使用が成功しているが、これらの種類の抗原が水を排除した油などの疎水性担体中に直接溶解している例は非常にわずかしか存在しない。抗原及び疎水性担体（たとえば油）を含有する典型的な配合物も、親水性相から成っている。たとえば、抗原を水性相中に懸濁させ、油で乳化させる、油中水及び水中油の乳濁液の例が多数存在する。しかし、乳濁液は、ｉｎ ｖｉｖｏで注射した後に不安定になり、組成物の水性相及び油性相の分離を引き起こし得る。これは、抗原及び他の構成成分の未熟な又は加速された放出をもたらす。他の場合では、水性区画又は水中油乳濁液中の抗原の存在は、比較的素早く、典型的には４８時間未満で注射部位から消散すると予想される。また、水中油乳濁液の微視的な油滴内に含有され得る抗原も注射部位から取り除かれる場合があり、持続しない。
[00137]リポソームは、抗原をカプセル封入するための小胞として、及び配合物を安定化するための乳化剤として、乳濁液中で使用されてきた。親水性抗原は、典型的には水性の内部に捕捉されている一方で、疎水性抗原は、脂質二重層中に挿入する、又は油相中に分散させることができる。他の乳濁液と同様、乳濁液を含有するリポソームは調製が厄介な場合があり、ｉｎ ｖｉｖｏで水性相と油相に分離する場合がある。
[00138]第３の実施形態では、両親媒性物質を使用することによって抗原を十分に疎水性にし得る。特に適切な実施形態では、抗原は、親水性相の非存在下で、疎水性担体中の１つ又は複数の両親媒性物質を用いて可溶化し得る。
[00139]「両親媒性物質」とは、親水性及び疎水性（親油性）の部分又は特徴をどちらも有する化合物である。用語「両親媒性物質（ａｍｐｈｉｐｈｉｌｅ）」は、「両親媒性（ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ）」及び「両親媒性（ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ）」と互換性があるように使用され得る。一部の実施形態では、適切な両親媒性物質には、本明細書中以下に記載のものなどの乳化剤も含まれる。本明細書中、用語「両親媒性物質」によって包含される乳化剤の例示的な実施形態には、それだけには限定されないが、ポリソルベート（たとえばモノオレイン酸ソルビタン）、オレイン酸マンニド（アルラセル（Ａｒｌａｃｅｌ）（商標）Ａ）、レシチン、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）（商標）８０、並びにスパン（Ｓｐａｎ）（商標）２０、８０、８３、及び８５が含まれる。両親媒性物質は、親水性の親和性を有するワクチン構成成分の、油などの疎水性担体内への取り込みを促進することができる。ワクチン構成成分には、それだけには限定されないが、抗原及び／又はアジュバント及び／又は免疫応答の生成を促進することができる他の成分（たとえばヘルパーＴエピトープ）が含まれることができる。
[00140]それだけには限定されないが、両親媒性物質の疎水性部分は、典型的には、ＣＨ３（ＣＨ２）ｎ（式中ｎ＞４）の形の長鎖などの大きな炭化水素部分である。両親媒性物質の親水性部分は、通常は荷電基又は極性の非荷電基のいずれかである。荷電基には陰イオン基及び陽イオン基が含まれる。陰イオン性荷電基の例には以下のものが含まれる（分子の疎水性部分を「Ｒ」によって表す）：カルボン酸イオン：ＲＣＯ２ −、硫酸イオン：ＲＳＯ４ −、スルホン酸イオン：ＲＳＯ３ −、及びリン酸イオン（リン脂質中の荷電官能基）。陽イオン性荷電基には、たとえば、アミン：ＲＮＨ３ ＋（ここでも「Ｒ」は分子の疎水性部分を表す）が含まれる。非荷電の極性基には、たとえば、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）などの大きなＲ基を有するアルコールが含まれる。両親媒性物質は、疎水性部分を数個、親水性部分を数個、又は両方を数個ずつ有し得る。タンパク質及び一部のブロックコポリマーが例である。また、ステロイド、コレステロール、脂肪酸、胆汁酸、及びサポニンも両親媒性物質である。
[00141]使用し得る数々の両親媒性物質が存在し、本明細書中に開示するワクチン配合物は、単一種類の両親媒性物質又は異なる種類の両親媒性物質の混合物を含有し得る。
[00142]一実施形態では、両親媒性物質は脂質である。任意の両親媒性脂質を使用し得るが、特に適切な脂質には、少なくとも４個の炭素、典型的には約４〜２８個の炭素の長さを含有する少なくとも１つの脂肪酸鎖を有するものが含まれ得る。脂肪酸鎖は任意の数の飽和及び／又は不飽和結合を含有し得る。脂質は天然脂質又は合成脂質であり得る。両親媒性脂質の非限定的な例には、リン脂質、スフィンゴ脂質、スフィンゴミエリン、セロブロシド（ｃｅｒｏｂｒｏｃｉｄｅ）、ガングリオシド、エーテル脂質、ステロール、カルジオリピン、カチオン性脂質、並びにポリ（エチレングリコール）及び他のポリマーで修飾された脂質が含まれ得る。合成脂質には、それだけには限定されないが、以下の脂肪酸構成要素が含まれ得る：ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、アラキドイル、オレオイル、リノレオイル、エルコイル、又はこれらの脂肪酸の組合せ。
[00143]一実施形態では、両親媒性物質はリン脂質又はリン脂質混合物である。広く定義すると、「リン脂質」とは、加水分解の際にリン酸、アルコール、脂肪酸、及び窒素塩基を与える脂質化合物群のメンバーである。
[00144]リポソームの調製において使用し得るリン脂質には、たとえば、それだけには限定されないが、ホスホグリセロール、ホスホエタノールアミン、ホスホセリン、ホスホコリン（たとえばＤＯＰＣ、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、及びホスホイノシトールからなる群から選択される少なくとも１つの頭部基を有するものが含まれる。一部の実施形態では、ＤＯＰＣ及び非エステル化コレステロールの混合物を使用し得る。非エステル化コレステロールを使用する場合、コレステロールは、リン脂質の重量の約１０％と同等の量（たとえば、１０：１ｗ／ｗのＤＯＰＣ：コレステロール比）で使用し得る。たとえば、単一用量の本明細書中に記載の組成物中のＤＯＰＣの量が１２０ｍｇ／ｍｌ、コレステロールの量が１２ｍｇ／ｍｌであり得る。特定の実施形態では、ＤＯＰＣの量が約３０ｍｇ／単位用量の組成物、コレステロールの量が約３ｍｇ／単位用量であり得る。コレステロールは、リン脂質小胞の形成を安定化させるために使用する。コレステロール以外の化合物を使用する場合、当業者は必要な量を容易に決定できるであろう。
[00145]別の一般的なリン脂質はスフィンゴミエリンである。スフィンゴミエリンは、長い不飽和炭化水素鎖を有するアミノアルコールであるスフィンゴシンを含有する。脂肪酸アシル側鎖がアミド結合によってスフィンゴシンのアミノ基に連結されてセラミドを形成する。スフィンゴシンのヒドロキシル基はホスホコリンへとエステル化されている。ホスホグリセリドと同様、スフィンゴミエリンは両親媒性である。
[00146]やはり使用し得るレシチンは、典型的には鶏卵又は羊毛に由来するリン脂質の天然混合物である。
[00147]これらのすべて及び他のリン脂質を本発明の実施において使用し得る。リン脂質は、たとえばＡｖａｎｔｉ ｌｉｐｉｄｓ（米国アラバマ州Ａｌａｂａｓｔａｒ）及びｌｉｐｏｉｄ ＬＬＣ（米国ニュージャージー州Ｎｅｗａｒｋ）から購入することができる。
[00148]抗原は、１つ又は複数の両親媒性物質の存在によって、疎水性担体中で混和性であるように十分に疎水性にし得る。抗原、両親媒性物質、及び疎水性担体を含むワクチン及び免疫原性組成物の調製の例示的な開示は、たとえば、国際公開第１９９６／０１４８７１号及び国際公開第２００９／０４３１６５号が含まれる。
[00149]一実施形態では、両親媒性物質は疎水性担体中に実質的に均質に分散されていてもよく、ここで、両親媒性物質の単独での存在が、抗原を疎水性担体中で混和性にするために十分である。
[00150]別の実施形態では、両親媒性物質は、抗原を疎水性担体中で混和性にするために、抗原と密に会合していてもよい。「密に会合している」とは、抗原が疎水性担体中で混和性である形態で提示されるほど、両親媒性物質が抗原の近傍にあることを意味する。密な会合は、抗原と両親媒性物質の間の物理的相互作用を伴っていても、伴っていなくてもよい。典型的には、両親媒性物質の親水性部分は、抗原上の親水性部分に向けられている。両親媒性物質は互いに実質的に分離して保たれていてもよく、又は様々な異なる種類の構造、アセンブリ、若しくはアレイを形成していてもよい。
[00151]両親媒性物質が形成し得る構造、アセンブリ、又はアレイの種類の例示的な実施形態には、それだけには限定されないが、単層シート、二重層シート、多層シート、単層小胞構造（たとえばミセル）、二重層小胞構造（たとえば単層若しくは多重膜小胞）、又はその様々な組合せが含まれる。「単層」とは、両親媒性物質が二重層を形成せず、むしろ、疎水性部分が片側に向けられ、親水性部分が逆側に向けられている層であることを意味する。「二重層」とは、両親媒性物質が２層のシートを形成し、典型的には、それぞれの層の疎水性部分が二重層の中心に向かって内部に向けられており、親水性部分が外部に向けられていることを意味する。しかし、逆の立体配置も可能である。用語「多層」には、単層及び二重層構造の任意の組合せが包含されることを意味する。採用する形態は、使用する特定の抗原、特定の両親媒性物質、及び／又は特定の疎水性担体に依存し得る。
[00152]一実施形態では、両親媒性物質によって形成される構造、アセンブリ、又はアレイは、抗原を部分的に又は完全に取り囲み得る。一例として、両親媒性物質は抗原の周りに閉じた小胞構造を形成し得る。
[00153]一実施形態では、小胞構造は単層小胞構造である。そのような構造の一例はミセルである。典型的な水溶液中のミセルは、周囲の水溶液と接触している親水性部分と凝集体を形成し、疎水性部分をミセル中心に隔離する。対照的に、疎水性担体中では、反転／逆転ミセルが周囲の水溶液と接触している疎水性部分と形成され、親水性部分をミセル中心に隔離する。球状逆転ミセルは、親水性の親和性を有する抗原をその核内にパッケージングすることができる。
[00154]一実施形態では、小胞構造はミセル又は反転／逆転ミセルである。それだけには限定されないが、ミセル又は反転／逆転ミセルの大きさは、直径２ｎｍ（２０Ａ）〜２０ｎｍ（２００Ａ）の範囲である。特定の実施形態では、ミセル又は反転／逆転ミセルの大きさは直径約１０ｎｍである。
[00155]別の実施形態では、小胞構造はたとえばリポソームなどの二重層小胞構造である。リポソームは、捕捉された水性体積を含有する、完全に閉じた脂質二重層膜である。リポソームは単層膜ベシクル（単一の二重層膜を保有）又は多重膜二重層によって特徴づけられた多重膜小胞であってもよく、それぞれの二重層は、水性層によって次の層と分離されていても、されていなくてもよい。リポソームの一般的な記述は、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ Ｇ．、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、１１：８９〜９７、１９９０及びＦｒｅｚａｒｄ，Ｆ．、Ｂｒａｚ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏ．Ｒｅｓ．、３２：１８１〜１８９、１９９９に見つけることができる。リポソームは、事実上任意の種類の細胞上に吸着し、そのあと、取り込んだ薬剤（たとえば抗原）を放出することができる。或いは、リポソームは、標的細胞と融合し、そこでリポソームの内容物が標的細胞内に出されることもできる。或いは、リポソームは食作用を有する細胞によってエンドサイトーシスを受け得る。
[00156]リポソームは、抗原をカプセル封入するための小胞として、及び配合物を安定化するための乳化剤として、疎水性担体を含む組成物の調製において使用されてきた（たとえば、国際公開第２００２／０３８１７５号、国際公開第２００７／０４１８３２号、国際公開第２００９／０３９６２８号、国際公開第２００９／１４６５２３号及び国際公開第２０１３／０４９９４１号を参照。親水性抗原は、典型的には水性内部に捕捉されている一方で、疎水性抗原は、脂質二重層中に挿入する、又は油相中に分散させることができる。
[00157]二重層及び多層小胞構造の他の実施形態には、それだけには限定されないが、ニオソーム、トランスファーソーム、ビロソーム、多重膜小胞（ＭＬＶ）、オリゴ層状小胞（ＯＬＶ）、単層膜ベシクル（ＵＶ）、小単層膜ベシクル（ＳＵＶ）、中単層膜ベシクル（ＭＵＶ）、大単層膜ベシクル（ＬＵＶ）、巨大単層膜ベシクル（ＧＵＶ）、多胞体小胞（ＭＶＶ）、逆相蒸発方法によって作製された単層又はオリゴ層状小胞（ＲＥＶ）、逆相蒸発方法によって作製された多重膜小胞（ＭＬＶ−ＲＥＶ）、安定多層状小胞（ＳＰＬＶ）、凍結解凍ＭＬＶ（ＦＡＴＭＬＶ）、押し出し成形方法によって調製された小胞（ＶＥＴ）、フレンチプレスによって調製された小胞（ＦＰＶ）、融合によって調製された小胞（ＦＵＶ）、脱水再水和小胞（ＤＲＶ）、及びバブルソーム（ＢＳＶ）が含まれる。当業者には、これらの小胞構造を調製するための技法は当分野で周知であることが理解されよう（たとえばＫｒｅｕｔｅｒ，Ｊ．編、Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、第６６巻、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、１９９４を参照）。
[00158]上述した手法及びワクチン組成物は、ワクチン構成成分をどのように疎水性担体中で配合し得るかの例示的な非限定的な実施形態である。ここでも、抗原をどのように疎水性担体中で混和性にし得るかの上記説明は、たとえば、ヘルパーＴエピトープ、アジュバントなどの他のワクチン構成成分にも適用及び使用し得ることが理解されよう。
[00159]本明細書中に記載のデポー形成ワクチンの用量あたりの体積は、は、対象の特徴（たとえば、大きさ、重量、年齢、性別など）、使用する疎水性担体の種類、及び他の要因に応じて変動し得る。当業者は、必要以上の実験を行わずに適切な体積を決定できるであろう。一実施形態では、用量体積は約０．０１〜１ｍｌ／用量となる。特定の実施形態では、用量体積は約５０μｌであり得る。たとえばヒト対象のためなどの特定の実施形態では、用量体積は約２５０μｌであり得る。そのような実施形態では、疎水性担体は、たとえばモンタニドＩＳＡ５１ ＶＧであり得る。
[00160]（ｉｉｉ）デポー非形成ワクチン
[00161]「デポー非形成ワクチン」とは、対象に投与した際、ワクチン及びその構成成分（たとえば、抗原、ヘルパーＴエピトープ、アジュバントなど）が対象の身体内で迅速に分散され、「デポー効果」が得られない又は持続されないことを意味する。デポー非形成ワクチンでは、抗原又は抗原と１つ若しくは複数の他のワクチン構成成分は、デポー形成ワクチンの対応する構成成分よりも実質的に素早く、注射部位からクリアランスされる。したがって、デポー非形成ワクチンは、事前にプライミングした免疫系を抗原及び他のワクチン構成成分に迅速に再曝露させ、その後、その部位で有害な反応が生じることができる前に注射部位から消散する。一実施形態では、デポー非形成ワクチンの抗原又は抗原と１つ若しくは複数の他のワクチン構成成分の５０％より多く、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％が、約３時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、３６時間、又は４８時間で注射部位からクリアランスされている。
[00162]デポー非形成ワクチンは、デポー形成ワクチンと同じ抗原決定基（すなわち抗原又はエピトープ）を共有し、注射部位でデポー効果をもたらさない、任意のワクチン組成物であり得る。この観点から、ワクチン構成成分は、任意の数の既知の薬学的に許容される担体中で配合し得る。一般的には、担体は、ワクチン接種した対象の水性環境（たとえば、体液、組織など）と混和性である。
[00163]本明細書中で使用する用語「薬学的に許容される担体」とは、組成物の他の成分と適合性があり、そのレシピエントに対して有害（たとえば毒性）でないという意味で「許容される」担体をいう。典型的には、薬学的に許容される担体は、活性成分の免疫調節活性と干渉しない媒体である。
[00164]デポー非形成ワクチンにおいて使用し得る薬学的に許容される担体の一部の例には、決してそれだけには限定されないが、たとえば、水、水中油乳濁液、リン酸緩衝生理食塩水、グリセロール、エタノール、リンゲル液、デキストロース溶液、血清含有溶液、ハンクス液、及び他の水性の生理的にバランスのとれた溶液が含まれる。たとえばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、２０００、Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ Ｒ編、ペンシルベニア州Ｅａｔｏｎ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．を参照されたい。
[00165]一実施形態では、デポー非形成ワクチンは、ワクチン構成成分を水又はＰＢＳなどの水性担体中で配合することによって調製し得る。デポー非形成ワクチンが対象（水性環境）内に導入された際、水性担体中に懸濁させた抗原粒子及び他のワクチン構成成分は、対象の身体内で迅速に分散される。これは、ワクチンの水性担体が対象の身体内の水性環境（たとえば、体液、組織など）と混和性であるためである。このことは、ワクチン構成要素（たとえば抗原）の、流入領域リンパ節への素早い輸送及び迅速な蓄積を可能にする。
[00166]一実施形態では、デポー非形成ワクチンの担体は水である。
[00167]本明細書中に記載のデポー非形成ワクチンの用量あたりの体積は、対象の特徴（たとえば、大きさ、重量、年齢、性別など）、使用する担体の種類、及び他の要因に応じて変動し得る。当業者は、必要以上の実験を行わずに適切な体積を決定できるであろう。一実施形態では、用量体積は約０．０１〜１ｍｌ／用量となる。特定の実施形態では、用量体積は約５０μｌであり得る。たとえばヒト対象のためなどの特定の実施形態では、用量体積は約５００μｌであり得る。そのような実施形態では、担体は滅菌水であり得る。
[00168]本明細書中に記載のワクチン組成物（デポー及びデポー非形成）は、当分野で知られている任意の手段によって投与し得る。一実施形態では、ワクチン組成物を皮下注射によって投与する。
[00169]抗原
[00170]デポー形成及びデポー非形成ワクチンをどちらも含めた本明細書中に開示するワクチン組成物は、１つ又は複数の抗原を含み得る。
[00171]本明細書中で使用する用語「抗原」とは、免疫系の構成成分と特異的に結合することができる任意の物質又は分子をいう。一部の実施形態では、本明細書中の組成物の適切な抗原は、対象において免疫応答を誘導する又は生じることができるものである。免疫応答を誘導することができる抗原は免疫原性であると言われ、免疫原とも呼ばれ得る。したがって、本明細書中で使用する用語「抗原」には免疫原が含まれ、これらの用語は、別段に具体的に記述した場合以外は互換性があるように使用され得る。また、本明細書中で使用する用語抗原にはハプテンも含まれる。当分野で理解されるように、ハプテンとは、抗原性である（たとえば、免疫系の構成成分によって結合されることができる）が、免疫原性を供給する何かしらの担体分子と付着していたい限りは免疫原性でない、小分子である。
[00172]本発明の組成物において有用であり得る抗原には、たとえば、それだけに限定されないが、ポリペプチド、炭水化物、微生物又はその一部、たとえば、生きた、弱毒化した、不活性化した、若しくは死滅した細菌、ウイルス、若しくは原虫、又はその一部が含まれる。抗原は、たとえば、病原性生物剤、毒素、アレルゲン、ペプチド、適切なネイティブ、非ネイティブ、組換え、若しくは変性タンパク質若しくはポリペプチド、又はその断片、或いは対象において免疫応答を誘導又は強化することができるエピトープであり得る。一部の実施形態では、抗原は、たとえばヒト（ヒト抗原）などの動物（動物抗原）に由来するもの、又はそれに実質的に関連している抗原であり得る。
[00173]本明細書中で使用する用語「由来する」には、それだけに限定されないが、元の供給源（たとえば対象）から単離された若しくは直接得られた抗原、元の供給源からの抗原と同一である若しくはそれに実質的に関連する、合成若しくは組換えにより生成した抗原、又は元の供給源の抗原若しくはその断片から作製した抗原が包含される。この文脈として用語「実質的に関連する」とは、抗原は化学的、物理的、又は他の手段（たとえば配列修飾）によって改変されていてもよいが、生じる産物は依然として元の抗原又は元の抗原に関連する疾患若しくは障害に対して免疫応答を生じることができることを意味する。
[00174]また、本明細書中で使用する用語「抗原」には、抗原として機能するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドも含まれる。核酸に基づくワクチン接種戦略が知られており、ここではポリヌクレオチドを含有するワクチン組成物を対象に投与する。ワクチン組成物自体がポリペプチドを含有していたかのように、抗原ポリペプチドが最終的に対象内に存在するように、ポリヌクレオチドによってコードされている抗原ポリペプチドが対象内で発現される。本開示の目的のために、内容が指定する場合、用語「抗原」には、抗原として機能するポリペプチドをコードしている、そのようなポリヌクレオチドが包含される。
[00175]一部の実施形態では、抗原は、以下に定義する少なくとも１つのＢ細胞エピトープ又はＣＴＬエピトープを含んでおり、対象に適切に投与した場合に、疾患に対して保護的である液性及び／又は細胞性免疫応答を誘導又は強化する分子である。
[00176]一部の実施形態では、抗原は、癌、感染性疾患、又は嗜癖疾患に関連するものであり得る。
[00177]本明細書中の組成物において抗原として有用であり得るウイルス又はその一部には、たとえば、それだけに限定されないが、牛痘ウイルス、ワクシニアウイルス、偽牛痘ウイルス、ヘルペスウイルス、ヒトヘルペスウイルス１、ヒトヘルペスウイルス２、サイトメガロウイルス、ヒトアデノウイルスＡ〜Ｆ、ポリオーマウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、パルボウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、オルトレオウイルス、ロタウイルス、エボラウイルス、パラインフルエンザウイルス、インフルエンザウイルス（たとえば、Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルス、インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルス、インフルエンザＣ型ウイルス）、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、風疹ウイルス、ニューモウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ヒト呼吸器合胞体ウイルス、狂犬病ウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、ハンタンウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、コロナウイルス、エンテロウイルス、ライノウイルス、ポリオウイルス、ノロウイルス、フラビウイルス、デングウイルス、西ナイルウイルス、黄熱ウイルス、ジカウイルス及び水痘が含まれる。
[00178]一実施形態では、本明細書中に開示する組成物は、それを必要としている対象においてインフルエンザウイルス感染症を治療及び／又は予防するために潜在的に有用であり得る抗原を含む。インフルエンザはオルトミクスウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）の一本鎖ＲＮＡウイルスであり、多くの場合、ウイルス粒子の外側の２つ大きな糖タンパク質、赤血球凝集素（ＨＡ）、及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）に基づいて特徴づけられる。インフルエンザＡ型の数々のＨＡ亜型が同定されている（Ｋａｗａｏｋａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９０）、１７９：７５９〜７６７、Ｗｅｂｓｔｅｒら、「Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ａｍｏｎｇ ｔｙｐｅ Ａ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｅｓ」、ページ１２７〜１６８、Ｐ．Ｐａｌｅｓｅ及びＤ．Ｗ．Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ（編）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｅｓ．、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。一部の実施形態では、抗原はＨＡ又はＮＡ糖タンパク質に由来し得る。
[00179]別の実施形態では、本明細書中に開示する組成物は、それを必要としている対象においてエボラウイルス感染症を治療及び／又は予防するために潜在的に有用であり得る抗原を含む。
[00180]別の実施形態では、本明細書中に開示する組成物は、それを必要としている対象においてヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染症を治療及び／又は予防するために潜在的に有用であり得る抗原を含む。より詳細な実施形態では、本明細書中に開示する組成物は、ＨＰＶ関連子宮頸癌又はＨＰＶ関連頭頸部癌を治療及び／又は予防するために潜在的に有用であり得る抗原を含む。一部の実施形態では、抗原は配列ＲＡＨＹＮＩＶＴＦを含むペプチドである（ＨＰＶ１６Ｅ７（Ｈ−２Ｄｂ）ペプチド４９−５７、Ｒ９Ｆ、配列番号３）。
[00181]別の実施形態では、本明細書中に開示する組成物は、それを必要としている対象において呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染症を治療及び／又は予防するために潜在的に有用であり得る抗原を含む。より詳細な実施形態では、本明細書中に開示する組成物は、ＲＳＶ感染症に関連する肺疾患を治療及び／又は予防するために潜在的に有用であり得る抗原を含む。一部の実施形態では、抗原は、たとえば国際公開第２０１２／０６５９９７号に開示されているように、小さな疎水性タンパク質の外部ドメインに由来する。
[00182]本明細書中の組成物において抗原として有用であり得る細菌又はその一部には、たとえば、それだけに限定されないが、炭疽菌（バチルス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ））、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、肺炎クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、オウム病クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）、コレラ、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ジフテリア、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｏ１５７：Ｈ７、腸管出血性大腸菌、腸内毒素原性大腸菌、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、髄膜炎菌、肺炎マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、百日咳、肺炎、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、及びエンテロコリチカ菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）が含まれる。
[00183]一実施形態では、本明細書中に開示する組成物は、それを必要としている対象においてバチルス・アントラシス感染症（すなわち炭疽病）を治療及び／又は予防するために潜在的に有用であり得る抗原を含む。それだけに限定されないが、ワクチンに含有される抗原は、たとえば、炭疽菌組換え保護抗原（ｒＰＡ）（Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州Ｃａｍｐｂｅｌｌ）又は炭疽菌突然変異体組換え保護抗原（ｍｒＰＡ）（Ｐｆｅｎｅｘ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）であり得る。
[00184]本明細書中の組成物において抗原として有用であり得る原虫又はその一部には、たとえば、それだけに限定されないが、マラリアを引き起こすプラスモジウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）（熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ）、又は二日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｋｎｏｗｌｅｓｉ））が含まれる。
[00185]一実施形態では、本明細書中に開示する組成物は、それを必要としている対象において四日熱マラリア原虫感染症（すなわちマラリア）を治療及び／又は予防するために潜在的に有用であり得る抗原を含む。
[00186]或いは、抗原は、天然に存在する又は合成の毒素又はアレルゲンであり得る。本明細書中で使用する「毒素」とは、疾患若しくは病気を引き起こすことができる、生細胞若しくは生物（たとえば、植物、動物、微生物など）によって産生された任意の物質、又は感染性物質、又は有害作用が可能な組換え若しくは合成分子をいう。毒素は、たとえば、小分子、ペプチド、又はタンパク質であり得る。毒素には、たとえばコカインなどの薬物が含まれる。毒素は抗体によって中和されることができ得る。そのような実施形態では、抗原は、（たとえば血液中で）循環中の毒素と結合してそれを捕捉する抗体の産生を誘発し、それによって、体内の別の領域（たとえば脳）へのその送達を潜在的に防止し得る。
[00187]本明細書中で使用する「アレルゲン」とは、アレルギーを引き起こすことができる任意の物質をいう。アレルゲンは、それだけに限定されないが、細胞、細胞抽出物、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖、複合多糖、多糖及び他の分子のペプチド及び非ペプチド模倣体、小分子、脂質、糖脂質、並びに、植物、動物、真菌、昆虫、食品、薬物、粉塵、及びダニの炭水化物に由来し得る。アレルゲンには、それだけに限定されないが、環境的空中アレルゲン、植物花粉（たとえばブタクサ／枯草熱）、雑草花粉アレルゲン、草花粉アレルゲン、セイバンモロコシ、樹木花粉アレルゲン、ライグラス、クモ類アレルゲン（たとえばハウスダストダニアレルゲン）、貯蔵庫ダニアレルゲン、スギ花粉／枯草熱、カビ／真菌胞子アレルゲン、動物アレルゲン（たとえば、イヌ、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ラット、マウスなどのアレルゲン）、食物アレルゲン（たとえば、甲殻類、ナッツ、柑橘果実、小麦粉、コーヒー）、昆虫アレルゲン（たとえば、ノミ、ゴキブリ）、毒液（ハチ目（Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ）、スズメバチ（ｙｅｌｌｏｗ ｊａｃｋｅｔ）、ミツバチ、ワスプ（ｗａｓｐ）、ホーネット（ｈｏｒｎｅｔ）、フシアリ（ｆｉｒｅ ａｎｔ））、細菌アレルゲン（たとえば、連鎖球菌抗原、回虫族（Ａｓｃａｒｉｓ）抗原などの寄生生物アレルゲン）、ウイルス抗原、薬物アレルゲン（たとえばペニシリン）、ホルモン（たとえばインスリン）、酵素（たとえばストレプトキナーゼ）、並びに不完全抗原又はハプテンとして作用することができる薬物又は化学薬品（たとえば、酸無水物及びイソシアネート類）が含まれる。
[00188]ハプテンを本発明の組成物中で使用する場合、これをたとえばタンパク質などの担体と付着させて、ハプテン−担体付加物を形成させ得る。ハプテン−担体付加物は免疫応答を誘発することが可能である一方で、ハプテン自体は典型的には応答を誘発しない。ハプテンの非限定的な例は、アニリン、ウルシオール（ツタウルシの毒素）、ヒドララジン、フルオレセイン、ビオチン、ジゴキシゲニン、及びジニトロフェノールである。
[00189]別の実施形態では、たとえばアミロイドタンパク質などの循環中の抗原を捕捉することが望ましい場合（たとえばアルツハイマー病）、抗原は疾患に関連する抗原であり得る。したがって、一部の実施形態では、本発明の組成物は、神経変性疾患が抗原の発現に関連している場合、それを必要としている対象において神経変性疾患の治療及び／又は予防において潜在的に有用であり得る抗原を含む。
[00190]別の実施形態では、抗原は、たとえば国際公開第２００７／０４１８３２号の頁１７〜１９の表１に開示されているペプチド抗原などの、国際公開第２００７／０４１８３２号に開示されている抗原の任意の１つ又は複数であり得る。
[00191]たとえば、それだけに限定されないが、本明細書中の組成物において抗原として有用であり得るポリペプチド又はその断片には、コレラトキソイド、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、Ｂ型肝炎表面抗原、赤血球凝集素（たとえばＨ５Ｎ１組換え赤血球凝集素タンパク質）、炭疽菌組換え保護抗原（Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州Ｃａｍｐｂｅｌｌ）、炭疽菌突然変異体組換え保護抗原（Ｐｆｅｎｅｘ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）、ノイラミニダーゼ、インフルエンザＭタンパク質、ＰｆＨＲＰ２、ｐＬＤＨ、アルドラーゼ、ＭＳＰ１、ＭＳＰ２、ＡＭＡ１、Ｄｅｒ−ｐ−１、Ｄｅｒ−ｆ−１、アディポフィリン、ＡＦＰ、ＡＩＭ−２、ＡＲＴ−４、ＢＡＧＥ、α−フェトプロテイン、ＢＣＬ−２、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、ＢＩＮＧ−４、ＣＥＡ、ＣＰＳＦ、ＣＴ、サイクリンＤ１Ｅｐ−ＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥＬＦ−２、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧＮＲＨ）、ＨＥＲ−２、腸管カルボキシルエステラーゼ（ｉＣＥ）、ＩＬ１３Ｒα２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＲＴ−２、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＤＭ−２、ＭＭＰ−２、ＭＵＣ−１、ＮＹ−ＥＯＳ−１、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、百日咳トキソイドタンパク質、ｐ５３、ＰＢＦ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＲＡＧＥ−１、ＲＮＦ４３、ＲＵ１、ＲＵ２ＡＳ、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−２、ＳＡＲＴ−３、ＳＡＧＥ−１、ＳＣＲＮ １、ＳＯＸ２、ＳＯＸ１０、ＳＴＥＡＰ１、サバイビン、テロメラーゼ、ＴＧＦβＲＩＩ、ＴＲＡＧ−３、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＴＥＲＴ、及びＷＴ１に由来するものが含まれる。
[00192]用語「ポリペプチド」には、長さ（たとえば、少なくとも６、８、１０、１２、１４、１６、１８、若しくは２０個のアミノ酸）又は翻訳後修飾（たとえば、グリコシル化若しくはリン酸化）にかかわらず、任意のアミノ酸の鎖が包含され、たとえば、天然タンパク質、合成又は組換えのポリペプチド及びペプチド、エピトープ、ハイブリッド分子、変異体、相同体、類似体、ペプトイド、ペプチド模倣体などが含まれる。したがって、変異体又は誘導体には、切断及び断片を含めた欠失、挿入及び付加、たとえば保存的置換、部位特異的突然変異体及び対立遺伝子変異体、並びに、１つ又は複数の非アミノアシル基（たとえば、糖、脂質など）がペプチドと共有結合したペプトイド及び翻訳後修飾を含めた修飾体が含まれる。本明細書中で使用する用語「保存的アミノ酸置換」又は「保存的置換」とは、関連する機能の実質的な損失なしに置換を行うことができる、ペプチドの所定の位置における１つのアミノ酸による別のアミノ酸の置換をいう。そのような変化を行う場合、同様のアミノ酸残基の置換は、側鎖置換基の相対的類似度、たとえば、その大きさ、荷電、疎水性、親水性などに基づいて行うことができ、そのような置換は、ルーチン的な試験によってペプチドの機能に対するその効果についてアッセイし得る。保存的置換の具体的且つ非限定的な例には以下の例が含まれる。
Figure 0006851983
[00193]抗原配列に対して実質的な同一性を有するポリペプチド又はペプチドを使用し得る。２つの配列は、最適にアラインメントした際に（ギャップを許容）、それらが少なくとも約５０％の配列同一性を共有する場合、又は配列が定義された機能的モチーフを共有する場合に、実質的な同一性を有すると考えられる。代替実施形態では、最適にアラインメントした配列は、それらが指定した領域にわたって少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する場合に、実質的に同一である（すなわち実質的な同一性を有する）と考えられる。用語「同一性」とは、２つのポリペプチド分子間の配列類似度をいう。同一性は、アラインメントした配列中のそれぞれの位置を比較することによって決定することができる。アミノ酸配列間の同一性の度合は、たとえば指定した領域にわたって、配列によって共有される位置での同一又は一致するアミノ酸の数の関数である。同一性を比較するための配列の最適なアラインメントは、ｈｔｔｐ：／／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐで利用可能なＣｌｕｓｔａｌＷプログラム、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ、１９８１、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ、２：４８２の局所的相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、１９７０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：２４４４の類似度検索方法、並びにこれらのアルゴリズムのコンピュータ実施（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓソフトウェアパッケージ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、米国ウィスコンシン州ＭａｄｉｓｏｎのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡなど）を含めた、当分野で知られている様々なアルゴリズムを使用して実施し得る。また、配列同一性は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３〜１０に記載のＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用しても決定し得る（公開されている初期設定を使用）。たとえば、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）から利用可能な「ＢＬＡＳＴ２配列」ツール（インターネットよりｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｗｂｌａｓｔ２．ｃｇｉ）を、「ｂｌａｓｔｐ」プログラムを以下の初期設定で選択して使用し得る：予想閾値１０、ワードサイズ３、マトリックスＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップコスト存在１１、伸長１。別の実施形態では、当業者は、任意の所定の配列を容易且つ正しくアラインメントし、単なる目視検査で配列同一性及び／又は相同性を推定することができる。
[00194]本発明を実施するために使用するポリペプチド及びペプチドは、天然源から単離する、合成である、又は組換え生成したポリペプチドであることができる。ペプチド及びタンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで組換えによって発現させることができる。本発明を実施するために使用するペプチド及びポリペプチドは、当分野で知られている任意の方法を使用して作製及び単離することができる。また、本発明を実施するために使用するポリペプチド及びペプチドは、当分野で周知の化学方法を使用して全体的に又は部分的に合成することもできる。たとえば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ（１９８０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．、２１５〜２２３、Ｈｏｍ（１９８０）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．、２２５〜２３２、Ｂａｎｇａ，Ａ．Ｋ、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（１９９５）、Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、ペンシルベニア州Ｌａｎｃａｓｔｅｒを参照されたい。たとえば、ペプチド合成は様々な固相技法を使用して行うことができ（たとえばＲｏｂｅｒｇｅ（１９９５）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６９：２０２、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９９７）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２８９：３〜１３を参照）、自動合成は、たとえば、ＡＢＩ４３１Ａペプチド合成機（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、製造者によって提供される指示に従って達成し得る。
[00195]一部の実施形態では、抗原は、精製した抗原、たとえば、約２５％〜５０％純粋、約５０％〜約７５％純粋、約７５％〜約８５％純粋、約８５％〜約９０％純粋、約９０％〜約９５％純粋、約９５％〜約９８％純粋、約９８％〜約９９％純粋、又は９９％より高く純粋であり得る。
[00196]上述のように、用語「抗原」には、抗原として機能するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドも含まれる。本明細書中で使用する用語「ポリヌクレオチド」には、任意の長さ（たとえば、９、１２、１８、２４、３０、６０、１５０、３００、６００、１５００個、若しくはそれより多くのヌクレオチド）又は鎖の数（たとえば一本鎖若しくは二本鎖）のヌクレオチドの鎖が包含される。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ（たとえば、ゲノムＤＮＡ若しくはｃＤＮＡ）又はＲＮＡ（たとえばｍＲＮＡ）或いはその組合せであり得る。これらは天然に存在する又は合成（たとえば化学合成）であり得る。ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド鎖中の１つ若しくは複数の窒素塩基、五炭糖、又はリン酸基の修飾を含有し得ることが企図される。そのような修飾は当分野で周知であり、たとえば、ポリヌクレオチドの安定性を改善する目的のものであり得る。
[00197]ポリヌクレオチドは様々な形態で送達し得る。一部の実施形態では、裸のポリヌクレオチドを、直線形態で、又は発現プラスミドなどのプラスミド内に挿入して使用し得る。他の実施形態では、ウイルス又は細菌ベクターなどの生きたベクターを使用し得る。
[00198]ＤＮＡのＲＮＡへの転写及び／又はＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を助ける１つ又は複数の調節配列が存在し得る。一部の例、たとえば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子であるポリヌクレオチドの場合では、転写プロセスに関連する調節配列（たとえばプロモーター）は必要なく、タンパク質発現はプロモーターの非存在下で達成され得る。当業者は、状況の必要性に応じて適切な調節配列を含めることができる。
[00199]一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは発現カセット中に存在し、発現カセット中で、ポリヌクレオチドは、本発明の組成物を投与する対象内でポリヌクレオチドが発現されることを許可する調節配列と作動可能に連結している。発現カセットの選択は、組成物を投与する対象及び発現されたポリペプチドに望ましい特長に依存する。
[00200]典型的には、発現カセットには、対象内で機能的であり、構成的又は誘導性であることができるプロモーターと、リボソーム結合部位と、必要な場合は開始コドン（ＡＴＧ）と、目的のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドと、ストップコドンと、任意選択で３’末端領域（翻訳及び／又は転写ターミネーター）とが含まれる。シグナルペプチドをコードしている領域などの付加配列が含まれ得る。目的のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、発現カセット中の他の調節配列のいずれかと相同的又は非相同的であり得る。シグナルペプチドをコードしている領域などの、目的のポリペプチドと一緒に発現させる配列は、典型的には発現させるタンパク質をコードしているポリヌクレオチドに隣接した位置にあり、正しい読み枠で配置されている。発現させるタンパク質単独、又は発現させる任意の他の配列（たとえばシグナルペプチド）を一緒にコードしているポリヌクレオチドによって構成されるオープンリーディングフレームは、転写及び翻訳が組成物を投与する対象において起こるように、プロモーターの制御下に置かれる。
[00201]一部の実施形態では、本明細書中に開示するワクチン組成物は免疫原性の弱い抗原を含む。本明細書中で使用する「免疫原性の弱い」とは、慣用のワクチン（たとえば水性ワクチン）中では、又は慣習的な方法で投与した場合、抗原が免疫応答を誘導、維持及び／又はブーストする能力がわずかである又は能力がないことを意味する。
[00202]たとえば、一実施形態では、免疫原性の弱い抗原とは、水性ワクチンなどのデポー非形成ワクチン中で配合した場合に、免疫応答を十分にプライミングことができないものである。これは、同じ抗原を本明細書中に開示の匹敵するデポー形成ワクチン中で配合した場合（すなわち、疎水性担体中で配合する以外は同じ構成成分を有する場合）と対照的であり、その場合、抗原は、今度は免疫応答を十分にプライミングすることができる。先行の文脈中、「免疫応答を十分にプライミングする」とは、抗原が必要な程度まで免疫応答を誘導することができ、続いてデポー非形成ワクチンによって維持及び／又はブーストすることができることを意味する。
[00203]一実施形態では、免疫原性の弱い抗原とは、デポー非形成ワクチン中での１回目の対象への曝露の際、免疫応答を誘導しない、又は、酵素結合イムノスポット（Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ）アッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴ）によって評価して、デポー形成ワクチン中での１回目の対象への曝露の際に誘導される免疫応答と比較して、有効性が少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、若しくは５０倍少ない免疫応答を誘導するものである。一実施形態では、デポー非形成ワクチンによって誘導された免疫応答は、ＥＬＩＳＰＯＴによって評価して、デポー形成ワクチンによって誘導されたものよりも有効性が少なくとも１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、又は５０倍低い。
[00204]一実施形態では、免疫原性の弱い抗原とは、デポー形成ワクチン中の同じ抗原を用いた事前のプライミングなしで、デポー非形成ワクチン中で投与した場合に、対象に測定可能な治療上の利点をもたらすことができないものであるが、測定可能な治療上の利点は、抗原を本明細書中に記載の方法に従って投与した場合に達成することができる。一実施形態では、測定可能な治療上の利点は、たとえば、腫瘍の大きさの縮小又は癌生存予後診断の増加であり得る。一実施形態では、測定可能な治療上の利点は、少なくとも２５％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％の腫瘍の大きさの縮小である。
[00205]それだけには限定されないが、免疫原性の弱い抗原には、たとえば、精製及び合成抗原（たとえばペプチド）、自己抗原、並びに／又は癌関連抗原が含まれ得る。
[00206]当分野で周知のように、自己抗原とは、対象の身体内に由来する抗原である。免疫系は、たとえば胸腺中のＴ細胞の陰性選択が原因で、通常は、正常な恒常性条件下では自己抗原に対して非反応性である。したがって、これらの種類の抗原は、標的化免疫療法の開発において困難をもたらす。同様に、弱い抗原性が、免疫系が典型的には腫瘍成長の制御に失敗することの根本的原因であることが推論されている。多くの癌抗原は弱い、したがって遅い免疫応答しか刺激せず、これにより、腫瘍細胞が免疫回避機構を発生し、最終的には優位となるための機会及び時間が与えられる。
[00207]これらの理由のため、とりわけ、免疫原性の弱い抗原が、抗原に対する免疫応答を強化する能力を有する本明細書中に開示する方法において使用するための特に適切な種類の抗原を表し得る。本明細書中に開示のデポー形成ワクチン（たとえば水を含まない、油ベースのワクチン）を用いてこれらの抗原に対する免疫応答をプライミングすることによって、続いてこれらの抗原をデポー非形成ワクチン（たとえば水性ワクチン）中で投与することが、その抗原に対する免疫応答の維持及び／又はブーストにおいてより有効となり得る。
[00208]実施形態では、本明細書中に開示するワクチン組成物は自己抗原である抗原を含む。実施形態では、本明細書中に開示するワクチン組成物は癌関連抗原である抗原を含む。一部の実施形態では、これらの抗原は免疫原性の弱い抗原である。
[00209]本明細書中に記載の組成物を用いた単一治療において使用する抗原の量は、抗原の種類及び対象の特徴（たとえば、大きさ、重量、年齢、性別など）に応じて変動し得る。当業者は、必要以上の実験を行わずに、特定の応用において使用するための抗原の有効量を決定できるであろう。本明細書中で使用する用語「有効量」とは、必要な用量及び期間で所望の結果を達成するために有効な量を意味する。
[00210]一実施形態では、単一用量の本明細書中に記載の組成物中で使用する抗原の量は０．００１〜５ｍｇ／単位用量の組成物であり得る。特定の実施形態では、抗原の量は約０．２５０ｍｇ／単位用量の組成物となる。特定の実施形態では、抗原の量は約１ｍｇ／ｍＬの組成物となる。
[00211]癌関連抗原
[00212]一部の実施形態では、抗原は、癌若しくは腫瘍関連タンパク質又はその断片であり得る。たとえば、それだけには限定されないが、国際公開第２００７／０４１８３２号に開示されているものなど、多くの癌又は腫瘍関連タンパク質が当分野で知られている。
[00213]一部の実施形態では、癌はウイルスなどの病原体によって引き起こされ得る。癌の発生に関連づけられているウイルスは当業者に知られており、それだけに限定されないが、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ジョン・カニンガムウイルス（ＪＣＶ）、ヒトヘルペスウイルス８、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、メルケル細胞ポリオーマウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、及びヒトＴ細胞白血病ウイルス−１が含まれる。したがって、一実施形態では、本明細書中に開示する組成物は、癌の発生に関連づけられているウイルスに関連する抗原を含み得る。
[00214]一部の実施形態では、抗原は、標的化された腫瘍細胞上の特異的コンホメーションを有効に認識し、その破壊を引き起こすことができる特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）免疫応答を誘導することができる、任意の１つであり得る。
[00215]さらなる実施形態では、抗原は以下の表から選択されるペプチド配列を含み得る。
[00216]
Figure 0006851983
Figure 0006851983
[00217]特定の実施形態では、本発明のワクチン組成物はＨＰＶに由来する抗原を含み得る。一実施形態では、抗原はＨＰＶのＥ６、Ｅ７、Ｌ１、又はＬ２タンパク質に由来し得る。
[00218]一実施形態では、ＨＰＶのＥ６タンパク質の抗原は、ペプチド配列ＴＩＨＤＩＩＬＥＣＶ（Ｔ１０Ｖ、配列番号４３）を含む。別の実施形態では、ＨＰＶのＥ７タンパク質の抗原は、ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（Ｒ９Ｆ、配列番号３）、ＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴ（Ｙ１０Ｔ、配列番号４４）、ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ（Ｙ９Ｔ、配列番号４５、ＬＬＭＧＴＬＧＩＶ（Ｌ９Ｖ、配列番号４６）、又はＴＬＧＩＶＣＰＩ（Ｔ８Ｉ、配列番号４７）のペプチド配列を含む。
[00219]他の実施形態では、ＨＰＶに由来する抗原は、国際公開第１９９３／０２２３３８号、国際公開第２００２／０７０００６号、国際公開第２００６／１１５４１３号、国際公開第２００８／１４７１８７号、国際公開第２００９／００２１５９号、又は国際公開第２０１０／１２３３６５号に開示されているＨＰＶ抗原のうちの１つ又は複数であり得る。
[00220]別の実施形態では、抗原は、たとえば黒色腫関連タンパク質などの腫瘍関連タンパク質に由来し得る。さらなる実施形態では、黒色腫関連タンパク質はチロシン関連タンパク質−２（ＴＲＰ−２）又はｐ５３である。一実施形態では、ＴＲＰ−２タンパク質に由来する抗原はペプチド配列ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ（Ｓ９Ｌ、配列番号３９）を含む。別の実施形態では、ＴＲＰ−２タンパク質に由来する抗原はペプチド配列ＶＹＤＦＦＶＷＬ（Ｖ８Ｌ、配列番号４８）を含む。別の実施形態では、ｐ５３タンパク質に由来する抗原は、ＫＹＭＣＮＳＳＣＭ（Ｋ９Ｍ、野生型ｐ５３、配列番号４９）、ＫＹＩＣＮＳＳＣＭ（ｍＫ９Ｍ、改変ｐ５３、配列番号５０）、及びＡＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡＫＹＩＣＮＳＳＣＭ（ｍＫ９Ｍ、配列番号５１）から選択されるペプチド配列を含み、式中、Ｘはシクロヘキシルアラニルであり得る。
[00221]一実施形態では、ワクチン組成物中に含有される抗原は、本明細書中に記載の抗原のうちの１つ又は複数の混合物を含んでいてもよく、これらは、抗原間にスペーサー配列を有する又は有さない融合タンパク質として任意選択で一緒に融合されている。
[00222]他の実施形態では、それだけには限定されないが、抗原は膜表面結合癌関連タンパク質からのものであり得る。表面結合癌関連タンパク質（又はその抗原）は、抗体によって認識されることができる。
[00223]特定の実施形態では、本発明のワクチン組成物は、１つ又は複数のサバイビン抗原を含み得る。
[00224]アポトーシス反復含有５のバキュロウイルス阻害剤（ＢＩＲＣ５）とも呼ばれるサバイビンは、アポトーシスの負の調節に関与しているタンパク質である。これは、アポトーシスタンパク質阻害剤（ＩＡＰ）のファミリーのメンバーとして分類されている。サバイビンは、単一のＢＩＲモチーフとＲＩＮＧフィンガーの代わりに高い荷電のカルボキシ末端コイル領域とを含有する、１６．５ｋＤａの細胞質タンパク質である。サバイビンをコードしている遺伝子は、エフェクター細胞プロテアーゼ受容体−１（ＥＰＲ−１）の配列とほぼ同一であるが、反対方向に配向されている。サバイビンのコード配列（ヒト（ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ））の長さは、ストップコドンを含めて４２９個のヌクレオチドである。
atgggtgccc cgacgttgcc ccctgcctgg cagccctttctcaaggacca ccgcatctct 60
acattcaaga actggccctt cttggagggc tgcgcctgcaccccggagcg gatggccgag 120
gctggcttca tccactgccc cactgagaac gagccagacttggcccagtg tttcttctgc 180
ttcaaggagc tggaaggctg ggagccagat gacgaccccatagaggaaca taaaaagcat 240
tcgtccggtt gcgctttcct ttctgtcaag aagcagtttgaagaattaac ccttggtgaa 300
tttttgaaac tggacagaga aagagccaag aacaaaattgcaaaggaaac caacaataag 360
aagaaagaat ttgaggaaac tgcgaagaaa gtgcgccgtgccatcgagca gctggctgcc 420
atggattga 429
配列番号52
[00225]コードされているタンパク質サバイビン（ヒト）の長さは１４２個のアミノ酸である。
Met Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp GlnPro Phe Leu Lys Asp
1 5 10 15
His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro PheLeu Glu Gly Cys Ala
20 25 30
Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly PheIle His Cys Pro Thr
35 40 45
Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe PheCys Phe Lys Glu Leu
50 55 60
Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Ile GluGlu His Lys Lys His
65 70 75 80
Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val Lys LysGln Phe Glu Glu Leu
85 90 95
Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg GluArg Ala Lys Asn Lys
100 105 110
Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys Lys Lys GluPhe Glu Glu Thr Ala
115 120 125
Lys Lys Val Arg Arg Ala Ile Glu Gln Leu AlaAla Met Asp
130 135 140
配列番号53
[00226]サバイビンタンパク質はカスパーゼ活性化を阻害するように機能し、それによってアポトーシス又はプログラム細胞死の負の調節がもたらされることが想定されている。この機能と一貫して、サバイビンは、多くの種類の癌において決まって上方調節されているが、正常組織中ではされていないトップクラスの遺伝子の１つとして同定されている（たとえば、Ａｌｔｉｅｒｉら、Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ、７９：１３２７〜１３３３、１９９９及び米国特許第６，２４５，５２３号を参照）。したがって、この事実により癌細胞が標的とされる一方で正常細胞は標的とされないため、サバイビンが癌治療の理想的な標的となる。実際、サバイビンはヒト癌の大部分を含めた多くの腫瘍の種類で高度に発現されており、予後的価値が報告されている。
[00227]一部の実施形態では、本発明のワクチンは１つ又は複数のサバイビン抗原を含み得る。本明細書中で使用する用語「サバイビン抗原」には、サバイビンタンパク質又はその断片に由来する任意のペプチド、ポリペプチド、又はその変異体（たとえばサバイビンペプチド変異体）が包含される。また、用語「サバイビン抗原」には、本明細書中に記載のサバイビンペプチド、サバイビンペプチド変異体、又はサバイビンペプチド機能的等価物をコードしているポリヌクレオチドも包含される。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ（たとえば、ゲノムＤＮＡ若しくはｃＤＮＡ）又はＲＮＡ（たとえばｍＲＮＡ）或いはその組合せであり得る。これらは天然に存在する又は合成（たとえば化学合成）であり得る。ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド鎖中の１つ若しくは複数の窒素塩基、五炭糖、又はリン酸基の修飾を含有し得ることが企図される。そのような修飾は当分野で周知であり、たとえば、ポリヌクレオチドの安定性を改善する目的のものであり得る。
[00228]一実施形態では、サバイビン抗原は、完全長サバイビンポリペプチド又は完全長サバイビンポリペプチドをコードしている核酸を含み得る。或いは、サバイビン抗原は、サバイビンタンパク質の任意の長さの断片を含むサバイビンペプチドであり得る。例示的な実施形態には、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個のアミノ酸残基を含むサバイビンペプチドが含まれる。具体的な実施形態では、サバイビンペプチドは、サバイビンタンパク質（たとえば配列番号５３）のそれぞれ７、８、９、１０、１１個の連続するアミノ酸残基からなる、ヘプタペプチド、オクタペプチド、ノナペプチド、デカペプチド、又はウンデカペプチドからなる。サバイビン抗原の特定の実施形態には、約９又は１０個のアミノ酸のサバイビンペプチドが含まれる。
[00229]また、本発明のサバイビン抗原には、サバイビンペプチドの変異体及び機能的等価物も包含される。サバイビンペプチドの変異体又は機能的等価物には、１つ若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、若しくは付加、又はその任意の組合せなどの、サバイビンタンパク質の特定の配列と比較して相違を有するアミノ酸配列を示すペプチドが包含される。相違は、サバイビンタンパク質配列とサバイビンペプチド変異体又はサバイビンペプチド機能的等価物との間の同一性の低下として測定し得る。
[00230]アミノ酸配列間の同一性は当分野で周知のアルゴリズムを使用して計算し得る。サバイビンペプチド変異体又は機能的等価物は、その全長にわたって、サバイビンタンパク質のペプチド配列と少なくとも７０％同一、たとえば、サバイビンタンパク質のペプチド配列と少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、又は少なくとも９５％同一（９６％、９７％、９８％、又は９９％同一が含まれる）である場合に、本発明の「サバイビン抗原」の意味の範囲内にあると考えられる。特定の実施形態では、サバイビンペプチド変異体は、配列番号５３の連続するアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である配列を有する。
[00231]サバイビン抗原が由来することができるサバイビンタンパク質は、タンパク質が発現される任意の動物種からのサバイビンタンパク質である。特定の実施形態はヒトからのサバイビンタンパク質である（配列番号５３）。選択されたサバイビンタンパク質の配列に基づいて、サバイビン抗原は、サバイビンタンパク質又はコード核酸の任意の適切な化学処理又は酵素処理によって誘導し得る。或いは、サバイビン抗原は、当業者が精通している任意の慣用のペプチド又は核酸合成手順によって合成し得る。
[00232]サバイビン抗原（ペプチド又は核酸）は、サバイビンのネイティブ配列である配列を有し得る。或いは、サバイビン抗原は、たとえば本明細書中に記載のサバイビンペプチド変異体又は機能的等価物などのように、１つ又は複数の置換、欠失、又は付加によって改変されたペプチド又は核酸配列であり得る。ペプチドの免疫原性を増加させる、サバイビンペプチドの例示的な手順及び改変には、たとえば、ＨＬＡクラスＩ分子とのペプチド結合を増加させる、アンカー位置に導入されたアミノ酸置換を含む、国際公開第２００４／０６７０２３号に記載のものが含まれる。
[00233]一実施形態では、サバイビン抗原は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ分子と結合することができる、サバイビンタンパク質に由来する任意のペプチド又はその任意のサバイビンペプチド変異体である。これに沿って、サバイビン抗原は、対象において免疫応答を誘導又は強化することができる任意のサバイビンペプチド又はそのサバイビンペプチド変異体であり得る。
[00234]一実施形態では、サバイビン抗原は、対象において細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を誘発することができるサバイビンタンパク質（たとえば配列番号５３）からのアミノ酸配列を含むペプチド抗原、又は上記ペプチドをコードしている核酸分子である。
[00235]一実施形態では、ワクチンは、配列番号５３に記載のアミノ酸配列などのサバイビンタンパク質のアミノ酸配列に基づいて、１つ又は複数の合成サバイビンペプチド又はその変異体を含む。
[00236]サバイビンペプチド、サバイビンペプチド変異体、及びサバイビン機能的等価物、並びにその診断目的及び治療目的、特に癌における使用は、たとえば、国際公開第２００４／０６７０２３号及び国際公開第２００６／０８１８２６号に記載されている。これらの出版物中に開示されている新規ペプチドは、癌患者において細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を誘発できることが見いだされている。特に、国際公開第２００４／０６７０２３号では、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ分子と結合することによって、広範囲の癌疾患を患っている患者においてｅｘ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｓｉｔｕのＣＴＬ免疫応答をどちらも誘発することができるＭＨＣクラスＩ制限ペプチドは、サバイビンタンパク質に由来することができることが見いだされている。
[00237]一実施形態では、本発明のワクチン組成物には、国際公開第２００４／０６７０２３号及び国際公開第２００６／０８１８２６号中に開示されているサバイビンペプチド、サバイビンペプチド変異体、又はサバイビンペプチド機能的等価物の任意の１つ又は複数が含まれ得る。
[00238]別の実施形態では、本発明のワクチン組成物には、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、又はＨＬＡ−Ｃ分子から選択されるＭＨＣクラスＩ分子のいずれかと結合することができる、サバイビンペプチド、サバイビンペプチド変異体、又はサバイビンペプチド機能的等価物の１つ又は複数が含まれ得る。
[00239]サバイビンペプチド、サバイビンペプチド変異体、又はサバイビンペプチド機能的等価物が結合し得る例示的なＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ−Ａ分子には、それだけに限定されないが、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ９、ＨＬＡ−Ａ１０、ＨＬＡ−Ａ１１、ＨＬＡ−Ａ１９、ＨＬＡ−Ａ２３、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ２５、ＨＬＡ−Ａ２６、ＨＬＡ−Ａ２８、ＨＬＡ−Ａ２９、ＨＬＡ−Ａ３０、ＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ３２、ＨＬＡ−Ａ３３、ＨＬＡ−Ａ３４、ＨＬＡ−Ａ３６、ＨＬＡ−Ａ４３、ＨＬＡ−Ａ６６、ＨＬＡ−Ａ６８、及びＨＬＡ−Ａ６９が含まれる。
[00240]サバイビンペプチド、サバイビンペプチド変異体、又はサバイビンペプチド機能的等価物が結合し得る例示的なＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ−Ｂ分子には、それだけに限定されないが、ＨＬＡ−Ｂ５、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ８、ＨＬＡ−Ｂ１２、ＨＬＡ−Ｂ１３、ＨＬＡ−Ｂ１４、ＨＬＡ−Ｂ１５、ＨＬＡ−Ｂ１６、ＨＬＡ−Ｂ１７、ＨＬＡ−Ｂ１８、ＨＬＡ−Ｂ２１、ＨＬＡ−Ｂ２２、ＨＬＡ−Ｂ２７、ＨＬＡ−Ｂ３５、ＨＬＡ−Ｂ３７、ＨＬＡ−Ｂ３８、ＨＬＡ−Ｂ３９、ＨＬＡ−Ｂ４０、ＨＬＡ−Ｂ４１、ＨＬＡ−Ｂ４２、ＨＬＡ−Ｂ４４、ＨＬＡ−Ｂ４５、ＨＬＡ−Ｂ４６及びＨＬＡ−Ｂ４７が含まれる。
[00241]サバイビンペプチド、サバイビンペプチド変異体、又はサバイビンペプチド機能的等価物が結合し得る例示的なＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ−Ｃ分子には、それだけに限定されないが、ＨＬＡ−Ｃ１、ＨＬＡ−Ｃ２、ＨＬＡ−Ｃ３、ＨＬＡ−Ｃ４、ＨＬＡ−Ｃ５、ＨＬＡ−Ｃ６、ＨＬＡ−Ｃ７、及びＨＬＡ−Ｃ１６が含まれる。
[00242]特定の実施形態では、本発明のワクチン組成物は、以下から選択されるサバイビンペプチド抗原の１つ又は複数を含み得る。
ｉ） ＦＥＥＬＴＬＧＥＦ（配列番号５４） ［ＨＬＡ−Ａ１］
ｉｉ） ＦＴＥＬＴＬＧＥＦ（配列番号５５） ［ＨＬＡ−Ａ１］
ｉｉｉ） ＬＴＬＧＥＦＬＫＬ（配列番号５６） ［ＨＬＡ−Ａ２］
ｉｖ） ＬＭＬＧＥＦＬＫＬ（配列番号２） ［ＨＬＡ−Ａ２］
ｖ） ＲＩＳＴＦＫＮＷＰＦ（配列番号５７） ［ＨＬＡ−Ａ３］
ｖｉ） ＲＩＳＴＦＫＮＷＰＫ（配列番号５８） ［ＨＬＡ−Ａ３］
ｖｉｉ） ＳＴＦＫＮＷＰＦＬ（配列番号５９） ［ＨＬＡ−Ａ２４］
ｖｉｉｉ） ＬＰＰＡＷＱＰＦＬ（配列番号６０） ［ＨＬＡ−Ｂ７］
[00243]上に列挙したサバイビンペプチドは、それだけに限定されないが、本発明によって包含される例示的なＭＨＣクラスＩ制限ペプチドを表す。サバイビンペプチドのそれぞれが結合すると考えられている特定のＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ分子を、右側の角括弧内に示す。本発明のワクチンは、これらのバイビンペプチドの１つ又は複数を任意の適切な組合せで含み得る。
[00244]さらなる実施形態では、本発明のワクチン組成物は、以下に列挙する５つのサバイビンペプチドの任意の１つ又は複数を任意の適切な組合せで含み得る。
ｉ） ＦＴＥＬＴＬＧＥＦ（配列番号５５） ［ＨＬＡ−Ａ１］
ｉｉ） ＬＭＬＧＥＦＬＫＬ（配列番号２） ［ＨＬＡ−Ａ２］
ｉｉｉ） ＲＩＳＴＦＫＮＷＰＫ（配列番号５８） ［ＨＬＡ−Ａ３］
ｉｖ） ＳＴＦＫＮＷＰＦＬ（配列番号５９） ［ＨＬＡ−Ａ２４］
ｖ） ＬＰＰＡＷＱＰＦＬ（配列番号６０） ［ＨＬＡ−Ｂ７］
[00245]特定の実施形態では、本発明の組成物は、上に列挙した５つすべてのサバイビンペプチド抗原を含む。
[00246]一部の実施形態では、少なくとも１つのサバイビン抗原に加えて、本発明のワクチン組成物は、１つ又は複数の追加の抗原、たとえば本明細書中に記載したものなどを含み得る。
[00247]ＣＴＬエピトープ及びＢ細胞エピトープ
[00248]上述したように、一部の実施形態では、抗原は、少なくとも１つのＢ細胞エピトープ又はＣＴＬエピトープを含む分子である。
[00249]エピトープは、それだけに限定されないが、ペプチド、炭水化物、脂質、糖ペプチド、及び糖脂質を含めた、任意の化学性質のものであり得る。特定の実施形態では、エピトープは、本明細書中に記載の抗原のいずれかに由来するペプチドである。エピトープは、天然に存在するエピトープと同一であり得るか、天然に存在するエピトープの修飾体であり得る。
[00250]Ｂ細胞エピトープとは、Ｂ細胞及び抗体によって認識されるエピトープである。Ｂ細胞ペプチドエピトープの長さは、典型的には少なくとも５個のアミノ酸、より多くの場合は少なくとも６個のアミノ酸、さらにより多くの場合は少なくとも７又は８個のアミノ酸の長さであり、連続的（「直鎖状」）又は不連続（「コンホメーション」）であってよく、後者は、たとえば、タンパク質の折り畳みにより一次アミノ酸配列の非連続的な部分を物理的に近接させることによって形成される。また、Ｂ細胞エピトープは炭水化物エピトープであってもよい。
[00251]一実施形態では、本明細書中に記載した組成物の抗原は、液性免疫応答を誘導することができるＢ細胞エピトープであり得るか、それを含み得る。
[00252]一部の実施形態では、本明細書中に記載した組成物の抗原は、感染性疾患に関連するＢ細胞エピトープであり得るか、それを含み得る。たとえば、抗原は、ウイルス、たとえばインフルエンザウイルス又は呼吸器合胞体ウイルスなどに由来するＢ細胞エピトープであり得るか、それを含み得る。別の実施形態では、Ｂ細胞エピトープは、Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスの赤血球凝集素糖タンパク質に由来するエピトープであり得る。
[00253]別の実施形態では、本明細書中に記載した組成物の抗原は、細菌、たとえば百日咳菌又はバチルス・アントラシスなどに由来するＢ細胞エピトープであり得るか、それを含み得る。特定の実施形態では、Ｂ細胞エピトープは、百日咳菌によって産生される百日咳トキソイドタンパク質のエピトープであり得る。別の特定の実施形態では、Ｂ細胞エピトープは、炭疽菌組換え保護抗原（ｒＰＡ）又は炭疽菌突然変異体組換え保護抗原（ｍｒＰＡ）のエピトープであり得る。
[00254]別の実施形態では、本明細書中に記載した組成物の抗原は、プラスモジウム属のものなどの原虫に由来するＢ細胞エピトープであり得るか、それを含み得る。
[00255]さらなる実施形態では、組成物は、液性免疫応答を誘導するための抗原としてＢ細胞エピトープの混合物を含み得る。Ｂ細胞エピトープを連結させて単一のポリペプチドを形成し得る。
[00256]ＣＴＬエピトープとは、細胞毒性Ｔリンパ球によって認識される分子である。ＣＴＬエピトープは、典型的には、抗原提示細胞の表面上にＭＨＣ分子と複合体化して提示される。本明細書中で使用する用語「ＣＴＬエピトープ」とは、抗原（ハプテンが含まれる）の天然ＣＴＬエピトープと実質的に同じである分子（たとえばペプチド）をいう。ＣＴＬエピトープは、その天然の対応物と比較して、１個又は２個のアミノ酸などが改変されていてもよい。別段に記述しない限りは、本明細書中におけるＣＴＬエピトープへの言及は、細胞によって取り込まれ、抗原提示細胞の表面上に提示されることができる、未結合の分子をさす。
[00257]ＣＴＬエピトープは、典型的には、細胞性免疫応答が起こることができるように、Ｔ細胞受容体による認識を受け入れやすいものであるべきである。ペプチドでは、ＣＴＬエピトープはクラスＩ又はクラスＩＩ ＭＨＣ分子と相互作用し得る。ＭＨＣクラスＩ分子によって提示されるＣＴＬエピトープは、典型的には８〜１５個のアミノ酸の長さ、より多くの場合は９〜１１個のアミノ酸の長さのペプチドである。ＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示されるＣＴＬエピトープは、典型的には５〜２４個のアミノ酸の長さ、より多くの場合は１３〜１７個のアミノ酸の長さのペプチドである。抗原がこれらのサイズよりも大きい場合、それは免疫系によって、ＭＨＣクラスＩ又はＩＩ分子との相互作用により適したサイズの断片へと処理される。したがって、ＣＴＬエピトープは、上述したものよりも大きなペプチドの一部であってもよい。
[00258]多くのＣＴＬエピトープが知られている。さらなるＣＴＬエピトープを同定するためのいくつかの技法が当分野で認識されている。一般に、それらは、ＣＴＬエピトープを潜在的に提供する分子を調製し、その分子に対する免疫応答を特徴づけることを含む。
[00259]一実施形態では、本明細書中に記載した組成物の抗原は、ＣＴＬ応答を誘導することができるＣＴＬエピトープであり得るか、それを含み得る。たとえば、抗原は、ＨＰＶなどのウイルスに由来するＣＴＬエピトープであり得る。
[00260]別の実施形態では、抗原は、ＨＰＶのＥ６又はＥ７タンパク質に由来するＣＴＬエピトープであり得るか、それを含み得る。たとえば、それだけに限定されないが、ＨＰＶのＥ６タンパク質のＣＴＬエピトープはペプチド配列ＴＩＨＤＩＩＬＥＣＶ（Ｔ１０Ｖ、配列番号４３）を含んでいてもよく、ＨＰＶのＥ７タンパク質のＣＴＬエピトープは、ペプチド配列ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（Ｒ９Ｆ、配列番号３）、ＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴ（Ｙ１０Ｔ、配列番号４４）、ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ（Ｙ９Ｔ、配列番号４５）ＬＬＭＧＴＬＧＩＶ（Ｌ９Ｖ、配列番号４６）、及びＴＬＧＩＶＣＰＩ（Ｔ８１、配列番号４７）を含んでいてもよい。
[00261]別の実施形態では、ＣＴＬエピトープは、たとえば本明細書中に記載したサバイビンペプチドの１つ若しくは複数又は黒色腫関連タンパク質などの腫瘍関連タンパク質のエピトープであり得る。一実施形態では、黒色腫関連タンパク質は、組換え技術又は化学合成を含めた様々な方法によって得ることができるチロシン関連タンパク質−２（ＴＲＰ−２）又はｐ５３であり得る。
[00262]たとえば、それだけに限定されないが、ＴＲＰ−２由来のタンパク質のＣＴＬエピトープは、ペプチド配列ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ（Ｓ９Ｌ、配列番号３９）又はＶＹＤＦＦＶＷＬ（Ｖ８Ｌ、配列番号４８）を含み得る。ｐ５３に由来するタンパク質のＣＴＬエピトープは、たとえば、ペプチド配列ＫＹＭＣＮＳＳＣＭ（Ｋ９Ｍ、野生型ｐ５３、配列番号４９）、ＫＹＩＣＮＳＳＣＭ（ｍＫ９Ｍ、改変ｐ５３、配列番号５０）、又はＡＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡＫＹＩＣＮＳＳＣＭ（ｍＫ９Ｍ、配列番号５１）を含んでいてもよく、式中、Ｘはシクロヘキシルアラニルであり得る。
[00263]さらなる実施形態では、組成物は、ＣＴＬ応答を誘導するための抗原としてＣＴＬエピトープの混合物を含み得る。ＣＴＬエピトープを連結させて単一のポリペプチドを形成し得る。
[00264]一部の実施形態では、Ｂ細胞及びＣＴＬエピトープは疾患関連及び／又は疾患特異的エピトープである。そのような疾患には、それだけに限定されないが、本明細書中に既に記載したもののいずれかが含まれる。たとえば、それだけに限定されないが、疾患は、癌（たとえば、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膠芽細胞腫、若しくはびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫など）、感染性疾患（たとえば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染症、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染症、インフルエンザウイルス感染症、エボラウイルス感染症、バチルス・アントラシス感染症、若しくは四日熱マラリア原虫感染症によって引き起こされる若しくはそれに関連する疾患など）、又は嗜癖疾患（たとえばコカインに対する嗜癖など）であり得る。
[00265]ヘルパーＴエピトープ
[00266]一部の実施形態では、デポー形成及びデポー非形成ワクチンをどちらも含めた本発明のワクチン組成物は、少なくとも１つのヘルパーＴエピトープ又はヘルパーＴ抗原も含み得る。
[00267]ヘルパーＴエピトープとは、ヘルパーＴ活性を有するアミノ酸（天然又は非天然のアミノ酸）の配列である。ヘルパーＴエピトープはヘルパーＴリンパ球によって認識され、これは、免疫系の能力を確立及び最大化することにおいて重要な役割を果たしており、また、たとえば細胞毒性Ｔリンパ球などの他の免疫細胞の活性化及び指示に関与している。
[00268]ヘルパーＴエピトープは連続的又は不連続のエピトープからなることができる。それゆえ、ヘルパーＴのすべてのアミノ酸が必ずしもエピトープの必要な部分ではない。したがって、ヘルパーＴエピトープの類似体及びセグメントを含めたヘルパーＴエピトープは、免疫応答を増強又は刺激することができる。免疫優性ヘルパーＴエピトープは幅広く多岐にわたるＭＨＣ型を有しており、動物及びヒト集団において広範に反応性がある（Ｃｅｌｉｓら（１９８８）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４０：１８０８〜１８１５、Ｄｅｍｏｔｚら（１９８９）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４２：３９４〜４０２、Ｃｈｏｎｇら（１９９２）、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、６０：４６４０〜４６４７）。対象ペプチドのヘルパーＴドメインは、約１０〜約５０個のアミノ酸、より詳細には約１０〜約３０個のアミノ酸を有し得る。複数のヘルパーＴエピトープが存在する場合、それぞれのヘルパーＴエピトープは独立して作用する。
[00269]一部の実施形態では、ヘルパーＴエピトープは、本明細書中に記載の抗原の一部を形成し得る。特に、抗原が十分な大きさのものである場合、これはヘルパーＴエピトープとして機能するエピトープを含有し得る。他の実施形態では、ヘルパーＴエピトープは抗原とは別個の分子である。
[00270]別の実施形態では、ヘルパーＴエピトープ類似体には、ヘルパーＴエピトープ中に１個〜約１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、及び挿入が含まれ得る。ヘルパーＴセグメントは、免疫応答を増強又は刺激するために十分な、ヘルパーＴエピトープの連続的な部分である。ヘルパーＴセグメントの一例は、単一のより長いペプチドに由来する一連の重複ペプチドである。
[00271]特定の実施形態では、本発明の組成物は、ヘルパーＴエピトープ又は抗原として、安定性を増強するためにアラニン残基がそのアミノ末端に付加された改変破傷風毒素ペプチドＡ１６Ｌ（８３０〜８４４、ＡＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ（配列番号６１）を含み得る（Ｓｌｉｎｇｌｕｆｆら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、７：３０１２〜３０２４、２００１）。
[00272]本組成物において使用し得るヘルパーＴエピトープの他の供給源には、たとえば、Ｂ型肝炎表面抗原ヘルパーＴ細胞エピトープ、百日咳毒素ヘルパーＴ細胞エピトープ、麻疹ウイルスＦタンパク質ヘルパーＴ細胞エピトープ、クラミジア・トラコミチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍｉｔｉｓ）主要外膜タンパク質ヘルパーＴ細胞エピトープ、ジフテリア毒素ヘルパーＴ細胞エピトープ、熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲ヘルパーＴ細胞エピトープ、マンソン住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉ）トリオースリン酸イソメラーゼヘルパーＴ細胞エピトープ、大腸菌ＴｒａＴヘルパーＴ細胞エピトープ、並びにこれらのヘルパーＴエピトープのいずれかの免疫増強性の類似体及びセグメントが含まれる。
[00273]一部の実施形態では、ヘルパーＴエピトープは普遍的ヘルパーＴエピトープであり得る。本明細書中で使用する普遍的ヘルパーＴエピトープとは、クラスＩＩ（ＣＤ４＋Ｔ細胞）制限様式でＴ細胞の機能を活性化する様式で多数のＭＨＣクラスＩＩ分子と結合する、ペプチド若しくは他の免疫原性分子又はその断片をいう。普遍的ヘルパーＴエピトープの一例は、ペプチド配列ＡＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（配列番号６２）（式中、Ｘはシクロヘキシルアラニルであり得る）を含むＰＡＤＲＥ（ｐａｎ−ＤＲエピトープ）である。ＰＡＤＲＥは特異的にＣＤ４＋ヘルパーＴエピトープを有している、すなわち、これはＰＡＤＲＥに特異的なＣＤ４＋ヘルパーＴ応答の誘導を刺激する。
[00274]既に言及した改変破傷風毒素ペプチドＡ１６Ｌに加えて、破傷風トキソイドは、ＰＡＤＲＥと同様の様式で作用する他のヘルパーＴエピトープを有する。破傷風及びジフテリア毒素はヒトＣＤ４＋細胞に対する普遍的エピトープを有する（Ｄｉｅｔｈｅｌｍ−Ｏｋｉｔａ，Ｂ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓｅａｓｅｓ、１８１：１００１〜１００９、２０００）。別の実施形態では、ヘルパーＴエピトープは、ペプチド配列ＦＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ（アミノ酸９４７〜９６７）（配列番号６３）を含むＦ２１Ｅなどの破傷風トキソイドペプチドであり得る。
[00275]特定の実施形態では、ヘルパーＴエピトープは、本発明のワクチン中の１つ又は複数の抗原の少なくとも１つと融合している（たとえば融合ペプチド）。
[00276]本明細書中に記載の組成物を用いた単一治療において使用するヘルパーＴエピトープの量は、ヘルパーＴエピトープの種類及び対象の特徴（たとえば、大きさ、重量、年齢、性別など）に応じて変動し得る。当業者は、必要以上の実験を行わずに、特定の応用において使用するための適切な量のヘルパーＴエピトープを決定できるであろう。
[00277]一実施形態では、単一用量の本明細書中に記載の組成物中で使用するヘルパーＴエピトープの量は０．００１〜５ｍｇ／単位用量の組成物であり得る。特定の実施形態では、抗原の量は約０．１２５ｍｇ／単位用量の組成物となる。特定の実施形態では、抗原の量約５００μｇ／ｍＬの組成物となる。
[00278]アジュバント
[00279]一部の実施形態では、デポー形成及びデポー非形成ワクチンをどちらも含めた本明細書中に開示するワクチン組成物は、１つ又は複数のアジュバントを含み得る。
[00280]多数のアジュバントが記載されており、当業者に知られている。たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、米国ペンシルベニア州Ｅａｓｔｏｎ、１９８５）及び米国薬局方：国民医薬品集（ＵＳＰ ２４ ＮＦ１９）、１９９９年出版を参照されたい。
[00281]例示的なアジュバントには、それだけに限定されないが、ミョウバン、アルミニウムの他の化合物、バチルスカルメット・ゲラン（ＢＣＧ）、タイターマックス（ＴｉｔｅｒＭａｘ）（商標）、リビ（Ｒｉｂｉ）（商標）、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、ＣｐＧ含有オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ ＯＤＮ）、リポペプチド類、及びポリＩ：Ｃポリヌクレオチドが含まれる。例示的なＣｐＧ ＯＤＮは５’−ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ−３’（配列番号６４）である。当業者は、標的の種及び有効性に基づいて他の適切なＣｐＧ ＯＤＮを容易に選択することができる。例示的なリポペプチドには、それだけに限定されないが、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫ（ＥＭＣ Ｍｉｃｒｏｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ、ドイツ）、又はその変異体、相同体、及び類似体が含まれる。Ｐａｍ２リポペプチドファミリーは、Ｐａｍ３リポペプチドファミリーの有効な代替物であることが示されている。
[00282]一部の実施形態では、医薬組成物又はワクチン組成物は、アジュバントとして、たとえばそれだけに限定されないが２６量体のデオキシイノシン／シトシン合成ポリヌクレオチドなどのポリＩ：Ｃポリヌクレオチドを含み得る。
[00283]本明細書中で使用する「ポリＩ：Ｃ」又は「ポリＩ：Ｃポリヌクレオチド」とは、それぞれの鎖が少なくとも６個の連続的なイノシン酸若しくはシチジル酸残基、又は任意の順序でイノシン酸及びシチジル酸から選択される少なくとも６個の連続的な残基（たとえば、ＩＩＣＩＩＣ、ＩＣＩＣＩＣ、若しくはＩＩＩＣＣＣ）を含有しており、哺乳動物対象においてインターフェロンなどの少なくとも１つの炎症性サイトカインの産生を誘導又は増強することができる、二本鎖ポリヌクレオチド分子（ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又はＤＮＡ及びＲＮＡの組合せ）である。ポリＩ：Ｃポリヌクレオチドは、典型的には、約８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２５、２８、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、５００、１０００個、又はそれより多くの残基の長さを有する。上限は重要でないと考えられている。ポリＩ：Ｃポリヌクレオチドは、多くの場合、最短で約６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、又は３０個のヌクレオチドの長さ、及び最大で約１０００、５００、３００、２００、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４５、又は４０個のヌクレオチドの長さを有する。
[00284]ポリＩ：Ｃポリヌクレオチドのそれぞれの鎖はイノシン酸若しくはシチジル酸残基のホモポリマーであり得るか、又は、それぞれの鎖はイノシン酸及びシチジル酸残基をどちらも含有するヘテロポリマーであり得る。どちらも場合でも、少なくとも１つの上述の６個のＩ、６個のＣ、又は６個のＩ／Ｃ残基の連続的な領域が存在する限りは、ポリマーは１つ又は複数の非イノシン酸又は非シチジル酸残基（たとえばウリジン）によって中断され得る。典型的には、ポリＩ：Ｃポリヌクレオチドのそれぞれの鎖は、６個のＩ／Ｃ残基あたり１個以下の非Ｉ／Ｃ残基、より詳細には８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、又は３０個のＩ／Ｃ残基あたり１個以下の非Ｉ／Ｃ残基しか含有しない。
[00285]ポリＩ：Ｃポリヌクレオチド中のイノシン酸若しくはシチジル酸（又は他の）残基は、インターフェロンなどの炎症性サイトカインの産生を促進するポリＩ：Ｃポリヌクレオチドの能力が保持されている限り、当分野で知られているように誘導体化又は修飾し得る。誘導体又は修飾体の非限定的な例には、たとえば、アジド修飾、フルオロ修飾、又はｉｎ ｖｉｖｏ安定性を増加させるための、天然のリン酸ジエステル結合の代わりにチオエステル（若しくは類似の）結合の使用が含まれる。また、ポリＩ：Ｃポリヌクレオチドは、たとえば、分子を正荷電ポリリシンとカルボキシメチルセルロース又は正荷電合成ペプチドと複合体化することによって、たとえばｉｎ ｖｉｖｏ分解に対するその耐性を増強させるためにも修飾し得る。
[00286]存在する場合、ポリＩ：Ｃポリヌクレオチドは、典型的には、組成物中に、約０．００１ｍｇ〜１ｍｇ／組成物単位用量の量で含められる。特定の実施形態では、ポリＩ：Ｃポリヌクレオチドの量は約０．１ｍｇ／単位用量の組成物である。特定の実施形態では、ポリＩ：Ｃポリヌクレオチドの量は約４００μｇ／ｍＬの組成物である。
[00287]本明細書中に開示する組成物の他の適切なアジュバントは、ＴＬＲ２を活性化する又はその活性を増加させるものである。本明細書中で使用する、ＴＬＲ２を「活性化する」又はその「活性を増加させる」アジュバントには任意のアジュバントが含まれ、一部の実施形態では、ＴＬＲ２作用剤として作用する脂質に基づくアジュバントが含まれる。さらに、ＴＬＲ２の活性化又はその活性の増加には、任意の単量体、ホモ二量体、又はヘテロ二量体の形態でのその活性化が包含され、ＴＬＲ１又はＴＬＲ６とのヘテロ二量体としてのＴＬＲ２（すなわちＴＬＲ１／２又はＴＬＲ２／６）の活性化が特に含まれる。ＴＬＲ２を活性化させる又はその活性を増加させるアジュバントの例示的な実施形態には、国際公開第２０１３／０４９９４１号に記載のものなどの脂質に基づくアジュバントが含まれる。
[00288]別の実施形態では、本発明の組成物は、たとえば、国際出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１５／０５１３０９号及びそれ中に引用されている参考文献中に開示されているものなどの、脂質Ａ模倣体又は類似体アジュバントを含み得る。特定の実施形態では、アジュバントは、国際出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１５／０５１３０９号に開示のようにＪＬ−２６５又はＪＬ−２６６であり得る。
[00289]使用し得るアジュバントのさらなる例には、それだけに限定されないが、ケモカイン、コロニー刺激因子、サイトカイン、１０１８ ＩＳＳ、アルミニウム塩、アンプリボックス（Ａｍｐｌｉｖａｘ）、ＡＳ０４、ＡＳ１５、ＡＢＭ２、アジュマー（Ａｄｊｕｍｅｒ）、アルガムリン（Ａｌｇａｍｍｕｌｉｎ）、ＡＳ０１Ｂ、ＡＳ０２（ＳＢＡＳＡ）、ＡＳＯ２Ａ、ＢＣＧ、カルシトリオール、キトサン、コレラ毒素、ＣＰ−８７０，８９３、ＣｐＧ、ポリＩ：Ｃ、ＣｙａＡ、デトックス（ＤＥＴＯＸ）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）、フタル酸ジブチル（ＤＢＰ）、ｄＳＬＩＭ、ガンマイヌリン、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＭＤＰ、グリセロール、ＩＣ３０、ＩＣ３１、イミキモド、イムファクト（ＩｍｕＦａｃｔ）ＩＭＰ３２１、ＩＳパッチ（ＩＳ Ｐａｔｃｈ）、イスコム（ＩＳＣＯＭ）、イスコマトリックス（ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ）、ジュヴイミューン（ＪｕｖＩｍｍｕｎｅ）、リポバック（ＬｉｐｏＶａｃ）、ＬＰＳ、脂質コアタンパク質、ＭＦ５９、モノホスホリルリピドＡ及びその類似体又は模倣体、モンタニド（登録商標）ＩＭＳ１３１２、モンタニド（登録商標）に基づくアジュバント（たとえば、モンタニドＩＳＡ−５１、−５０、及び−７０）、ＯＫ−４３２、ＯＭ−１７４、ＯＭ−１９７−ＭＰ−ＥＣ、オンタック（ＯＮＴＡＫ）、ペプテル（ＰｅｐＴｅｌ）ベクター系、他のパルミトイルに基づく分子、ＰＬＧ微粒子、レシキモド、スクアレン、ＳＬＲ１７２、ＹＦ−１７ ＤＢＣＧ、ＱＳ２１、ＱｕｉｌＡ、Ｐ１００５、ポロキサマー、サポニン、合成ポリヌクレオチド、ザイモサン、百日咳毒素が含まれる。
[00290]したがって、本明細書中の組成物は、１つ又は複数の薬学的に許容されるアジュバントを含み得る。一部の実施形態では、抗原の少なくとも１つはアジュバントの少なくとも１つとカップリングされていてもよい。
[00291]使用するアジュバントの量は抗原の量及びアジュバントの種類に依存する。当業者は、特定の応用において必要なアジュバントの量を経験的な試験によって容易に決定できるであろう。
[00292]疎水性担体
[00293]本発明のデポー形成ワクチン組成物は、たとえば液体の疎水性物質などの疎水性担体を含む。
[00294]疎水性担体は、本質的に純粋な疎水性物質又は疎水性物質の混合物であり得る。疎水性担体は、疎水性物質中の水の乳濁液又は疎水性物質混合物中の水の乳濁液（すなわち油中水乳濁液）であり得ることが可能であるが、水の排除が、本明細書中に開示するデポー形成ワクチンを配合するための好ましい実施形態を表し得る。
[00295]したがって、特定の実施形態では、本明細書中に開示するデポー形成ワクチンは水を含まない場合がある。「水を含まない」とは、デポー形成ワクチンが水を全く含有しないことを意味する。別の実施形態では、本明細書中に開示するデポー形成ワクチンは、水を実質的に含まない場合がある。用語「水を実質的に含まない」には、水が担体の不連続相中に存在する限りは、疎水性担体が少量の水を含有したままであり得る実施形態が包含されることを意図する。たとえば、組成物の個々の構成成分は、凍結乾燥又は蒸発などの処理によって完全に除去され得ない結合水を有する場合があり、特定の疎水性担体はそれ中に溶解した少量の水を含有する場合がある。一般に、「水を実質的に含まない」本発明の組成物は、たとえば、重量／重量に基づいて、組成物の担体構成成分の全重量の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、又は０．０１％未満の水を含有する。
[00296]本明細書中に記載した組成物において有用な疎水性物質は、薬学的及び／又は免疫学的に許容されるものである。担体は典型的には液体であるが、大気温で液体でない特定の疎水性物質を、たとえば温めることによって液化してもよく、これらも有用であり得る。
[00297]油又は油の混合物は、本明細書中に開示するデポー形成ワクチン組成物において使用するために特に適した担体である。油は薬学的及び／又は免疫学的に許容されるはずである。適切な油には、たとえば、鉱物油（特に、ドラケオール（Ｄｒａｋｅｏｌ）（登録商標）６ＶＲなどの軽い若しくは低粘度の鉱物油）、植物油（たとえばダイズ油）、堅果油（たとえばピーナッツ油）、又はその混合物が含まれる。したがって、一実施形態では、疎水性担体は、植物油、堅果油、又は鉱物油などの疎水性物質である。動物性脂肪及び人工疎水性ポリマー材料、特に大気温で液体であるもの又は比較的容易に液化できるものも使用し得る。
[00298]一部の実施形態では、疎水性担体は、鉱物油ベースのモデル疎水性担体である不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）である又は鉱物油ベースのモデル疎水性担体である不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を含み得る。
[00299]別の実施形態では、疎水性担体は、モンタニド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）（登録商標）ＩＳＡ５１（ＳＥＰＰＩＣ、フランス）として市販されているものなどの、鉱物油溶液中のオレイン酸マンニドである又はモンタニド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）（登録商標）ＩＳＡ５１（ＳＥＰＰＩＣ、フランス）として市販されているものなどの、鉱物油溶液中のオレイン酸マンニドを含み得る。
[00300]ワクチンの免疫原性を増強させるために、Ｉｍｍｕｎｏｖａｃｃｉｎｅ Ｉｎｃ．は、ペプチド又はポリヌクレオチド抗原に対する強力且つ頑強な免疫応答を促進するために設計されたアジュバント化ワクチンプラットフォームを開発している。デポヴァックス（商標）（ＤＰＸ）は、細胞性免疫応答（Ｋａｒｋａｄａら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、３３（３）：２５０〜２６１、２０１０）及び／又は液性免疫応答を誘導又は強力にするために、任意の抗原又は抗原の混合物を用いて配合することができる油中脂質の配合物である。ＤＰＸは免疫化の部位で強力なデポーを形成し、これにより免疫系に対する抗原の曝露が延長される。
[00301]ＤＰＸ中におけるペプチド又はポリヌクレオチド抗原を用いた単一のワクチン接種は、第一世代の乳濁液に基づくワクチンプラットフォームであったワクチマックスと同様、モンタニドＩＳＡ５１ ＶＧ乳濁液などの他の慣用の配合物中における同じ抗原を用いた複数回のワクチン接種と同等又はそれよりも良好な免疫応答をもたらすことが示されている（Ｄａｆｔａｒｉａｎら、Ｊ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ、５：２６、２００７、Ｍａｎｓｏｕｒら、Ｊ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ、５：２０、２００７）。ＤＰＸ−０９０７と呼ばれる、デポヴァックス（商標）に基づくペプチド−ワクチンは乳房、卵巣、及び前立腺癌の患者において第Ｉ相臨床治験が完了しており、これらの進行性の患者において安全性及び免疫原性が実証されている（Ｂｅｒｉｎｓｔｅｉｎら、Ｊ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ、１０（１）：１５６、２０１２）。
[00302]抗原及びアジュバントを含有する水滴を捕捉する油に依存する、油中水乳濁液に基づくワクチンとは異なり、デポヴァックス（商標）に基づく配合物は、乳化を必要とせずに、抗原及びアジュバントの油内への直接の取り込みを促進するために脂質に依存する。この手法の利点には、（１）そうでなければ通常は水性希釈剤中で最大の溶解度を有する親水性の抗原／アジュバントの、油状希釈剤中での溶解度が増強されること、及び（２）ワクチン投与の厄介な乳化手順が排除されることが含まれる。
[00303]一部の実施形態では、本明細書中に開示するデポー形成ワクチン組成物の疎水性担体は、Ｉｍｍｕｎｏｖａｃｃｉｎｅ，Ｉｎｃのアジュバント系、デポヴァックス（商標）であり得る。
[00304]乳化剤
[00305]一部の実施形態では、本明細書中に開示するワクチン組成物は１つ又は複数の乳化剤を含み得る。乳化剤は純粋な乳化剤又は乳化剤の混合物であり得る。乳化剤（複数可）は、薬学的に及び／又は免疫学的に許容されるものであるべきである。
[00306]乳化剤の使用は、本明細書中に開示するデポー形成ワクチンにおいて特に関連性があり得る。たとえば、一部の実施形態では、乳化剤は、両親媒性物質又は混合物を疎水性担体内に再懸濁させる際に、両親媒性物質、両親媒性物質と抗原の混合物、又は両親媒性物質と抗原と他のワクチン構成成分（たとえば、アジュバント、ヘルパーＴエピトープなど）の混合物の安定化を補助するために使用し得る。乳化剤の使用は、たとえば、疎水性担体中での両親媒性物質又は混合物のより均一な分布を促進し得る。
[00307]乳化剤は両親媒性であってもよく、したがって、乳化剤には広範囲の化合物が含まれ得る。一部の実施形態では、乳化剤は、たとえば非イオン性界面活性剤などの界面活性剤であり得る。使用し得る乳化剤の例には、ポリエチレングリコリル化ソルビタール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌｙａｔｅｄ ｓｏｒｂｉｔａｌ）に由来する油性の液体であるポリソルベート、及びソルビタンエステルが含まれる。ポリソルベートにはたとえばモノオレイン酸ソルビタンが含まれ得る。典型的な乳化剤は当分野で周知であり、それだけには限定されないが、オレイン酸マンニド（アルラセル（商標）Ａ）、レシチン、ツイーン（商標）８０、スパン（商標）２０、８０、８３、及び８５が含まれる。一実施形態では、ワクチン組成物において使用するため乳化剤はオレイン酸マンニドである。
[00308]乳化剤は、一般的には疎水性担体と事前に混合する。一部の実施形態では、乳化剤を既に含有する疎水性担体を使用し得る。たとえば、モンタニド（商標）ＩＳＡ−５１などの疎水性担体は、乳化剤オレイン酸マンニドを既に含有する。他の実施形態では、疎水性担体は、両親媒性物質、両親媒性物質と抗原の混合物、又は両親媒性物質と抗原と他のワクチン構成成分（たとえばアジュバント、ヘルパーＴエピトープなど）の混合物と合わせる前に乳化剤と混合し得る。
[00309]乳化剤は、疎水性担体中での両親媒性物質の均一な分布を促進する、及び／又は本明細書中に記載の構造、アセンブリ、若しくはアレイの形成の補助するために有効な量で使用する。典型的には、疎水性担体対乳化剤の体積比（ｖ／ｖ）は、約５：１〜約１５：１の範囲、より詳細には１０：１である。
[00310]一実施形態では、デポー形成ワクチンは、以下を含む又はそれからなる：（ｉ）アミノ酸配列ＦＴＥＬＴＬＧＥＦ（配列番号５５）、ＬＭＬＧＥＦＬＫＬ（配列番号２）、ＲＩＳＴＦＫＮＷＰＫ（配列番号５８）、ＳＴＦＫＮＷＰＦＬ（配列番号５９）、及びＬＰＰＡＷＱＰＦＬ（配列番号６０）を含む５つのサバイビンペプチド抗原、（ｉｉ）アミノ酸配列ＡＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ（配列番号６１）を含む破傷風トキソイドからのユニバーサルヘルパーＴエピトープ、（ｉｉｉ）ポリＩ：Ｃポリヌクレオチドアジュバント、（ｉｖ）１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）とコレステロール脂質混合物の脂質分子混合物、並びに（ｖ）疎水性担体モンタニド（登録商標）ＩＳＡ ５１ ＶＧ。
[00311]一実施形態では、デポー形成及びデポー非形成ワクチン（ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃ）は、以下を含む又はそれからなる：５つのヒト白血球抗原（ＨＬＡ）制限エピトープ（ＨＬＡ−Ａ１：ＦＴＥＬＴＬＧＥＦ（配列番号５５）、ＨＬＡ−Ａ２：ＬＭＬＧＥＦＬＫＬ（配列番号２）、ＨＬＡ−Ａ３：ＲＩＳＴＦＫＮＷＰＫ（配列番号５８）、ＨＬＡ−Ａ２４：ＳＴＦＫＮＷＰＦＬ（配列番号５９）、及びＨＬＡ−Ｂ７：ＬＰＰＡＷＱＰＦＬ（配列番号６０））、破傷風トキソイドからのユニバーサルヘルパーＴエピトープ（ＡＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ、配列番号６１）、ポリＩ：Ｃポリヌクレオチドアジュバント、並びにＤＯＰＣ及びコレステロールからなるリポソーム。これらの構成成分をリン酸緩衝液中で配合し、バイアルに満たし、凍結乾燥させて乾燥ケークにする。デポー形成ワクチンには、ケークを１×体積の疎水性担体モンタニドＩＳＡ５１ ＶＧ（ＳＥＰＰＩＣ、フランス）に再懸濁させる。デポー非形成ワクチンには、疎水性担体の代わりに２×体積の滅菌水を使用して乾燥ケークを再懸濁させる。例示的な最終ワクチン配合物中の用量体積及び送達物を表３に示す。
[00312]
Figure 0006851983
[00313]別の実施形態では、デポー形成ワクチンは、以下を含む又はそれからなる：（ｉ）ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に由来するペプチド抗原、（ｉｉ）アミノ酸配列ＡＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ（配列番号６１）を含む破傷風トキソイドからのユニバーサルヘルパーＴエピトープ、（ｉｉｉ）ポリＩ：Ｃポリヌクレオチドアジュバント、（ｉｖ）１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）とコレステロール脂質混合物の脂質分子混合物、並びに（ｖ）疎水性担体モンタニド（登録商標）ＩＳＡ ５１ ＶＧ。
[00314]一実施形態では、デポー非形成ワクチンは、（ｉ）アミノ酸配列ＦＴＥＬＴＬＧＥＦ（配列番号５５）、ＬＭＬＧＥＦＬＫＬ（配列番号２）、ＲＩＳＴＦＫＮＷＰＫ（配列番号５８）、ＳＴＦＫＮＷＰＦＬ（配列番号５９）、及びＬＰＰＡＷＱＰＦＬ（配列番号６０）を含む５つのサバイビンペプチド抗原、（ｉｉ）アミノ酸配列ＡＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ（配列番号６１）を含む破傷風トキソイドからのユニバーサルヘルパーＴエピトープ、（ｉｉｉ）ポリＩ：Ｃポリヌクレオチドアジュバント、（ｉｖ）１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）とコレステロール脂質混合物の脂質分子混合物、並びに（ｖ）水担体を含む。
[00315]別の実施形態では、デポー非形成ワクチンは、（ｉ）ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に由来するペプチド抗原、（ｉｉ）アミノ酸配列ＡＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ（配列番号６１）を含む破傷風トキソイドからのユニバーサルヘルパーＴエピトープ、（ｉｉｉ）ポリＩ：Ｃポリヌクレオチドアジュバント、（ｉｖ）１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）とコレステロール脂質混合物の脂質分子混合物、並びに（ｖ）水担体を含む。
[00316]ワクチン組成物を調製する方法
[00317]デポー形成及びデポー非形成ワクチン組成物は、実施例中に記載の非限定的な方法を含めて、本開示を考慮した当分野の既知の方法によって調製し得る。デポー形成ワクチンを調製するためには、たとえば、抗原、両親媒性物質、及び疎水性担体を含むワクチン及び免疫原性組成物の調製の例示的な開示として、国際公開第１９９６／０１４８７１号及び国際公開第２００９／０４３１６５号を詳細に参照し得る。デポー非形成ワクチン（たとえば水性ベースのワクチン）を調製するための方法は当分野で周知であり、これらの方法のうちの任意のものを用い得る。
[00318]それだけには限定されないが、本明細書中に開示するワクチン組成物を調製するための例示的な実施形態を以下に記載する。
[00319]本セクションで使用する用語「抗原」とは、抗原を本発明のワクチン組成物中で配合し得ることを記載するために一般的に使用する。用語「抗原」には、単数形「抗原（ａｎｔｉｇｅｎ）」及び複数形「複数の抗原（ａｎｔｉｇｅｎｓ）」がどちらも包含される。すべての抗原がワクチン組成物内に同じ方法で導入されている必要はない。
[00320]ワクチンを調製するための一実施形態では、抗原と任意選択で他のワクチン構成成分（たとえば、ヘルパーＴエピトープ及びアジュバント）を、両親媒性物質と一緒に適切な溶媒中で再溶解する。その後、ワクチン構成成分を乾燥させて乾燥ケークを形成し、乾燥ケークを疎水性担体中に再懸濁させてデポー形成ワクチンを調製するか、又は水性担体中に再懸濁させてデポー非形成ワクチンを調製する。乾燥ステップは、フリーズドライ、凍結乾燥、回転蒸発、加圧下蒸発などの、当分野で知られている様々な手段によって行い得る。また、構成成分の完全性を損なわない低温乾燥も使用することができる。また、熱は、抗原／両親媒性物質の混合物の再懸濁の補助にも使用することができる。
[00321]「適切な溶媒」とは、抗原及び／又は両親媒性物質を可溶化するために適切なものであり、当業者によって決定することができる。一実施形態では、アルコール（たとえば、ｔｅｒｔ−ブタノール、ｎ−ブタノール、イソプロパノール、ｎ−プロパノール、エタノール、若しくはメタノール）、水、酢酸緩衝液、ギ酸、又はクロロホルムなどの極性プロトン性溶媒を使用することができる。一部の場合では、両親媒性物質及び抗原をどちらも可溶化するために同じ溶媒を使用することができ、その後、可溶化した抗原及び可溶化した両親媒性物質を混合する。或いは、抗原及び両親媒性物質を可溶化の前に混合し、その後、一緒に可溶化してもよい。さらなる代替実施形態では、両親媒性物質又は抗原のうちの１つのみを可溶化し、可溶化していない構成成分を添加する。
[00322]特定の実施形態では、ワクチンを調製するために、抗原及びアジュバントを、ＤＯＰＣ及びコレステロール（Ｌｉｐｏｉｄ、ドイツ）を含む酢酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ９．５）中で再溶解する。その後、これらのワクチン構成成分を凍結乾燥させて乾燥ケークを形成する。注射の直前に、乾燥ケークをＩＳＡ５１ ＶＧ油（ＳＥＰＰＩＣ、フランス）中に再懸濁させて油ベースのデポー形成ワクチンを調製するか、又は水中に再懸濁させて水性ベースのデポー非形成ワクチンを調製する。
[00323]別の実施形態では、ワクチンを調製するために、抗原を、ＤＯＰＣ及びコレステロール（Ｌｉｐｏｉｄ、ドイツ）を含む３０％のｔｅｒｔ−ブタノール中で再溶解する。この抗原−脂質混合物にアジュバントを添加し、凍結乾燥させて乾燥ケークを形成する。注射の直前に、乾燥ケークをＩＳＡ５１ ＶＧ油（ＳＥＰＰＩＣ、フランス）中に再懸濁させて油ベースのデポー形成ワクチンを調製するか、又は水中に再懸濁させて水性ベースのデポー非形成ワクチンを調製する。
[00324]上記実施形態では、溶媒の除去（乾燥）により、抗原を含めたワクチン構成成分が、両親媒性物質分子のアレイ中に、その親水性頭部基がワクチン構成成分に向けられて残る。ワクチン構成成分及び両親媒性物質は本明細書中に記載のように十分に疎水性となっているため、その後、これらを油などの疎水性担体中に懸濁させることができる。
[00325]別の実施形態では、ワクチンを調製するために、抗原（複数可）と任意選択でヘルパーＴエピトープ及び／又はアジュバントを、ＤＯＰＣ及びコレステロール（Ｌｉｐｏｉｄ、ドイツ）を含むリン酸緩衝液中で配合し得る。その後、これらのワクチン構成成分を凍結乾燥させて乾燥ケークを形成する。注射の直前に、乾燥ケークをモンタニドＩＳＡ５１ ＶＧ油（ＳＥＰＰＩＣ、フランス）中に再懸濁させて油ベースのデポー形成ワクチンを調製するか、又は水中に再懸濁させて水性ベースのデポー非形成ワクチンを調製する。
[00326]ヘルパーＴエピトープ及びアジュバントなどの、本明細書中に記載の追加の構成成分は、配合プロセスの任意の段階で添加し得る。たとえば、１つ又は複数のそのような追加の構成成分は、可溶化の前若しくは後のどちらかに抗原又は両親媒性物質と合わせるか、又は可溶化した混合物に添加してもよい。別の実施形態では、その代わりに、追加の構成成分を、抗原及び両親媒性物質の乾燥混合物に添加する若しくはそれと合わせるか、又は、抗原及び両親媒性物質の乾燥混合物を疎水性担体中に再懸濁させる前若しくは後のどちらかに、疎水性若しくは水性の担体と合わせてもよい。一実施形態では、ヘルパーＴエピトープは、抗原と同じ方法でワクチン組成物に添加する。一実施形態では、抗原及びヘルパーＴエピトープは融合ペプチドである。
[00327]一部の実施形態では、乾燥ケークのワクチン構成成分を疎水性担体中に再懸濁させる際にそれらの安定化を補助するために、乳化剤を疎水性担体中に含めることが適切であり得る。乳化剤は、抗原及び両親媒性物質の乾燥混合物を疎水性担体中に再懸濁させ、疎水性担体中で抗原及び両親媒性物質を懸濁状態に維持するために十分な量で提供する。たとえば、乳化剤は、疎水性担体の約５％〜約１５％の重量／重量又は重量／体積で存在し得る。
[00328]デポー非形成ワクチンに両親媒性物質を含めることは、典型的には必要ないことが理解されよう。したがって、一部の実施形態では、デポー非形成ワクチンは、両親媒性物質を用いずに調製し得る。
[00329]ワクチン構成成分のうちの任意のものの貯蔵寿命を延長させるために生物活性を維持する又は化学安定性を改善させる、糖、抗酸化剤、又は保存料などの安定化剤を、そのような組成物に添加し得る。
[00330]免疫応答及び治療の効能
[00331]本開示は、対象において抗原に対する免疫応答を強化する方法、対応する使用、並びにそのような方法において使用し得るワクチン及びキットに関する。
[00332]本明細書中で言及する「免疫応答」は、細胞媒介性免疫応答又は液性免疫応答のどちらかであり得る。
[00333]特定の実施形態では、本明細書中に開示する方法は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）免疫応答を強化するために使用し得る。
[00334]本明細書中で使用する用語「細胞媒介性免疫応答」、「細胞性免疫」、又は「細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）免疫応答」（本明細書中で互換性があるように使用される）とは、マクロファージ及びナチュラルキラー細胞の活性化、抗原特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球の産生、並びに／又は抗原に応答した様々なサイトカインの放出によって特徴づけられた免疫応答をいう。細胞毒性Ｔリンパ球は、感染した体性又は腫瘍細胞の死滅を誘導することができるＴリンパ球の部分群（白血球の一種）であり、これらは、ウイルス（若しくは他の病原体）に感染した細胞、又は他の様式で損傷若しくは機能不全となった細胞を死滅させる。
[00335]ほとんどの細胞毒性Ｔ細胞は、クラスＩ ＭＨＣ分子と結合した特異的なペプチド抗原を認識することができるＴ細胞受容体を発現する。典型的には、細胞毒性Ｔ細胞はＣＤ８（すなわちＣＤ８＋Ｔ細胞）も発現し、これはクラスＩ ＭＨＣ分子の一部分に誘引される。この親和性により、抗原特異的活性化中に細胞毒性Ｔ細胞及び標的細胞が密に一緒に結合されて保たれる。
[00336]細胞性免疫は、たとえば、ウイルス感染細胞、細胞内細菌を有する細胞、及び腫瘍抗原を表示している癌細胞などの、その表面上に外来抗原のエピトープを表示している体細胞を溶解すること、マクロファージ及びナチュラルキラー細胞を活性化して、それらが細胞内病原体を破壊することを可能にすること、並びに、細胞を刺激して、適応免疫応答及び自然免疫応答に関与している他の細胞機能に影響を与える様々なサイトカインを分泌させることができる、抗原特異的細胞毒性Ｔリンパ球（たとえば抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞）を活性化することによって、身体を保護する。
[00337]細胞性免疫は、適応免疫応答、続いて、樹状細胞、Ｂリンパ球、及びより低い程度でマクロファージなどの抗原提示細胞とのその相互作用を介した、細胞による抗原の認識の重要な構成成分であり、たとえば以下の様々な機構によって身体を保護する：
１．ウイルス感染細胞、細胞内細菌を有する細胞、及び腫瘍抗原を表示している癌細胞などの、その表面上に外来抗原のエピトープを表示する体細胞においてアポトーシスを誘導することができる抗原特異的細胞毒性Ｔリンパ球を活性化すること、
２．マクロファージ及びナチュラルキラー細胞を活性化して、それらが細胞内病原体を破壊することを可能にすること、並びに
３．適応免疫応答及び自然免疫応答に関与している他の細胞機能に影響を与える様々なサイトカインを分泌する細胞を刺激すること。
[00338]細胞性免疫は、ウイルス感染細胞を除去するために最も有効であるが、真菌、原虫、癌、及び細胞内細菌に対する防御にも関与している。これは移植片拒絶においても主要な役割を果たす。
[00339]細胞性免疫は様々な細胞種の関与を含み、様々な機構によって媒介されるため、ワクチン接種後の免疫の誘導を実証するために、いくつかの方法を使用することができる。これらは、ｉ）特異的抗原提示細胞の検出、ｉｉ）特異的エフェクター細胞及びその機能の検出、並びにｉｉｉ）サイトカインなどの可溶性媒介因子の放出の検出へと広く分類することができる。
[00340]ｉ）抗原提示細胞：樹状細胞及びＢ細胞（及びより低い程度でマクロファージ）は、Ｔ細胞の増強された活性化を可能にする特殊な免疫賦活性受容体を備えており、プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）と呼ばれる。これらの免疫賦活性分子（共刺激分子とも呼ばれる）は、感染症又はワクチン接種後、ＣＤ４及びＣＤ８細胞毒性Ｔ細胞などのエフェクター細胞への抗原提示プロセス中に、これらの細胞上で上方調節される。そのような共刺激分子（ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩ、又はＭＨＣクラスＩＩなど）は、たとえば、これらの分子に向けられた、蛍光色素とコンジュゲートした抗体を、ＡＰＣを特異的に同定する抗体（樹状細胞用のＣＤ１１ｃなど）と共に用いたフローサイトメトリーを使用して、検出することができる。
[00341]ｉｉ）細胞毒性Ｔ細胞：（Ｔｃ、キラーＴ細胞、又は細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）としても知られる）は、ウイルス（及び他の病原体）に感染した細胞、又は腫瘍抗原を発現する細胞の死滅を誘導するＴ細胞の部分群である。これらのＣＴＬは、特定の外来又は異常分子をその表面上に保有する他の細胞を直接攻撃する。そのような細胞毒性の能力は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞溶解性アッセイ（クロム放出アッセイ）を使用して検出することができる。したがって、適応細胞性免疫の誘導は、そのような細胞毒性Ｔ細胞の存在によって実証することができ、ここで、抗原がロードされた標的細胞は、ワクチン接種又は感染症後にｉｎ ｖｉｖｏで産生される特異的ＣＴＬによって溶解される。
[00342]ナイーブ細胞毒性Ｔ細胞は、そのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が、ペプチド結合したＭＨＣクラスＩ分子と強力に相互作用した際に活性化される。この親和性は、抗原／ＭＨＣ複合体の種類及び配向に依存し、これにより、ＣＴＬと感染細胞が一緒に結合して保たれる。活性化された後、ＣＴＬはクローン増殖と呼ばれるプロセスを受け、ここでこれは機能性を獲得し、迅速に分裂して、「武装」エフェクター細胞の軍隊が生成される。その後、活性化されたＣＴＬは、そのユニークなＭＨＣクラスＩ＋ペプチドを保有する細胞を探索して身体全体を移動する。このことは、ペプチド−ＭＨＣクラスＩ四量体をフローサイトメトリーアッセイにおいて使用することによって、そのようなＣＴＬをｉｎ ｖｉｔｒｏで同定するために使用することができる。
[00343]これらの感染した又は機能不全の体細胞に曝露された際、エフェクターＣＴＬは、標的細胞の形質膜に孔を形成し、イオン及び水を感染細胞内に流入させ、それが破裂又は溶解することを引き起こす細胞毒素である、パーフォリン及びグラニュリシンを放出する。ＣＴＬは、孔を介して細胞に入ってアポトーシス（細胞死）を誘導するセリンプロテアーゼである、グランザイムを放出する。ＣＴＬからのこれらの分子の放出は、ワクチン接種後の細胞性免疫応答の誘導の成功の測度として使用することができる。これは、ＣＴＬを定量的に測定することができる、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）又は酵素結合免疫スポットアッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴ）によって行うことができる。ＣＴＬはＩＦＮ−γなどの重要なサイトカインを産生することもできるため、ＩＦＮ−γ産生ＣＤ８細胞の定量的測定は、ＥＬＩＳＰＯＴによって、及びこれらの細胞中の細胞内ＩＦＮ−γのフローサイトメトリー測定によって達成することができる。
[00344]ＣＤ４＋「ヘルパー」Ｔ細胞：ＣＤ４＋リンパ球、又はヘルパーＴ細胞は、免疫応答媒介因子であり、適応免疫応答の能力を確立及び最大化することにおいて重要な役割を果たす。これらの細胞は細胞毒性又は食作用活性を有さず、感染細胞を死滅させたり病原体を除去したりすることはできないが、他の細胞がこれらの任務を行うように指示することによって、実質的に免疫応答を「管理する」。それぞれ異なる種類の病原体を排除するように設計されている、Ｔｈ１及びＴｈ２と命名されている２種類のエフェクターＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞応答を、プロフェッショナルＡＰＣによって誘導することができる。
[00345]ヘルパーＴ細胞は、クラスＩＩ ＭＨＣ分子と結合した抗原を認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する。ナイーブヘルパーＴ細胞の活性化によりサイトカインの放出が引き起こされ、これは、それを活性化させたＡＰＣを含めた多くの細胞種の活性に影響を与える。ヘルパーＴ細胞は、細胞毒性Ｔ細胞よりもはるかに穏やかな活性化刺激を必要とする。ヘルパーＴ細胞は、細胞毒性細胞の活性化を「助ける」追加のシグナルを提供することができる。それぞれ異なる種類の病原体を排除するように設計されている、Ｔｈ１及びＴｈ２と命名されている２種類のエフェクターＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞応答を、プロフェッショナルＡＰＣによって誘導することができる。２つのＴｈ細胞集団は、産生されるエフェクタータンパク質（サイトカイン）のパターンが異なる。一般に、Ｔｈ１細胞は、マクロファージ及び細胞毒性Ｔ細胞の活性化によって細胞性免疫応答を支援する一方で、Ｔｈ２細胞は、形質細胞への変換のためのＢ細胞の刺激によって、及び抗体の形成によって、液性免疫応答を促進する。たとえば、Ｔｈ１細胞によって調節された応答は、マウスではＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂ（ヒトではＩｇＧ１及びＩｇＧ３）を誘導し、抗原に対する細胞媒介性免疫応答を優先し得る。抗原に対するＩｇＧ応答がＴｈ２型細胞によって調節される場合、これは圧倒的にマウスではＩｇＧ１（ヒトではＩｇＧ２）の産生を増強し得る。Ｔｈ１又はＴｈ２応答に関連するサイトカインの測定は、ワクチン接種の成功の測度を与えるであろう。これは、とりわけ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−αなどのＴｈ１−サイトカイン、又はＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ１０などのＴｈ２−サイトカインのために設計された特異的ＥＬＩＳＡによって達成することができる。
[00346]ｉｉｉ）サイトカインの測定：所属リンパ節からの放出は、免疫化の成功の良好な指標を与える。抗原提示並びにＡＰＣの成熟並びにＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞の結果、いくつかのサイトカインがリンパ節細胞によって放出される。これらのＬＮＣをｉｎ ｖｉｔｒｏで抗原の存在下で培養することで、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、及びＧＭ−ＣＳＦなどの特定の重要なサイトカインの放出を測定することによって、抗原特異的免疫応答を検出することができる。これは、培養上清及び組換えサイトカインを標準として使用したＥＬＩＳＡによって行うことができる。
[00347]免疫化の成功は、それだけに限定されないが、機能的抗体を検出するための血球凝集阻害（ΗＡＩＪ）及び血清中和阻害アッセイ、ワクチン接種の有効性を決定するためにワクチン接種した対象を関連する病原体で攻撃する攻撃研究、及び、たとえば活性化された又は記憶リンパ球の同定において特異的細胞表面マーカーを発現する細胞集団を決定するための、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）の使用を含めた、当業者に知られているいくつかの方法で決定し得る。また、当業者は、他の既知の方法を使用しても、本発明の組成物を用いた免疫化が抗体及び／又は細胞媒介性免疫応答を誘発したかどうかを決定し得る。たとえばＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｏｌｉｇａｎら編（Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、２００７）を参照されたい。
[00348]一実施形態では、本明細書中に開示する方法は、抗体免疫応答を強化するために使用し得る。
[00349]細胞媒介性免疫に対して、「抗体免疫応答」又は「液性免疫応答」（本明細書中で互換性があるように使用される）は、Ｂリンパ球系統の細胞（Ｂ細胞）によって産生される分泌抗体によって媒介される。そのような分泌抗体は、たとえば、外来物質、病原体（たとえば、ウイルス、細菌など）、及び／又は癌細胞の表面上にあるものなどの抗原と結合し、破壊のためにそれらに旗を立てる。
[00350]本明細書中で使用する「液性免疫応答」とは、抗体産生をいい、それに加えて又はその代わりに、たとえば、ヘルパーＴ２（Ｔｈ２）又はヘルパーＴ１７（Ｔｈ１７）細胞の産生及び／又は活性化、サイトカインの産生、アイソタイプスイッチ、親和性成熟、並びに記憶細胞の活性化などの、それに伴う付随プロセスも含まれ得る。また、「液性免疫応答」には、たとえば、毒素の中和、古典的補体活性化、並びに貪食の促進及び病原体の排除などの、抗体のエフェクター機能も含まれ得る。液性免疫応答は多くの場合ＣＤ４＋Ｔｈ２細胞によって助けられ、したがって、この細胞種の活性化又は産生も液性免疫応答の指標であり得る。用語「液性免疫応答」は本明細書中で「抗体応答」又は「抗体免疫応答」と互換性があるように使用される。
[00351]「抗体」とは、免疫グロブリン遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子の断片によって実質的に又は部分的にコードされている１つ又は複数のポリペプチドを含むタンパク質である。認識されている免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α、γ、δ、ε、及びμ定常領域遺伝子、並びに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖はκ又はλのどちらかに分類される。重鎖はγ、μ、α、δ、又はεとして分類され、立ち代ってこれは、免疫グロブリンクラスであるＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥをそれぞれ定義する。典型的な免疫グロブリン（抗体）の構造単位は、４つのポリペプチドを含有するタンパク質を含む。それぞれの抗体の構造単位は、それぞれ１本の「軽」鎖及び１本の「重」鎖を有する、２つの同一のポリペプチド鎖対からなる。それぞれの鎖のＮ末端は、抗原認識を主に司っている可変領域を定義する。抗体の構造単位（たとえばＩｇＡ及びＩｇＭクラスのもの）は、互い及び追加のポリペプチド鎖と共に、たとえばＪ鎖ポリペプチドと会合したＩｇＭ五量体として、オリゴマー体へとアセンブルされ得る。
[00352]抗体は、Ｂリンパ球（Ｂ細胞）と呼ばれる白血球の部分群の、抗原特異的な糖タンパク質産物である。抗原とＢ細胞の表面上に発現された抗体との結合は、Ｂ細胞が活性化され、有糸分裂を受け、最終的には形質細胞へと分化するようにＢ細胞を刺激することを含む抗体応答を誘導することができ、抗原特異的抗体の合成及び分泌に特殊化されている。
[00353]Ｂ細胞は免疫応答中の唯一の抗体産生者であり、したがって、有効な液性免疫への主要な要素である。大量の抗体の産生に加え、Ｂ細胞は抗原提示細胞としても作用し、抗原をヘルパーＴ ＣＤ４又は細胞毒性ＣＤ８＋Ｔ細胞などのＴ細胞に提示することができ、したがって免疫応答を伝播させる。Ｂ細胞及びＴ細胞は適応免疫応答の一部である。たとえばワクチン接種又は天然感染症のいずれかによって誘導された活性免疫応答中、抗原特異的なＢ細胞が活性化され、クローンが拡大される。拡大中、Ｂ細胞はエピトープに対してより高い親和性を有するように進化する。Ｂ細胞の増殖は、活性化ヘルパーＴ細胞によって間接的に誘導することができ、ＴＬＲなどの受容体の刺激によって直接誘導することができる。
[00354]樹状細胞及びＢ細胞などの抗原提示細胞はワクチン接種部位へと引き寄せられ、ワクチン組成物に含有される抗原及びアジュバントと相互作用することができる。典型的には、アジュバントは、細胞が活性化されるようにそれを刺激し、抗原は標的の青写真を提供する。様々な種類のアジュバントが様々な刺激シグナルを細胞に提供し得る。たとえば、ポリＩ：Ｃ（ＴＬＲ３作用剤）は樹状細胞を活性化することができるが、Ｂ細胞を活性化することはできない。Ｐａｍ３Ｃｙｓ、Ｐａｍ２Ｃｙｓ、及びＦＳＬ−１などのアジュバントは、Ｂ細胞の増殖を活性化及び開始することに特に熟達しており、これは抗体応答の生成を容易にすると予想されている（Ｍｏｙｌｅら、Ｃｕｒｒ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ、２００８、Ｓｏ．、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２０１２）。
[00355]液性免疫応答は、有効な感染性疾患ワクチン（たとえばウイルス又は細菌侵入物に対して保護するため）の一般的な機構の１つである。しかし、液性免疫応答も癌と闘うために有用な場合がある。癌ワクチンは、癌細胞を認識して破壊することができる細胞性免疫応答を生じるように典型的に設計されている一方で、Ｂ細胞媒介性応答は、一部の例では最大の利点のために細胞毒性Ｔ細胞と協同し得る、他の機構を介して癌細胞を標的とし得る。Ｂ細胞媒介性（たとえば液性免疫応答媒介性）の抗腫瘍応答の例には、それだけに限定されないが、以下のものが含まれる。１）腫瘍細胞又は腫瘍化に影響を与える他の細胞上に見つかる表面抗原と結合するＢ細胞によって産生される抗体であって、たとえば、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）又は補体結合を介した標的細胞の死滅を誘導し、免疫系によって認識されることができる追加の抗原の放出を潜在的にもたらすことができる抗体、２）腫瘍細胞上の受容体と結合してその刺激を遮断し、その効果を事実上中和する抗体、３）腫瘍又は腫瘍関連細胞によって放出される又はそれに関連する因子と結合して、癌を支持するシグナル伝達又は細胞経路を調節する抗体、及び４）現在は未知である機構によって、細胞内標的と結合して抗腫瘍活性を媒介する抗体が含まれる。
[00356]抗体応答を評価する一方法は、特定の抗原と反応性のある抗体の力価を測定することである。これは、動物から得られた抗体含有物質の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などの、当分野で知られている様々な方法を使用して行い得る。たとえば、特定の抗原と結合する血清抗体の力価は、抗原への曝露の前及び後の両方で、対象において決定し得る。抗原への曝露後の、抗原特異的抗体の力価の統計的に有意な増加は、対象が抗原に対する抗体応答を開始したことを示すであろう。
[00357]それだけに限定されないが、抗原特異的抗体の存在を検出するために使用し得る他のアッセイには、免疫学的アッセイ（たとえばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））、免疫沈降アッセイ、及びタンパク質ブロット（たとえばウエスタンブロット）アッセイ、並びに中和アッセイ（たとえば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏアッセイにおけるウイルス感染力の中和）が含まれる。
[00358]本明細書中に記載の方法及びワクチン組成物は、細胞媒介性免疫応答又は液性免疫応答によって寛解される疾患及び／又は障害を治療又は予防するために有用であり得る。本方法及びワクチンは、細胞媒介性免疫応答又は液性免疫応答を誘導するために抗原を対象に投与することが望まれる任意の場合において応用が見つかる。
[00359]本明細書中で使用する「治療すること」若しくは「〜の治療」、又は「予防すること」若しくは「〜の予防」とは、臨床結果を含めた有益又は所望の結果を得るための手法をいう。有益又は所望の結果には、それだけに限定されないが、１つ又は複数の症状又は状態の軽減又は寛解、疾患の程度の減退、疾患の状態の安定化、疾患の発生の予防、疾患の拡大の予防、疾患の進行の遅延又は減速（たとえば抑制）、疾患の発症の遅延又は減速、疾患原因因子に対する保護免疫の付与、及び症状の寛解又は緩和が含まれることができる。また、「治療すること」又は「予防すること」は、治療の非存在下において予測されるものを超えて患者の生存を延長させることも意味することができ、また、対象において感染症を予防することなどによって、疾患の進行を一時的に阻害すること又は疾患の発生を予防することも意味することができる。また、「治療すること」又は「予防すること」は、腫瘍塊の大きさの縮小、腫瘍の侵襲性の低下などにも言及し得る。
[00360]一実施形態では、本明細書中に開示する方法及び組成物は、それを必要としている対象において癌を治療及び／又は予防するために使用し得る。対象は癌を有し得る、又は癌を発生する危険性にあり得る。
[00361]本明細書中で使用する用語「癌」、「癌細胞」、「腫瘍」、及び「腫瘍細胞」（互換性があるように使用される）とは、細胞増殖の制御の有意な損失を特徴とする、異常な成長を示す細胞、又は不死化された細胞をいう。用語「癌」又は「腫瘍」には、転移性及び非転移性の癌又は腫瘍が含まれる。癌は、悪性腫瘍の存在を含めた、当分野において一般的に受け入れられている基準を使用して診断し得る。
[00362]それだけに限定されないが、本発明の組成物の使用又は投与によって治療及び／又は予防することができ得る癌には、癌腫、腺癌、リンパ腫、白血病、肉腫、芽細胞腫、骨髄腫、及び生殖細胞腫瘍が含まれる。それだけに限定されないが、特に適切な実施形態には、膠芽細胞腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、乳癌、輸卵管癌、前立腺癌、又は腹膜癌が含まれ得る。一実施形態では、癌はウイルスなどの病原体によって引き起こされ得る。癌の発生に関連づけられているウイルスは当業者に知られており、それだけに限定されないが、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ジョン・カニンガムウイルス（ＪＣＶ）、ヒトヘルペスウイルス８、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、メルケル細胞ポリオーマウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、及びヒトＴ細胞白血病ウイルス−１が含まれる。別の実施形態では、癌は１つ又は複数の癌特異的抗原（たとえばサバイビン）を発現するものであり得る。
[00363]特定の実施形態では、癌は、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、輸卵管癌、腹膜癌、膠芽細胞腫、又はびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である。
[00364]本明細書中に開示する方法及び組成物は、癌の治療又は予防のどちらか、たとえば、癌の重篤度の低下（たとえば腫瘍の大きさ、攻撃性、及び／若しくは侵襲性、悪性度など）、又は癌の再発の予防に有用であり得る。
[00365]別の実施形態では、本明細書中に開示する方法及び組成物は、それを必要としている対象において、ウイルス感染症によって引き起こされたものなどの感染性疾患を治療及び／又は予防するために使用し得る。対象はウイルスに感染している場合がある、又はウイルス感染症を発生する危険性にあり得る。本発明の組成物の使用又は投与によって治療及び／又は予防し得るウイルス感染症には、それだけに限定されないが、牛痘ウイルス、ワクシニアウイルス、偽牛痘ウイルス、ヒトヘルペスウイルス１、ヒトヘルペスウイルス２、サイトメガロウイルス、ヒトアデノウイルスＡ〜Ｆ、ポリオーマウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、パルボウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、オルトレオウイルス、ロタウイルス、エボラウイルス、パラインフルエンザウイルス、インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルス、インフルエンザＣ型ウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、風疹ウイルス、ニューモウイルス、ヒト呼吸器合胞体ウイルス、狂犬病ウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、ハンタンウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、コロナウイルス、エンテロウイルス、ライノウイルス、ポリオウイルス、ノロウイルス、フラビウイルス、デングウイルス、西ナイルウイルス、黄熱ウイルス、及び水痘が含まれる。特定の実施形態では、ウイルス感染症は、ヒトパピローマウイルス、エボラウイルス、ヒト呼吸器合胞体ウイルス、又はインフルエンザウイルスである。
[00366]別の実施形態では、本明細書中に開示する方法又は組成物は、それを必要としている対象において、非ウイルス病原体（細菌又は原虫など）によって引き起こされたものなどの感染性疾患を治療及び／又は予防するために使用し得る。対象は病原体に感染している場合がある、又は病原体による感染症を発生する危険性にあり得る。それだけに限定されないが、例示的な細菌病原体には、炭疽菌（バチルス・アントラシス）、ブルセラ属、百日咳菌、カンジダ属、肺炎クラミジア、オウム病クラミジア、コレラ、ボツリヌス菌、コクシジオイデス・イミチス、クリプトコッカス属、ジフテリア、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７、腸管出血性大腸菌、腸内毒素原性大腸菌、インフルエンザ菌、ピロリ菌、レジオネラ属、レプトスピラ属、リステリア属、髄膜炎菌、肺炎マイコプラズマ、マイコバクテリウム属、百日咳、肺炎、サルモネラ属、シゲラ属、ブドウ球菌属、肺炎連鎖球菌、及びエンテロコリチカ菌が含まれ得る。特定の実施形態では、細菌感染症は炭疽菌である。それだけに限定されないが、例示的な原虫病原体には、マラリアを引き起こすプラスモジウム属のもの（熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、又は二日熱マラリア原虫）が含まれ得る。
[00367]別の実施形態では、本明細書中に開示する方法又は組成物は、神経変性疾患が抗原の発現に関連している場合、それを必要としている対象において神経変性疾患を治療及び／又は予防するために使用し得る。対象は神経変性疾患を有し得る、又は神経変性疾患を発生する危険性にあり得る。本明細書中に開示する方法又は組成物によって治療及び／又は予防し得る神経変性疾患には、それだけに限定されないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）が含まれる。
[00368]別の実施形態では、本明細書中に開示する方法又は組成物は、嗜癖疾患（たとえばコカインに対する嗜癖など）を治療及び／又は予防するために使用し得る。
[00369]キット、組合せ、及び試薬
[00370]本発明の方法を実施するために、本明細書中に記載の組成物は、使用者に任意選択でキットとして提供し得る。たとえば、本発明のキットは、本発明のワクチン組成物の１つ又は複数の構成成分を含有する。キットは、１つ又は複数の追加の試薬、梱包材料、キットの構成成分を保持する容器、及びキット構成成分を使用するための好ましい方法を詳述する指示一式又は使用者マニュアルをさらに含むことができる。一実施形態では、容器はバイアルである。
[00371]一実施形態では、キットは、別々の容器中にすぐに使用できる様式で事前に配合した、デポー形成及びデポー非形成ワクチンをどちらも含有する。一例として、一実施形態では、キットは、１つ又は複数の抗原及び疎水性担体を含むデポー形成ワクチンを含む少なくとも１つの容器と、１つ又は複数の抗原を含むデポー非形成ワクチンを含む少なくとも１つの容器と、水性担体とを含む。
[00372]一代替実施形態では、キットは、容器中にすぐに使用できる様式で事前に配合した、デポー形成ワクチン又はデポー非形成ワクチンのどちらかのうちの１つのみを含有する。他のワクチンは、担体以外のすべての構成成分を、１つの容器（たとえば乾燥ケーク）中に、適切な担体（たとえば疎水性担体又は水性担体）中ですぐに再溶解できるように、又は、適切な担体（たとえば疎水性担体又は水性担体）中で配合及び再溶解するための別々の容器中の個々の構成成分として、提供し得る。特定の実施形態では、デポー非形成ワクチンは事前に配合したすぐに使用できる様式で提供する一方で、デポー形成ワクチンの構成成分は疎水性担体中での再溶解又は配合及び再溶解を必要とする形態で提供する。
[00373]上記キットの実施形態の様々な態様では、抗原及び担体に加えて、デポー形成ワクチン及び／又はデポー非形成ワクチンは、ヘルパーＴエピトープ、アジュバント、両親媒性物質、及び乳化剤のうちの１つ又は複数を任意選択でさらに含み得る。これらの構成成分は、個々に別々の容器で提供し得るか、又はその任意の組合せで容器中に一緒に提供し得る。
[00374]さらなる代替実施形態では、キットは、適切な担体以外のワクチン構成成分を含む少なくとも１つの容器を含有する。本実施形態では、キットは、追加の別々の容器中に、ワクチン構成成分を再溶解するための疎水性担体及び水性担体のうちの一方又は両方を含むことができる。これらの実施形態では、ワクチン構成成分は、適切な担体中ですぐに再懸濁させることができる乾燥ケークの形態であり得る。
[00375]一実施形態では、キットは、１つ又は複数の抗原並びに任意選択でヘルパーＴエピトープ、アジュバント、両親媒性物質、及び乳化剤のうちの１つ又は複数を含む１つの容器と、疎水性担体を含む少なくとも１つの容器と、水性担体を含む少なくとも１つの容器とを含み、１つ又は複数の抗原並びに任意選択でヘルパーＴエピトープ、アジュバント、両親媒性物質のうちの１つ又は複数を含む容器は、疎水性担体又は水性担体を用いた再溶解によってデポー形成ワクチン及びデポー非形成ワクチンの両方を調製するために十分な量のそれぞれの構成成分を含む。
[00376]別の実施形態では、キットは少なくとも２つの容器を含み、それぞれの容器は、１つ又は複数の抗原並びに任意選択でヘルパーＴエピトープ、アジュバント、両親媒性物質、及び乳化剤のうちの１つ又は複数と、疎水性担体を含む少なくとも１つの容器と、水性担体を含む少なくとも１つの容器とを含み、抗原並びに任意選択でヘルパーＴエピトープ、アジュバント、両親媒性物質、及び乳化剤の少なくとも１つの容器は、疎水性担体を用いて再溶解してデポー形成ワクチンを調製するためのものであり、抗原並びに任意選択でヘルパーＴエピトープ、アジュバント、両親媒性物質、及び乳化剤の少なくとも１つの容器は、水性担体を用いて再溶解してデポー非形成ワクチンを調製するためのものである。
[00377]特定の実施形態では、キットは、それぞれが１つ又は複数の抗原、ヘルパーＴエピトープ、アジュバント、及び脂質を含む少なくとも２つの容器と、疎水性担体を含む少なくとも１つの容器と、水性担体を含む少なくとも１つの容器とを含み、抗原、ヘルパーＴエピトープ、アジュバント、及び脂質の少なくとも１つの容器が、疎水性担体を用いて再溶解してデポー形成ワクチンを調製するためのものであり、抗原、ヘルパーＴエピトープ、アジュバント、及び脂質の少なくとも１つの容器が、水性担体を用いて再溶解してデポー非形成ワクチンを調製するためのものである。
[00378]他の実施形態では、デポー形成及びデポー非形成ワクチンを別々のキット中で提供し得る。一実施形態では、それぞれの対応するキット中、デポー形成又はデポー非形成ワクチンは単一のすぐに使用できるバイアルとして提供する。別の実施形態では、それぞれの対応するキット中、デポー形成又はデポー非形成ワクチンの任意の数の構成成分を、個々に、又は構成成分の任意の組合せとして、適切な担体中で配合及び再溶解する別々の容器中で提供する。
[00379]キットの一実施形態では、ヘルパーＴエピトープはアミノ酸配列ＦＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ（配列番号６３）を含むペプチドである。
[00380]キットの一実施形態では、アジュバントはポリＩ：Ｃポリヌクレオチドである。
[00381]キットの一実施形態では、両親媒性物質は、リン脂質などの１つ又は複数の脂質である。一実施形態では、脂質は１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）及びコレステロールである。
[00382]キットの一実施形態では、１つ又は複数の抗原は本明細書中に記載の１つ又は複数のサバイビン抗原を含む。キットの特定の実施形態では、１つ又は複数の抗原は、アミノ酸配列ＦＴＥＬＴＬＧＥＦ（配列番号５５）、ＬＭＬＧＥＦＬＫＬ（配列番号２）、ＲＩＳＴＦＫＮＷＰＫ（配列番号５８）、ＳＴＦＫＮＷＰＦＬ（配列番号５９）、又はＬＰＰＡＷＱＰＦＬ（配列番号６０）を含む５つのペプチド抗原の混合物を含む。
[00383]キットの一実施形態では、抗原は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に由来するペプチド抗原である。
[00384]一実施形態では、キットは、ＤＮＡ複製を妨げる薬剤をさらに含有し得る。ＤＮＡ複製を妨げる薬剤は、別の容器を用いてキット中に含め得るか、又は薬剤を他の構成成分と共に含め得る。特定の実施形態では、キット中に含めるＤＮＡ複製を妨げる薬剤は、たとえばシクロホスファミドなどのアルキル化剤である。
[00385]当業者には、キットの別のアレンジが可能であり、本明細書中の開示によって包含されることを理解されよう。
[00386]本明細書中に開示のキットは、本明細書中に開示する方法の実施において使用し得る。一実施形態では、キットは、デポー形成ワクチンを用いて免疫応答をプライミングし、デポー非形成ワクチンを用いて免疫応答を維持及び／又はブーストすることによって、対象における免疫応答の強化において使用するためのものである。特に適切であり得る一実施形態では、デポー形成ワクチンは水を含まない又は水を実質的に含まない。
[00387]また、本開示は、本明細書中に開示する方法を実施するための組合せにも関する。一実施形態では、本発明は、本明細書中に開示の方法において使用するための、疎水性担体中に１つ又は複数の抗原を含むデポー形成ワクチンと同じ１つ又は複数の抗原を含むデポー非形成ワクチンとの組合せに関する。デポー形成及びデポー非形成ワクチンは、本明細書中に開示する実施形態のうちの任意の１つであり得る。
[00388]より詳細には、一実施形態では、本開示は、対象に少なくとも１回の用量のデポー形成ワクチンを投与し、続いて対象に少なくとも１回の用量のデポー非形成ワクチンを投与する、対象において抗原に対する免疫応答を強化する方法で使用するための、疎水性担体中に１つ又は複数の抗原を含むデポー形成ワクチンと１つ又は複数の抗原を含むデポー非形成ワクチンとの組合せに関する。上述のように、デポー形成及びデポー非形成ワクチンは本明細書中に開示する実施形態のうちの任意の１つであり得る。
[00389]実施形態
[00390]本開示の特定の実施形態には、それだけには限定されないが、以下のものが含まれる。
[00391]（１）対象において抗原に対する免疫応答を強化する方法であって、（ｉ）少なくとも１回の用量の、疎水性担体中に１つ又は複数の抗原を含むデポー形成ワクチンを前記対象に投与するステップと、（ｉｉ）続いて、少なくとも１回の用量の、上記１つ又は複数の抗原を含むデポー非形成ワクチンを強化する方法であって、対象に投与するステップとを含む、方法。
[00392]（２）上記少なくとも１回の用量の上記デポー形成ワクチンのそれぞれが、上記１つ又は複数の抗原に対する免疫応答を誘導することができるプライム用量である、段落（１）に記載の方法。
[00393]（３）上記少なくとも１回の用量の上記デポー非形成ワクチンのそれぞれが、上記１つ又は複数の抗原に対する免疫応答を維持及び／又はブーストすることができる維持又はブースト用量である、段落（１）又は（２）に記載の方法。
[00394]（４）上記デポー非形成ワクチンの初回の維持又はブースト用量を、上記デポー形成ワクチンの最終プライム用量の約１日、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、又は１０週間以内に投与することを含む、段落（３）に記載の方法。
[00395]（５）上記デポー非形成ワクチンの初回の維持又はブースト用量を、上記デポー形成ワクチンの最終プライム用量の約１日、１週間、２週間、３週間、又は４週間以内に投与することを含む、段落（３）に記載の方法。
[00396]（６）上記少なくとも１回の用量の上記デポー形成ワクチンが１、２、３、４、又は５回の用量である、段落（１）〜（５）のいずれか一項に記載の方法。
[00397]（７）上記少なくとも１回の用量の上記デポー形成ワクチンが１又は２回の用量である、段落（１）〜（６）のいずれか一項に記載の方法。
[00398]（８）上記少なくとも１回の用量の上記デポー非形成ワクチンが１、２、３、４、又は５回の用量である、段落（１）〜（７）のいずれか一項に記載の方法。
[00399]（９）上記少なくとも１回の用量の上記デポー非形成ワクチンが、１日１回、週に１回、２週間に１回、３週間に１回、又は月に１回の連続的な反復投薬である、段落（１）〜（７）のいずれか一項に記載の方法。
[00400]（１０）初回用量の上記デポー非形成ワクチンの後、上記デポー非形成ワクチンのそれぞれの後続用量を、直前の用量の約１日、１週間、２週間、３週間、又は４週間以内に投与する、段落（１）〜（９）のいずれか一項に記載の方法。
[00401]（１１）初回用量の上記デポー形成ワクチンの後、上記デポー形成ワクチンのそれぞれの後続用量を、直前の用量の約１日、１週間、２週間、３週間、又は４週間以内に投与する、段落（１）〜（１０）のいずれか一項に記載の方法。
[00402]（１２）２回の用量の上記デポー形成ワクチンを、上記デポー非形成ワクチンを投与する前に投与することを含む、段落（１）〜（１１）のいずれか一項に記載の方法。
[00403]（１３）１回の用量の上記デポー形成ワクチンを、上記デポー非形成ワクチンを投与する前に投与することを含む、段落（１）〜（１０）のいずれか一項に記載の方法。
[00404]（１４）上記デポー形成ワクチンを０日目及び２１日目に投与することを含む、段落（１２）に記載の方法。
[00405]（１５）上記デポー形成ワクチンを０日目及び２１日目に投与すること、及び上記デポー非形成ワクチンを４２日目に投与することを含む、段落（１２）に記載の方法。
[00406]（１６）上記デポー形成ワクチンを０日目に投与すること、及び上記デポー非形成ワクチンを２１日目及び４２日目に投与することを含む、段落（１３）に記載の方法。
[00407]（１７）上記デポー非形成ワクチンの投与が、４２日目の後は３週間に１回続けられる、段落（１４）〜（１６）のいずれか一項に記載の方法。
[00408]（１８）ＤＮＡ複製を妨げる薬剤を対象に投与することをさらに含む、段落（１）〜（１７）のいずれか一項に記載の方法。
[00409]（１９）上記ＤＮＡ複製を妨げる薬剤がシクロホスファミドである、段落（１８）に記載の方法。
[00410]（２０）１サイクルの低用量の規則的なシクロホスファミドを含む、段落（１９）に記載の方法。
[00411]（２１）上記サイクルが、上記シクロホスファミドを、１日１回、２週間毎に開始する７日間の連続した日数の期間の間、上記対象に投与することを含む、段落（２０）に記載の方法。
[00412]（２２）上記シクロホスファミドを上記デポー形成ワクチンの上記初回投与の７日前に最初に投与する、段落（２１）に記載の方法。
[00413]（２３）免疫応答チェックポイント阻害剤を対象に投与することをさらに含む、段落（１）〜（２２）のいずれか一項に記載の方法。
[00414]（２４）上記免疫応答チェックポイント阻害剤が、プログラム死−リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、プログラム死１（ＰＤ−１）、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ２、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、４１ＢＢ、２Ｂ４、Ａ２ａＲ、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１６０、ＣＤ２２６、ＣＤ２７６、ＤＲ３、ＧＡＬ９、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、誘導性Ｔ細胞共刺激（ＩＣＯＳ）、ＫＩＲ、ＬＡＩＲ１、ＬＩＧＨＴ、コラーゲン様構造を有するマクロファージ受容体（ＭＡＲＣＯ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ＯＸ−４０、ＳＬＡＭ、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＶＴＣＮ１、又はその任意の組合せの阻害剤である、段落（２３）に記載の方法。
[00415]（２５）上記デポー形成ワクチンの上記疎水性担体が油又は油の混合物である、段落（１）〜（２４）のいずれか一項に記載の方法。
[00416]（２６）上記疎水性担体が植物油、堅果油、又は鉱物油を含む、段落（２５）に記載の方法。
[00417]（２７）上記疎水性担体が、鉱物油である、又は鉱物油溶液、たとえばモンタニド（登録商標）ＩＳＡ ５１中のオレイン酸マンニドである、段落（２５）に記載の方法。
[00418]（２８）上記デポー形成ワクチンが水を実質的に含まない、段落（１）〜（２７）のいずれか一項に記載の方法。
[00419]（２９）上記デポー形成ワクチンが水を含まない、段落（１）〜（２７）のいずれか一項に記載の方法。
[00420]（３０）上記１つ又は複数の抗原が上記油中に混和性であるように、上記１つ又は複数の抗原が十分に疎水性である、又は十分に疎水性にする、段落（２５）〜（２９）のいずれか一項に記載の方法。
[00421]（３１）上記１つ又は複数の抗原が天然に疎水性である、段落（３０）に記載の方法。
[00422]（３２）上記１つ又は複数の抗原の疎水性が上記抗原の修飾によって増加されている、段落（３０）に記載の方法。
[00423]（３３）上記１つ又は複数の抗原が脂質化によって修飾されたペプチド抗原である、段落（３２）に記載の方法。
[00424]（３４）上記脂質化が、Ｎ末端のミリストイル化、コレステロールのＣ末端付着、Ｃ末端又はその付近のシステイン残基のＳ−プレニル化、システイン残基のＳ−パルミトイル化、及びアジュバント活性を有する脂質の付着のうちの１つ又は複数である、段落（３３）に記載の方法。
[00425]（３５）上記アジュバント活性を有する脂質が、ジパルミトイル−Ｓ−グリセリル−システイン（ＰＡＭ２Ｃｙｓ）、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリル−システイン（ＰＡＭ３Ｃｙｓ）、パルミチン酸、又は他のリポアミノ酸を含む、段落（３４）に記載の方法。
[00426]（３６）上記アジュバント活性を有する脂質がＰａｍ−２−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）４又はＰａｍ−３−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）４である、段落（３５）に記載の方法。
[00427]（３７）疎水性イオン対合を使用して上記１つ又は複数の抗原を疎水性分子、化合物、又は複合体と非共有結合で複合体化する、段落（３０）に記載の方法。
[00428]（３８）上記疎水性イオン対合の技法が、正荷電の抗原と負荷電の有機分子、化合物、又は複合体との間の静電気的相互作用によって免疫原性複合体を形成することを含む、段落（３７）に記載の方法。
[00429]（３９）上記負荷電の有機分子、化合物、又は複合体がサポニン又はサポニン複合体である、段落（３８）に記載の方法。
[00430]（４０）上記１つ又は複数の抗原が、上記デポー形成ワクチン中の両親媒性物質の存在によって十分に疎水性になる、段落（３０）に記載の方法。
[00431]（４１）上記両親媒性物質が上記１つ又は複数の抗原と密に会合して、上記１つ又は複数の抗原が上記疎水性担体中で混和性になる、段落（４０）に記載の方法。
[00432]（４２）上記両親媒性物質がシート又は小胞構造を形成し、上記１つ又は複数の抗原を部分的に又は完全に取り囲む、段落（４１）に記載の方法。
[00433]（４３）上記両親媒性物質が脂質である、段落（４０）〜（４２）のいずれか一項に記載の方法。
[00434]（４４）上記脂質が上記１つ又は複数の抗原の周りに閉じた小胞構造を形成する、段落（４３）に記載の方法。
[00435]（４５）上記閉じた小胞構造が単層小胞構造（たとえばミセル）又は二重層小胞構造（たとえば単層若しくは多重膜リポソーム）である、段落（４４）に記載の方法。
[00436]（４６）上記脂質がリン脂質である、段落（４３）〜（４５）のいずれか一項に記載の方法。
[00437]（４７）上記デポー非形成ワクチンが水性担体を含む、段落（１）〜（４６）のいずれか一項に記載の方法。
[00438]（４８）上記水性担体が水又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である、段落（４７）に記載の方法。
[00439]（４９）上記デポー形成ワクチン及び／又は上記デポー非形成ワクチンがアジュバントをさらに含む、段落（１）〜（４８）のいずれか一項に記載の方法。
[00440]（５０）上記アジュバントがポリＩ：Ｃポリヌクレオチドである、段落（４９）に記載の方法。
[00441]（５１）上記１つ又は複数の抗原が、（ｉ）たとえば、エボラウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、若しくは四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）などのウイルス、細菌、若しくは原虫に由来する、（ｉｉ）たとえばサバイビン抗原などの膜表面結合癌抗原である、又は（ｉｉｉ）たとえばコカインなどの毒素である、段落（１）〜（５０）のいずれか一項に記載の方法。
[00442]（５２）上記１つ又は複数の抗原が、少なくとも１つのＢ細胞エピトープ、少なくとも１つのＣＴＬエピトープ、又はその組合せを含む、段落（１）〜（５１）のいずれか一項に記載の方法。
[00443]（５３）上記抗原がサバイビン抗原である、段落（１）〜（５２）のいずれか一項に記載の方法。
[00444]（５４）上記サバイビン抗原が、サバイビンタンパク質からのアミノ酸配列を含むペプチド抗原（配列番号５３）、又は上記ペプチド抗原をコードしている核酸分子である、段落（５３）に記載の方法。
[00445]（５５）上記抗原が、アミノ酸配列ＦＥＥＬＴＬＧＥＦ（配列番号５４）、ＦＴＥＬＴＬＧＥＦ（配列番号５５）、ＬＴＬＧＥＦＬＫＬ（配列番号５６）、ＬＭＬＧＥＦＬＫＬ（配列番号２）、ＲＩＳＴＦＫＮＷＰＦ（配列番号５７）、ＲＩＳＴＦＫＮＷＰＫ（配列番号５８）、ＳＴＦＫＮＷＰＦＬ（配列番号５９）、及びＬＰＰＡＷＱＰＦＬ（配列番号６０）、若しくはその任意の組合せを含むペプチド抗原、又は上記ペプチド抗原をコードしている核酸分子である、段落（１）〜（５２）のいずれ一項に記載の方法。
[00446]（５６）上記１つ又は複数の抗原が、アミノ酸配列ＦＴＥＬＴＬＧＥＦ（配列番号５５）、ＬＭＬＧＥＦＬＫＬ（配列番号２）、ＲＩＳＴＦＫＮＷＰＫ（配列番号５８）、ＳＴＦＫＮＷＰＦＬ（配列番号５９）、又はＬＰＰＡＷＱＰＦＬ（配列番号６０）を含む５つのペプチド抗原の混合物を含む、段落（１）〜（５２）のいずれか一項に記載の方法。
[00447]（５７）上記抗原がヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に由来するペプチド抗原又は上記ペプチド抗原をコードしている核酸分子である、段落（１）〜（５２）のいずれか一項に記載の方法。
[00448]（５８）上記ＨＰＶに由来するペプチド抗原が、アミノ酸配列ＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴ（配列番号４４）、ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ（配列番号４５）、ＬＬＭＧＴＬＧＩＶ（配列番号４６）、又はＴＬＧＩＶＣＰＩ（配列番号４７）を含む、段落（５７）に記載の方法。
[00449]（５９）上記抗原が自己抗原である、段落（１）〜（５２）のいずれか一項に記載の方法。
[00450]（６０）上記抗原が癌関連抗原である、段落（１）〜（５２）のいずれか一項に記載の方法。
[00451]（６１）上記抗原が免疫原性の弱い抗原である、段落（１）〜（６０）のいずれか一項に記載の方法。
[00452]（６２）上記デポー形成ワクチン及び／又は上記デポー非形成ワクチンがヘルパーＴエピトープをさらに含む、段落（１）〜（６１）のいずれか一項に記載の方法。
[00453]（６３）上記ヘルパーＴエピトープがアミノ酸配列ＦＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ（配列番号６３）を含むペプチドである、段落（６２）に記載の方法。
[00454]（６４）上記デポー形成ワクチンが、（ｉ）アミノ酸配列ＦＴＥＬＴＬＧＥＦ（配列番号５５）、ＬＭＬＧＥＦＬＫＬ（配列番号２）、ＲＩＳＴＦＫＮＷＰＫ（配列番号５８）、ＳＴＦＫＮＷＰＦＬ（配列番号５９）、及びＬＰＰＡＷＱＰＦＬ（配列番号６０）を含む５つのサバイビンペプチド抗原、（ｉｉ）アミノ酸配列ＡＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ（配列番号６１）を含む破傷風トキソイドからのユニバーサルヘルパーＴエピトープ、（ｉｉｉ）ポリＩ：Ｃポリヌクレオチドアジュバント、（ｉｖ）１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）とコレステロール脂質混合物の脂質分子混合物、並びに（ｖ）上記疎水性担体モンタニド（登録商標）ＩＳＡ ５１ ＶＧを含む、段落（１）〜（２４）のいずれか一項に記載の方法。
[00455]（６５）上記デポー非形成ワクチンが、同じ構成成分（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）、並びに水担体を含む、段落（６４）に記載の方法。
[00456]（６６）上記デポー形成ワクチンが、（ｉ）ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に由来するペプチド抗原、（ｉｉ）アミノ酸配列ＡＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ（配列番号６１）を含む破傷風トキソイドからのユニバーサルヘルパーＴエピトープ、（ｉｉｉ）ポリＩ：Ｃポリヌクレオチドアジュバント、（ｉｖ）１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）とコレステロール脂質混合物の脂質分子混合物、及び（ｖ）上記疎水性担体モンタニド（登録商標）ＩＳＡ ５１ ＶＧを含む、段落（１）〜（２４）のいずれか一項に記載の方法。
[00457]（６７）上記デポー非形成ワクチンが、同じ構成成分（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）、並びに水担体を含む、段落（６６）に記載の方法。
[00458]（６８）上記対象において細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）免疫応答を強化するためのものである、段落（１）〜（６７）のいずれか一項に記載の方法。
[00459]（６９）上記対象において抗体免疫応答を強化するためのものである、段落（１）〜（５２）のいずれか一項に記載の方法。
[00460]（７０）上記対象が上記抗原に対して事前の免疫応答を有していない、段落（１）〜（６９）のいずれか一項に記載の方法。
[00461]（７１）癌、感染性疾患、又は嗜癖疾患を治療又は予防するためのものである、段落（６８）〜（７０）のいずれか一項に記載の方法。
[00462]（７２）癌を治療又は予防するためのものである、段落（６８）に記載の方法。
[00463]（７３）上記癌が、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、輸卵管癌、腹膜癌、膠芽細胞腫、又はびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である、段落（７１）又は（７２）に記載の方法。
[00464]（７４）上記デポー非形成ワクチンが、上記デポー形成ワクチンよりも素早く注射部位からクリアランスされる、段落（１）〜（７３）のいずれか一項に記載の方法。
[00465]（７５）上記免疫応答の強化が注射部位反応の発生率の低下を含む、段落（７４）に記載の方法。
[00466]（７６）抗原に対する免疫応答を強化するための、デポー非形成ワクチンと組み合わせたデポー形成ワクチンの使用であって、少なくとも１回の用量の、上記抗原及び疎水性担体を含む上記デポー形成ワクチンが、上記抗原を含む上記デポー非形成ワクチンの前に投与するためのものである、使用。
[00467]（７７）上記デポー形成ワクチンが上記抗原に対する上記免疫応答をプライミングし、続く上記デポー非形成ワクチンの投与が上記抗原に対する上記免疫応答を維持及び／又はブーストする、段落（７６）に記載の使用。
[00468]（７８）上記デポー非形成ワクチンが、上記デポー形成ワクチンよりも素早く注射部位からクリアランスされる、段落（７６）又は（７７）に記載の使用。
[00469]（７９）上記免疫応答の強化が注射部位反応の発生率の低下を含む、段落（７６）〜（７８）のいずれか一項に記載の使用。
[00470]（８０）上記デポー形成ワクチンが段落（２５）〜（４６）、（４９）、（５０）、（６２）、（６３）、（６４）、及び（６６）のいずれか一項に定義した通りであり、上記デポー非形成ワクチンが段落（４７）〜（５０）、（６２）、（６３）、（６５）、及び（６７）のいずれか一項に定義した通りである、段落（７６）〜（７９）のいずれか一項に記載の使用。
[00471]（８１）上記デポー形成ワクチンが段落（６４）に定義した通りであり、上記デポー非形成ワクチンが段落（６５）に定義した通りである、段落（７６）〜（８０）のいずれか一項に記載の使用。
[00472]（８２）上記デポー形成ワクチンが段落（６６）に定義した通りであり、上記デポー非形成ワクチンが段落（６７）に定義した通りである、段落（７６）〜（８１）のいずれか一項に記載の使用。
[00473]（８３）１つ又は複数の抗原及び疎水性担体を含むデポー形成ワクチンを含む少なくとも１つの容器と、上記１つ又は複数の抗原を含むデポー非形成ワクチンを含む少なくとも１つの容器とを含むキット。
[00474]（８４）上記デポー非形成ワクチンが水性担体を含む、段落（８３）に記載のキット。
[00475]（８５）上記デポー形成ワクチン及びデポー非形成ワクチンがヘルパーＴエピトープをさらに含む、段落（８３）又は（８４）に記載のキット。
[00476]（８６）上記ヘルパーＴエピトープがアミノ酸配列ＦＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ（配列番号６３）を含むペプチドである、段落（８５）に記載のキット。
[00477]（８７）上記デポー形成ワクチン及びデポー非形成ワクチンがアジュバントをさらに含む、段落（８３）〜（８６）のいずれか一項に記載のキット。
[00478]（８８）上記アジュバントがポリＩ：Ｃポリヌクレオチドである、段落（８７）に記載のキット。
[00479]（８９）上記デポー形成ワクチン及びデポー非形成ワクチンが脂質をさらに含む、段落（８３）〜（８８）のいずれか一項に記載のキット。
[00480]（９０）上記脂質が１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）である、段落（８９）に記載のキット。
[00481]（９１）それぞれが１つ又は複数の抗原、ヘルパーＴエピトープ、アジュバント、及び脂質を含む少なくとも２つの容器と、疎水性担体を含む少なくとも１つの容器と、水性担体を含む少なくとも１つの容器とを含むキットであって、抗原、ヘルパーＴエピトープ、アジュバント、及び脂質の少なくとも１つの容器が、上記疎水性担体を用いて再溶解してデポー形成ワクチンを調製するためのものであり、抗原、ヘルパーＴエピトープ、アジュバント、及び脂質の少なくとも１つの容器が、上記水性担体を用いて再溶解してデポー非形成ワクチンを調製するためのものである、キット。
[00482]（９２）上記ヘルパーＴエピトープがアミノ酸配列ＦＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ（配列番号６３）を含むペプチドである、段落（９１）に記載のキット。
[00483]（９３）上記アジュバントがポリＩ：Ｃポリヌクレオチドである、段落（９１）又は（９２）に記載のキット。
[00484]（９４）上記脂質が１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）及びコレステロールである、段落（９１）〜（９３）のいずれか一項に記載のキット。
[00485]（９５）上記１つ又は複数の抗原が、アミノ酸配列ＦＴＥＬＴＬＧＥＦ（配列番号５５）、ＬＭＬＧＥＦＬＫＬ（配列番号２）、ＲＩＳＴＦＫＮＷＰＫ（配列番号５８）、ＳＴＦＫＮＷＰＦＬ（配列番号５９）、又はＬＰＰＡＷＱＰＦＬ（配列番号６０）を含む５つのペプチド抗原の混合物を含む、段落（８３）〜（９４）のいずれか一項に記載のキット。
[00486]（９６）上記抗原がヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に由来するペプチド抗原である、段落（８３）〜（９４）のいずれか一項に記載のキット。
[00487]（９７）上記デポー形成ワクチンを用いて上記免疫応答をプライミングし、上記デポー非形成ワクチンを用いて上記免疫応答を維持及び／又はブーストすることによって、対象における免疫応答の強化において使用するための、段落（８３）〜（９６）のいずれか一項に記載のキット。
[00488]（９８）上記デポー形成ワクチンが水を含まない又は水を実質的に含まない、段落（８３）〜（９７）のいずれか一項に記載のキット。
[00489]（９９）段落（１）〜（７５）のいずれか一項に記載の方法において使用するための、１つ又は複数の抗原及び疎水性担体を含むデポー形成ワクチンと、上記１つ又は複数の抗原を含むデポー非形成ワクチンとの組合せ。
[00490]（１００）上記対象に少なくとも１回の用量の上記デポー形成ワクチンを投与し、続いて対象に少なくとも１回の用量の上記デポー非形成ワクチンを投与する、対象において抗原に対する免疫応答を強化する方法で使用するための、疎水性担体中に１つ又は複数の抗原を含むデポー形成ワクチンと、水性担体中に上記１つ又は複数の抗原を含むデポー非形成ワクチンとの組合せ。
[00491]本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに例示される。
[00492]実施例１：
[00493]６〜１２週齢の病原体を有さないＨＨＤ−ＤＲ１トランスジェニックマウスを施設内で繁殖させ、施設の指針に従って、水及び食料を自由に与え、フィルターで制御された空気循環を用いて飼育した。ＨＨＤ−ＤＲ１マウスは、ヒトＭＨＣクラスＩ及びＩＩ分子、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、並びにＨＬＡ−ＤＲ＊０１０１を発現し、対応するネズミＭＨＣ分子Ｈ−２Ｄｂ、−ＩＡ、又は−ＩＥ（β２ｍ−／−、Ｈ−２Ｄｂ−／−、ＩＡα−／−、ＩＡβ−／−、ＩＥβ−／−）を発現しない。
[00494]マウスに、油ベースのデポー形成ワクチン又は水性ベースのワクチン中で配合した５つのサバイビンペプチド抗原の混合物をワクチン接種した。それぞれのサバイビンペプチド抗原は異なるＨＬＡ（ＨＬＡ−Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ２４、及びＢ７）によって制限されている。また、ワクチン配合物は、破傷風トキソイドに由来するユニバーサルヘルパーＴエピトープ及びポリＩ：Ｃポリヌクレオチドアジュバントも含有していた。ワクチンを調製するために、まず、ペプチド及びアジュバントを、ＤＯＰＣ及びコレステロール（Ｌｉｐｏｉｄ、ドイツ）を含む酢酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ９．５）中で再溶解した。その後、ワクチン構成成分を凍結乾燥させて乾燥ケークを形成した。注射の直前に、乾燥ケークをＩＳＡ５１ ＶＧ油（ＳＥＰＰＩＣ、フランス）中に再懸濁させて油ベースの配合物を調製した、又は水中に再懸濁させて水性ベースの配合物を調製した。最終ワクチン配合物は、それぞれのサバイビンペプチド抗原を１ミリグラム／ミリリットル、ヘルパーＴを５００マイクログラム／ミリリットル、アジュバントを４００マイクログラム／ミリリットル、ＤＯＰＣを１２０ミリグラム／ミリリットル、及びコレステロールを１２ミリグラム／ミリリットルで含有していた。
[00495]ワクチン配合物の免疫原性は、ＨＨＤ−ＤＲ１トランスジェニックマウスにワクチン接種することによって試験した。５０マイクロリットル用量のそれぞれのワクチンをマウスの右脇腹に皮下投与した。第１群のマウス（ｎ＝５匹）には、上述の油ベースの配合物中で配合したペプチド及びアジュバントをワクチン接種した。第２群のマウス（ｎ＝５匹）には、上述の水性配合物中で配合したペプチド及びアジュバントをワクチン接種した。ワクチンは右脇腹に皮下送達した。免疫化の８日後、すべてのマウスを安楽死させ、右鼠径リンパ節を取り出した。単一細胞懸濁液を調製し、リンパ節細胞を、ＥＬＩＳＰＯＴプレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カリフォルニア州Ｓａｎ Ｊｏｓｅ）の抗ＩＦＮ−ガンマでコーティングされたウェル（２００，０００個の細胞／ウェル）内にローディングした。また、ＨＬＡ−Ａ２制限サバイビンペプチド（ＳｕｒＡ２．Ｍ、ＬＭＬＧＥＦＬＫＬ、配列番号２）でローディングした成熟した同系の樹状細胞、無関係のＨＬＡ−Ａ２制限ペプチド（ＡＬＭＥＱＱＨＹＶ、配列番号１）、又はローディングしていない（バックグラウンド）もウェルに加えた（２０，０００個の細胞／ウェル）。細胞をＥＬＩＳＰＯＴプレート中で１８時間インキュベートした。翌日、ＡＥＣキット（Ｓｉｇｍａ、モンタナ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）を使用してプレートを展開させ、個々のＩＦＮ−ガンマ分泌細胞を、イムノスポットプレートリーダー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ Ｌｔｄ、オハイオ州Ｓｈａｋｅｒ Ｈｅｉｇｈｔｓ）を使用して数えた。結果を図１に示す。
[00496]第１群のマウスは、ＳｕｒＡ２．Ｍペプチドを用いた刺激に対して９７スポット形成単位（ＳＦＵ）の平均応答を生じた。バックグラウンド及び無関係のペプチドに対する応答は１０ＳＦＵ未満の無視できるほどであった。ＳｕｒＡ２．Ｍ刺激によって生じた応答は、二元ＡＮＯＶＡによって無関係のペプチドに対する応答よりも有意に高かった、＊＊＊ｐ＜０．００１。
[00497]第２群のマウスは、ＳｕｒＡ２．Ｍペプチドを用いた刺激に対して２ＳＦＵの平均応答を生じた。バックグラウンド及び無関係のペプチドに対する応答は１０ＳＦＵ未満の無視できるほどであった。ＳｕｒＡ２．Ｍ刺激によって生じた応答は、二元ＡＮＯＶＡによって無関係のペプチドに対する応答と有意に差異がなかった、ｐ＞０．０５。
[00498]これらのデータは、抗原特異的免疫応答の誘導において油ベースのワクチンの投与が水性ベースのワクチンよりも有効であることを実証している。
[00499]実施例２：
[00500]６〜１２週齢の病原体を有さないＨＨＤ−ＤＲ１トランスジェニックマウスを施設内で繁殖させ、施設の指針に従って、水及び食料を自由に与え、フィルターで制御された空気循環を用いて飼育した。ＨＨＤ−ＤＲ１マウスは、ヒトＭＨＣクラスＩ及びＩＩ分子、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、並びにＨＬＡ−ＤＲ＊０１０１を発現し、対応するネズミＭＨＣ分子Ｈ−２Ｄｂ、−ＩＡ、又は−ＩＥ（β２ｍ−／−、Ｈ−２Ｄｂ−／−、ＩＡα−／−、ＩＡβ−／−、ＩＥβ−／−）を発現しない。
[00501]マウスに、油ベースのデポー形成ワクチン又は水性ベースのワクチン中で配合した５つのサバイビンペプチド抗原の混合物をワクチン接種した。それぞれのサバイビンペプチド抗原は異なるＨＬＡ（ＨＬＡ−Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ２４、及びＢ７）によって制限されている。また、ワクチン配合物は、破傷風トキソイドに由来するユニバーサルヘルパーＴエピトープ及びポリＩ：Ｃポリヌクレオチドアジュバントも含有していた。ワクチンを調製するために、まず、ペプチド及びアジュバントを、ＤＯＰＣ及びコレステロール（Ｌｉｐｏｉｄ、ドイツ）を含む酢酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ９．５）中で再溶解した。その後、ワクチン構成成分を凍結乾燥させて乾燥ケークを形成した。注射の直前に、乾燥ケークをＩＳＡ５１ ＶＧ油（ＳＥＰＰＩＣ、フランス）中に再懸濁させて油ベースの配合物を調製した、又は水中に再懸濁させて水性ベースの配合物を調製した。最終ワクチン配合物は、それぞれのサバイビンペプチド抗原を１ミリグラム／ミリリットル、ヘルパーＴを５００マイクログラム／ミリリットル、アジュバントを４００マイクログラム／ミリリットル、ＤＯＰＣを１２０ミリグラム／ミリリットル、及びコレステロールを１２ミリグラム／ミリリットルで含有していた。
[00502]また、マウスを、２０マイクログラム／キログラム／日の用量を経口投与によって７日間の連続した日の間与えた、規則的なシクロホスファミド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、モンタナ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）でも治療した。
[00503]ワクチン配合物の免疫原性は、ＨＨＤ−ＤＲ１トランスジェニックマウスにワクチン接種することによって試験した。２つの群のマウス（ｎ＝５匹）に、上述の油ベースの配合物中のペプチド抗原及びアジュバントの２回の５０マイクロリットルの免疫化を、３週間の間隔で、研究の０及び２１日目にワクチン接種した。研究の８４日目、２回目のワクチン接種の９週間後に、第１群のマウスを、同じ油ベースの配合物の５０マイクロリットル免疫化でブーストした。第２群のマウスは、水性ベースの配合物の５０マイクロリットル免疫化でブーストした。研究の全体にわたって、両群のマウスは、初回免疫化の７日前に開始して、隔週で規則的なシクロホスファミドでも治療した。ブースト免疫化の８日後、研究の９２日目に、すべてのマウスを安楽死させ、脾臓を取り出した。また、１匹のナイーブマウスも屠殺し、これはワクチン接種していない対照として役割を果たした。単一細胞懸濁液を調製し、脾細胞を、ＥＬＩＳＰＯＴプレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カリフォルニア州Ｓａｎ Ｊｏｓｅ）の抗ＩＦＮ−ガンマでコーティングされたウェル（５００，０００個の細胞／ウェル）内にローディングした。細胞を、１０マイクログラム／ミリリットルのＨＬＡ−Ａ２制限サバイビンペプチド（ＳｕｒＡ２．Ｍ、ＬＭＬＧＥＦＬＫＬ、配列番号２）、無関係のＨＬＡ−Ａ２制限ペプチド（ＡＬＭＥＱＱＨＹＶ、配列番号１）、又はペプチドを含有しない培地（バックグラウンド）で刺激した。細胞をＥＬＩＳＰＯＴプレート中で１８時間インキュベートした。翌日、ＡＥＣキット（Ｓｉｇｍａ、モンタナ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）を使用してプレートを展開させ、個々のＩＦＮ−ガンマ分泌細胞を、イムノスポットプレートリーダー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ Ｌｔｄ、オハイオ州Ｓｈａｋｅｒ Ｈｅｉｇｈｔｓ）を使用して数えた。結果を図２に示す。
[00504]第１群のマウスは、ＳｕｒＡ２．Ｍペプチドを用いた刺激に対して４２３スポット形成単位（ＳＦＵ）の平均応答を生じた。バックグラウンド及び無関係のペプチドに対する応答は１０ＳＦＵ未満の無視できるほどであった。ＳｕｒＡ２．Ｍ刺激によって生じた応答は、二元ＡＮＯＶＡによって無関係のペプチドに対する応答よりも有意に高かった、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
[00505]第２群のマウスは、ＳｕｒＡ２．Ｍペプチドを用いた刺激に対して１４７ＳＦＵの平均応答を生じた。バックグラウンド及び無関係のペプチドに対する応答は１０ＳＦＵ未満の無視できるほどであった。ＳｕｒＡ２．Ｍ刺激によって生じた応答は、二元ＡＮＯＶＡによって無関係のペプチドに対する応答よりも有意に高かった、＊ｐ＜０．０５。
[00506]これらのデータは、水性ベースのワクチンが、油ベースのワクチンを用いた免疫化によって事前にプライミングしたマウスにおいて抗原特異的なリコール応答を誘導できることを実証している。
[00507]実施例３：
[00508]６〜８週齢の病原体を有さないＣ５７ＢＬ／６ＮＣｒｌマウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓｔ．Ｃｏｎｓｔａｎｔ、ケベック州）から購入し、施設の指針に従って、水及び食料を自由に与え、フィルターで制御された空気循環を用いて飼育した。
[00509]マウスに、ＨＰＶ１６Ｅ７４９−５７ペプチド抗原（Ｒ９Ｆ、ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ、配列番号３）、破傷風毒素９４７−９６７に由来するユニバーサルヘルパーＴエピトープ（Ｆ２１Ｅ、ＦＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ、配列番号６３）、及びポリＩ：Ｃポリヌクレオチドアジュバントをワクチン接種した。ペプチド及びアジュバントを、油ベースのデポー形成ワクチン又は水性ベースのワクチン中で配合した。ワクチンを調製するために、ペプチドを、まず、ＤＯＰＣ及びコレステロール（Ｌｉｐｏｉｄ、ドイツ）を含む３０％のｔｅｒｔ−ブタノール中で再溶解した。この抗原−脂質混合物にアジュバントを添加し、凍結乾燥させて乾燥ケークを形成した。注射の直前に、乾燥ケークをＩＳＡ５１ ＶＧ油（ＳＥＰＰＩＣ、フランス）中に再懸濁させて油ベースの配合物を調製した、又は水中に再懸濁させて水性ベースの配合物を調製した。それぞれの用量は、５マイクログラムのＲ９Ｆペプチド、５マイクログラムのＦ２１Ｅペプチド、２０マイクログラムのアジュバント、６ミリグラムのＤＯＰＣ、及び０．６ミリグラムのコレステロールを含有していた。
[00510]また、マウスを、２０マイクログラム／キログラム／日の用量を経口投与によって７日間の連続した日の間与えた、規則的なシクロホスファミド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、モンタナ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）でも治療した。
[00511]３つの群のマウス（ｎ＝５匹）にワクチン接種することによって、ワクチン配合物の免疫原性を試験した。第１群のマウスには、０、２１、４２日目に油ベースのワクチン配合物をワクチン接種した。第２群のマウスには、０及び２１日目に油ベースのワクチン配合物、並びに４２日目に水性配合物をワクチン接種した。第３群のマウスには、０日目に油ベースの配合物、並びに２１及び４２日目に水性配合物をワクチン接種した。すべてのマウス群に、初回免疫化（０日目）の７日前に開始して、交互する１週間オン及び１週間オフでシクロホスファミドを与えた。すべてのマウスを５０日目に屠殺し、分析のために脾臓を取り出した。単一細胞懸濁液を調製し、脾細胞を、ＥＬＩＳＰＯＴプレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カリフォルニア州Ｓａｎ Ｊｏｓｅ）の抗ＩＦＮ−ガンマでコーティングされたウェル（５００，０００個の細胞／ウェル）内にローディングした。細胞を、１０マイクログラム／ミリリットルのＨＰＶ１６Ｅ７４９−５７ペプチド（Ｒ９Ｆ、ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ、配列番号３）、無関係のＨ−２ｂ制限ペプチド（ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ、配列番号４）、又はペプチドを含有しない培地（バックグラウンド）で刺激した。細胞をＥＬＩＳＰＯＴプレート中で１８時間インキュベートした。翌日、ＡＥＣキット（Ｓｉｇｍａ、モンタナ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）を使用してプレートを展開させ、個々のＩＦＮ−ガンマ分泌細胞を、イムノスポットプレートリーダー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ Ｌｔｄ、オハイオ州Ｓｈａｋｅｒ Ｈｅｉｇｈｔｓ）を使用して数えた。結果を図３に示す。
[00512]第１群のマウスは、Ｒ９Ｆペプチドを用いた刺激に対して１７７スポット形成単位（ＳＦＵ）の平均応答を生じた。バックグラウンド及び無関係のペプチドに対する応答は１０ＳＦＵ未満の無視できるほどであった。
[00513]第２群のマウスは、Ｒ９Ｆペプチドを用いた刺激に対して１２７スポット形成単位（ＳＦＵ）の平均応答を生じた。バックグラウンド及び無関係のペプチドに対する応答は１０ＳＦＵ未満の無視できるほどであった。
[00514]第３群のマウスは、Ｒ９Ｆペプチドを用いた刺激に対して１９４スポット形成単位（ＳＦＵ）の平均応答を生じた。バックグラウンド及び無関係のペプチドに対する応答は１０ＳＦＵ未満の無視できるほどであった。
[00515]Ｒ９Ｆ刺激によって生じた応答は、一元ＡＮＯＶＡによってそれぞれの群間で有意な差異がなかった。
[00516]これらのデータは、水性ワクチンが、油ベースのワクチン配合物を用いた１又は２回の免疫化でプライミングした全身性リコール応答を誘導することができ、同じ抗原を含有する水性ワクチンを用いたブーストでそのような免疫応答を維持できることを実証している。
[00517]実施例４：
[00518]６〜８週齢の病原体を有さないＣ５７ＢＬ／６ＮＣｒｌマウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓｔ．Ｃｏｎｓｔａｎｔ、ケベック州）から購入し、施設の指針に従って、水及び食料を自由に与え、フィルターで制御された空気循環を用いて飼育した。
[00519]マウスに、ＨＰＶ１６Ｅ７４９−５７ペプチド抗原（Ｒ９Ｆ、ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ、配列番号３）、破傷風毒素９４７−９６７に由来するユニバーサルヘルパーＴエピトープ（Ｆ２１Ｅ、ＦＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ、配列番号６３）、及びポリＩ：Ｃポリヌクレオチドアジュバントをワクチン接種した。ペプチド及びアジュバントを、油ベースのデポー形成ワクチン又は水性ベースのワクチン中で配合した。ワクチンを調製するために、ペプチドを、まず、ＤＯＰＣ及びコレステロール（Ｌｉｐｏｉｄ、ドイツ）を含む３０％のｔｅｒｔ−ブタノール中で再溶解した。この抗原−脂質混合物にアジュバントを添加し、凍結乾燥させて乾燥ケークを形成した。注射の直前に、乾燥ケークをＩＳＡ５１ ＶＧ油（ＳＥＰＰＩＣ、フランス）中に再懸濁させて油ベースの配合物を調製した、又は水中に再懸濁させて水性ベースの配合物を調製した。それぞれの用量は、５マイクログラムのＲ９Ｆペプチド、５マイクログラムのＦ２１Ｅペプチド、２０マイクログラムのアジュバント、６ミリグラムのＤＯＰＣ、及び０．６ミリグラムのコレステロールを含有していた。
[00520]また、マウスを、２０マイクログラム／キログラム／日の用量を経口投与によって７日間の連続した日の間与えた、規則的なシクロホスファミド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、モンタナ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）でも治療した。
[00521]治療の有効性を、ＨＰＶ１６Ｅ７を発現するＣ３腫瘍を保有するマウスにおいて試験した。研究０日目腫瘍を皮下移植し、成長を週に１回モニタリングした。明白な腫瘍を週に２回ノギスを使用して測定して、長さ及び幅を記録した。腫瘍体積が事前に定義したエンドポイント体積である２０００ｍｍ３に達した際に、マウスを人道的に安楽死させた。第１群のマウスは治療しないままであり、腫瘍成長対照群（ｎ＝９匹）として役割を果たした。第２〜４群のマウス（ｎ＝１０匹）は、腫瘍細胞移植の５日後に開始した規則的なシクロホスファミドで治療し、１２、３３、５４日目にワクチン接種した。第２群のマウスには、油ベースのワクチンを１２、３３、及び５４日目にワクチン接種した。第３群のマウスには、油ベースのワクチンを１２及び３３日目に、並びに５４日目に水性ワクチンをワクチン接種した。第４群のマウスには、油ベースのワクチンを１２日目に、並びに水性ワクチンを３３及び５４日目にワクチン接種した。結果を図４に示す。
[00522]図４Ａは、それぞれの群について記録された平均腫瘍体積を示す。第１群のマウスの大多数は大きな腫瘍体積又は腫瘍潰瘍形成が原因で研究の２９日目までに屠殺されており、この時点での平均腫瘍体積は４６８±４１ｍｍ３であった。研究の４９日目に、第２群の平均腫瘍体積は２８１±９９ｍｍ３であり、第３群の平均腫瘍体積は２２６±７５ｍｍ３であり、第４群の平均腫瘍体積は３２７±１０３ｍｍ３であった。統計分析を直線回帰によって行い、第２、３、及び４群の間に有意差は検出されなかった。
[00523]図４Ｂは、それぞれの群のパーセント生存を示す。研究の６４日目までに、第１群のマウス０％が残っており、第２群のマウスの６０％が残っており、第３群のマウスの５０％が残っており、第４群のマウスの８０％が残っていた。統計分析をマンテル−コックスによって行い、第２、３、及び４の間に有意差は検出されなかった。
[00524]このデータは、油ベースのワクチンを用いたプライミング、及びその後の同じ抗原を含有する水性ワクチンを用いたブーストが、腫瘍成長からの有効な保護を提供できることを実証している。
[00525]実施例５：
[00526]６〜１２週齢の病原体を有さないＨＨＤ−ＤＲ１トランスジェニックマウスを施設内で繁殖させ、施設の指針に従って、水及び食料を自由に与え、フィルターで制御された空気循環を用いて飼育した。ＨＨＤ−ＤＲ１マウスは、ヒトＭＨＣクラスＩ及びＩＩ分子、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、並びにＨＬＡ−ＤＲ＊０１０１を発現し、対応するネズミＭＨＣ分子Ｈ−２Ｄｂ、−ＩＡ、又は−ＩＥ（β２ｍ−／−、Ｈ−２Ｄｂ−／−、ＩＡα−／−、ＩＡβ−／−、ＩＥβ−／−）を発現しない。
[00527]マウスに、油ベースのデポー形成ワクチン中で配合した５つのサバイビンペプチド抗原の混合物をワクチン接種した。それぞれのサバイビンペプチド抗原は異なるＨＬＡ（ＨＬＡ−Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ２４、及びＢ７）によって制限されている。また、ワクチン配合物は、破傷風トキソイドに由来するユニバーサルヘルパーＴエピトープ及びポリＩ：Ｃポリヌクレオチドアジュバントも含有していた。ワクチンを調製するために、まず、ペプチド及びアジュバントを、ＤＯＰＣ及びコレステロール（Ｌｉｐｏｉｄ、ドイツ）を含む酢酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ９．５）中で再溶解した。その後、ワクチン構成成分を凍結乾燥させて乾燥ケークを形成した。注射の直前に、乾燥ケークをＩＳＡ５１ ＶＧ油（ＳＥＰＰＩＣ、フランス）中に再懸濁させた。最終ワクチン配合物は、それぞれのサバイビンペプチド抗原を１ミリグラム／ミリリットル、ヘルパーＴを５００マイクログラム／ミリリットル、アジュバントを４００マイクログラム／ミリリットル、ＤＯＰＣを１２０ミリグラム／ミリリットル、及びコレステロールを１２ミリグラム／ミリリットルで含有していた。
[00528]ワクチンの免疫原性は、ＨＨＤ−ＤＲ１トランスジェニックマウスに５０マイクロリットル用量の油ベースのワクチンを側腹部に皮下でワクチン接種することによって試験した。第１群のマウス（ｎ＝５匹）は、研究０日目に１回ワクチン接種し、８日目に屠殺した。第２群のマウス（ｎ＝５匹）は、研究の０及び２１日目に２回ワクチン接種し、２８日目（２回目の免疫化の８日後）に屠殺した。第３群のマウスは、研究の０及び２１日目に２回ワクチン接種し、４８日目（２回目の免疫化の２７日後）に屠殺した。屠殺後に脾臓を取り出した。単一細胞懸濁液を脾臓から調製し、脾細胞を、ＥＬＩＳＰＯＴプレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カリフォルニア州Ｓａｎ Ｊｏｓｅ）の抗ＩＦＮ−ガンマでコーティングされたウェル（５００，０００個の細胞／ウェル）内にローディングした。細胞を、１０マイクログラム／ミリリットルのＨＬＡ−Ａ２制限サバイビンペプチド（ＳｕｒＡ２．Ｍ、ＬＭＬＧＥＦＬＫＬ、配列番号２）、無関係のＨＬＡ−Ａ２制限ペプチド（ＡＬＭＥＱＱＨＹＶ、配列番号１）、又はペプチドを含有しない培地（バックグラウンド）で刺激した。細胞をＥＬＩＳＰＯＴプレート中で１８時間インキュベートした。翌日、ＡＥＣキット（Ｓｉｇｍａ、モンタナ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）を使用してプレートを展開させ、個々のＩＦＮ−ガンマ分泌細胞を、イムノスポットプレートリーダー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ Ｌｔｄ、オハイオ州Ｓｈａｋｅｒ Ｈｅｉｇｈｔｓ）を使用して数えた。結果を図５に示す。
[00529]第１群のマウスは、ＳｕｒＡ２．Ｍペプチドを用いた刺激に対して１３１スポット形成単位（ＳＦＵ）の平均応答を生じた。バックグラウンド及び無関係のペプチドに対する応答は１０ＳＦＵ未満の無視できるほどであった。
[00530]第２群のマウスは、ＳｕｒＡ２．Ｍペプチドを用いた刺激に対して３５１ＳＦＵの平均応答を生じた。バックグラウンド及び無関係のペプチドに対する応答は１０ＳＦＵ未満の無視できるほどであった。
[00531]第３群のマウスは、ＳｕｒＡ２．Ｍペプチドを用いた刺激に対して４９ＳＦＵの平均応答を生じた。バックグラウンド及び無関係のペプチドに対する応答は１０ＳＦＵ未満の無視できるほどであった。
[00532]ＳｕｒＡ２．Ｍ刺激によって生じた応答は第１及び２群間で有意な差異があった、ｐ＜０．０５。予想どおり、２回目のワクチン用量を用いたブーストは、免疫応答を維持及び増加させた（第１群対第２群）。ＳｕｒＡ２．Ｍ刺激によって生じた応答は第２及び３群間で有意な差異があり、ｐ＜０．０１、これは、免疫応答がブースターワクチン接種の投与後、２７日間以内に顕著に降下したことを実証している。これらのデータは、ワクチンによって誘導された抗原特異的な応答は、ブーストなしでは時間と共に減退することを実証しており、そのような免疫応答、詳細には細胞性免疫応答を維持するためにブースター免疫化を投与することの重要性を強調している。統計分析は、チューキー事後検定を用いた一元ＡＮＯＶＡによって行った。
[00533]実施例６：
[00534]米国（ＩＮＤ＃１４７３１）及びカナダ（ＣＴＡ−Ａ＃１８３６００）で実施された、ＯＮＣ−ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃ−０３と命名された第Ｉｂ相研究は、卵巣癌対象において、低用量シクロホスファミドと共に油ベースのワクチンを用いたプライミング（デポー形成）、次いで水性ベースのワクチン配合物（デポー非形成）を用いたブーストの安全性及び免疫効力を調査した、対象のコホートを含有していた。
[00535]本研究で使用したワクチンは、５つのヒト白血球抗原（ＨＬＡ）制限エピトープ（ＨＬＡ−Ａ１：ＦＴＥＬＴＬＧＥＦ（配列番号５５）、ＨＬＡ−Ａ２：ＬＭＬＧＥＦＬＫＬ（配列番号２）、ＨＬＡ−Ａ３：ＲＩＳＴＦＫＮＷＰＫ（配列番号５８）、ＨＬＡ−Ａ２４：ＳＴＦＫＮＷＰＦＬ（配列番号５９）、及びＨＬＡ−Ｂ７：ＬＰＰＡＷＱＰＦＬ（配列番号６０））、破傷風トキソイドからのユニバーサルヘルパーＴエピトープ（ＡＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ、配列番号６１）、ポリＩ：Ｃポリヌクレオチドアジュバント、並びにＤＯＰＣ及びコレステロールからなるリポソームからなるＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃであった。抗原／アジュバント／リポソーム複合体は、リン酸緩衝液中で配合し、バイアルに満たし、凍結乾燥させて乾燥ケークにする。診療所では、注射前にケークを１×体積の疎水性担体モンタニドＩＳＡ５１ ＶＧ（ＳＥＰＰＩＣ、フランス）に再懸濁させて、油ベースの配合物を調製する。水性ベースの配合物を調製するためには、疎水性担体の代わりに２×体積の滅菌水を使用して乾燥ケークを再懸濁させる。最終ワクチン配合物中の用量体積及び送達物を表４に示す。
[00536]
Figure 0006851983
[00537]臨床研究では、対象は、２回の０．２５ミリリットル用量のＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃ（油）の皮下プライミング注射及び３回の０．５０ミリリットル用量のＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃ（水性）の皮下ブースト注射を、４週間の間隔で受けた。また、対象は、研究の期間の間、隔週で５０ミリグラムＢＩＤ（１日２回）の経口シクロホスファミドでも治療した。臨床治験は図６に示すスケジュールに従って実施した。
[00538]有害事象は、国立癌研究所の有害事象共通用語規準（ＣＴＣＡＥ）バージョン４．０３に従って評価した。最初のワクチン接種の前（ベースライン）、それぞれのワクチン接種時点、及び２回目のプライミングワクチン接種の２週間後に血液を採取した（研究の０、２８、４２、５６、８４、及び１１２日目）。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離し、（ｉ）インターフェロン−ガンマＥＬＩＳＰＯＴ及び（ｉｉ）多量体分析によって免疫機能及びワクチンに誘導されたＴ細胞免疫を研究するために冷凍保存した。
[00539]（ｉ）ＰＢＭＣ中の機能的な抗原特異的Ｔ細胞を検出するためのインターフェロン−ガンマＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
[00540]ワクチン接種に応答して生じた抗原特異的なＴ細胞は、同族ペプチドに遭遇した際にサイトカインインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）を分泌する。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、ＩＦＮ−ガンマの分泌量を測定し、ペプチドを用いた刺激に応答してそれを分泌している細胞の数を提供することができる。
[00541]臨床治験対象から採取したＰＢＭＣ試料を、指定された試験抗原に対するリコール応答についてインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイで試験した。ＥＬＩＳＰＯＴはＣ．Ｔ．Ｌ．Ｌｔｄ．（米国オハイオ州Ｓｈａｋｅｒ Ｈｅｉｇｈｔｓ）から購入したキットを用いて行った。ＰＢＭＣを解凍し、５つのサバイビンペプチドのプールで刺激した。抗原、陰性対照（培地単独中の細胞）、並びに陽性対照（Ｔ細胞活性化剤ＰＭＡ及びイオノマイシン）に対する応答を２つ組のウェル中で試験した。臨床試料からのＰＢＭＣを９６ウェルＥＬＩＳＰＯＴプレートのウェルに３００，０００個の細胞／ウェルの濃度で播種した。また、健康な対照対象からのＰＢＭＣも対照として使用した。
[00542]１日目に、プレートを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１：２５０に希釈した捕捉抗体（精製抗ＩＦＮ−ガンマ）でコーティングし、プレートを２〜６℃の冷蔵庫内で終夜インキュベートした。２日目に、プレートをＰＢＳで１回洗浄した。洗浄は、２００マイクロリットル／ウェルの緩衝液を加え、次いでプレートを反転させ、内容物を流し台にはじき出すことによって行った。抗原は、無血清ＣＴＬ−テスト（ＣＴＬ−Ｔｅｓｔ）（商標）培地（Ｃ．Ｔ．Ｌ．Ｌｔｄ）中、それぞれ１００マイクログラム／ミリリットルの濃度で調製した。ＰＢＭＣは、無血清ＣＴＬ−テスト（商標）培地中に３×１０Ｅ６個の細胞／ミリリットルの濃度で再懸濁させた。ペプチド及び細胞をそれぞれ、ウェルにそれぞれ１００マイクロリットル／ウェルで加え、２００マイクロリットルの最終体積とした。プレートを加湿した３７℃、５％のＣＯ２インキュベーター内で終夜インキュベートした。３日目に、Ｃ．Ｔ．Ｌ Ｌｔｄから購入したヒトＩＦＮ−ガンマＥＬＩＳＰＯＴセット試薬を使用してプレートを展開させた。プレートをＰＢＳで２回、０．０５％のツイーン２０−ＰＢＳで２回洗浄し、次いで１００マイクロリットル／ウェルの検出抗体（ビオチン標識した抗ＩＦＮ−ガンマ）を加えた。室温（１８〜２３℃）で２時間のインキュベーションの後、プレートを０．０５％のツイーン２０−ＰＢＳで３回洗浄し、次いで１００マイクロリットル／ウェルのストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ試薬を加え、室温で２時間インキュベートした。プレートを０．０５％のツイーン２０−ＰＢＳで２回、ＰＢＳで２回洗浄し、その後、１００マイクロリットルの新しく調製したＴｒｕｅＢｌｕｅペルオキシダーゼ基質展開溶液を加えた。スポット展開を室温で１５〜２０分間モニタリングして、抗原含有ウェル中のスポットの出現を確認した。プレートを水道水ですすぐことによって反応を停止させた。プレートを終夜空気乾燥させ、室温で保管した。ＥＬＩＳＰＯＴプレートのウェル内のスポットの数を、自動プレート分析器（イムノスポット Ｓ６ Ｃｏｒｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｃ．Ｔ．Ｌ．Ｌｔｄ．）を使用して数えた。データは、それぞれの２つ組のウェルのＳＦＵの平均をとり、その後それに３．３３を掛け算することによって得られる、１００万個のＰＢＭＣあたりのスポット形成単位（ＳＦＵ）として表す。
[00543]（ｉｉ）多量体染色
[00544]抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞は、抗原提示細胞の表面上のＭＨＣ分子中に提示される特異的ペプチドを認識することによって免疫応答を媒介する。これらは、そのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を介してこれを行う。多量体試薬を免疫蛍光分析と併せて使用して、抗原特異的なＴＣＲを保有するすべてのＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを定量することができる。このアッセイは、ＰＢＭＣ並びに蛍光コンジュゲート多量体試薬及び抗体を使用して行い、フローサイトメトリーによって検出した。
[00545]ＰＢＭＣを解凍し、１×１０Ｅ７の濃度で無血清ＣＴＬ−テスト（商標）培地に再懸濁させた。細胞を終夜、３７℃、５％のＣＯ２インキュベーター内で培養した。翌日、トリパンブルー排除染色を使用して細胞生存度を評価した。細胞をアッセイチューブに分割し、ＰＥコンジュゲート多量体試薬を用いて、緩衝液（ＰＢＳ＋２％のウシ胎児血清、ＦＢＳ）中で３０分間、４℃、暗所で染色した。その後、１ミリリットルのＰＢＳ＋２％のＦＢＳを加え、３００×ｇで５分間遠心分離することによって細胞を洗浄した。上清を廃棄し、細胞ペレットを１００マイクロリットルのＰＢＳ＋２％のＦＢＳに再懸濁させ、抗ヒト−ＣＤ３−ＡＰＣ（ＯＫＴ３）及び抗ヒト−ＣＤ８アルファ−ＦＩＴＣ（ＯＫＴ８）を用いて３０分間、４℃、暗所で染色した。その後、細胞を上記の様に洗浄し、ペレットを１００マイクロリットルのＰＢＳ＋２％のＦＢＳに再懸濁させた。フローサイトメーターでの取得の１５分前に、５マイクロリットルの７−ＡＡＤ生存度色素をそれぞれの試料に加えた。データはＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して取得し、ＷｉｎＬｉｓｔ６．０（Ｖｅｒｉｔｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｈｏｕｓｅ）を使用して分析した。ゲートは非生存細胞を排除し（７−ＡＡＤ＋）、その後、ＣＤ３＋及びＣＤ８＋細胞を含めるように設定した。
[00546]ＩＦＮ−ガンマＥＬＩＳＰＯＴ及び四量体分析によって評価した、本研究に登録されている２人の対象の抗原特異的免疫応答を実施例７及び８に記載する。
[00547]実施例７：
[00548]対象０３−２８は、研究ＯＮＣ−ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃ−０３に含める１４カ月前に３ｃ段階の卵巣癌を診断された、６６歳のＨＬＡ−Ａ２陽性の女性である。診断時、対象は標準の減量手術、次いで１クールの白金及びタキソールに基づく化学療法を受けた。対象は本臨床研究への登録前に再発は示さず、標準治療が完了した９カ月後に治療を開始した。
[00549]免疫応答は、は、研究の０、２８、４２、５６、８４、及び１１２日目に採取した血液から単離した対象ＰＢＭＣを使用して、実施例６に記載したＩＦＮ−ガンマＥＬＩＳＰＯＴ及び多量体フローサイトメトリーによってモニタリングした。結果を図７に示す。ＥＬＩＳＰＯＴ応答はＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃ（油）を用いたプライミングワクチン接種が完了した後に徐々に上昇し、ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃ（水性）を用いたブーストワクチン接種の後に増加したように見えた。多量体フローサイトメトリーによって検出された、循環ＳｕｒＡ２．Ｍに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞は、研究の５６日目にピークとなり、研究の１１２日目までバックグラウンドより高く維持された。
[00550]これらの結果は、ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃ（油）が、ワクチン抗原に対して事前の免疫応答を有さないＨＬＡ−Ａ２＋対象において免疫応答をプライミングできることを実証している。ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃ（水性）を用いたブーストによりこれらの免疫応答が維持された。
[00551]実施例８：
[00552]対象０３−３０は、研究ＯＮＣ−ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃ−０３に含める１３カ月前に３ａ段階の卵巣癌を診断された、５２歳のＨＬＡ−Ａ１陽性対象である。診断時、対象は標準治療の減量手術、次いで１クールの白金及びタキソールに基づく化学療法を受け、完全な応答を経験した。対象は本臨床研究への登録前に再発は示さず、標準治療が完了した８カ月後に治療を開始した。
[00553]免疫応答は、は、研究の０、２８、４２、５６、８４、及び１１２日目に採取した血液から単離した対象ＰＢＭＣを使用して、実施例６に記載したＩＦＮ−ガンマＥＬＩＳＰＯＴ及び多量体フローサイトメトリーによってモニタリングした。結果を図８に示す。ＥＬＩＳＰＯＴ応答はＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃ（油）を用いたプライミングワクチン接種中に迅速に上昇し、ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃ（水性）を用いたブースト免疫化の間、上昇したレベルで維持された。多量体フローサイトメトリーによって検出された、循環ＳｕｒＡ１．Ｔに特異的なＴ細胞は、ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃ（油）を用いたプライミング免疫化の２週間後である研究の４２日目にピークとなり、ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃ（水性）を用いたブースト免疫化の期間の間、バックグラウンドより高いレベルで維持された。
[00554]これらの結果は、ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃ（油）が、ワクチン抗原に対して事前の免疫応答を有さないＨＬＡ−Ａ１＋対象において免疫応答をプライミングできることを実証している。ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃ（水性）を用いたブーストによりこれらの免疫応答が維持された。
[00555]ＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃ（油）プライム用量の後にＤＰＸ−Ｓｕｒｖｉｖａｃ（水性）配合物を受けた、実施例中に概要を示した患者では、すべての注射部位反応は穏やかであり（グレード１）、紅班、そう痒症、硬結、及び疼痛からなっていた。これらの部位反応の大多数は、特に注射部位が水性配合物を受けた場合は２〜３カ月後に完全に回復していた。
[00556]本明細書中で引用されているすべての出版物及び特許出願は、それぞれの個々の出版物又は特許出願が具体的且つ個々に参考として組み込まれていると示されているかのように、本明細書中に参考として組み込まれている。任意の出版物の引用は、出願日前でのその開示のためであり、先行発明の理由に基づいて本発明がそのような出版物に先行する権利を有さないという承認として解釈されるべきでない。
[00557]前述の発明は、理解を明瞭にする目的のために例示及び実施例によって多少詳細に記載されているが、本発明の教示に鑑みて、添付の特許請求の範囲の精神又は範囲から逸脱せずにそれに特定の変化及び改変を行い得ることは、当業者には容易に明らかである。
[00558]本明細書及び添付の特許請求の範囲中で使用する単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」には、内容により明らかにそうでないと指示される場合以外は、複数形の言及が含まれることに注意する必要がある。別段に定義しない限りは、本明細書中で使用するすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の技術者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
[00559]明細書及び特許請求の範囲中で使用する語句「及び／又は」は、そのように結合された要素の「一方又は両方」、すなわち、一部の場合に接続的に存在し、他の場合には非接続的に存在する要素を意味すると理解されるべきである。「及び／又は」を用いて列挙した複数の要素は、同じ様式で、すなわち、そのように結合された要素の「１つ又は複数」と解釈されるべきである。具体的に同定した要素に関連しているか関連していないかにかかわらず、「及び／又は」節によって具体的に同定した要素以外の他の要素も任意選択で存在し得る。したがって、非限定的な例として、「Ａ及び／又はＢ」への言及は、「含む」などのオープンエンドの言葉と併せて使用した場合、一実施形態ではＡのみ（任意選択でＢ以外の要素が含まれる）、別の実施形態ではＢのみ（任意選択でＡ以外の要素が含まれる）、さらに別の実施形態ではＡ及びＢの両方（任意選択で他の要素が含まれる）などを指す可能性がある。
[00560]明細書及び特許請求の範囲中で使用する「又は」には、上記定義した「及び／又は」と同じ意味が包含されると理解されるべきである。たとえば、リストの項目を分離する場合、「又は」又は「及び／又は」は、包括的であると解釈されるべきである、すなわち、数個の要素又は要素のリストの少なくとも１つが包含されるが、そのうちの複数、及び任意選択で追加の列挙していない項目も含まれる。
[00561]明細書又は添付の特許請求の範囲中にかかわらず、本明細書中で使用する移行用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「保有する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」などは、包括的又はオープンエンド（すなわち、含むがそれだけに限定されないことを意味する）であると理解され、これらは列挙していない要素、材料、又は方法ステップを排除しない。移行語句「からなる」及び「から本質的になる」のみが、特許請求の範囲及び本明細書中の例示的な実施形態の段落に関してそれぞれクローズド又は部分的にクローズドの移行語句である。移行語句「からなる」は、具体的に列挙していないすべての要素、ステップ、又は成分を排除する。移行語句「から本質的になる」は、範囲を指定した要素、材料、又はステップ、並びに本明細書中に開示及び／又は特許請求した本発明の基本特徴（複数可）に実質的な影響を与えないものに限定する。
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Claims (43)

  1. デポー非形成ワクチンと組み合わせて使用する、抗原に対する免疫応答を強化するためのデポー形成ワクチンであって、
    前記デポー形成ワクチンは、１つ又は複数の抗原及び疎水性担体を含み、
    前記デポー形成ワクチンの前記疎水性担体は、油又は油の混合物であり、
    前記デポー非形成ワクチンは、１つ又は複数の抗原を含み、
    対象に少なくとも１回の用量の前記デポー形成ワクチンを、少なくとも１回の用量の前記デポー非形成ワクチンを投与する前に投与する、デポー形成ワクチン。
  2. 前記少なくとも１回の用量の前記デポー形成ワクチンのそれぞれが、前記１つ又は複数の抗原に対する免疫応答を誘導することができるプライム用量であり、前記少なくとも１回の用量の前記デポー非形成ワクチンのそれぞれが、前記１つ又は複数の抗原に対する免疫応答を維持及び／又はブーストすることができる維持又はブースト用量である、請求項１に記載のデポー形成ワクチン。
  3. 前記デポー非形成ワクチンの初回の維持又はブースト用量を、前記デポー形成ワクチンの最終プライム用量の約１日、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、又は１０週間以内に投与することを含む、請求項２に記載のデポー形成ワクチン。
  4. 前記少なくとも１回の用量の前記デポー形成ワクチンが１、２、３、４、又は５回の用量である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のデポー形成ワクチン。
  5. 前記少なくとも１回の用量の前記デポー非形成ワクチンが１、２、３、４、又は５回の用量である、又は前記少なくとも１回の用量の前記デポー非形成ワクチンが、１日１回、週に１回、２週間に１回、３週間に１回、又は月に１回の連続的な反復投薬である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のデポー形成ワクチン。
  6. 初回用量の前記デポー形成ワクチンの後、前記デポー形成ワクチンのそれぞれの後続用量を、直前の用量の約１日、１週間、２週間、３週間、又は４週間以内に投与する、及び／又は初回用量の前記デポー非形成ワクチンの後、前記デポー非形成ワクチンのそれぞれの後続用量を、直前の用量の約１日、１週間、２週間、３週間、又は４週間以内に投与する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のデポー形成ワクチン。
  7. 前記デポー形成ワクチン及び前記デポー非形成ワクチンのそれぞれの後続用量を、直前の用量の約３週間又は約４週間以内に投与する、請求項６に記載のデポー形成ワクチン。
  8. １回又は２回の用量の前記デポー形成ワクチンを、前記デポー非形成ワクチンを投与する前に投与することを含む、請求項６に記載のデポー形成ワクチン。
  9. 前記デポー形成ワクチンを０日目及び２１日目に投与すること、及び前記デポー非形成ワクチンを４２日目に投与することを含む、請求項８に記載のデポー形成ワクチン。
  10. 前記デポー形成ワクチンを０日目に投与すること、及び前記デポー非形成ワクチンを２１日目及び４２日目に投与することを含む、請求項８に記載のデポー形成ワクチン。
  11. ＤＮＡ複製を妨げる薬剤及び／又は免疫応答チェックポイント阻害剤を前記対象に投与することをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のデポー形成ワクチン。
  12. ＤＮＡ複製を妨げる薬剤を投与することを含み、前記ＤＮＡ複製を妨げる薬剤がシクロホスファミドである、請求項１１に記載のデポー形成ワクチン。
  13. １サイクルの低用量の規則的なシクロホスファミドを含み、前記サイクルが、前記シクロホスファミドを、１日１回、２週間毎に開始する７日間の連続した日数の期間の間、前記対象に投与することを含む、請求項１２に記載のデポー形成ワクチン。
  14. 前記シクロホスファミドを前記デポー形成ワクチンの初回投与の７日前に最初に投与する、請求項１３に記載のデポー形成ワクチン。
  15. 前記疎水性担体が、鉱物油である、又は鉱物油溶液中のオレイン酸マンニドである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のデポー形成ワクチン。
  16. 前記デポー形成ワクチンが水を含まない、又は水を実質的に含まない、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のデポー形成ワクチン。
  17. 前記１つ又は複数の抗原が前記油中に混和性であるように、前記１つ又は複数の抗原が十分に疎水性である、又は十分に疎水性にする、請求項１５に記載のデポー形成ワクチン。
  18. 前記１つ又は複数の抗原が天然に疎水性である、又は前記デポー形成ワクチン中の両親媒性物質の存在によって十分に疎水性になる、請求項１７に記載のデポー形成ワクチン。
  19. 前記両親媒性物質が前記１つ又は複数の抗原と密に会合して、前記１つ又は複数の抗原が前記疎水性担体中で混和性になる、及び／又は前記両親媒性物質がシート又は小胞構造を形成し、前記１つ又は複数の抗原を部分的に又は完全に取り囲む、請求項１８に記載のデポー形成ワクチン。
  20. 前記両親媒性物質が脂質である、請求項１８又は１９に記載のデポー形成ワクチン。
  21. 前記脂質が前記１つ又は複数の抗原の周りに閉じた小胞構造を形成する、請求項２０に記載のデポー形成ワクチン。
  22. 前記閉じた小胞構造が逆転ミセルである、請求項２１に記載のデポー形成ワクチン。
  23. 前記デポー非形成ワクチンが水性担体を含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のデポー形成ワクチン。
  24. 前記デポー形成ワクチン及び／又は前記デポー非形成ワクチンがアジュバント及び／又はヘルパーＴエピトープをさらに含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のデポー形成ワクチン。
  25. 前記アジュバントがポリＩ：Ｃポリヌクレオチドであり、前記ヘルパーＴエピトープがアミノ酸配列ＡＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ（配列番号６１）又はＦＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ（配列番号６３）を含む、請求項２４に記載のデポー形成ワクチン。
  26. 前記１つ又は複数の抗原が、（ｉ）ウイルス、細菌、若しくは原虫に由来する、（ｉｉ）膜表面結合癌抗原である、又は（ｉｉｉ）毒素である、請求項１〜２５のいずれか一項に記載のデポー形成ワクチン。
  27. 前記抗原が、エボラウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、百日咳菌、炭疽菌、又は四日熱マラリア原虫に由来する、請求項２６に記載のデポー形成ワクチン。
  28. 前記抗原がサバイビン抗原である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載のデポー形成ワクチン。
  29. 前記サバイビン抗原が、サバイビンタンパク質からのアミノ酸配列（配列番号５３）を含むペプチド抗原若しくはその変異体、又は前記ペプチド抗原をコードしている核酸分子である、請求項２８に記載のデポー形成ワクチン。
  30. 前記１つ又は複数の抗原が、ＦＥＥＬＴＬＧＥＦ（配列番号５４）、ＦＴＥＬＴＬＧＥＦ（配列番号５５）、ＬＴＬＧＥＦＬＫＬ（配列番号５６）、ＬＭＬＧＥＦＬＫＬ（配列番号２）、ＲＩＳＴＦＫＮＷＰＦ（配列番号５７）、ＲＩＳＴＦＫＮＷＰＫ（配列番号５８）、ＳＴＦＫＮＷＰＦＬ（配列番号５９）、及びＬＰＰＡＷＱＰＦＬ（配列番号６０）からなる群より選択されるアミノ酸配列、若しくはその任意の組合せを含む１つ又は複数のペプチド抗原、又は前記１つ又は複数のペプチド抗原をコードしている１つ又は複数の核酸分子を含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のデポー形成ワクチン。
  31. 前記１つ又は複数の抗原が、アミノ酸配列ＦＴＥＬＴＬＧＥＦ（配列番号５５）を含む第１のペプチド抗原、アミノ酸配列ＬＭＬＧＥＦＬＫＬ（配列番号２）を含む第２のペプチド抗原、アミノ酸配列ＲＩＳＴＦＫＮＷＰＫ（配列番号５８）を含む第３のペプチド抗原、アミノ酸配列ＳＴＦＫＮＷＰＦＬ（配列番号５９）を含む第４のペプチド抗原、及びアミノ酸配列ＬＰＰＡＷＱＰＦＬ（配列番号６０）を含む第５のペプチド抗原を含む５つのペプチド抗原の混合物を含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載のデポー形成ワクチン。
  32. 前記抗原がヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に由来するペプチド抗原又は前記ペプチド抗原をコードしている核酸分子である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載のデポー形成ワクチン。
  33. 前記ＨＰＶに由来するペプチド抗原が、アミノ酸配列ＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴ（配列番号４４）、ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ（配列番号４５）、ＬＬＭＧＴＬＧＩＶ（配列番号４６）、又はＴＬＧＩＶＣＰＩ（配列番号４７）を含む、請求項３２に記載のデポー形成ワクチン。
  34. 前記抗原が自己抗原、癌関連抗原及び／又は免疫原性の弱い抗原である、請求項１〜３３のいずれか一項に記載のデポー形成ワクチン。
  35. 前記デポー形成ワクチンが、
    （ｉ）アミノ酸配列ＦＴＥＬＴＬＧＥＦ（配列番号５５）を含む第１のペプチド抗原、アミノ酸配列ＬＭＬＧＥＦＬＫＬ（配列番号２）を含む第２のペプチド抗原、アミノ酸配列ＲＩＳＴＦＫＮＷＰＫ（配列番号５８を含む第３のペプチド抗原）、アミノ酸配列ＳＴＦＫＮＷＰＦＬ（配列番号５９）を含む第４のペプチド抗原、及びアミノ酸配列ＬＰＰＡＷＱＰＦＬ（配列番号６０）を含む第５のペプチド抗原を含む５つのサバイビンペプチド抗原、
    （ｉｉ）アミノ酸配列ＡＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ（配列番号６１）を含むヘルパーＴエピトープ、
    （ｉｉｉ）ポリＩ：Ｃポリヌクレオチドアジュバント、
    （ｉｖ）１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）とコレステロール脂質混合物の脂質分子混合物、並びに
    （ｖ）疎水性担体モンタニド（登録商標）ＩＳＡ ５１ ＶＧ
    を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のデポー形成ワクチン。
  36. 前記デポー非形成ワクチンが、同じ構成成分（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）、並びに水担体を含む、請求項３５に記載のデポー形成ワクチン。
  37. 前記デポー形成ワクチンが、
    （ｉ）ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に由来するペプチド抗原、
    （ｉｉ）アミノ酸配列ＡＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ（配列番号６１）を含むヘルパーＴエピトープ、
    （ｉｉｉ）ポリＩ：Ｃポリヌクレオチドアジュバント、
    （ｉｖ）１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）とコレステロール脂質混合物の脂質分子混合物、及び
    （ｖ）疎水性担体モンタニド（登録商標）ＩＳＡ ５１ ＶＧ
    を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のデポー形成ワクチン。
  38. 前記デポー非形成ワクチンが、同じ構成成分（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）、並びに水担体を含む、請求項３７に記載のデポー形成ワクチン。
  39. 前記対象において細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）免疫応答及び／又は抗体免疫応答を強化するためのものである、請求項１〜３８のいずれか一項に記載のデポー形成ワクチン。
  40. 前記対象が前記抗原に対して事前の免疫応答を有していない、請求項１〜３９のいずれか一項に記載のデポー形成ワクチン。
  41. 癌、感染性疾患、又は嗜癖疾患を治療又は予防するためのものである、請求項３９又は４０に記載のデポー形成ワクチン。
  42. 前記デポー非形成ワクチンが、前記デポー形成ワクチンよりも素早く注射部位からクリアランスされる、請求項１〜４１のいずれか一項に記載のデポー形成ワクチン。
  43. 前記免疫応答の強化が注射部位反応の発生率の低下を含む、請求項１〜４２のいずれか一項に記載のデポー形成ワクチン。
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