CN105308063B - Wt1抗原肽缀合物疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供式(1)所示的化合物或其盐等，其中Xa和Ya各自为单键等，癌抗原肽A是由7‑30个氨基酸残基组成的MHC I类‑限制性WT1肽；R1是氢原子、式(2)所示的基团或癌抗原肽C，其中Xb和Yb各自为单键等，癌抗原肽B具有不同于癌抗原肽A的序列，并且是由7‑30个氨基酸残基组成的MHC I类‑限制性WT1肽，并且癌抗原肽C具有不同于癌抗原肽A的序列，并且是由含有一个半胱氨酸残基的7‑30个氨基酸残基组成的MHC I类‑限制性WT1肽或MHC II类‑限制性WT1肽。

Description

WT1抗原肽缀合物疫苗
技术领域
本发明属于癌免疫疗法领域，并且涉及缀合物疫苗，其可以通过肽酶ERAP1接受修整，其通过将来源于WT1抗原蛋白的肽前体经由硫-硫共价键缀合而得到，并且其有效地诱导细胞毒性T细胞。
背景技术
对于消灭体内的癌细胞而言，主要是细胞免疫、尤其是细胞毒性T细胞（细胞毒性T淋巴细胞、细胞毒性T细胞，在下文中称为CTL）起着重要的作用。CTL通过前体T细胞的分化和增殖而生成，该前体T细胞识别由来源于癌抗原蛋白的抗原肽 (癌抗原肽)和MHC I类分子形成的复合物，并且该CTL攻击癌细胞。
肾母细胞瘤的抑癌基因WT1 (WT1基因)被认为是白血病和实体瘤的新的癌抗原蛋白(参见非专利文献1)。
对于WT1蛋白，例如，已经报道了与MHC I类结合且被其提呈的下述癌抗原肽(参见专利文献1、2)。
WT1126-134肽:RMFPNAPYL (Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu) (SEQ IDNO:2)，
WT1235-243肽:CMTWNQMNL (Cys-Met-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu) (SEQ IDNO:3),
WT110-18肽:ALLPAVPSL (Ala-Leu-Leu-Pro-Ala-Val-Pro-Ser-Leu) (SEQ ID NO:5)，
WT1187-195肽:SLGEQQYSV (Ser-Leu-Gly-Glu-Gln-Gln-Tyr-Ser-Val) (SEQ IDNO:6)，
WT1302-310肽:RVPGVAPTL (Arg-Val-Pro-Gly-Val-Ala-Pro-Thr-Leu) (SEQ IDNO:7)等。
在癌免疫疗法中，辅助T细胞的活化对于活化包括CTL的其它T细胞也重要。通常，抗原蛋白被细胞内溶酶体降解，由肽（由约13 - 17个氨基酸残基组成）构成的肽片段的一部分作为抗原肽与MHC II类分子结合并被提呈至辅助T细胞-TCR･CD3复合物而活化辅助T细胞。对于WT1蛋白，例如，已经报道了下述通过与MHC II类结合而被提呈的癌抗原肽(参见专利文献3 - 5)。
WT1332-347肽:KRYFKLSHLQMHSRKH (Lys-Arg-Tyr-Phe-Lys-Leu-Ser-His-Leu-Gln-Met-His-Ser-Arg-Lys-His) (SEQ ID NO:8)，
WT1328-349肽:PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (Pro-Gly-Cys-Asn-Lys-Arg-Tyr-Phe-Lys-Leu-Ser-His-Leu-Gln-Met-His-Ser-Arg-Lys-His-Thr-Gly) (SEQ ID NO:10)，
WT1122-140肽:SGQARMFPNAPYLPSCLES (Ser-Gly-Gln-Ala-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-Pro-Ser-Cys-Leu-Glu-Ser) (SEQ ID NO:11)等。
作为WT1的疫苗抗原，主要使用抗原蛋白本身或来源于上述抗原蛋白的抗原肽(参见非专利文献2)。因为使用蛋白的癌疫苗通常含有各种癌抗原肽，其可以同时诱导多种CTL和辅助T细胞。另一方面，因为癌蛋白疫苗在稳定供应和质量控制上存在问题，因此促进制造和质量控制的肽被广泛用作WT1的癌抗原。然而，由于常规的肽疫苗通常主要由单一MHCI类提呈肽抗原构成，近年来已经指出有效的CTL的诱导还需要进一步的改进(参见非专利文献3)。
一个解决方案是多价抗原肽提呈WT1肽癌疫苗。作为该肽癌疫苗，已经报道了含有由MHC I类和II类所提呈的多种肽抗原的混合物的混合疫苗（cocktail vaccine）(参见非专利文献4)，含有由MHC I类和II类所提呈的肽抗原(其通过酰胺键结合)的长链肽疫苗等(参见非专利文献5)。然而，在混合疫苗的情形中，由于由各种氨基酸组成的各肽抗原表现出各种性质，能够有效地诱导与其对应的CTL的最佳制剂的开发常常有问题。在长链肽疫苗的情形中，其生产有时像蛋白那样出现问题。进而，由于在长链肽疫苗中，被I类和II类所提呈的肽抗原经由任意的肽间隔物而结合，因而难以通过细胞内酶控制和预测切割位点。同时，已经报道了其中两个肽单体通过二硫键相互结合的肽二聚体(参见专利文献6)。与混合疫苗不同，由于是两个单一的肽结合，因此它们具有单一的物性并能容易地制造。另一方面，为了形成缀合物，WT1癌抗原肽需要在其氨基酸序列中含有半胱氨酸，因此可应用的是有限的。进而，还已经报道了一种通过二硫键将具有半胱氨酸、谷胱甘肽或巯基乙酸的癌抗原肽的N-末端半胱氨酸缩合而获得的改变的化合物(参见专利文献7)。
MHC I类上的癌抗原肽提呈的过程涉及多种肽酶。这些肽酶中，内质网氨肽酶 1(下文中称为ERAP1)是内质网(下文中称为ER)中的一种修整酶，并且已被报道识别特定的抗原肽序列和肽长度，并且从N-末端切断癌抗原肽前体而控制长度为最适于与MHC I类结合(参见非专利文献6-8)。然而，迄今尚未报道通过ERAP1的修整功能而控制了其从N-末端起的长度的含有半胱氨酸的WT1肽癌抗原前体。
[文献列表]
[专利文献]
专利文献1:WO 00/06602
专利文献2:WO 00/18795
专利文献3:WO 2005/045027
专利文献4:WO 2007/047764
专利文献5:WO 2007/120673
专利文献6:WO 2004/063217
专利文献7:WO 2007/063903
[非专利文献]
非专利文献1:The Journal of Immunology, 2000; 164(4); 1873-1880
非专利文献2:The Oncologist, 2012; 17(2); 250-259
非专利文献3:Cancer Journal, 2011; 17(5); 343-350
非专利文献4:Blood, 2010; 166(2); 171-179
非专利文献5:Cancers, 2011; 3; 3991-4009
非专利文献6:Proceedings of the National Academy of Sciences of UnitedStates of America, 2005; 102(47); 17107-17112
非专利文献7:The Journal of Immunology, 2009; 183; 5526-5536
非专利文献8:The Journal of Immunology, 2010; 184; 4725-4732。
发明内容
发明要解决的技术问题
本发明要解决的问题是提供一种有效地诱导CTL的WT1缀合物疫苗。
用于解决技术问题的方法
为了解决上述问题，本发明人已经进行了深入研究，并且发现，当考虑采用缀合物疫苗时，想到将半胱氨酸添加至WT1癌抗原肽，并且进一步证实了采用体内动物模型的药理学试验等的结果强烈暗示ERAP1从通过细胞内的二硫键的还原裂解生成的WT1癌抗原肽前体的N-末端切断半胱氨酸，而有效地将其转换为癌抗原肽，这使得发现能够在体内诱导CTL的多价抗原肽提呈缀合物疫苗，从而完成了本发明。
具体地，在研究上述问题的解决方案的过程中，他们已经获得了下述想法，即在不影响MHC I类的抗原提呈的情形下将形成两个不同WT1癌抗原肽的缀合物所需的半胱氨酸导入至N-末端或C-末端的任意位置的方法。作为进一步研究的结果，他们已经创造了将含有半胱氨酸的0 – 5个氨基酸导入至WT1癌抗原肽的N末端而得的肽，以及经由半胱氨酸含有二硫键的该肽的缀合物。进而，本发明人已首次证实了所述肽和缀合物，在体外和/或体内容易受到ERAP1的修整，结果使得癌抗原肽形成，因此本发明得以完成。
尽管能够容易地制造、能够适用于各种情形、并以高效率诱导CTL的新型的多价WT1 抗原肽提呈肽癌疫苗的开发一直受到期望，本发明人所发明的缀合物已经使得能够开发有效地诱导CTL、物理化学性质优异、能够容易地制造、便于生产管理、并且适用于各种情形的WT1 缀合物疫苗。
因此，本发明涉及下述内容。
1.第一实施方案
1. 式(1)所示的化合物或其药学上可接受的盐，
其中Xa和Ya 各自独立地为单键或由1 - 4个氨基酸残基组成的二价肽基团，并且Xa的氨基酸残基数和Ya的氨基酸残基数的总和是0 - 4的整数，
癌抗原肽A是由7 - 30个氨基酸残基组成的MHC I类-限制性WT1肽，癌抗原肽A的N-末端氨基酸的氨基与式(1)中的Ya结合，并且癌抗原肽A的C-末端氨基酸的羰基与式(1)中的羟基结合，
R1是氢原子、式(2)所示的基团或癌抗原肽C，
其中Xb和Yb 各自独立地为单键或由1 - 4个氨基酸残基组成的二价肽基团，并且Xb的氨基酸残基数和Yb的氨基酸残基数的总和是0 - 4的整数，
癌抗原肽B具有不同于癌抗原肽A的序列，并且其是由7 - 30个氨基酸残基组成的MHC I类-限制性WT1肽，癌抗原肽B的N-末端氨基酸的氨基与式(2)中的Yb结合，并且癌抗原肽B的C-末端氨基酸的羰基与式(2)中的羟基结合，并且
式(2)中的硫醚基与式(1)中的硫醚基结合，
其中癌抗原肽C具有不同于癌抗原肽A的序列，并且其是由含有一个半胱氨酸残基的7 - 30个氨基酸残基组成的MHC I类-限制性WT1肽或者由含有一个半胱氨酸残基的7 -30个氨基酸残基组成的MHC II类-限制性WT1肽，并且癌抗原肽C的半胱氨酸残基的硫醚基与式(1)中的硫醚基结合，
其中，在R1为氢原子时，式(1)所示的化合物的序列与WT1蛋白的部分序列并不相同；
2. 根据1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中Xa是由2个氨基酸残基组成的二价肽基团并且Ya是单键，或者Xa和Ya各自独立地为由1个氨基酸残基组成的二价肽基团，或者Xa是单键并且Ya是由2个氨基酸残基组成的二价肽基团，或者Xa是由1个氨基酸残基组成的二价肽基团并且Ya是单键，或者Xa是单键并且Ya是由1个氨基酸残基组成的二价肽基团，或者Xa和Ya各自为单键；
3. 根据1或2所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中Xa是单键并且Ya是单键、丙氨酸残基、亮氨酸残基或蛋氨酸残基；
4. 根据1或2所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中Xa是单键或由1个氨基酸残基组成的二价肽基团，并且Ya是单键；
5. 根据1 – 4中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中Xa和Ya各自为单键；6. 根据1 – 5中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中癌抗原肽A是由7- 15个氨基酸残基组成的MHC I类-限制性WT1肽；
7. 根据1 - 6中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中癌抗原肽A是包含选自下述氨基酸序列中的任意氨基酸序列的肽:
RMFPNAPYL (SEQ ID NO:2)，
CMTWNQMNL (SEQ ID NO:3)，
ALLPAVPSL (SEQ ID NO:5), SLGEQQYSV (SEQ ID NO:6) 和RVPGVAPTL (SEQ IDNO:7)，或者是包含改变氨基酸序列并且具有CTL诱导活性的肽，该改变氨基酸序列是选自SEQ ID NO:2, 3, 5, 6和7但含有氨基酸残基的改变的任意氨基酸序列；
8. 根据1 - 7中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中癌抗原肽A是由选自下述氨基酸序列中的任意氨基酸序列组成的肽:
RMFPNAPYL (SEQ ID NO:2)，
CMTWNQMNL (SEQ ID NO:3)，
CYTWNQMNL (SEQ ID NO:4)，
ALLPAVPSL (SEQ ID NO:5)，
SLGEQQYSV (SEQ ID NO:6) 和
RVPGVAPTL (SEQ ID NO:7)；
9. 根据1 – 8中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1是氢原子；
10. 根据1 – 9中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中式(1)所示的化合物是由选自下述氨基酸序列中的任意氨基酸序列组成的肽:
CRMFPNAPYL (SEQ ID NO:13)，
CCMTWNQMNL (SEQ ID NO:14)，
CCYTWNQMNL (SEQ ID NO:15)，
CALLPAVPSL (SEQ ID NO:16)，
CSLGEQQYSV (SEQ ID NO:17) 和
CRVPGVAPTL (SEQ ID NO:18)；
11. 根据1 – 8中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1是式(2)所示的基团；
12. 根据1 – 8和11中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中Xb是由2个氨基酸残基组成的二价肽基团并且Yb是单键，或者Xb和Yb各自独立地为由1个氨基酸残基组成的二价肽基团，或者Xb是单键并且Yb是由2个氨基酸残基组成的二价肽基团，或者Xb是由1个氨基酸残基组成的二价肽基团并且Yb是单键，或者Xb是单键并且Yb是由1个氨基酸残基组成的二价肽基团，或者Xb和Yb各自为单键；
13. 根据1 – 8和11 - 12中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中Xb是单键，并且Yb是单键、丙氨酸残基、亮氨酸残基或蛋氨酸残基；
14. 根据1 – 8和11 - 12中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中Xb是单键或由1个氨基酸残基组成的二价肽基团，并且Yb是单键；
15. 根据1 – 8和11 - 14中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中Xb和Yb各自为单键；
16. 根据1 – 8和11 - 15中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中癌抗原肽B是由7 - 15个氨基酸残基组成的MHC I类-限制性WT1肽；
17. 根据1 - 8和11 - 16中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中癌抗原肽B是包含下述氨基酸序列中的任意氨基酸序列的肽:
RMFPNAPYL (SEQ ID NO:2)，
CMTWNQMNL (SEQ ID NO:3)，
ALLPAVPSL (SEQ ID NO:5)，
SLGEQQYSV (SEQ ID NO:6) 和
RVPGVAPTL (SEQ ID NO:7)，或者是
包含改变氨基酸序列并且具有CTL诱导活性的肽，该改变氨基酸序列是选自SEQID NO:2, 3, 5, 6和7但含有氨基酸残基的改变的任意氨基酸序列；
18. 根据1 - 8和11 - 17中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中癌抗原肽B是由选自下述氨基酸序列中的任意氨基酸序列组成的肽:
RMFPNAPYL (SEQ ID NO:2)，
CMTWNQMNL (SEQ ID NO:3)，
CYTWNQMNL (SEQ ID NO:4)，
ALLPAVPSL (SEQ ID NO:5)，
SLGEQQYSV (SEQ ID NO:6) 和
RVPGVAPTL (SEQ ID NO:7)；
19. 根据1 - 8和11 - 18中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中式(1)所示的化合物是式(3)所示的化合物:
其中C与C之间的键是二硫键；
20. 根据1 - 8中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1是癌抗原肽C；
21. 根据1 – 8和20中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中癌抗原肽C是由7 - 15个氨基酸残基组成的MHC I类-限制性WT1肽；
22. 根据1 - 8和20 - 21中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中癌抗原肽C是包含下述氨基酸序列的肽:
CMTWNQMNL (SEQ ID NO:3)，或者是
包含改变氨基酸序列并且具有CTL诱导活性的肽，该改变氨基酸序列是SEQ IDNO:3但含有氨基酸残基的改变的氨基酸序列；
23. 根据1 - 8和20 - 22中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中癌抗原肽C是由选自下述氨基酸序列中的任意氨基酸序列组成的肽:
CMTWNQMNL (SEQ ID NO:3) 和
CYTWNQMNL (SEQ ID NO:4)；
24. 根据1 - 8和20 - 23中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中式(1)所示的化合物是式(4)所示的化合物:
其中C与C之间的键是二硫键；或者是式(5)所示的化合物:
其中C与C之间的键是二硫键；
25. 根据1 – 8和20中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中癌抗原肽C是由14 - 30个氨基酸残基组成的MHC II类-限制性WT1肽；
26. 根据1 – 8、20和25中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中癌抗原肽C是包含选自下述氨基酸序列中的任意氨基酸序列的肽:
SGQARMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO:19)，
SGQARMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO:11)，
PGCNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO:20)，
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO:21)，
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO:10)，
CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO:22)，
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO:23) 和
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO:24)，或者是
包含改变氨基酸序列并且具有辅助T细胞诱导活性的肽，该改变氨基酸序列是选自SEQ ID NO:10 - 11和19 - 24但含有氨基酸残基的改变的任意氨基酸序列；
27. 根据1 – 8、20和25 - 26中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中癌抗原肽C是由选自下述氨基酸序列中的氨基酸序列组成的肽:
SGQARMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO:19)，
SGQAYMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO:25)，
SGQARMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO:11)，
SGQAYMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO:12)，
PGCNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO:20)，
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO:21)，
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO:10)，
CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO:22)，
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO:23) 和
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO:24)；
28. 根据1 - 8、20和25 – 27中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中式(1)所示的化合物是式(6)所示的化合物:
其中C与C之间的键是二硫键，
式(7)所示的化合物:
其中C与C之间的键是二硫键，
式(8)所示的化合物:
其中C与C之间的键是二硫键，或
式(9)所示的化合物:
其中C与C之间的键是二硫键；
29. 药物组合物，其包含1 – 28中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐、和药学上可接受的载体；
30. 根据29所述的药物组合物，其被用作癌疫苗；
31. 根据1 - 28中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐在制造癌疫苗中的用途；
32. 治疗或预防癌症的方法，其包括对有需要的WT1阳性癌患者给予治疗或预防有效量的1 - 28中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐；和
33. 获得两种不同的MHC I类-限制性表位、或MHC I类-限制性表位与MHC II类-限制性表位的方法，其包括使1 - 28中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐与ERAP1反应。
2.第二实施方案
1. 式(1)所示的化合物或其药学上可接受的盐，
其中Xa和Ya 各自独立地为单键或由1 - 4个氨基酸残基组成的二价肽基团，并且Xa的氨基酸残基数和Ya的氨基酸残基数的总和是0 - 4的整数，
癌抗原肽A是由7 - 30个氨基酸残基组成的MHC I类-限制性WT1肽，癌抗原肽A的N-末端氨基酸的氨基与式(1)中的Ya结合，并且癌抗原肽A的C-末端氨基酸的羰基与式(1)中的羟基结合，
R1是氢原子、式(2)所示的基团或癌抗原肽C，
其中Xb和Yb 各自独立地为单键或由1 - 4个氨基酸残基组成的二价肽基团，并且Xb的氨基酸残基数和Yb的氨基酸残基数的总和是0 - 4的整数，
癌抗原肽B在序列上具有不同于癌抗原肽A的序列，并且其是由7 - 30个氨基酸残基组成的MHC I类-限制性WT1肽，癌抗原肽B的N-末端氨基酸的氨基与式(2)中的Yb结合，并且癌抗原肽B的C-末端氨基酸的羰基与式(2)中的羟基结合，并且
式(2)中的硫醚基与式(1)中的硫醚基结合，
其中癌抗原肽C是在序列上不同于癌抗原肽A的MHC I类-限制性WT1肽，并且由含有一个半胱氨酸残基的7 - 30个氨基酸残基组成，或者是由含有一个半胱氨酸残基的7 -30个氨基酸残基组成的MHC II类-限制性WT1肽，并且癌抗原肽C的半胱氨酸残基的硫醚基与式(1)中的硫醚基结合，
其中，在R1为氢原子时，式(1)所示的化合物的序列与WT1蛋白的部分序列并不相同；
2. 根据1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中Xa是由2个氨基酸残基组成的二价肽基团并且Ya是单键，或者Xa和Ya各自独立地为由1个氨基酸残基组成的二价肽基团，或者Xa是单键并且Ya是由2个氨基酸残基组成的二价肽基团，或者Xa是由1个氨基酸残基组成的二价肽基团并且Ya是单键，或者Xa是单键并且Ya是由1个氨基酸残基组成的二价肽基团，或者Xa和Ya各自为单键；
3. 根据1或2所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中Xa是单键并且Ya是单键、丙氨酸残基、亮氨酸残基或蛋氨酸残基；
4. 根据1或2所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中Xa是单键或由1个氨基酸残基组成的二价肽基团，并且Ya是单键；
5. 根据1 – 4中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中Xa和Ya各自为单键；
6. 根据1 – 5中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中癌抗原肽A是由7 - 15个氨基酸残基组成的MHC I类-限制性WT1肽；
7. 根据1 - 6中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中癌抗原肽A是包含选自下述氨基酸序列中的任意氨基酸序列的肽:
RMFPNAPYL (SEQ ID NO:2)，
CMTWNQMNL (SEQ ID NO:3)，
ALLPAVPSL (SEQ ID NO:5)，
SLGEQQYSV (SEQ ID NO:6) 和
RVPGVAPTL (SEQ ID NO:7)，或者是
包含改变氨基酸序列并且具有CTL诱导活性的肽，该改变氨基酸序列是选自SEQID NO:2, 3, 5, 6和7但含有氨基酸残基的改变的任意氨基酸序列；
8. 根据1 - 7中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中癌抗原肽A是由选自下述氨基酸序列中的任意氨基酸序列组成的肽:
RMFPNAPYL (SEQ ID NO:2)，
CMTWNQMNL (SEQ ID NO:3)，
CYTWNQMNL (SEQ ID NO:4)，
ALLPAVPSL (SEQ ID NO:5)，
SLGEQQYSV (SEQ ID NO:6) 和
RVPGVAPTL (SEQ ID NO:7)；
9. 根据1 – 8中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1是氢原子；
10. 根据1 – 9中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中式(1)所示的化合物是由选自下述氨基酸序列中的任意氨基酸序列组成的肽:
CRMFPNAPYL (SEQ ID NO:13)，
CCMTWNQMNL (SEQ ID NO:14)，
CCYTWNQMNL (SEQ ID NO:15)，
CALLPAVPSL (SEQ ID NO:16)，
CSLGEQQYSV (SEQ ID NO:17) 和
CRVPGVAPTL (SEQ ID NO:18)；
11. 根据1 – 8中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1是式(2)所示的基团；
12. 根据1 – 8和11中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中Xb是由2个氨基酸残基组成的二价肽基团并且Yb是单键，或者Xb和Yb各自独立地为由1个氨基酸残基组成的二价肽基团，或者Xb是单键并且Yb是由2个氨基酸残基组成的二价肽基团，或者Xb是由1个氨基酸残基组成的二价肽基团并且Yb是单键，或者Xb是单键并且Yb是由1个氨基酸残基组成的二价肽基团，或者Xb和Yb各自为单键；
13. 根据1 – 8和11 - 12中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中Xb是单键，并且Yb是单键、丙氨酸残基、亮氨酸残基或蛋氨酸残基；
14. 根据1 – 8和11 - 12中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中Xb是单键或由1个氨基酸残基组成的二价肽基团，并且Yb是单键；
15. 根据1 – 8和11 - 14中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中Xb和Yb各自为单键；
16. 根据1 – 8和11 - 15中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中癌抗原肽B是由7 - 15个氨基酸残基组成的MHC I类-限制性WT1肽；
17. 根据1 - 8和11 - 16中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中癌抗原肽B是包含下述氨基酸序列中的任意氨基酸序列的肽:
RMFPNAPYL (SEQ ID NO:2)，
CMTWNQMNL (SEQ ID NO:3)，
ALLPAVPSL (SEQ ID NO:5)，
SLGEQQYSV (SEQ ID NO:6) 和
RVPGVAPTL (SEQ ID NO:7)，或者是
包含改变氨基酸序列并且具有CTL诱导活性的肽，该改变氨基酸序列是选自SEQID NO:2, 3, 5, 6和7但含有氨基酸残基的改变的任意氨基酸序列；
18. 根据1 - 8和11 - 17中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中癌抗原肽B是由选自下述氨基酸序列中的任意氨基酸序列组成的肽:
RMFPNAPYL (SEQ ID NO:2)，
CMTWNQMNL (SEQ ID NO:3)，
CYTWNQMNL (SEQ ID NO:4)，
ALLPAVPSL (SEQ ID NO:5)，
SLGEQQYSV (SEQ ID NO:6) 和
RVPGVAPTL (SEQ ID NO:7)；
19. 根据1 - 8和11 - 18中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中式(1)所示的化合物是式(3)所示的化合物:
其中C与C之间的键是二硫键；
20. 根据13所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中Yb是丙氨酸残基；
21. 根据1 - 8和11 – 13和20中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中，在癌抗原肽B是含有一个半胱氨酸残基的MHC I类-限制性WT1肽时，癌抗原肽B中的硫醚基与式(16)中的硫醚基结合:
其中Xd和Yd各自独立地为单键或由1 - 4个氨基酸残基组成的二价肽基团，并且Xd的氨基酸残基数和Yd的氨基酸残基数的总和是0 - 4的整数，
癌抗原肽D是由7 - 30个氨基酸残基组成的MHC II类-限制性WT1肽，癌抗原肽D的N-末端氨基酸的氨基与式(16)中的Yd结合，并且癌抗原肽D的C-末端氨基酸的羰基与式(16)中的羟基结合，或者与癌抗原肽E的半胱氨酸残基的硫醚基结合，该癌抗原肽E是由含有一个半胱氨酸残基的7 - 30个氨基酸残基组成的MHC II类-限制性WT1肽；
22. 根据21所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中癌抗原肽B是由7 - 15个氨基酸残基组成的MHC I类-限制性WT1肽；
23. 根据21 - 22中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中癌抗原肽B是由选自下述氨基酸序列中的任意氨基酸序列组成的肽:
CMTWNQMNL (SEQ ID NO:3) 和
CYTWNQMNL (SEQ ID NO:4)；
24. 根据21 - 23中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中Xd是由2个氨基酸残基组成的二价肽基团并且Yd是单键，或者Xd和Yd各自独立地为由1个氨基酸残基组成的二价肽基团，或者Xd是单键并且Yd是由2个氨基酸残基组成的二价肽基团，或者Xd是由1个氨基酸残基组成的二价肽基团并且Yd是单键，或者Xd是单键并且Yd由1个氨基酸残基组成的二价肽基团，或者Xd和Yd各自为单键；
25. 根据21 - 24中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中Xd是单键，Yd是单键、丙氨酸残基、亮氨酸残基或蛋氨酸残基；
26. 根据21 - 24中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中Xd是单键或由一个氨基酸残基组成的二价肽基团，并且Yd是单键；
27. 根据21 - 26中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中Xd和Yd各自为单键；
28. 根据21 – 27中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中癌抗原肽D是由14 - 30个氨基酸残基组成的MHC II类-限制性WT1肽；
29. 根据21 – 28中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中癌抗原肽D是由选自下述氨基酸序列中的任意氨基酸序列组成的肽:
SGQARMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO:19)，
SGQAYMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO:25)，
SGQARMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO:11)，
SGQAYMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO:12)，
PGCNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO:20)，
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO:21)，
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO:10)，
CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO:22)，
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO:23)，
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO:24) 和
WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO:244)；
30. 根据1 - 8、11 - 13和20 – 29中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中式(1)所示的化合物是式(15)所示的化合物:
其中C与C之间的键是二硫键；
31. 根据21 – 23中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中癌抗原肽E是由14 - 30个氨基酸残基组成的MHC II类-限制性WT1肽；
32. 根据21 – 23和31中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中癌抗原肽E是由选自下述氨基酸序列中的任意氨基酸序列组成的肽:
SGQARMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO:19)，
SGQAYMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO:25)，
SGQARMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO:11)，
SGQAYMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO:12)，
PGCNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO:20)，
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO:21)，
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO:10)，
CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO:22)，
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO:23) 和
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO:24)；
33. 根据1 - 8中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1是癌抗原肽C；
34. 根据1 – 8和33中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中癌抗原肽C是由7 - 15个氨基酸残基组成的MHC I类-限制性WT1肽；
35. 根据1 - 8和33 - 34中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中癌抗原肽C是包含下述氨基酸序列的肽:
CMTWNQMNL (SEQ ID NO:3)，或者是
包含改变氨基酸序列并且具有CTL诱导活性的肽，该改变氨基酸序列是SEQ IDNO:3但含有氨基酸残基的改变的氨基酸序列；
36. 根据1 - 8和33 - 35中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中癌抗原肽C是由选自下述氨基酸序列中的任意氨基酸序列组成的肽:
CMTWNQMNL (SEQ ID NO:3) 和
CYTWNQMNL (SEQ ID NO:4)；
37. 根据1 - 8和33 - 36中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中式(1)所示的化合物是式(4)所示的化合物或者是式(5)所示的化合物，
其中C与C之间的键是二硫键，
其中C与C之间的键是二硫键；
38. 根据1 - 8和33中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中，在由含有一个半胱氨酸残基的1 - 4个氨基酸残基组成的肽进一步与癌抗原肽C的N-末端结合时，结合于癌抗原肽C的N-末端的该肽的半胱氨酸残基的硫醚基与式(16)中的硫醚基结合:
其中Xd和Yd各自独立地为单键或由1 - 4个氨基酸残基组成的二价肽基团，并且Xd的氨基酸残基数和Yd的氨基酸残基数的总和是0 - 4的整数，
癌抗原肽D是由7 - 30个氨基酸残基组成的MHC II类-限制性WT1肽，癌抗原肽D的N-末端氨基酸的氨基与式(16)中的Yd结合，并且癌抗原肽D的C-末端氨基酸的羰基与式(16)中的羟基结合，或者与癌抗原肽E的半胱氨酸残基的硫醚基结合，该癌抗原肽E是由含有一个半胱氨酸残基的7 - 30个氨基酸残基组成的MHC II类-限制性WT1肽；
39. 根据38所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中结合于癌抗原肽C的N-末端的由含有一个半胱氨酸残基的1 - 4个氨基酸残基组成的肽是由CA组成的二肽；
40. 根据38 – 39中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中癌抗原肽C是由7 - 15个氨基酸残基组成的MHC I类-限制性WT1肽；
41. 根据38 - 40中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中癌抗原肽C是由选自下述氨基酸序列中的任意氨基酸序列组成的肽:
CMTWNQMNL (SEQ ID NO:3) 和
CYTWNQMNL (SEQ ID NO:4)；
42. 根据38 - 41中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中Xd是由2个氨基酸残基组成的二价肽基团并且Yd是单键，或者Xd和Yd各自独立地为由1个氨基酸残基组成的二价肽基团，或者Xd是单键并且Yd是由2个氨基酸残基组成的二价肽基团，或者Xd是由1个氨基酸残基组成的二价肽基团并且Yd是单键，或者Xd是单键并且Yd由1个氨基酸残基组成的二价肽基团，或者Xd和Yd各自为单键；
43. 根据38 - 42中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中Xd是单键，并且Yd是单键、丙氨酸残基、亮氨酸残基或蛋氨酸残基；
44. 根据38 - 42中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中Xd是单键或由1个氨基酸残基组成的二价肽基团，并且Yd是单键；
45. 根据38 - 44中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中Xd和Yd各自为单键；
46. 根据38 – 45中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中癌抗原肽D是由14 - 30个氨基酸残基组成的MHC II类-限制性WT1肽；
47. 根据38 - 46中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中癌抗原肽D是由选自下述氨基酸序列中的任意氨基酸序列组成的肽:
SGQARMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO:19)，
SGQAYMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO:25)，
SGQARMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO:11)，
SGQAYMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO:12)，
PGCNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO:20)，
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO:21)，
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO:10)，
CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO:22)，
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO:23)，
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO:24) 和
WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO:244)；
48. 根据38 - 47中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中式(1)所示的化合物是式(14)所示的化合物:
其中C与C之间的键是二硫键；
49. 根据38 – 41和44中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中癌抗原肽E是由选自下述氨基酸序列中的任意氨基酸序列组成的肽:
SGQARMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO:19)，
SGQAYMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO:25)，
SGQARMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO:11)，
SGQAYMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO:12)，
PGCNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO:20)，
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO:21)，
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO:10)，
CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO:22)，
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO:23) 和
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO:24)；
50. 根据38 - 41和49中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中式(1)所示的化合物是式(12)所示的化合物:
其中C与C之间的键是二硫键；
51. 根据1 – 8和33中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中癌抗原肽C是由14 - 30个氨基酸残基组成的MHC II类-限制性WT1肽；
52. 根据1 – 8、33和51中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中癌抗原肽C是包含选自下述氨基酸序列中的任意氨基酸序列的肽:
SGQARMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO:19)，
SGQARMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO:11)，
PGCNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO:20)，
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO:21)，
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO:10)，
CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO:22)，
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO:23) 和
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO:24)，或者是
包含改变氨基酸序列并且具有辅助T细胞诱导活性的肽，该改变氨基酸序列是选自SEQ ID NO:10 - 11和19 - 24但含有氨基酸残基的改变的任意氨基酸序列；
53. 根据1 – 8、33和51 - 52中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中癌抗原肽C是由选自下述氨基酸序列中的氨基酸序列组成的肽:
SGQARMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO:19)，
SGQAYMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO:25)，
SGQARMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO:11)，
SGQAYMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO:12)，
PGCNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO:20)，
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO:21)，
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO:10)，
CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO:22)，
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO:23)和CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO:24)；
54. 根据1 - 8、33和51 – 53中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中式(1)所示的化合物是式(6)所示的化合物、式(7)所示的化合物、式(8)所示的化合物或者是式(9)所示的化合物，
其中C与C之间的键是二硫键，
其中C与C之间的键是二硫键，
其中C与C之间的键是二硫键，
其中C与C之间的键是二硫键；
55. 由7 - 30个氨基酸残基组成的MHC II类-限制性WT1肽的改变体；
56. 根据55所述的改变体，其是下述氨基酸序列:
CWAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO:242) 或
WAPVLDFAPPGASAYGSLC (SEQ ID NO:243)；
57. 式(10)所示的化合物或其药学上可接受的盐:
其中C与C之间的键是二硫键；
58. 组合物，其包含：选自式(3)所示的化合物、式(4)所示的化合物和式(5)所示的化合物中的化合物，
其中C与C之间的键是二硫键，
其中C与C之间的键是二硫键，
其中C与C之间的键是二硫键；以及
由选自下述氨基酸序列中的氨基酸序列组成的肽:
CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO:22)，
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO:23)，
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO:24)，
WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO:244)，
CWAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO:242) 和
WAPVLDFAPPGASAYGSLC (SEQ ID NO:243)；
59. 药物组合物，其包含1 – 54和57中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐、或58所述的组合物、和药学上可接受的载体;
60. 根据59所述的药物组合物，其被用作癌疫苗；
61. 根据1 – 54和57中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐、或根据58所述的组合物的在制造癌疫苗中的用途；
62. 治疗或预防癌症的方法，其包括对有需要的WT1阳性癌患者给予治疗或预防有效量的1 – 54和57中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或58所述的组合物；
63. 获得两种不同的MHC I类-限制性表位、或MHC I类-限制性表位与MHC II类-限制性表位的方法，其包括使1 – 54和57中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐与ERAP1反应；和
64. 合成化合物的方法，其包括下述步骤:
(1) 通过使用Fmoc-C(Mmt)A-SBn和癌抗原肽C来合成结合有C(Mmt)A的C-末端氨基酸的羰基和癌抗原肽C的N-末端氨基的肽的步骤，其中抗原肽 C是由含有一个半胱氨酸残基的7 - 30个氨基酸残基组成的MHC I类-限制性WT1肽，或者是由含有一个半胱氨酸残基的7 - 30个氨基酸残基组成的MHC II类-限制性WT1肽；
(2) 通过使用上述步骤(1)中获得的肽和被Npys基团保护的一个半胱氨酸残基结合于N-末端的癌抗原肽A来合成其中上述步骤(1)中所得的肽中的癌抗原肽C的半胱氨酸残基的硫醚基和结合于癌抗原肽A的N-末端的半胱氨酸残基的硫醚基结合了的肽的步骤，其中癌抗原肽A是由7 - 30个氨基酸残基组成的MHC I类-限制性WT1肽；和
(3) 通过使用上述步骤(2)中所得的肽和含有被Spy基团所保护的半胱氨酸残基的癌抗原肽D，来合成其中结合于上述步骤(2)中所得的肽中的癌抗原肽A的N-末端的半胱氨酸残基的硫醚基与癌抗原肽D的半胱氨酸残基的硫醚基结合了的肽的步骤，其中癌抗原肽D是由含有一个结合于N末端的半胱氨酸残基的7 - 30个氨基酸残基组成的MHC II类-限制性WT1肽或是由含有一个半胱氨酸残基的7 - 30个氨基酸残基组成的MHC II类-限制性WT1肽；
3.第三实施方案
1. 式(1)所示的化合物或其药学上可接受的盐，
其中Xa和Ya各自为单键，
癌抗原肽A是由选自下述氨基酸序列中的任意氨基酸序列组成的肽:
RMFPNAPYL (SEQ ID NO:2)，
ALLPAVPSL (SEQ ID NO:5)，
SLGEQQYSV (SEQ ID NO:6) 和
RVPGVAPTL (SEQ ID NO:7)，
癌抗原肽A的N-末端氨基酸的氨基与式(1)中的Ya结合，并且癌抗原肽A的C-末端氨基酸的羰基与式(1)中的羟基结合，
R1是癌抗原肽C，
癌抗原肽C具有不同于癌抗原肽A的序列，该癌抗原肽C是由选自下述氨基酸序列中的任意氨基酸序列组成的肽:
CMTWNQMNL (SEQ ID NO:3) 和
CYTWNQMNL (SEQ ID NO:4)，并且癌抗原肽C的半胱氨酸残基的硫醚基与式(1)中的硫醚基结合；
2. 根据1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中式(1)所示的化合物是式(4)所示的化合物:
其中C与C之间的键是二硫键；
3. 根据1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中式(1)所示的化合物是式(5)所示的化合物:
其中C与C之间的键是二硫键；
4. 药物组合物，其包含1 – 3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐、和药学上可接受的载体；
5. 根据4所述的药物组合物，其包含至少一个由选自下述氨基酸序列中的氨基酸序列组成的肽:
CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO:22)，
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO:23)，
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO:24)，
WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO:244)，
CWAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO:242) 和
WAPVLDFAPPGASAYGSLC (SEQ ID NO:243)；以及
6. 组合物，其包含：选自式(4)所示的化合物和式(5)所示的化合物中的化合物，
其中C与C之间的键是二硫键，
其中C与C之间的键是二硫键；以及
至少一个由选自下述氨基酸序列中的氨基酸序列组成的肽:
CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO:22)，
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO:23)，
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO:24)，
WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO:244)，
CWAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO:242) 和
WAPVLDFAPPGASAYGSLC (SEQ ID NO:243)。
发明效果
根据本发明，可以提供作为癌症免疫治疗剂有用的上述式(1)所示的化合物(以下有时称作本发明的化合物)。根据本发明的化合物，可以提供在体内和体外有效地诱导CTL的癌疫苗和癌症免疫治疗剂。具体地，根据本发明的化合物，目前可以在体内和体外制造具有不同的序列的两种MHC I类-限制性WT1肽，或具有不同序列的两种MHC I类-限制性WT1表位，MHC I类-限制性WT1肽和MHC II类-限制性WT1肽，MHC I类-限制性WT1表位和MHC II类-限制性WT1表位，具有不同序列的两种MHC I类-限制性WT1肽和MHC II类-限制性WT1肽，或具有不同序列的两种MHC I类-限制性WT1表位和MHC II类-限制性WT1表位，并且有效地诱导CTL。
关于具有不同序列的两种MHC I类-限制性WT1肽的HLA亚型，特别优选的是通过组合A02型 (A-0201、A0206等)的肽和A24型(A-2402等)的肽而得的本发明的化合物(缀合物)。在欧洲人和美国人(白种人)中，HLA-A0201亚型或HLA-A0206亚型的人口是最多的且为约47%，接着HLA-A2402亚型为约13%，并且排除重复(即，两种亚型均具有的人的重复计算)，这些亚型的总和占约56% (Human Immunol.62:1009;2001)。在日本人等中，HLA-A2402的人口是最多的且为约60%，接着HLA-A0201或HLA-A0206为约39%，排除重复(即，两种亚型均具有的人的重复计算)，这些亚型的总和占约81% (www.bmdc.irc.or.jp/GF-A.htm)。因此，本发明的化合物的优点具体为：通过本发明的单一的化合物来覆盖更多的人口，和并不总是必须在给药前选择患者的HLA亚型等。鉴于本发明的化合物的上述优点，优选式(3)、式(4)或式(5)所示的化合物，更优选式(5)所示的化合物。
另外，根据本发明的化合物，可以提供物理化学性质和稳定性优异、容易制造并且容易控制的癌疫苗的活性成分。结果，癌疫苗的制剂化得到了促进。
具体地，物理化学性质的例子包括溶解度、溶液的粘度、由此产生的纯化的容易性、冻干后的易操作性、由此产生的纯化的容易性等。稳定性包括盐置换后的稳定性、吸湿性、热稳定性、乳液形成后的稳定性等。药理学活性包括作为癌疫苗的效力、由API(ActivePharmaceutical Ingredient，活性药物成分)引起的差异, 与制剂中的添加剂的相互作用等。它们之中，由API引起的差异是API所致的作为癌疫苗的差异。具体地，在具有显著不同溶解度的两种API中，具有较小溶解度的API容易析出，并且容易预料不能进行作为对于药物制品的必须要求的通过利用膜过滤器的过滤进行的灭菌处理。即使几乎不能通过小溶解度的API的过滤来进行灭菌处理，也认为含有在滤液中的API的量显著降低并且癌疫苗所必须的CTL诱导能力显著降低。因此，容易预料溶解度小的API的生产效率显著降低的缺点。
附图说明
图 1是示出试验例 1关于实施例 2 - 5中合成的SEQ ID NO: 13、16、17和18的各肽的利用ERAP1的N-末端氨基酸修整的经时变化的试验结果的图。
图 2是示出试验例 2关于通过使用HLA-A0201转基因小鼠的IFNγ ELISPOT测定得到的实施例1中合成的式(5)所示的化合物的体内CTL诱导能力的试验结果的图。
图 3是示出试验例 2关于通过使用HLA-A2402转基因小鼠的IFNγ ELISPOT测定得到的实施例1中合成的式(5)所示的化合物的体内CTL诱导能力的试验结果的图。
图 4是示出试验例 4关于通过使用HLA-A0201转基因小鼠的IFNγ ELISPOT测定得到的实施例6中合成的式(3)所示的化合物的体内CTL诱导能力的试验结果的图。
图 5是示出试验例 5关于通过在用SEQ ID NO: 24的肽脉冲或非脉冲的状态下使用HLA-A0201转基因小鼠的IFNγ ELISPOT测定得到的，实施例7中合成的式(6)所示的化合物在体内诱导SEQ ID NO: 24所示的肽的反应性细胞的能力的试验结果的图。
图 6是示出试验例 5关于通过在用SEQ ID NO: 24的肽脉冲或非脉冲的状态下使用HLA-A0201转基因小鼠的IFNγ ELISPOT测定得到的，实施例7中合成的式(6)所示的化合物在体内诱导SEQ ID NO: 24所示的肽的反应性细胞的能力的试验结果的图。
图 7是示出试验例 6关于通过使用HLA-A0201转基因小鼠的IFNγ ELISPOT测定得到的在用SEQ ID NO: 2的肽脉冲或非脉冲的状态下的实施例9中合成的式(8)所示的化合物的体内CTL诱导能力的试验结果的图。
图 8是示出试验例 6关于通过在用SEQ ID NO: 22的肽脉冲或非脉冲的状态下使用HLA-A0201转基因小鼠的IFNγ ELISPOT测定得到的，实施例9中合成的式(8)所示的化合物在体内诱导SEQ ID NO: 22所示的肽的反应性细胞的能力的试验结果的图。
图 9是示出试验例 8关于通过使用HLA-A0201转基因小鼠的IFNγ ELISPOT测定得到的在用SEQ ID NO: 2的肽脉冲或非脉冲的状态下的实施例8中合成的式(7)所示的化合物的体内CTL诱导能力的试验结果的图。
图 10是示出试验例 8关于通过在用SEQ ID NO: 23的肽脉冲或非脉冲的状态下使用HLA-A0201转基因小鼠的IFNγ ELISPOT测定得到的，实施例8中合成的式(7)所示的化合物在体内诱导SEQ ID NO: 23所示的肽的反应性细胞的能力的试验结果的图。
图 11是示出试验例 9关于通过使用HLA-A0201转基因小鼠的IFNγ ELISPOT测定得到的在用SEQ ID NO: 5的肽脉冲或非脉冲的状态下的实施例10中合成的式(9)所示的化合物的体内CTL诱导能力的试验结果的图。
图 12是示出试验例 9关于通过在用SEQ ID NO: 24的肽脉冲或非脉冲的状态下使用HLA-A0201转基因小鼠的IFNγ ELISPOT测定得到的，实施例10中合成的式(9)所示的化合物在体内诱导SEQ ID NO: 24所示的肽的反应性细胞的能力的试验结果的图。
图 13是示出比较例1关于通过使用HLA-A0201转基因小鼠的IFNγ ELISPOT测定得到的在用SEQ ID NO: 2的肽脉冲或非脉冲的状态下的参考例 8和9中合成的SEQ ID NO:238和239所示的肽的体内CTL诱导能力的试验结果的图。
图 14是示出比较例1关于通过使用HLA-A2402转基因小鼠的IFNγ ELISPOT测定得到的在用SEQ ID NO: 4的肽脉冲或非脉冲的状态下的参考例 8和9中合成的SEQ ID NO:238和239所示的肽的体内CTL诱导能力的试验结果的图。
图 15是示出比较例2关于通过使用HLA-A0201转基因小鼠的IFNγ ELISPOT测定得到的在用SEQ ID NO: 2的肽脉冲或非脉冲的状态下的参考例 10和11中合成的SEQ IDNO: 240和241所示的肽的体内CTL诱导能力的试验结果的图。
图 16是示出比较例2关于通过使用HLA-A2402转基因小鼠的IFNγ ELISPOT测定得到的在用SEQ ID NO: 4的肽脉冲或非脉冲的状态下的参考例 10和11中合成的SEQ IDNO: 240和241所示的肽的体内CTL诱导能力的试验结果的图。
图 17是示出试验例 11关于通过使用HLA-A0201转基因小鼠的IFNγ ELISPOT测定得到的在用SEQ ID NO: 2的肽脉冲或非脉冲的状态下的实施例13中合成的式(10)所示的化合物的体内CTL诱导能力的试验结果的图。
图 18是示出比较例 3关于通过使用HLA-A0201转基因小鼠的IFNγ ELISPOT测定得到的在用SEQ ID NO: 2的肽脉冲或非脉冲的状态下的参考例12中合成的式(11)所示的化合物的体内CTL诱导能力的试验结果的图。
图 19是示出试验例 12关于通过使用HLA-A0201转基因小鼠的IFNγ ELISPOT测定得到的在用SEQ ID NO: 2的肽脉冲或非脉冲的状态下的实施例14中合成的式(12)所示的化合物的体内CTL诱导能力的试验结果的图。
图 20是示出试验例 12关于通过使用HLA-A2402转基因小鼠的IFNγ ELISPOT测定得到的在用SEQ ID NO: 4的肽脉冲或非脉冲的状态下的实施例14中合成的式(12)所示的化合物的体内CTL诱导能力的试验结果的图。
图 21是示出试验例 13关于通过使用HLA-A0201转基因小鼠的IFNγ ELISPOT测定得到的在用SEQ ID NO: 2的肽脉冲或非脉冲的状态下的实施例15中合成的式(14)所示的化合物的体内CTL诱导能力的试验结果的图。
图 22是示出试验例 13关于通过使用HLA-A2402转基因小鼠的IFNγ ELISPOT测定得到的在用SEQ ID NO: 4的肽脉冲或非脉冲的状态下的实施例15中合成的式(14)所示的化合物的体内CTL诱导能力的试验结果的图。
图 23是示出试验例 14关于通过使用HLA-A0201转基因小鼠的IFNγ ELISPOT测定得到的在用SEQ ID NO: 2的肽脉冲或非脉冲的状态下的实施例1中合成的式(5)所示的化合物与参考例1中合成的SEQ ID NO: 22所示的肽的混合疫苗的体内CTL诱导能力的试验结果的图。
图 24是示出试验例 15关于通过使用HLA-A0201转基因小鼠的IFNγ ELISPOT测定得到的在用SEQ ID NO: 2的肽脉冲或非脉冲的状态下的实施例1中合成的式(5)所示的化合物与参考例13中合成的SEQ ID NO: 244所示的肽的混合疫苗的体内CTL诱导能力的试验结果的图。
图 25是示出试验例 16关于通过使用HLA-A0201转基因小鼠的IFNγ ELISPOT测定得到的在用SEQ ID NO: 2的肽脉冲或非脉冲的状态下的实施例1中合成的式(5)所示的化合物与参考例2中合成的SEQ ID NO: 24所示的肽的混合疫苗的体内CTL诱导能力的试验结果的图。
图 26是示出试验例 17关于通过使用HLA-A0201转基因小鼠的IFNγ ELISPOT测定得到的在用SEQ ID NO: 2的肽脉冲或非脉冲的状态下的实施例1中合成的式(5)所示的化合物与实施例11中合成的SEQ ID NO: 242所示的肽的混合疫苗的体内CTL诱导能力的试验结果的图。
图 27是示出试验例 18关于通过使用HLA-A0201转基因小鼠的IFNγ ELISPOT测定得到的在用SEQ ID NO: 2的肽脉冲或非脉冲的状态下的实施例1中合成的式(5)所示的化合物与实施例11中合成的SEQ ID NO: 243所示的肽的混合疫苗的体内CTL诱导能力的试验结果的图。
具体实施方式
以下具体说明本发明的实施方案。
本发明中的“氨基酸残基”意指在肽或蛋白分子中与构成肽或蛋白的氨基酸的一个单元相对应的部分。“氨基酸残基”的例子包括天然或非天然μ-氨基酸残基、β-氨基酸残基、γ-氨基酸残基或δ-氨基酸残基。其具体例包括天然α-氨基酸残基、鸟氨酸残基、高丝氨酸残基、高半胱氨酸残基、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸或δ-氨基戊酸等。在“氨基酸残基”可以是光学活性物质时，其可以是L-体和D-体的任一者，并且优选L-体。
在本发明中的“氨基酸残基”以缩小表示时，可使用下述缩写。
Ala或A: 丙氨酸残基
Arg或R: 精氨酸残基
Asn或N: 天冬酰胺残基
Asp或D: 天冬氨酸残基
Cys或C: 半胱氨酸残基
Gln或Q: 谷氨酰胺残基
Glu或E: 谷氨酸残基
Gly或G: 甘氨酸残基
His或H: 组氨酸残基
Ile或I: 异亮氨酸残基
Leu或L: 亮氨酸残基
Lys或K: 赖氨酸残基
Met或M: 蛋氨酸残基
Phe或F: 苯丙氨酸残基
Pro或P: 脯氨酸残基
Ser或S: 丝氨酸残基
Thr或T: 苏氨酸残基
Trp或W: 色氨酸残基
Tyr或Y: 酪氨酸残基
Val或V: 缬氨酸残基
Abu:2-氨基丁酸残基 (也被称作α-氨基丁酸残基)
Orn: 鸟氨酸残基
Cit: 瓜氨酸残基。
本发明中的“肽”的氨基酸序列依照常法进行描述，其中N-末端氨基酸的氨基酸残基位于左侧，并且C-末端氨基酸的氨基酸残基位于右侧。在“肽”中，除非特别说明，否则N-末端氨基酸的氨基酸残基的氨基与氢原子结合，并且C-末端氨基酸的氨基酸残基的羰基与羟基结合。肽的二价基团意指经由N-末端氨基酸的氨基酸残基的氨基和C-末端氨基酸的氨基酸残基的羰基结合的基团。
在本发明的化合物中，例如，在式(3) - (9)所示的化合物中，关于作为其部分结构的肽，除非特别说明，否则N-末端氨基酸的氨基酸残基的氨基与氢原子结合，并且C-末端氨基酸的氨基酸残基的羰基与羟基结合。
本发明中的“Xa”和“Ya”独立地意指单键或由1 - 4个氨基酸残基组成的肽的二价基团。Xa的氨基酸残基数与Ya的氨基酸残基数的总和是0 - 4的整数。例如，所述总和为0的整数意指Xa和Ya各自为单键。在该总和为4的整数时，其例子包括：Xa和Ya独立地为由2个氨基酸残基组成的肽的二价基团，Xa为由3个氨基酸残基组成的肽的二价基团且Ya为由1个氨基酸残基组成的肽的二价基团，Xa为由4个氨基酸残基组成的肽的二价基团且Ya为单键等。
所述总和的整数优选为0 - 2，更优选为0 - 1，最优选为0。即，Xa和Ya最优选均为单键。
在总和是2的整数时，其例子包括：Xa为由2个氨基酸残基组成的肽的二价基团且Ya为单键，Xa和Ya独立地为由1个氨基酸残基组成的肽的二价基团，或者Xa为单键且Ya为由2个氨基酸残基组成的肽的二价基团。
在总和是1的整数时，其例子包括：Xa为由1个氨基酸残基组成的肽的二价基团且Ya为单键，和Xa为单键且Ya为由1个氨基酸残基组成的肽的二价基团。它们中，优选Xa为单键且Ya为丙氨酸残基、亮氨酸残基或蛋氨酸残基。
本发明中的“癌抗原肽A”是由7 - 30个氨基酸残基组成的MHC I类-限制性WT1肽。在式(1)中的癌抗原肽A中，N-末端氨基酸的氨基与式(1)中的Ya结合并且C-末端氨基酸的羰基与式(1)中的羟基结合。
本发明中的“MHC I类-限制性”意指通过与作为主要组织相容性复合物(MHC)的I类的MHC I类分子结合而诱导CTL的性质。
人中的MHC被称为人白细胞型抗原(HLA)。与MHC I类-分子对应的HLA被分类为HLA-A、B、Cw、F和G等的亚型。“MHC I类-限制性”的优选例子包括：HLA-A-限制性、HLA-B-限制性和HLA-Cw-限制性。
HLA的各亚型的多态性 (等位基因)是已知的。HLA-A的多态性的例子包括不少于27种，例如HLA-A1、HLA-A0201、HLA-A24等，HLA-B的多态性的例子包括不少于59种，例如HLA-B7、HLA-B40、HLA-B4403等，并且HLA-Cw的多态性的例子包括不少于10种，例如HLA-Cw0301、HLA-Cw0401、HLA-Cw0602等。这些多态性中，优选HLA-A0201和HLA-A24。
本发明中的“WT1肽”是由SEQ ID NO: 1中记载的人WT1的氨基酸序列中的连续的7- 30个氨基酸残基组成的部分肽。
因此，本发明中的“MHC I类-限制性WT1肽”是在体外和/或体内与MHC I类抗原结合并被作为复合物提呈、且该复合物被前体T细胞识别从而诱导CTL的肽。“MHC I类-限制性WT1肽”的氨基酸残基的数目为7 - 30，优选为7 - 15，更优选为8 - 12，进一步优选为8 -11，最优选为8或9。
由7 - 12个或优选9个氨基酸残基组成的“MHC I类-限制性WT1肽”也被称为“MHCI类-限制性WT1表位”。本发明中的“MHC I类-限制性WT1表位”意指与MHC I类抗原结合并且被作为复合物提呈的肽本身。即，“MHC I类-限制性WT1肽”在体外和/或体内，通过利用蛋白酶体和/或蛋白酶如γ-干扰素诱导的溶酶体硫醇还原酶 (GILT, GLT)等的细胞内的本发明的化合物的分解(蛋白水解、二硫键的还原裂解)、和/或利用内质网氨肽酶 1 (ERAP1,ER-aminopeptidase 1)切断(也称为修整)成适合的残基数，而生成“MHC I类-限制性WT1表位”。在该生成中，主要考虑下述生成过程，其中“MHC I类-限制性WT1表位”的C-末端氨基酸首先来自利用蛋白酶体和/或蛋白酶的降解，其后“MHC I类-限制性WT1表位”的N-末端氨基酸来自利用ERAP1的修整(切断)。然而，在该生成中，也可以是该生成过程之外的过程。目前，ERAP1也被称为ERAAP (与抗原提呈相关的ER氨肽酶)，并且也曾被称为A-LAP、PILS-AP或ARTS-1。
因此，“MHC I类-限制性WT1肽”优选为通过向由7 - 12个氨基酸残基组成的“MHCI类-限制性WT1表位”的C-末端氨基酸的羰基添加1 - 23个氨基酸残基而生成的由7 - 30个氨基酸残基组成的肽。
“MHC I类-限制性WT1肽”的例子包括表 1 - 44中记载的肽。在各表中，“位置”意指SEQ ID NO: 1中记载的人WT1的氨基酸序列中的位置。
“MHC I类-限制性WT1肽”的优选例子包括：包含选自下述氨基酸序列中的任意氨基酸序列的肽:
RMFPNAPYL (SEQ ID NO:2)，
CMTWNQMNL (SEQ ID NO:3)，
ALLPAVPSL (SEQ ID NO:5), SLGEQQYSV (SEQ ID NO:6) 和
RVPGVAPTL (SEQ ID NO:7)；和
包含改变氨基酸序列并且具有CTL诱导活性的肽，该改变氨基酸序列是选自SEQID NO:2, 3, 5, 6和7但含有氨基酸残基的改变的任意氨基酸序列，更优选为选自SEQ IDNO: 2, 3, 5, 6和7的任意氨基酸序列的肽。
本发明中的“包含氨基酸序列的肽”，如通常那样，意指该氨基酸序列的N-末端氨基酸和/或C-末端氨基酸上添加了又一个氨基酸的肽。在添加了“癌抗原肽A”和“癌抗原肽B”中的“MHC I类-限制性WT1肽”时，添加于C-末端侧的肽是优选的。在添加了“MHC I类-限制性WT1表位”时，添加于C-末端侧是优选的。
本发明中的“包含氨基酸序列中含有氨基酸残基的改变的改变氨基酸序列、并且具有CTL诱导活性的肽”也被称为“改变杀伤肽（altered killer peptide）”。该改变杀伤肽意指由其中1-3个氨基酸被缺失、替换和/或添加的氨基酸序列组成，并且与MHC I类结合而诱导CTL的肽。对于由9个氨基酸残基组成的肽，被替换的氨基酸的替换位置包括：1位 (N-末端)、2位、3位或9位。要添加(也包括插入)的氨基酸的数目优选为1或2，更优选为1。优选的添加位置是C-末端。要缺失的氨基酸的数目优选为1。在改变中，要添加的氨基酸或要替换的氨基酸可以是基因所编码的20种氨基酸以外的非天然氨基酸。
已知对于HLA亚型的各多态性，能够与HLA 抗原结合的肽的氨基酸序列具有规则性 (结合基序)。例如，作为HLA-A24的结合基序，已知由8 - 11个氨基酸残基组成的肽，其中2位氨基酸是Tyr、Phe、Met或Trp，并且C-末端氨基酸是Phe、Leu、Ile、Trp或Met是已知的(J. Immunol., 152, p3913, 1994, J. Immunol., 155, p4307, 1994,Immunogenetics, 41, p178, 1995)。因此，例如，在由9个氨基酸残基组成的肽的情形中，2位可以被Tyr、Phe、Met或Trp替换和/或9位可以被Phe、Leu、Ile、Trp或Met替换，并且具有该替换的肽优选作为改变杀伤肽。相同地，作为HLA-A0201的结合基序，已知由8 - 11个氨基酸残基组成的肽，其中2位氨基酸是Leu或Met并且C-末端氨基酸是Val或Leu。因此，例如，在由9个氨基酸残基组成的肽的情形中，2位可以被Leu或Met替换和/或9位可以被Val或Leu替换，并且具有该替换的肽优选作为改变杀伤肽。
该改变杀伤肽的例子包括下述的肽。
RYFPNAPYL (SEQ ID NO:223) (参见 WO03/106682),
FMFPNAPYL (SEQ ID NO:224)，
RLFPNAPYL (SEQ ID NO:225)，
RMMPNAPYL (SEQ ID NO:226)，
RMFPNAPYV (SEQ ID NO:227) 和
YMFPNAPYL (SEQ ID NO:228) (参见WO2009/072610)，其为RMFPNAPYL (SEQ IDNO: 2)的改变杀伤肽；
CYTWNQMNL (SEQ ID NO:4) (参见 WO02/79253);
Xaa-Met-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu (SEQ ID NO:229)
(其中Xaa是Ser或Ala) 和
Xaa-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu (SEQ ID NO:230)
(其中Xaa是Ser, Ala, Abu, Arg, Lys, Orn, Cit, Leu, Phe或Asn) (参见WO2004/026897)，其为CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 3)的改变杀伤肽；
AYLPAVPSL (SEQ ID NO:231) (参见 WO2003/106682)，其为ALLPAVPSL (SEQ IDNO: 5)的改变杀伤肽；
FLGEQQYSV (SEQ ID NO:232)，
SMGEQQYSV (SEQ ID NO:233) 和
SLMEQQYSV (SEQ ID NO:234) (WO2009/072610)，其为SLGEQQYSV (SEQ ID NO:6)的改变杀伤肽；和
RYPGVAPTL (SEQ ID NO:235) (WO2003/106682)，其为RVPGVAPTL (SEQ ID NO:7)的改变杀伤肽。
本发明中的“R1”是氢原子、上述式(2)所示的基团或癌抗原肽C，优选为上述式(2)所示的基团或癌抗原肽C。
在R1为氢原子时，式(1)的化合物是式(1-1)所示的化合物即肽:
其中Xa、Ya和癌抗原肽A如上述式(1)中所定义，并且Cys是半胱氨酸残基。
R1为氢原子的式(1)的化合物，即，式(1-1)所示的肽具有不同于WT1蛋白的部分序列的序列。式(1)的要件“具有不同于WT1蛋白的部分序列的序列”意指式(1-1)所示的肽并不是由SEQ ID NO: 1中记载的人WT1的氨基酸序列中连续的8 - 35个氨基酸残基组成的部分肽。
即，R1为氢原子的式(1)的化合物并不是由SEQ ID NO: 1中记载的人WT1的氨基酸序列中连续的8 - 35个氨基酸残基组成的部分肽。通过将癌抗原肽A为WT1138-146肽的情形作为例子，进行具体说明。WT1138-146 肽是由SEQ ID NO: 1中记载的人WT1的氨基酸序列的138位 – 146位的连续的9个氨基酸残基组成的部分肽，并且具有氨基酸序列LESQPAIRN(SEQ ID NO: 78)。在SEQ ID NO: 1中，从WT1138-146 肽的N-末端侧起连续的137位是C。因此，WT1137-146 肽 (CLESQPAIRN) (SEQ ID NO: 236)对应于由SEQ ID NO: 1中记载的人WT1的氨基酸序列的连续的10个氨基酸残基组成的部分肽。另一方面，基于本发明的要件“R1为氢原子的式(1)的化合物并不是由SEQ ID NO: 1中记载的人WT1的氨基酸序列中连续的8 -35个氨基酸残基组成的部分肽”，在R1为氢原子的式(1)的化合物中，在癌抗原肽A为WT1138-146 肽 (LESQPAIRN) (SEQ ID NO: 78)时，WT1137-146 肽 (CLESQPAIRN) (SEQ ID NO:236)被排除于本发明的化合物外，因此Xa和Ya不同时为单键。
作为R1为氢原子的式(1)的化合物，优选由选自下述氨基酸序列中的任意氨基酸序列组成的肽:
CRMFPNAPYL (SEQ ID NO:13), CCMTWNQMNL (SEQ ID NO:14)，
CCYTWNQMNL (SEQ ID NO:15)，
CALLPAVPSL (SEQ ID NO:16)，
CSLGEQQYSV (SEQ ID NO:17) 和
CRVPGVAPTL (SEQ ID NO:18)。
当“R1”为上述式(2)所示的基团时，式(1)的化合物是式(1-2)所示的化合物:
其中Xa、Ya和癌抗原肽A如上述式(1)中所定义，并且Xb、Yb和癌抗原肽B如上述式(2)中所定义。
本发明中的“Xb”和“Yb”独立地意指单键或由1 - 4个氨基酸残基组成的肽的二价基团。Xb的氨基酸残基数与Yb的氨基酸残基数的总和是0 - 4的整数。例如，所述总和为0的整数意指Xb和Yb各自为单键。在该总和为4的整数时，其例子包括：Xb和Yb独立地为由2个氨基酸残基组成的肽的二价基团，Xb为由3个氨基酸残基组成的肽的二价基团且Yb为由1个氨基酸残基组成的肽的二价基团，Xb为由4个氨基酸残基组成的肽的二价基团且Yb为单键等。
所述总和的整数优选为0 - 2，更优选为0 - 1，最优选为0。即，Xb和Yb最优选均为单键。
在总和是2的整数时，其例子包括：Xb为由2个氨基酸残基组成的肽的二价基团且Yb为单键，Xb和Yb独立地为由1个氨基酸残基组成的肽的二价基团，和Xb为单键且Yb为由2个氨基酸残基组成的肽的二价基团。
在总和是1的整数时，其例子包括：Xb为由1个氨基酸残基组成的肽的二价基团且Yb为单键，和Xb为单键且Yb为由1个氨基酸残基组成的肽的二价基团。它们中，优选Xb为单键且Yb为丙氨酸残基、亮氨酸残基或蛋氨酸残基。
本发明中的“癌抗原肽B”是由7 - 30个氨基酸残基组成的MHC I类-限制性WT1肽。该“MHC I类-限制性WT1肽”如上述所定义。然而，在式(1)所示的化合物中，癌抗原肽A和癌抗原肽B并不同时为相同的肽。即，癌抗原肽B被“不同于癌抗原肽A”的要件所限定。
由于癌抗原肽A和癌抗原肽B不同时为相同的肽，因而R1为上述式(2)所示的基团的式(1)的化合物，即使在Xa和Xb均相同且Ya和Yb均相同时，也不是同型二聚体而是异二聚体。同型二聚体意指其中相同的肽单体进行了二聚体化的二聚体，异二聚体意指其中不同的肽单体进行了二聚体化的二聚体。
在癌抗原肽B中，N-末端氨基酸的氨基与式(2)中的Yb结合(即，也与式(1-2)中的Yb结合)，并且C-末端氨基酸的羰基与式(2)中的羟基结合。
作为R1是式(2)所示的基团的式(1)的化合物，即，式(1-2)的化合物，优选为式(3)所示的化合物:
其中C与C之间的键是二硫键。
另外，在本发明中，当“癌抗原肽B”是含有一个半胱氨酸残基的MHC I类-限制性WT1肽时，式(1)的化合物可以是下述化合物，其中，癌抗原肽B中的硫醚基与式(16)中的硫醚基结合:
或者与癌抗原肽E的半胱氨酸残基的硫醚基结合。
本发明中的“Xd”和“Yd”独立地意指单键或由1 - 4个氨基酸残基组成的肽的二价基团。Xd的氨基酸残基数与Yd的氨基酸残基数的总和是0 - 4的整数。例如，所述总和为0的整数意指Xd和Yd各自为单键。在该总和为4的整数时，其例子包括：Xd和Yd独立地为由2个氨基酸残基组成的肽的二价基团，Xd为由3个氨基酸残基组成的肽的二价基团且Yd为由1个氨基酸残基组成的肽的二价基团，Xd为由4个氨基酸残基组成的肽的二价基团且Yd为单键等。
所述总和的整数优选为0 - 2，更优选为0 - 1，最优选为0。即，Xd和Yd最优选均为单键。
在总和是2的整数时，其例子包括：Xd为由2个氨基酸残基组成的肽的二价基团且Yd为单键，Xd和Yd独立地为由1个氨基酸残基组成的肽的二价基团，和Xd为单键且Yd为由2个氨基酸残基组成的肽的二价基团。
在总和是1的整数时，其例子包括：Xd为由1个氨基酸残基组成的肽的二价基团且Yd为单键，和Xd为单键且Yd为由1个氨基酸残基组成的肽的二价基团。它们中，优选Xd为单键且Yd为丙氨酸残基、亮氨酸残基或蛋氨酸残基。
本发明中的“癌抗原肽D”是由7 - 30个氨基酸残基组成的MHC II类-限制性WT1肽。在式(16)中，癌抗原肽D的N-末端氨基酸的氨基与式(16)中的Yd结合，并且C-末端氨基酸的羰基与式(16)中的羟基结合。
在本发明中，“MHC II类-限制性” 意指通过与MHC II类分子结合而诱导辅助T细胞的性质，并且如下述“癌抗原肽C”所定义。
与MHC II类-分子对应的HLA被分类为HLA-DR、DQ和DP等的亚型。“MHC II类-限制性”的优选例子包括HLA-DR-限制性、HLA-DQ-限制性和HLA-DP-限制性。
因此，本发明中的“MHC II类-限制性WT1肽”是在体外和/或体内与MHC II类抗原结合并诱导辅助T细胞的肽。“MHC II类-限制性WT1肽”的氨基酸残基的数目是7 - 30，优选为14 - 30。
作为“癌抗原肽D”，与下述“癌抗原肽C”中记载的氨基酸序列相同地，可以提及由选自下述氨基酸序列中的任意氨基酸序列组成的肽:
SGQARMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO:19)，
SGQAYMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO:25)，
SGQARMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO:11)，
SGQAYMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO:12)，
PGCNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO:20)，
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO:21)，
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO:10)，
CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO:22)，
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO:23)，
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO:24) 和
WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO:244)。
另外，在式(1)的化合物中，当“癌抗原肽B”是含有一个半胱氨酸残基的MHC I类-限制性WT1肽时，作为癌抗原肽B中的硫醚基与式(16)中的硫醚基结合的化合物，优选可提及式(15)所示的化合物:
其中C与C之间的键是二硫键。
在本发明中，“癌抗原肽E”是由含有一个半胱氨酸残基的7 - 30个氨基酸残基组成的MHC II类-限制性WT1肽，并且如下述“癌抗原肽C”中的“由含有一个半胱氨酸残基的7- 30个氨基酸残基组成的MHC II类-限制性WT1肽”所定义。
作为“癌抗原肽E”，与下述“癌抗原肽C”中记载的氨基酸序列相同地，可以提及由选自下述氨基酸序列中的任意氨基酸序列组成的肽:
SGQARMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO:19)，
SGQAYMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO:25)，
SGQARMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO:11)，
SGQAYMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO:12)，
PGCNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO:20)，
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO:21)，
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO:10)，
CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO:22)，
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO:23) 和
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO:24)。
当R1是癌抗原肽C时，癌抗原肽C的半胱氨酸残基的硫醚基与式(1)中的硫醚基结合。
癌抗原肽C是由含有一个半胱氨酸残基的7 - 30个氨基酸残基组成的MHC I类-限制性WT1肽或由含有一个半胱氨酸残基的7 - 30个氨基酸残基组成的MHC II类-限制性WT1肽。
在本发明中的“由含有一个半胱氨酸残基的7 - 30个氨基酸残基组成的MHC I类-限制性WT1肽” 中，肽的氨基酸序列仅需要含有至少一个半胱氨酸残基。要含有的半胱氨酸残基的数目优选为1 - 3、更优选为1 - 2、最优选为1。该“MHC I类-限制性WT1肽”如上述所定义。另外，R1为“由含有一个半胱氨酸残基的7 - 30个氨基酸残基组成的MHC I类-限制性WT1肽” 的式(1)的化合物不是同型二聚体而是异二聚体。
“由含有一个半胱氨酸残基的7 - 30个氨基酸残基组成的MHC I类-限制性WT1肽”的优选例子包括表45 - 52中记载的肽。在各表中，“位置”意指SEQ ID NO: 1中记载的人WT1的氨基酸序列中的位置。
“由含有一个半胱氨酸残基的7 - 30个氨基酸残基组成的MHC I类-限制性WT1肽”的更优选的例子包括：包含下述氨基酸序列的肽:
CMTWNQMNL (SEQ ID NO:3)
和包含改变氨基酸序列并且具有CTL诱导活性的肽，该改变氨基酸序列为SEQ IDNO: 3的氨基酸序列但含有氨基酸残基的改变。所述“含有氨基酸序列”和“包含氨基酸序列中含有氨基酸残基的改变的改变氨基酸序列、并且具有CTL诱导活性的的肽”如上述所定义。最优选可提及由选自下述氨基酸序列中的任意氨基酸序列组成的肽:
CMTWNQMNL (SEQ ID NO:3) 和
CYTWNQMNL (SEQ ID NO:4)。
作为R1为“由含有一个半胱氨酸残基的7 - 30个氨基酸残基组成的MHC I类-限制性WT1肽”的式(1)的化合物，优选为式(4)所示的化合物或者为式(5)所示的化合物，
其中C与C之间的键是二硫键，
其中C与C之间的键是二硫键。它们之中，更优选式(5)所示的化合物。
另外，在本发明中，当作为MHC I类-限制性WT1肽的“癌抗原肽C”的N-末端上进一步结合有由含有一个半胱氨酸残基的1 - 4个氨基酸残基组成的肽时，式(1)的化合物可以是下述化合物，其中结合于癌抗原肽C的N-末端的肽的半胱氨酸残基的硫醚基与式(16)中的硫醚基结合，
或者与癌抗原肽E的半胱氨酸残基的硫醚基结合。
本发明中的“Xd”、“Yd”、“癌抗原肽D” 和“癌抗原肽E” 如上述“Xd”、“Yd”、“癌抗原肽D”和“癌抗原肽E”中所定义。
在本发明中，结合于作为MHC I类-限制性WT1肽的“癌抗原肽C”的N-末端的由含有一个半胱氨酸残基的1 - 4个氨基酸残基组成的肽优选为由CA组成的二肽。
在式(1)的化合物中，当作为MHC I类-限制性WT1肽的“癌抗原肽C”的N-末端进一步结合有由含有一个半胱氨酸残基的1 - 4个氨基酸残基组成的肽时，结合于癌抗原肽C的N-末端的肽的半胱氨酸残基的硫醚基与式(16)中的硫醚基结合的化合物优选为式(14)所示的化合物:
其中C与C之间的键是二硫键。
另外，在式(1)的化合物中，当作为MHC I类-限制性WT1肽的“癌抗原肽C”的N-末端进一步结合有由含有一个半胱氨酸残基的1 - 4个氨基酸残基组成的肽时，结合于癌抗原肽C的N-末端的肽的半胱氨酸残基的硫醚基与“癌抗原肽E”中的硫醚基结合的化合物优选为式(12)所示的化合物:
其中C与C之间的键是二硫键。
在本发明中的“由含有一个半胱氨酸残基的7 - 30个氨基酸残基组成的MHC II类-限制性WT1肽” 中，肽的氨基酸序列仅需要含有至少一个半胱氨酸残基。要含有的半胱氨酸残基的数目优选为1 - 3、更优选为1 - 2、最优选为1。
在本发明中，“MHC II类-限制性” 意指通过与MHC II类分子结合而诱导辅助T细胞的性质。
与MHC II类-分子对应的HLA被分类为HLA-DR、DQ和DP等的亚型。“MHC II类-限制性”的优选例子包括HLA-DR-限制性、HLA-DQ-限制性和HLA-DP-限制性。
因此，本发明中的“MHC II类-限制性WT1肽”是在体外和/或体内与MHC II类抗原结合并诱导辅助T细胞的肽。“MHC II类-限制性WT1肽”的氨基酸残基的数目是7 - 30，优选为14 - 30。
“由含有一个半胱氨酸残基的7 - 30个氨基酸残基组成的MHC II类-限制性WT1肽”的例子包括表 53中记载的肽。在各表中，“位置”意指SEQ ID NO: 1中记载的人WT1的氨基酸序列中的位置。
作为“由含有一个半胱氨酸残基的7 - 30个氨基酸残基组成的MHC II类-限制性WT1肽”，优选为包含选自下述氨基酸序列中的任意氨基酸序列的肽:
SGQARMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO:11) 和
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO:10)，
或
包含改变氨基酸序列并且具有辅助T细胞诱导活性的肽，该改变氨基酸序列是选自SEQ ID NO:10 - 11但含有氨基酸残基的改变的任意氨基酸序列。
如上所述，“包含氨基酸序列的肽”意指该氨基酸序列的N-末端氨基酸和/或C-末端氨基酸上添加了又一个氨基酸的肽。当添加至 “含有一个半胱氨酸残基的MHC II类-限制性WT1肽”时，该添加可以在N-末端侧和/或C-末端侧进行。
本发明中的“包含氨基酸序列中含有氨基酸残基的改变的改变氨基酸序列、并且具有辅助T细胞诱导活性的肽”也被称为“改变辅助肽（altered helper peptide）”。该改变辅助肽意指由其中1-3个氨基酸被缺失、替换和/或添加的氨基酸序列组成，并且与MHC II类结合而诱导辅助T细胞的肽。要添加(也包括插入)的氨基酸的数目优选为1 - 3。要缺失的氨基酸的数目优选为1 - 5。在改变中，要添加的氨基酸或要替换的氨基酸可以是基因所编码的20种氨基酸以外的非天然氨基酸。
作为该改变辅助肽，例如，可以提及下述肽:
SGQAYMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO:12) (参见专利文献6),
SGQARMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO:19) 和
SGQAYMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO:25)，其为SGQARMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO:11)的改变辅助肽；和
GCNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO:20)，
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO:21)，
CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO:22)，
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO:23) 和
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO:24)，其为PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQID NO: 10)的改变辅助肽。
作为“由含有一个半胱氨酸残基的7 - 30个氨基酸残基组成的MHC II类-限制性WT1肽”，更优选为由选自下述氨基酸序列中的任意氨基酸序列组成的肽:
SGQARMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO:19)，
SGQAYMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO:25)，
SGQARMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO:11)，
SGQAYMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO:12)，
PGCNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO:20)，
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO:21)，
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO:10)，
CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO:22)，
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO:23) 和
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO:24)。
作为R1为“由含有一个半胱氨酸残基的7 - 30个氨基酸残基组成的MHC II类-限制性WT1肽”的式(1)的化合物，优选为式(6)所示的化合物、式(7)所示的化合物、式(8)所示的化合物、以及式(9)所示的化合物，
其中C与C之间的键是二硫键，
其中C与C之间的键是二硫键，
其中C与C之间的键是二硫键，
其中C与C之间的键是二硫键。
本发明还提供组合物，其包含本发明的化合物以及一个或多个MHC II类-限制性WT1肽。
要含有在本发明的组合物中的本发明的化合物的例子包括：
式(3)所示的化合物、式(4)所示的化合物、以及式(5)所示的化合物，
其中C与C之间的键是二硫键, :
其中C与C之间的键是二硫键，
其中C与C之间的键是二硫键。
要含有在本发明的组合物中的MHC II类-限制性WT1肽的例子包括下述氨基酸序列:
CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO:22)，
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO:23)，
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO:24)，
WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO:244)，
CWAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO:242) 和
WAPVLDFAPPGASAYGSLC (SEQ ID NO:243)。
本发明还提供两个不同的MHC I类-限制性WT1肽和MHC II类-限制性WT1肽、或两个不同的MHC I类-限制性WT1表位和MHC II类-限制性WT1表位各自经由二硫键结合的化合物的合成方法。本发明的方法包括下述步骤(1) - (3)。
本发明的步骤(1)中，通过使用Fmoc-C(Mmt)A-SBn和癌抗原肽C来合成C(Mmt)A的C-末端氨基酸的羰基与癌抗原肽C的N-末端氨基结合的肽。
“癌抗原肽C” 如上述“癌抗原肽C”中所定义。“Fmoc”是9-芴基甲氧基羰基。“Mmt”是单甲氧基三苯甲基。“SBn”是硫苄基（thiobenzyl group）。
在本发明的步骤(2)中，通过使用上述步骤(1)中所得的肽以及被Npys基保护的一个半胱氨酸残基结合于N-末端的癌抗原肽A，来合成上述步骤(1)中所得的肽中的癌抗原肽C的半胱氨酸残基的硫醚基与结合于癌抗原肽A的N-末端的半胱氨酸残基的硫醚基结合的肽。
“癌抗原肽A” 如上述“癌抗原肽A”中所定义。“Npys”是3-硝基-2-吡啶基硫基（3-nitro-2-pyridylthio group）。
在本发明的步骤(3)中，通过使用上述步骤(2)中所得的肽和含有被Spy基保护的半胱氨酸残基的癌抗原肽D，来合成结合于上述步骤(2)中所得的肽中的癌抗原肽A的N-末端的半胱氨酸残基的硫醚基与癌抗原肽D的半胱氨酸残基的硫醚基结合的肽。
“癌抗原肽D” 如上述“癌抗原肽D”中所定义。“SPy”是2-吡啶基硫化物基（2-pyridylsulfide group）。
本发明的化合物和肽，以及作为它们的中间体的肽可以根据本说明书的实施例中记载的方法或通常用于肽合成的方法来制造。制造方法的例子包括：文献(PeptideSynthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins, Vol. 2, Academic PressInc., New York, 1976; peptide synthesis, Maruzen Co., LTD., 1975; Basics andExperiment of Peptide Synthesis, Maruzen Co., LTD., 1985; Development ofPharmaceutical Product subsequent vol. 14, Peptide Synthesis, HirokawaShoten, 1991)等中记载的方法。
其例子包括：使用Fmoc法或Boc法利用固相合成仪的制造方法，和基于利用液相合成法逐次缩合Boc-氨基酸或Z-氨基酸的制造方法(Fmoc是9-芴基甲氧基羰基，Boc是叔丁氧基羰基，并且Z是苄基氧基羰基)。
在用于制造本发明化合物的中间体中，官能团如氨基、羧基、巯基等可以根据需要使用保护和脱保护技术用合适的保护基保护或脱保护。作为优选的保护基、保护方法和脱保护方法，详细记载于“Protective Groups in Organic Synthesis 2nd Edition (JohnWiley & Sons, Inc.; 1990)”等中。巯基保护基的例子包括：乙酰氨基甲基、三苯甲基等。
当本发明的化合物具有二硫键时，该二硫键可以根据通常的肽化学中所用的方法，形成在含有半胱氨酸残基的两个不同的肽之间，或形成在含有半胱氨酸残基的肽与半胱氨酸之间。二硫键的形成方法的例子包括记载于文献(Peptide Synthesis,Interscience, New York, 1966; The Proteins, Vol. 2, Academic Press Inc., NewYork, 1976; peptide synthesis, Maruzen Co., LTD., 1975; Basics and Experimentof peptide synthesis, Maruzen Co., LTD., 1985; Development of PharmaceuticalProduct sequential vol. 14, Peptide Synthesis, Hirokawa Shoten, 1991)等中的方法。
具体地，当肽含有一个半胱氨酸残基时，具有二硫键的化合物(二硫化物)可以通过除去半胱氨酸侧链上的包括巯基保护基的全部保护基并在惰性溶剂中进行氧化来制造。另外，其还可通过在合适的溶剂中混合具有巯基的两种中间体并使之氧化来制造。作为氧化的方法，可以根据需要选择通常的肽合成中用于形成二硫键的已知方法。例如，可以提及碘氧化、包括碱性条件下的空气氧化反应的方法、通过在碱性或酸性条件下添加氧化剂来形成二硫键的方法等。本文中，作为氧化剂，可以提及碘、二甲基亚砜(DMSO)、铁氰化钾等。作为溶剂，可以使用水、乙酸、甲醇、氯仿、DMF、DMSO等、或它们的混合物。氧化反应通常得到对称、不对称的二硫化物的混合物。目标不对称二硫化物可通过利用各种色谱、重结晶等进行纯化而获得。可选地，将具有活化巯基的中间体和具有巯基的中间体混合而形成选择性二硫键。作为具有活化巯基的中间体，可以提及与Npys基 (3-硝基-2-吡啶硫基)结合的巯基等。可选地，可以将一种中间体和例如2,2’-二硫双(5-硝基吡啶)预先混合以活化巯基，然后添加另一种中间体，由此形成选择性二硫键(Tetrahedron Letters. Vol. 37. No.9, pp. 1347-1350)。
另外，当肽中含有2个或更多个半胱氨酸残基时，可以采用与上述方法类似的方法。在该情形中，获得具有不同方式的二硫键的异构体。二硫键形成在目标半胱氨酸残基之间的二聚体可以通过使用半胱氨酸侧链保护基的特定组合来得到。作为上述保护基的组合，可以提及：MeBzl (甲基苄基)基团 和Acm (乙酰氨基甲基)基团、Trt (三苯甲基)基团和Acm 基团、Npys (3-硝基-2-吡啶基硫基)基团和Acm基团、S-Bu-t (S-叔丁基)基团和Acm基团等。例如，在MeBzl基团和Acm基团的组合的情形中，可以提及在被Acm基团保护的半胱氨酸残基之间形成二硫键的方法等，其包括将MeBzl基团和半胱氨酸侧链以外的保护基除去，并将含有肽单体的溶液进行空气氧化反应而在脱保护的半胱氨酸残基间形成二硫键，然后进行利用碘的脱保护和氧化。
所得的本发明的化合物、肽和中间体可以根据本领域技术人员已知的方法和通常用于肽化学中的方法来进行纯化。例如，它们可以通过各种色谱(即，硅胶柱色谱、离子交换柱色谱、凝胶过滤、反相色谱)、重结晶等进行纯化。例如，作为重结晶溶剂，可以使用：醇溶剂如甲醇、乙醇、2-丙醇等；醚溶剂如二乙醚等；酯溶剂如乙酸乙酯等；芳香族烃溶剂如苯、甲苯等；酮溶剂如丙酮等；烃溶剂如己烷等；非质子溶剂如二甲基甲酰胺、乙腈等；水；它们的混合溶剂等。作为其它纯化方法，可以使用Jikken Kagaku Kouza (The ChemicalSociety of Japan ed., Maruzen) 第1卷等中记载的方法等。
二硫化物的纯化方法记载于文献(Peptide Synthesis, Interscience, NewYork, 1966; The Proteins, Vol. 2, Academic Press Inc., New York, 1976;peptide synthesis, Maruzen Co., LTD., 1975; Basics and Experiment of PeptideSynthesis, Maruzen Co., LTD., 1985; Development of Pharmaceutical Productsequential vol. 14･peptide synthesis, Hirokawa Shoten, 1991)等中。它们之中，优选HPLC。
当本发明的化合物具有一个或更多个不对称点时，其可以通过通常的方法，使用具有该不对称点的原料(氨基酸)来制造。另外，为了提高本发明的化合物的光学纯度，可以在制造步骤的适当阶段进行光学拆分等。作为光学拆分方法，可以采用例如非对映体法，其包括将本发明化合物或其中间体与光学活性酸(即，单羧酸如扁桃酸, N-苄基氧基丙氨酸、乳酸等；二羧酸如酒石酸、o-二亚异丙基酒石酸、苹果酸等；或磺酸如樟脑磺酸、溴樟脑磺酸等)，在惰性溶剂(即，醇溶剂如甲醇、乙醇、2-丙醇等；醚溶剂如二乙基醚等；酯溶剂如乙酸乙酯等；烃溶剂如甲苯等；非质子溶剂如乙腈等；以及它们的混合溶剂)中形成盐。当本发明的化合物或中间体具有如羧基等的酸性官能团时，也可以通过与光学活性胺(即，有机胺如α-苯乙胺、激肽、奎尼丁、辛可尼丁、辛可宁、士的宁等)形成盐来进行光学拆分。
用于形成盐的温度是从室温至溶剂的沸点的范围内选择。为了提高光学纯度，理想的是一次将温度提高至溶剂的沸点附近。当通过过滤收集析出的盐时，可以根据需要进行冷却以提高收率。要使用的光学活性酸或胺的合适的量相对于基质在约0.5 - 约2.0当量的范围、优选为约1当量。根据需要，可以将结晶在惰性溶剂(即，醇溶剂如甲醇、乙醇或2-丙醇等；醚溶剂如二乙基醚等；酯溶剂如乙酸乙酯等；烃溶剂如甲苯等；非质子溶剂如乙腈等；以及它们的混合溶剂)重结晶，也得到高纯度的光学活性盐。根据需要，可以将进行了光学拆分的盐以通常的方法用酸或碱处理而得到游离体。
本发明中的“药学上可接受的盐”的例子包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐的例子包括：无机酸盐如盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、磷酸盐等；和有机酸盐如柠檬酸盐、草酸盐、乙酸盐、甲酸盐、丙酸盐、苯甲酸盐、三氟乙酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐等。碱加成盐的例子包括：与无机碱的盐如钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、铵盐等；与有机碱的盐如三乙基铵盐、三乙醇铵盐、吡啶鎓盐、二异丙基铵盐等，等；以及碱性或酸性氨基酸如精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等的氨基酸盐。
本发明也包括本发明的化合物或其药学上可接受的盐的水合物、溶剂化物如乙醇溶剂化物等。此外，本发明还包括可存在的式(1)所示的化合物的任何立体异构体如任何非对映体、对映体等、以及任何形态的任何结晶。
通常，在肽的制造中，各种副产物如氨基酸缺失的肽、因水解、氧化等而降解的肽、具有外消旋化氨基酸的肽等产生于缩合光学活性α-氨基酸的步骤、除去各种保护基的步骤、从树脂切出肽的步骤等中。在实验室规模，将各种色谱(即，硅胶柱色谱、离子交换柱色谱、凝胶过滤、和反相色谱)组合来除去这些杂质，由此可以获得高纯度的肽和化合物。然而，难以在工业规模上获得高纯度的肽和化合物来得到医药产品。
本发明的化合物具有能够大量制造医药产品用原料药的物理化学性质。具体地，它具有高的溶解度，溶液中的稳定性优异，浓缩时难以发生凝胶化等，该化合物可以通过使用反相HPLC等柱色谱法的纯化步骤而容易地以大规模制造为具有高纯度的原料药。
如此制造的本发明的化合物，由于半胱氨酸残基形成二硫键等，因而对溶液中的氧化剂等的稳定性优异，并且保持作为医药品原料药的恒定品质和有效的CTL诱导活性。
本发明的化合物可用作癌免疫疗法用的CTL诱导剂的活性成分、癌疫苗的活性成分或药物组合物的活性成分。即，如本说明书的实施例中所示，本发明的化合物具有优异的免疫原性并可以有效地表现出优异的CTL诱导活性。此外，出人意料地，通过本发明的化合物诱导的CTL可以识别固有存在于癌细胞中的WT1的天然型部分肽。
该CTL诱导活性可以通过用HLA四聚体法(Int. J. Cancer: 100, 565-570(2002))或有限稀释法(Nat. Med.: 4, 321-327 (1998))测定CTL的数目来检测。可选地，例如，HLA-A24-限制性CTL诱导活性可以通过使用WO 02/47474 and Int. J. Cancer:100, 565-570 (2002) 等中记载的HLA-A24模型小鼠来考察。
因此，本发明的化合物可被用作表达WT1基因的癌或与WT1基因表达水平增加相关的癌的治疗药或预防药(复发预防药)。该癌的例子包括：血液癌如白血病、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤、恶性淋巴瘤等；以及实体瘤如胃癌、大肠癌、肺癌、乳腺癌、生殖细胞癌、肝癌、皮肤癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌、卵巢癌、脑肿瘤等。
本发明的化合物或其药学上可接受的盐，通过将各化合物或盐以适当形式配制，可以作为癌的细胞免疫疗法用的CTL诱导剂的活性成分、癌疫苗的活性成分或/和药物组合物的活性成分。
本发明的化合物可以和作为药物可接受的载体如合适的佐剂一起给药，以使其细胞免疫会有效地建立。作为佐剂，文献(Clin. Microbiol. Rev., 7: 277-289, 1994)等中记载的那些是可应用的。具体可提及：来自真菌的成分，GM-CSF，细胞因子如白介素-2, 白介素-7、白介素-12等，来自植物的成分，来自海洋生物的成分，矿物凝胶如氢氧化铝、溶血卵磷脂，表面活性剂如Pluronic多元醇，聚阴离子，肽，油乳液(乳液制剂)等。作为来自真菌的成分，可以提及：脂质 A、作为其衍生物的单磷酰脂质 A、死亡的细菌(分枝杆菌属细菌如BCG菌等)、来自细菌的蛋白、多核苷酸、弗氏不完全佐剂、弗氏完全佐剂、细胞壁骨架成分(即BCG-CWS等)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)等。
此外，本发明的化合物也可以以脂质体制剂、包括结合于直径为数μm的珠子的颗粒制剂、包括结合于脂质的制剂等的形式给药。
进而，本发明的化合物(缀合物)可以与MHC II类-限制性WT1肽 (即，辅助肽)一起给药。作为联合给药的方法，缀合物和辅助肽可以分别给药。在单一的药物组合物中含有缀合物和辅助肽的混合制剂(混合剂、混合物)更优选。该混合制剂含有能够产生MHC I类-限制性WT1肽 (即，杀伤肽)和MHC II类-限制性WT1肽 (即，辅助肽)的缀合物。因此，通过给予含有辅助肽的该混合制剂作为癌免疫疗法用的癌疫苗，对于包括CTL的其它T细胞的功能促进重要的辅助T细胞也可以被活化，可以提高缀合物的功能和效力(细胞免疫能力等)。
MHC II类-限制性WT1肽 (即，辅助肽)如本说明书中所记载。混合制剂用辅助肽的例子包括下述氨基酸序列:
CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO:22)，
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO:23)，
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO:24)，
WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO:244)，
CWAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO:242) 和
WAPVLDFAPPGASAYGSLC (SEQ ID NO:243)。其中，优选WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQID NO:244)。
如说明书中的例如实施例和试验例所示，可以确认该混合制剂表现出提高的作为癌疫苗的效力如细胞免疫能力等。
尽管制剂中的本发明化合物的给药量可以根据治疗对象疾病、患者的年龄和体重等而适宜调整，但其通常为0.0001 mg – 1000 mg，优选为0.001 mg – 1000 mg，更优选为0.1 mg – 10 mg。
作为给药方法，可提及皮内给药、皮下给药、肌肉内给药、静脉内给药、经皮给药等。皮内给药和皮下给药是优选的，因为它们有效地诱导CTL。尽管给药频率和给药间隔可以根据预防或治疗的对象疾病以及患者的个体差异而适宜调整，但其通常为多次，并且数天至数月给予1次是优选的。
通过将含有该本发明的化合物作为活性成分的药物组合物给予WT1阳性患者，可以提供癌症的预防或治疗方法。
实施例
以下，通过参考实施例具体说明本发明，但本发明并不受其限定。
实施例1
式(5)所示的化合物的合成:
其中C与C之间的键是二硫键。
步骤1. H-Cys(Npys)-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH的合成
(C(Npys)RMFPNAPYL的合成)
使用Fmoc-Leu-Alko-树脂(Alko是对烷氧基苄基醇)282 mg(由WatanabeChemical制造; 0.71 mmol/g, 0.2 mmol)作为起始原料，依照Fmoc/tBu法通过固相合成组装肽链。使用CS Bio制造的CS336X 肽合成仪进行固相合成，Fmoc基的脱保护是通过用20%哌啶的DMF溶液处理 5 min和20 min来进行。保护氨基酸的偶联是通过用1.05 mmol保护氨基酸、1 mmol HBTU和2 mmol DIPEA的DMF溶液反应1 hr来进行。将所得树脂用DMF和乙醚洗涤，减压下干燥，得到Boc-Cys(Npys)-Arg(Pmc)-Met-Phe-Pro-Asn(Trt)-Ala-Pro-Tyr(tBu)-Leu-Alko-树脂 (630 mg)。向该肽树脂添加TFA/H2O/TIS=95/2.5/2.5的混合物 (10ml)，将该混合物在室温振荡2 hr。滤去树脂，减压下浓缩反应混合物。将反应混合物冰冷却，添加二乙基醚 (50 ml)。通过过滤收集生成的析出物，用乙醚洗涤并在减压下干燥，得到粗制肽 (217 mg)。将所得粗制肽溶液溶解于20% 乙酸水溶液(7 ml)和乙腈 (1 ml)的混合物中， 通过反相HPLC进行纯化。
泵: 由Shimadzu制造; LC-8A
柱:YMC ODS-A 3 cmφ×25 cmL, 10 μm
洗脱液 1:H2O/0.1%TFA
洗脱液 2:CH3CN/0.1%TFA
流速:20 ml/min
检测:UV220 nm。
将粗制肽溶液注入用15%的洗脱液 2进行了平衡的柱中。然后，用10 min将洗脱液2的浓度升高至37%，然后以每分钟0.24%的比率升高。收集含有目标产物的级分并冻干，得到H-Cys(Npys)-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH (53 mg)。
质谱:LC-ESI/MS m/z=1366.1 [M+1]+ (计算值=1366.6)。
步骤2. (H-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH)(H-Cys-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH) 二硫键的合成
[即，式(5)所示的化合物的合成:
其中C与C之间的键是二硫键]。
将步骤1中所得的H-Cys(Npys)-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH (50mg)和通过已知方法(即，WO07/063903)合成的H-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH (即，CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 4)) (43 mg)混合，加入DMSO (1 mL)，将混合物在室温搅拌20 min。将反应混合物用0.1% TFA水(5 ml)稀释并通过反相HPLC纯化。
泵: 由Shimadzu制造; LC-8A
柱:YMC ODS-A 3 cmφ×25 cmL, 10 μm
洗脱液 1:H2O/0.1% TFA
洗脱液 2:CH3CN/0.1% TFA
流速:20 ml/min
检测:UV220 nm。
将反应溶液注入用25%的洗脱液 2进行了平衡的柱中。然后，将洗脱液 2的浓度以每分钟0.25%的比率升高。收集含有目标产物的级分并冻干，通过反相HPLC再纯化，冻干得到(H-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH)(H-Cys-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH) 二硫键 (即，式(5)所示的化合物，21 mg)。
质谱:LC-ESI/MS m/z =1191.8 [M+2]2+ (计算值=1191.9)。
实施例2
由下述氨基酸序列组成的肽的合成:
CRMFPNAPYL (SEQ ID NO:13)
步骤1. 使用Fmoc‐Leu-Alko-树脂 (Alko是对烷氧基苄基醇) (338 mg, 由Watanabe Chemical制造; 0.74 mmol/g, 0.25 mmol)作为起始原料，与实施例1中记载的方法相同地进行固相合成2次，得到H-Cys(Trt)-Arg(Pmc)-Met-Phe-Pro-Asn(Trt)-Ala-Pro-Tyr(tBu)-Leu-Alko-树脂 (1.54 g)。向该肽树脂添加TFA/H2O/TIS=95/2.5/2.5的混合物 (15 ml)，将该混合物在室温振荡3 hr。滤去树脂，减压下浓缩反应混合物。将反应混合物冰冷却，添加二乙基醚 (50 ml)。通过过滤收集生成的析出物，用乙醚洗涤并在减压下干燥，得到粗制肽 (637 mg)。
质谱:LC‐ESI/MS m/z=1211.9 [M+1]+ (计算值=1212.5)。
步骤2. 将步骤1中所得的粗制肽 (321 mg)溶解于TFA (10 ml)，由HPLC的泵加载至用HPLC (由Shimadzu制造; LC6AD) 洗脱液 1 =H2O/0.1% TFA进行了平衡的YMC-PACKODS-A 3 cmφ×25 cmL 柱。将该状态维持约20 min，在20 min后，将洗脱液 2=CH3CN/0.1%TFA的浓度升高至27%。然后，通过220 nm UV监控目标肽的洗脱液的同时，将洗脱液 2的浓度以每分钟0.25%的比率升高，并且收集含有目标产物的级分。将冻干获得的肽 (100 mg)在相同条件下再次进行反相纯化，减压下蒸发乙腈，将残余物冻干，得到目标肽(CRMFPNAPYL (SEQ ID NO:13), 37.2 mg)。
泵: 由Shimadzu制造; LC-6A
柱:YMC ODS-A 3 cmφ×25 cmL, 10 μm
洗脱液 1:H2O/0.1%TFA
洗脱液 2:CH3CN/0.1%TFA
流速:20 ml/min
检测:UV220 nm
质谱:LC-ESI/MS m/z =1212.0 [M+1]+ (计算值=1211.6)。
实施例 3 - 5
通过与实施例2中相同的方法，合成了由SEQ ID NO: 16, 18或17的氨基酸序列组成的肽。表 54示出合成量和质谱结果。
试验例 1
利用ERAP1的N-末端氨基酸的修整的经时变化
对于实施例 2 – 5中合成的SEQ ID NO: 13, 16, 18和17的肽，评价利用ERAP1(PLoS One November 2008, vol.3, Issue 11, e3658)的N-末端氨基酸的修整。
将30 μl的ERAP1 (2.0 mg/ml)的PBS缓冲溶液添加至258 μl的Tris･HCl缓冲液中。将10 mM 各肽的DMSO溶液(12.0 μl)添加至上述ERAP1溶液，将混合物充分共混并在室温静置。1.0, 2.0, 4.0, 8.0 hr后，将50 μl的样品添加至150 μl的MeOH 以终止反应，将25 μl注入UFLC (分析条件如下所示)，测定目标肽的AUC。分别对修整所得的肽进行化学合成，在不含酶的相同条件下进行分析。基于所得AUC，测定修整所得的肽的形成比率。
分析条件
泵:由Shimadzu制造的UFLC
柱:Shim-pack XR-ODS 3.0 mmi.d.x75 mm
溶液:0.1% TFA H2O(A) ― 0.1% TFA CH3CN(B)
烘箱温度:40℃
流速:1.0 ml/min
检测波长: λ=220 nm。
梯度:
1. 将溶液 B的浓度在0.0 min至5.0 min从1.0%升高至70%。
2. 将溶液 B的浓度在0.0 min至5.0 min从1.0%升高至50%。
目标肽:
对于实施例 2 – 5中合成的肽，通过用ERAP1修整N-末端氨基酸所得的肽的氨基酸序列示于表 55。
修饰所得的肽的形成比率的经时变化示于表 56和图 1。
修整结果强烈暗示，在任何 Cys扩展肽(SEQ ID NO: 13, 16, 17和18)中，扩增的N-末端上的Cys被ERAP-1选择性地切断，即，Cys扩展肽受到ERAP-1的适宜修整而不显著依赖于肽序列，并最终转变为目标癌抗原肽(SEQ ID NO: 2, 5, 6或7)。
试验例 2
使用HLA-A0201转基因小鼠和HLA-A2402转基因小鼠的体内CTL诱导能力的评价
对于实施例1中合成的式(5)所示的化合物，通过使用HLA-A0201转基因小鼠和HLA-A2402转基因小鼠的体内CTL诱导试验来评价CTL诱导能力。式(5)所示的化合物:
其中C与C之间的键是二硫键；特别是上述式(1)的化合物，其中癌抗原肽A是RMFPNAPYL (SEQ ID NO:2)且癌抗原肽B是CYTWNQMNL (SEQ ID NO:4)。RMFPNAPYL (SEQ IDNO:2)是HLA-A0201-限制性WT1肽，并且CYTWNQMNL (SEQ ID NO:4)是HLA-A24-限制性WT1肽。
HLA-A0201转基因小鼠 (C57BL/6CrHLA-A2.1DR1)是缺失了小鼠MHC，并且表达人MHC HLA-A0201与小鼠MHC H-2Db的嵌合HLA、以及HLA-DRB1*0101的小鼠。使用该小鼠，可以选择HLA-A02阳性的能够诱导人中的CTL的肽(Eur J Immunol.2004; 34:3060-9)。另一方面，HLA-A2402转基因小鼠 (C57BL/6CrHLA-A2402/Kb)是一种小鼠，其表达人MHC HLA-A2402与小鼠MHC H-2Kb的嵌合HLA。使用该小鼠，可以选择HLA-A24阳性的能够诱导人中的CTL的肽(Int J Cancer.2002; 100:565-70)。
式(5)所示的化合物的给药是否导致诱导对目标肽 (SEQ ID NO: 2, 4)为特异性的CTL是基于下述再刺激所致的IFNγ产生的测定来判断，该再刺激是用肽 (SEQ ID NO:2, 4)对来自给予了式(5)所示的化合物的上述小鼠的脾细胞进行的再刺激。
具体地，将式(5)所示的化合物以40 mg/mL溶解于二甲基亚砜(DMSO)，进而用注射用水稀释至5 mg/mL，通过与等量的弗氏不完全佐剂(IFA)混合来进行乳化。将乳化的化合物以250 μg/处在小鼠尾根部的4处进行皮内给药。一周后，将小鼠用CO2气体安乐死，分离脾脏并制备脾细胞。使用IFNγ ELISPOT 测定试剂盒用于测定IFNγ产生。在制备脾细胞的前一天，将ELISPOT板用抗-小鼠IFNγ抗体处理并在次日用含有10% FBS的RPMI1640培养基封闭。将制备的来自HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞以0.15×106细胞/孔接种于进行了封闭的ELISPOT板，将来自HLA-A2402转基因小鼠的脾细胞以1×106 细胞/孔接种于进行了封闭的ELISPOT板。将肽 (SEQ ID NO: 2, 4) 以40 mg/mL溶解于DMSO，进而用含有10% FBS的RPMI1640培养基稀释至40 μg/mL。将稀释的肽 (SEQ ID NO: 2)以终浓度10 μg/mL添加至来自HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞。另外，将稀释的肽 (SEQ ID NO: 4)以终浓度10 μg/mL添加至来自HLA-A2402转基因小鼠的脾细胞。将添加有肽的脾细胞在37℃、5% CO2下培养20 hr，由此在体外进行肽再刺激。培养后，除去上清，依照所附操作规程使ELISPOT板显色。通过ImmunoSpot Analyzer (由C.T.L.制造)测定显色的斑点数目。
使用HLA-A0201转基因小鼠的IFNγ ELISPOT测定的结果示于图 2，使用HLA-A2402转基因小鼠的IFNγ ELISPOT测定的结果示于图 3。
在各附图中，纵轴表示接种细胞中发生了反应的细胞数。图 2中，黑色条棒和白色条棒表示在SEQ ID NO: 2所示的目标肽的存在或不存在的下培养来自HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞的结果，并且图 3中，黑色条棒和白色条棒表示在SEQ ID NO: 4所示的目标肽的存在或不存在的下培养来自HLA-A2402转基因小鼠的脾细胞的结果。即，黑色条棒和白色条棒的数值差异表示通过式(5)所示的化合物的给药在小鼠体内诱导的目标的各肽特异性CTL的数量。
在各附图中，未检测到白色条棒的数值。这意味着各转基因小鼠的脾细胞在目标肽的不存在下根本没有反应。作为该试验的结果，在来自HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞中检测到SEQ ID NO: 2所示的目标肽特异性的IFNγ产生，并且在来自HLA-A2402转基因小鼠的脾细胞中检测到SEQ ID NO: 4所示的目标肽特异性的IFNγ产生。
由上述明确了，式(5)所示的化合物可以诱导SEQ ID NO: 2所示的肽特异性的CTL，以及SEQ ID NO: 4所示的肽特异性的CTL。这强烈暗示了式(5)所示的化合物在小鼠体内受到二硫键的切断和ERAP-1的适当修整，并且实际上被加工成SEQ ID NO: 2和SEQ IDNO: 4所示的肽。
即，明确了作为本发明化合物的一个实施方案的式(5)所示的化合物是其中不同的两种WT1肽经由式(1)中所示的二硫键形成复合物的缀合物，并且是实际上能够在体内诱导不同的两种CTL的WT1癌抗原肽缀合物疫苗。
参考例 1 - 7
通过与实施例2中相同的方法，合成了由SEQ ID NO: 22, 24, 23, 2, 4, 6和5的各氨基酸序列组成的各肽。表 57示出质谱的结果。由于SEQ ID NO: 22, 24, 23, 2, 4, 6和5并不是本发明的化合物，因而将它们记载为参考例。
实施例 6 - 9
通过与实施例1中相同的方法，合成了式(3), (6), (7)和(8)所示的各化合物(缀合物)。表 58示出质谱的结果。(在各式中，C与C之间的键是二硫键)。
试验例 3
溶解度的测定
步骤1. 等渗缓冲液的制备
1.75% 磷酸氢二钠水溶液和5.53% 柠檬酸水溶液进行混合，制备各缓冲液(pH6.0和7.4)。
步骤2. 试验溶液的制备
称量约1 mg的试验品，加入等渗缓冲液 (0.5 mL)，将其用作试验溶液。将制备的试验溶液在室温振荡90 min (振荡条件: 由TAITEC制造的RECIPRO SHAKER SR-1N, 速度=8)，进行离心(15000 rpm, 5 min, 室温)，并将离心后的上清用作试验溶液。
步骤3. 标准溶液的制备
精确称量约1 mg的试验品，溶解于0.1% TFA 水/乙腈=1/1中，使总量为10 mL，将其用作试验品的标准溶液。
步骤4. 试验品的浓度测定
将试验品的标准溶液和试验溶液通过HPLC (分析条件记载于表 59)进行分析，由标准溶液的峰面积比计算试验品的溶解度。
HPLC测定条件
柱: ChemcoPack Quicksorb (4.6 mmφ×150 mm, 5 μm) 由Chemco ScientificCo., Ltd制造。
流动相: 溶液A; 0.1% TFA 水, 溶液 B; 0.1% TFA 乙腈溶液
柱温: 室温
流速: 1 mL/min
检测波长: UV 254 nm, 230 nm (双波长检测)
样品注射体积: 10 μL。
对参考例 1 - 2和4 – 7中合成的肽以及实施例 1, 7和9中合成的化合物(缀合物)进行上述溶解度测定。各溶解度示于表 60。
试验例 4
使用HLA-A0201转基因小鼠的体内CTL诱导能力的评价
对于实施例6中合成的式(3)所示的化合物，通过使用HLA-A0201转基因小鼠的体内CTL诱导试验来评价CTL诱导能力。式(3)所示的化合物:
其中C与C之间的键是二硫键；特别是上述式(1)的化合物，其中癌抗原肽A是RMFPNAPYL (SEQ ID NO:2)且癌抗原肽B是SLGEQQYSV (SEQ ID NO:6)。RMFPNAPYL (SEQ IDNO:2)和SLGEQQYSV(SEQ ID NO:6)是HLA-A0201-限制性WT1肽。
HLA-A0201转基因小鼠如试验例 2中所记载。
式(3)所示的化合物的给药是否导致诱导对目标肽 (SEQ ID NO: 2, 6)为特异性的CTL是基于下述再刺激所致的IFNγ产生的测定来判断，该再刺激是用肽 (SEQ ID NO:2, 6)对来自给予了式(3)所示的化合物的上述小鼠的脾细胞进行的再刺激。
具体地，将式(3)所示的化合物以10 mg/mL溶解于注射用水，通过与等量的弗氏不完全佐剂 (IFA)混合来进行乳化。将乳化的化合物以500 μg/处在小鼠尾根部的2处进行皮内给药。一周后，将小鼠用CO2气体安乐死，分离脾脏并制备脾细胞。使用IFNγ ELISPOT 测定试剂盒用于测定IFNγ产生。在制备脾细胞的前一天，将ELISPOT板用抗-小鼠IFNγ抗体处理并在次日用含有10% FBS的RPMI1640培养基封闭。将制备的来自HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞以0.75×106 细胞/孔接种在进行了封闭的ELISPOT板上。将肽 (SEQ ID NO: 2,6) 以40 mg/mL溶解于DMSO，进而用含有10% FBS的RPMI1640培养基稀释至40 μg/mL。将稀释的肽 (SEQ ID NO: 2, 6)以终浓度10 μg/mL添加至来自HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞。将添加有肽的脾细胞在37℃、5% CO2下培养20 hr，由此在体外进行肽再刺激。培养后，除去上清，依照所附操作规程使ELISPOT板显色。通过ImmunoSpot Analyzer (由C.T.L.制造)测定显色的斑点数目。
使用HLA-A0201转基因小鼠的IFNγ ELISPOT测定的结果示于图 4。
图4中，纵轴表示接种细胞中发生了反应的细胞数。图 4中，黑色条棒和阴影条棒表示在用SEQ ID NO: 2, 6所示的各肽脉冲的同时培养来自HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞的结果，并且白色条棒表示没有脉冲的情形下的培养结果。即，黑色或阴影条棒与白色条棒的数值差异表示肽特异性CTL的数量，并表示式(3)所示的化合物的给药导致在小鼠体内诱导SEQ ID NO: 2, 6所示的各肽特异性的CTL。图4中，未检测到白色条棒的数值。这意味着HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞在没有用目标肽脉冲的情形下根本没有反应。作为该试验的结果，在来自HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞中检测到SEQ ID NO: 2, 6所示的肽特异性的IFNγ产生。
由上述明确了，式(3)所示的化合物可以诱导SEQ ID NO: 2, 6所示的肽特异性的CTL。这强烈暗示了式(3)所示的化合物在小鼠体内受到二硫键的切断和ERAP-1的适当修整，并且实际上被加工成SEQ ID NO: 2和6所示的肽。即，明确了作为本发明化合物的一个实施方案的式(3)所示的化合物是其中不同的两种肽经由式(1)中所示的二硫键形成复合物的缀合物，并且是实际上能够在体内诱导不同的两种CTL的WT1癌抗原肽缀合物疫苗。
试验例 5
使用HLA-A0201转基因小鼠的体内CTL诱导能力的评价
对于实施例7中合成的式(6)所示的化合物，通过使用HLA-A0201转基因小鼠的体内CTL诱导试验来评价CTL诱导能力。式(6)所示的化合物:
其中C与C之间的键是二硫键；特别是上述式(1)的化合物，其中癌抗原肽A是RMFPNAPYL (SEQ ID NO:2)且癌抗原肽C是CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO:24)。RMFPNAPYL (SEQ ID NO:2)是HLA-A0201-限制性WT1肽，并且CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQID NO:24)是MHC II类-限制性WT1肽 (即，辅助肽)。
HLA-A0201转基因小鼠如试验例 2中所记载。使用该小鼠，可以选择HLA-A02阳性的能够诱导人中的CTL的肽，另外还可以评价能够通过与人HLA-DRB1*0101结合而诱导辅助T细胞的辅助肽的CTL诱导增强活性。
式(6)所示的化合物的给药是否导致诱导对目标肽 (SEQ ID NO: 2)为特异性的CTL、和辅助肽(SEQ ID NO: 24)反应性的细胞是基于下述再刺激所致的IFNγ产生的测定来判断，该再刺激是用肽 (SEQ ID NO: 2, 24)对来自给予了式(6)所示的化合物的上述小鼠的脾细胞进行的再刺激。此外，将给予了式(6)所示的化合物的来自上述小鼠的脾细胞和给予了SEQ ID NO: 2所示的化合物的来自上述小鼠的脾细胞用肽 (SEQ ID NO: 2)进行再刺激，并比较IFNγ产生细胞数。
具体地，将SEQ ID NO: 2所示的肽以6 mg/mL溶解于注射用水，通过与等量的弗氏不完全佐剂 (IFA)混合来进行乳化。将乳化的肽以150 μg/处在小鼠尾根部的2处进行皮内给药。将式(6)所示的化合物溶解于注射用水(19.8 mg/mL)，通过与等量的弗氏不完全佐剂(IFA)混合来进行乳化。将乳化的化合物以495 μg/处在小鼠尾根部的2处进行皮内给药。将每一只小鼠的式(6)所示化合物的给药量中所含的SEQ ID NO: 2的肽的摩尔数调整为与每一只小鼠的给药量中所含的SEQ ID NO: 2的肽的摩尔数相等。一周后，将小鼠用CO2气体安乐死，分离脾脏并制备脾细胞。使用IFNγ ELISPOT 测定试剂盒用于测定IFNγ产生。在制备脾细胞的前一天，将ELISPOT板用抗-小鼠IFNγ抗体处理并在次日用含有10% FBS的RPMI1640培养基封闭。将制备的来自HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞以0.25×106 细胞/孔或0.5×106 细胞/孔接种在进行了封闭的ELISPOT板上。将肽 (SEQ ID NO: 2, 24) 以40mg/mL溶解于DMSO，进而用含有10% FBS的RPMI1640培养基稀释至40 μg/mL。将稀释的肽(SEQ ID NO: 2, 24)以终浓度10 μg/mL添加至来自HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞。将添加有肽的脾细胞在37℃、5% CO2下培养20 hr，由此在体外进行肽再刺激。培养后，除去上清，依照所附操作规程使ELISPOT板显色。通过ImmunoSpot Analyzer (由C.T.L.制造)测定显色的斑点数目。
使用HLA-A0201转基因小鼠的IFNγ ELISPOT测定的结果示于图 5和6。
图 5和6中，纵轴表示接种细胞中发生了反应的细胞数，并且横轴表示给药于小鼠的化合物或肽。图 5中，黑色条棒表示在用SEQ ID NO: 2所示的肽脉冲的同时培养来自HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞的结果，并且白色条棒表示没有脉冲的情形下的培养结果。即，黑色条棒与白色条棒的数值差异表示肽特异性CTL的数量，并且表示SEQ ID NO: 2所示的肽或式(6)所示的化合物的给药导致在小鼠体内诱导SEQ ID NO: 2所示的肽特异性的CTL。图5中，未检测到白色条棒的数值。这意味着HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞在没有用目标肽脉冲的情形下根本没有反应。作为该试验的结果，在来自HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞中检测到SEQ ID NO: 2所示的肽特异性的IFNγ产生。此外，图 5中，通过式(6)所示的化合物的给药诱导的SEQ ID NO: 2所示的肽特异性的IFNγ产生细胞的数量高于通过SEQID NO: 2所示的肽的给药诱导的肽特异性的IFNγ产生细胞的数量。
进而，图 6中，黑色条棒表示在用SEQ ID NO: 24所示的肽脉冲的同时培养来自HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞的结果，并且白色条棒表示没有脉冲的情形下的培养结果。即，黑色条棒和白色条棒的数值差异表示肽反应性细胞的数量，并且表示式(6)所示的化合物的给药导致在小鼠体内诱导SEQ ID NO: 24所示的辅助肽反应性的细胞，而SEQ ID NO:2所示的化合物的给药并未在小鼠体内诱导SEQ ID NO: 24所示的肽反应性的细胞。图6中，未检测到白色条棒的数值。这意味着HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞在没有用目标肽脉冲的情形下根本没有反应。
由上述明确了，式(6)所示的化合物可以诱导SEQ ID NO: 2所示的肽特异性的CTL，以及SEQ ID NO: 24所示的辅助肽反应性的细胞。这强烈暗示了式(6)所示的化合物在小鼠体内受到二硫键的切断和ERAP-1的适当修整，并且实际上被加工成SEQ ID NO: 2和24所示的肽。据推测，由式(6)所示的化合物制造的SEQ ID NO: 24所示的辅助肽反应性的细胞的诱导增强了SEQ ID NO: 2所示的肽特异性的CTL的诱导，并且与SEQ ID NO: 2所示的肽的给药相比，观察到了许多的SEQ ID NO: 2所示的肽特异性的IFNγ产生细胞。
即，明确了作为本发明化合物的一个实施方案的式(6)所示的化合物是其中不同的两种肽经由式(1)中所示的二硫键形成复合物的缀合物，并且是实际上能够在体内诱导CTL和辅助肽反应性细胞的WT1癌抗原肽缀合物疫苗。
试验例 6
使用HLA-A0201转基因小鼠的体内CTL诱导能力的评价
对于实施例9中合成的式(8)所示的化合物，通过使用HLA-A0201转基因小鼠的体内CTL诱导试验来评价CTL诱导能力。式(8)所示的化合物:
其中C与C之间的键是二硫键；特别是上述式(1)的化合物，其中癌抗原肽A是RMFPNAPYL (SEQ ID NO:2)且癌抗原肽C是CNKRYFKLSHLQMHSRK(SEQ ID NO:22)。RMFPNAPYL(SEQ ID NO:2)是HLA-A0201-限制性WT1肽，并且CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO:22)是MHC II类-限制性WT1肽 (即，辅助肽)。
HLA-A0201转基因小鼠如试验例 2和5中所记载。
式(8)所示的化合物的给药是否导致诱导对目标肽 (SEQ ID NO: 2)为特异性的CTL、和辅助肽(SEQ ID NO: 22)反应性的细胞是基于下述再刺激所致的IFNγ产生的测定来判断，该再刺激是用肽 (SEQ ID NO: 2, 22)对来自给予了式(8)所示的化合物的上述小鼠的脾细胞进行的再刺激。此外，将给予了式(8)所示的化合物的来自上述小鼠的脾细胞和给予了SEQ ID NO: 2所示的化合物的来自上述小鼠的脾细胞用肽 (SEQ ID NO: 2)进行再刺激，并比较IFNγ产生细胞数。
具体地，将SEQ ID NO: 2所示的肽以6 mg/mL溶解于注射用水，通过与等量的弗氏不完全佐剂 (IFA)混合来进行乳化。将乳化的肽以150 μg/处在小鼠尾根部的2处进行皮内给药。将式(8)所示的化合物溶解于注射用水(18 mg/mL)，通过与等量的弗氏不完全佐剂(IFA)混合来进行乳化。将乳化的化合物以450 μg/处在小鼠尾根部的2处进行皮内给药。将每一只小鼠的式(8)所示化合物的给药量中所含的SEQ ID NO: 2的肽的摩尔数调整为与每一只小鼠的给药量中所含的SEQ ID NO: 2的肽的摩尔数相等。一周后，将小鼠用CO2气体安乐死，分离脾脏并制备脾细胞。使用IFNγ ELISPOT 测定试剂盒用于测定IFNγ产生。在制备脾细胞的前一天，将ELISPOT板用抗-小鼠IFNγ抗体处理并在次日用含有10% FBS的RPMI1640培养基封闭。将制备的来自HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞以0.25×106 细胞/孔或0.5×106 细胞/孔接种在进行了封闭的ELISPOT板上。将肽 (SEQ ID NO: 2, 22) 以40mg/mL溶解于DMSO，进而用含有10% FBS的RPMI1640培养基稀释至40 μg/mL。将稀释的肽(SEQ ID NO: 2, 22)以终浓度10 μg/mL添加至来自HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞。将添加有肽的脾细胞在37℃、5% CO2下培养20 hr，由此在体外进行肽再刺激。培养后，除去上清，依照所附操作规程使ELISPOT板显色。通过ImmunoSpot Analyzer (由C.T.L.制造)测定显色的斑点数目。
使用HLA-A0201转基因小鼠的IFNγ ELISPOT测定的结果示于图 7和8。
图 7和8中，纵轴表示接种细胞中发生了反应的细胞数，并且横轴表示给药于小鼠的化合物或肽。图 7中，黑色条棒表示在用SEQ ID NO: 2所示的肽脉冲的同时培养来自HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞的结果，并且白色条棒表示没有脉冲的情形下的培养结果。即，黑色条棒与白色条棒的数值差异表示肽特异性CTL的数量，并且表示SEQ ID NO: 2所示的肽或式(8)所示的化合物的给药导致在小鼠体内诱导SEQ ID NO: 2所示的肽特异性的CTL。图7中，未检测到白色条棒的数值。这意味着HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞在没有用目标肽脉冲的情形下根本没有反应。作为该试验的结果，在来自HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞中检测到SEQ ID NO: 2所示的肽特异性的IFNγ产生。此外，图 7中，通过式(8)所示的化合物的给药诱导的SEQ ID NO: 2所示的肽特异性的IFNγ产生细胞的数量高于通过SEQID NO: 2所示的肽的给药诱导的肽特异性的IFNγ产生细胞的数量。
进而，图 8中，黑色条棒表示在用SEQ ID NO: 22所示的肽脉冲的同时培养来自HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞的结果，并且白色条棒表示没有脉冲的情形下的培养结果。即，黑色条棒和白色条棒的数值差异表示肽反应性细胞的数量，并且表示式(8)所示的化合物的给药导致在小鼠体内诱导SEQ ID NO: 22所示的辅助肽反应性的细胞，而SEQ ID NO:2所示的肽的给药并未在小鼠体内诱导SEQ ID NO: 22所示的肽反应性的细胞。图8中，未检测到白色条棒的数值。这意味着HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞在没有用目标肽脉冲的情形下根本没有反应。
由上述明确了，式(8)所示的化合物可以诱导SEQ ID NO: 2所示的肽特异性的CTL，以及SEQ ID NO: 22所示的辅助肽反应性的细胞。这强烈暗示了式(8)所示的化合物在小鼠体内受到二硫键的切断和ERAP-1的适当修整，并且实际上被加工成SEQ ID NO: 2和22所示的肽。据推测，由式(8)所示的化合物制造的SEQ ID NO: 22所示的辅助肽反应性的细胞的诱导增强了SEQ ID NO: 2所示的肽特异性的CTL的诱导，并且与SEQ ID NO: 2所示的化合物的给药相比，观察到了许多的SEQ ID NO: 2所示的肽特异性的IFNγ产生细胞。
即，明确了作为本发明化合物的一个实施方案的式(8)所示的化合物是其中不同的两种肽经由式(1)中所示的二硫键形成复合物的缀合物，并且是实际上能够在体内诱导CTL和辅助肽反应性细胞的WT1癌抗原肽缀合物疫苗。
实施例10
通过与实施例1中相同的方法，合成了式(9)所示的各化合物(缀合物)。表 61示出质谱的结果。(在各式中，C与C之间的键是二硫键)。
参考例8 - 9
通过与实施例2中相同的方法，合成了由SEQ ID NO: 238 – 239所示的氨基酸序列组成的肽。质谱的结果示于表 62。由于表中记载的肽并不是本发明的化合物，因而将它们记作参考例。
参考例 10 - 11
通过与实施例2中相同的方法，合成了由SEQ ID NO: 240 – 241所示的氨基酸序列组成的肽。质谱的结果示于表 63。由于表中记载的肽并不是本发明的化合物，因而将它们记作参考例。
通过参考非专利文献Cancer Science January 2012, Vol. 103, no. 1, 150-153，合成了表 63中所示的肽。
试验例 7
缀合物和混合疫苗的稳定性试验
步骤1
将缀合物(式No.: (6)) (2.4 mg)溶解于120 μL的注射用水并在遮光下室温保存。
步骤2
作为混合疫苗，将SEQ ID NO: 2所示的肽 (1.1 mg)溶解于180 μL的注射用水，将其123 μL用于溶解SEQ ID NO: 24所示的肽 (1.3 mg)，将该溶液在遮光下室温保存。
步骤3
将步骤1和步骤2中所得的溶液(2.5 μL)用注射用水(50 μL)稀释，进行HPLC分析(分析条件如下所示)，以刚保存后的面积值作为100%，测定缀合物和肽在水溶液中的含有率。缀合物的含有率示于表 64，各肽在混合疫苗中的含有率示于表 65。
分析条件
泵:由Shimadzu制造的UFLC
柱:Kinetex 2.6u C18 100A 3.0 mm i.d. x 75 mm
流动相:溶液A; 0.1% TFA 水, 溶液 B; 0.1% TFA 乙腈溶液
柱温:40℃
流速:1 mL/min
检测波长:UV 220, 254 nm (双波长检测)
样品注射体积:10 μL。
[表 64]
经过时间 式No. (6) 含有率(%)
1 天 107
2 周 96
[表 65]
经过时间 SEQ ID NO:2 含有率(%) SEQ ID NO:24 含有率(%)
1 天 97 65
1 周 99 9
2 周 94 6
试验例 7中，在溶液制备起为2周的时刻，式No. (6)所示的缀合物含有96%的式(6)所示化合物。相反，在作为混合疫苗的SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 24的混合溶液中，SEQ ID NO: 24的含有率在经过1天的时刻降低至65%，并且在2周后降低至6%。这些结果表明，以水溶液形式保存的缀合物比在相同条件下保存的混合疫苗更稳定。
试验例 8
使用HLA-A0201转基因小鼠的体内CTL诱导能力的评价
对于实施例8中合成的式(7)所示的化合物，通过使用HLA-A0201转基因小鼠的体内CTL诱导试验来评价CTL诱导能力。式(7)所示的化合物:
其中C与C之间的键是二硫键；特别是上述式(1)的化合物，其中癌抗原肽A是RMFPNAPYL (SEQ ID NO:2)并且癌抗原肽C是CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO:23)。RMFPNAPYL (SEQ ID NO:2)是HLA-A0201-限制性WT1肽，并且CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ IDNO:23)是MHC II类-限制性WT1肽 (即，辅助肽)。
HLA-A0201转基因小鼠如试验例 2和5中所记载。
式(7)所示的化合物的给药是否导致诱导对目标肽 (SEQ ID NO: 2)为特异性的CTL、和辅助肽(SEQ ID NO: 23)反应性的细胞是基于下述再刺激所致的IFNγ产生的测定来判断，该再刺激是用肽 (SEQ ID NO: 2, 23)对来自给予了式(7)所示的化合物的上述小鼠的脾细胞进行的再刺激。此外，将给予了式(7)所示的化合物的来自上述小鼠的脾细胞和给予了SEQ ID NO: 2所示的化合物的来自上述小鼠的脾细胞用肽 (SEQ ID NO: 2)进行再刺激，并比较IFNγ产生细胞数。
具体地，将SEQ ID NO: 2所示的肽以6 mg/mL溶解于注射用水，通过与等量的弗氏不完全佐剂 (IFA)混合来进行乳化。将乳化的肽以150 μg/处在小鼠尾根部的2处进行皮内给药。将式(7)所示的化合物溶解于注射用水(19 mg/mL)，通过与等量的弗氏不完全佐剂(IFA)混合来进行乳化。将乳化的化合物以475 μg/处在小鼠尾根部的2处进行皮内给药。将每一只小鼠的式(7)所示化合物的给药量中所含的SEQ ID NO: 2的肽的摩尔数调整为与每一只小鼠的给药量中所含的SEQ ID NO: 2的肽的摩尔数相等。一周后，将小鼠用CO2气体安乐死，分离脾脏并制备脾细胞。使用IFNγ ELISPOT 测定试剂盒用于测定IFNγ产生。在制备脾细胞的前一天，将ELISPOT板用抗-小鼠IFNγ抗体处理并在次日用含有10% FBS的RPMI1640培养基封闭。将制备的来自HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞以0.25×106 细胞/孔或0.5×106 细胞/孔接种在进行了封闭的ELISPOT板上。将肽 (SEQ ID NO: 2, 23) 以40mg/mL溶解于DMSO，进而用含有10% FBS的RPMI1640培养基稀释至40 μg/mL。将稀释的肽(SEQ ID NO: 2, 23)以终浓度10 μg/mL添加至来自HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞。将添加有肽的脾细胞在37℃、5% CO2下培养17 hr，由此在体外进行肽再刺激。培养后，除去上清，依照所附操作规程使ELISPOT板显色。通过ImmunoSpot Analyzer (由C.T.L.制造)测定显色的斑点数目。
使用HLA-A0201转基因小鼠的IFNγ ELISPOT测定的结果示于图 9和10。图 9和10中，纵轴表示接种细胞中发生了反应的细胞数，并且横轴表示给药于小鼠的化合物或肽。图9中，黑色条棒表示在用SEQ ID NO: 2所示的肽脉冲的同时培养来自HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞的结果，并且白色条棒表示没有脉冲的情形下的培养结果。即，黑色条棒与白色条棒的数值差异表示肽特异性CTL的数量，并且表示SEQ ID NO: 2所示的肽或式(7)所示的化合物的给药导致在小鼠体内诱导SEQ ID NO: 2所示的肽特异性的CTL。图9中，未检测到白色条棒的数值。这意味着HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞在没有用目标肽脉冲的情形下根本没有反应。作为该试验的结果，在来自HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞中检测到SEQ IDNO: 2所示的肽特异性的IFNγ产生。此外，图 9中，通过式(7)所示的化合物的给药诱导的SEQ ID NO: 2所示的肽特异性的IFNγ产生细胞的数量高于通过SEQ ID NO: 2所示的肽的给药诱导的肽特异性的IFNγ产生细胞的数量。
进而，图 10中，黑色条棒表示在用SEQ ID NO: 23所示的肽脉冲的同时培养来自HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞的结果，并且白色条棒表示没有脉冲的情形下的培养结果。即，黑色条棒和白色条棒的数值差异表示肽反应性细胞的数量，并且表示式(7)所示的化合物的给药导致在小鼠体内诱导SEQ ID NO: 23所示的辅助肽反应性的细胞，而SEQ ID NO:2所示的肽的给药并未在小鼠体内诱导SEQ ID NO: 23所示的肽反应性的细胞。图10中，未检测到白色条棒的数值。这意味着HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞在没有用目标肽脉冲的情形下根本没有反应。
由上述明确了，式(7)所示的化合物可以诱导SEQ ID NO: 2所示的肽特异性的CTL，以及SEQ ID NO: 23所示的辅助肽反应性的细胞。这强烈暗示了式(7)所示的化合物在小鼠体内受到二硫键的切断和ERAP-1的适当修整，并且实际上被加工成SEQ ID NO: 2和23所示的肽。据推测，由式(7)所示的化合物制造的SEQ ID NO: 23所示的辅助肽反应性的细胞的诱导增强了SEQ ID NO: 2所示的肽特异性的CTL的诱导，并且与SEQ ID NO: 2所示的化合物的给药相比，观察到了许多的SEQ ID NO: 2所示的肽特异性的IFNγ产生细胞。
即，明确了作为本发明化合物的一个实施方案的式(7)所示的化合物是其中不同的两种肽经由式(1)中所示的二硫键形成复合物的缀合物，并且是实际上能够在体内诱导CTL和辅助肽反应性细胞的WT1癌抗原肽缀合物疫苗。
试验例 9
使用HLA-A0201转基因小鼠的体内CTL诱导能力的评价
对于实施例10中合成的式(9)所示的化合物，通过使用HLA-A0201转基因小鼠的体内CTL诱导试验来评价CTL诱导能力。式(9)所示的化合物:
其中C与C之间的键是二硫键；特别是上述式(1)的化合物，其中癌抗原肽A是ALLPAVPSL (SEQ ID NO:5)且癌抗原肽C是CNKRYFKLSHLQMHSRKHG (SEQ ID NO:24)。ALLPAVPSL (SEQ ID NO:5)是HLA-A0201和HLA-A2402-限制性WT1肽，并且CNKRYFKLSHLQMHSRKHG (SEQ ID NO:24)是MHC II类-限制性WT1肽 (即，辅助肽)。
HLA-A0201转基因小鼠如试验例 2和5中所记载。
式(9)所示的化合物的给药是否导致诱导对目标肽 (SEQ ID NO: 5)为特异性的CTL、和辅助肽(SEQ ID NO: 24)反应性的细胞是基于下述再刺激所致的IFNγ产生的测定来判断，该再刺激是用肽 (SEQ ID NO: 5, 24)对来自给予了式(9)所示的化合物的上述小鼠的脾细胞进行的再刺激。此外，将给予了式(9)所示的化合物的来自上述小鼠的脾细胞和给予了SEQ ID NO: 5所示的化合物的来自上述小鼠的脾细胞用肽 (SEQ ID NO: 5)进行再刺激，并比较IFNγ产生细胞数。
具体地，将SEQ ID NO: 5所示的肽以6 mg/mL溶解于注射用水，通过与等量的弗氏不完全佐剂 (IFA)混合来进行乳化。将乳化的肽以150 μg/处在小鼠尾根部的2处进行皮内给药。将式(9)所示的化合物溶解于注射用水(23.6 mg/mL)，通过与等量的弗氏不完全佐剂(IFA)混合来进行乳化。将乳化的化合物以590 μg/处在小鼠尾根部的2处进行皮内给药。将每一只小鼠的式(9)所示化合物的给药量中所含的SEQ ID NO: 5的肽的摩尔数调整为与每一只小鼠的给药量中所含的SEQ ID NO: 5的肽的摩尔数相等。一周后，将小鼠用CO2气体安乐死，分离脾脏并制备脾细胞。使用IFNγ ELISPOT 测定试剂盒用于测定IFNγ产生。在制备脾细胞的前一天，将ELISPOT板用抗-小鼠IFNγ抗体处理并在次日用含有10% FBS的RPMI1640培养基封闭。将制备的来自HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞以0.25×106 细胞/孔或0.75×106 细胞/孔接种在进行了封闭的ELISPOT板上。将肽 (SEQ ID NO: 5, 24) 以40mg/mL溶解于DMSO，进而用含有10% FBS的RPMI1640培养基稀释至40 μg/mL。将稀释的肽(SEQ ID NO: 5, 24)以终浓度10 μg/mL添加至来自HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞。将添加有肽的脾细胞在37℃、5% CO2下培养17 hr，由此在体外进行肽再刺激。培养后，除去上清，依照所附操作规程使ELISPOT板显色。通过ImmunoSpot Analyzer (由C.T.L.制造)测定显色的斑点数目。
使用HLA-A0201转基因小鼠的IFNγ ELISPOT测定的结果示于图 11和12。图 11和12中，纵轴表示接种细胞中发生了反应的细胞数，并且横轴表示给药于小鼠的化合物或肽。图 11中，黑色条棒表示在用SEQ ID NO: 5所示的肽脉冲的同时培养来自HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞的结果，并且白色条棒表示没有脉冲的情形下的培养结果。即，黑色与白色条棒的数值差异表示肽特异性CTL的数量，并且表示SEQ ID NO: 5所示的肽或式(9)所示的化合物的给药导致在小鼠体内诱导SEQ ID NO: 5所示的肽特异性的CTL。图11中，未检测到白色条棒的数值。这意味着HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞在没有用目标肽脉冲的情形下并未反应。作为该试验的结果，在来自HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞中检测到SEQ ID NO: 5所示的肽特异性的IFNγ产生。图 11中，通过式(9)所示的化合物的给药诱导的SEQ ID NO:5所示的肽特异性的IFNγ产生细胞的数量高于通过SEQ ID NO: 5所示的肽的给药诱导的肽特异性的IFNγ产生细胞的数量。
进而，图 12中，黑色条棒表示在用SEQ ID NO: 24所示的肽脉冲的同时培养来自HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞的结果，并且白色条棒表示没有脉冲的情形下的培养结果。即，黑色条棒和白色条棒的数值差异表示肽反应性细胞的数量，并且表示式(9)所示的化合物的给药导致在小鼠体内诱导SEQ ID NO: 24所示的辅助肽反应性的细胞，而SEQ ID NO:5所示的肽的给药并未在小鼠体内诱导SEQ ID NO: 24所示的肽反应性的细胞。图12中，基本未检测到白色条棒的数值。这意味着HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞在没有用目标肽脉冲的情形下并未反应。
由上述明确了，式(9)所示的化合物可以诱导SEQ ID NO: 5所示的肽特异性的CTL，以及SEQ ID NO: 24所示的辅助肽反应性的CTL。这强烈暗示了式(9)所示的化合物在小鼠体内受到二硫键的切断和ERAP-1的适当修整，并且实际上被加工成SEQ ID NO: 5和24所示的肽。据推测，由式(9)所示的化合物制造的SEQ ID NO: 24所示的辅助肽反应性的细胞的诱导增强了SEQ ID NO: 5所示的肽特异性的CTL的诱导，并且与SEQ ID NO: 5所示的化合物的给药相比，观察到了许多的SEQ ID NO: 5所示的肽特异性的IFNγ产生细胞。
即，明确了作为本发明化合物的一个实施方案的式(9)所示的化合物是其中不同的两种肽经由式(1)中所示的二硫键形成复合物的缀合物，并且是实际上能够在体内诱导CTL和辅助肽反应性细胞的WT1癌抗原肽缀合物疫苗。
比较例1
使用HLA-A0201转基因小鼠和HLA-A2402转基因小鼠的体内CTL诱导能力的评价
对于实施例1中合成的式(5)所示的化合物和参考例8和9中合成的SEQ ID NO:238和239所示的肽，通过使用HLA-A0201转基因小鼠和HLA-A2402转基因小鼠的体内CTL诱导试验来评价CTL诱导能力。式(5)所示的化合物如试验例 2中所记载，
其中C与C之间的键是二硫键。SEQ ID NO: 238和239所示的肽是长链肽，其中作为HLA-A0201-限制性WT1肽的RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2)和作为HLA-A2402-限制性WT1肽的CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 4)通过酰胺键连接。
HLA-A0201转基因小鼠和HLA-A2402转基因小鼠如试验例 2中所记载。
式(5)所示的化合物和SEQ ID NO: 238, 239所示的肽的给药是否导致诱导对目标肽 (SEQ ID NO: 2, 4)为特异性的CTL是基于下述再刺激所致的IFNγ产生的测定来判断，该再刺激是用肽 (SEQ ID NO: 2, 4)对来自给予了式(5)所示的化合物和SEQ ID NO:238, 239所示的肽的上述小鼠的脾细胞进行的再刺激。
具体地，将式(5)所示的化合物和SEQ ID NO: 238, 239所示的肽各自以40 mg/mL溶解于二甲基亚砜(DMSO)，进而以注射用水稀释至5 mg/mL，通过与等量的弗氏不完全佐剂(IFA)混合来进行乳化。将乳化的化合物以250 μg/处在小鼠尾根部的4处进行皮内给药。一周后，将小鼠用CO2气体安乐死，分离脾脏并制备脾细胞。使用IFNγ ELISPOT 测定试剂盒用于测定IFNγ产生。在制备脾细胞的前一天，将ELISPOT板用抗-小鼠IFNγ抗体处理并在次日用含有10% FBS的RPMI1640培养基封闭。将制备的来自HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞以0.25×106细胞/孔接种于进行了封闭的ELISPOT板，将来自HLA-A2402转基因小鼠的脾细胞以1×106 细胞/孔接种于进行了封闭的ELISPOT板。将肽 (SEQ ID NO: 2, 4) 以40 mg/mL溶解于DMSO，进而用含有10% FBS的RPMI1640培养基稀释至40 μg/mL。将稀释的肽 (SEQID NO: 2)以终浓度10 μg/mL添加至来自HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞。另外，将稀释的肽 (SEQ ID NO: 4)以终浓度10 μg/mL添加至来自HLA-A2402转基因小鼠的脾细胞。将添加有肽的脾细胞在37℃、5% CO2下培养18 hr，由此在体外进行肽再刺激。培养后，除去上清，依照所附操作规程使ELISPOT板显色。通过ImmunoSpot Analyzer (由C.T.L.制造)测定显色的斑点数目。
使用HLA-A0201转基因小鼠的IFNγ ELISPOT测定的结果示于图 13，使用HLA-A2402转基因小鼠的IFNγ ELISPOT测定的结果示于图 14。
在各附图中，纵轴表示接种细胞中发生了反应的细胞数。图 13中，黑色条棒和白色条棒表示在SEQ ID NO: 2所示的目标肽的存在或不存在的下培养来自HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞的结果，并且图 14中，黑色条棒和白色条棒表示在SEQ ID NO: 4所示的目标肽的存在或不存在的下培养来自HLA-A2402转基因小鼠的脾细胞的结果。即，黑色条棒和白色条棒的数值差异表示通过式(5)所示的化合物和SEQ ID NO: 238, 239所示的肽的给药在小鼠体内诱导的目标的各肽特异性CTL的数量。
在各附图中，未检测到白色条棒的数值。这意味着各转基因小鼠的脾细胞在目标肽的不存在下根本没有反应。作为该试验的结果，在来自给予了式(5)所示的化合物的HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞中检测到SEQ ID NO: 2所示的目标肽特异性的IFNγ产生，并且在来自给予了式(5)所示的化合物的HLA-A2402转基因小鼠的脾细胞中检测到SEQ ID NO:4所示的目标肽特异性的IFNγ产生。另一方面，尽管在来自给予了SEQ ID NO: 238所示的肽的HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞中检测到SEQ ID NO: 2所示的目标肽特异性的IFNγ产生；然而，当与来自给予了式(5)所示的化合物的HLA-A2402转基因小鼠的脾细胞相比，其数量非常小。在来自给予了SEQ ID NO: 238所示的肽的HLA-A2402转基因小鼠的脾细胞中检测到SEQ ID NO: 4所示的目标肽特异性的IFNγ产生。尽管在来自给予了SEQ ID NO:239所示的肽的HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞中检测到SEQ ID NO: 2所示的目标肽特异性的IFNγ产生；然而，当与来自给予了式(5)所示的化合物的HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞相比，其数量较小。在来自给予了SEQ ID NO: 239所示的肽的HLA-A2402转基因小鼠的脾细胞中检测到SEQ ID NO: 4所示的目标肽特异性的IFNγ产生。
由此，已经明确了本发明的式(5)所示的化合物能够有效地诱导SEQ ID NO: 2所示的肽特异性的CTL以及SEQ ID NO: 4所示的肽特异性的CTL。另一方面，SEQ ID NO: 238,239所示的长链肽不能有效地诱导SEQ ID NO: 2所示的肽特异性的CTL以及SEQ ID NO: 4所示的肽特异性的CTL。
比较例2
使用HLA-A0201转基因小鼠和HLA-A2402转基因小鼠的体内CTL诱导能力的评价
对于实施例1中合成的式(5)所示的化合物和参考例10和11中合成的SEQ ID NO:240和241所示的肽，通过使用HLA-A0201转基因小鼠和HLA-A2402转基因小鼠的体内CTL诱导试验来评价CTL诱导能力。式(5)所示的化合物如试验例 2中所记载，
其中C与C之间的键是二硫键。SEQ ID NO: 240和241所示的肽是长链肽，其中作为HLA-A0201-限制性WT1肽的RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2)和作为HLA-A2402-限制性WT1肽的CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 4)经由作为肽间隔物的6个甘氨酸通过酰胺键连接。
HLA-A0201转基因小鼠和HLA-A2402转基因小鼠如试验例 2中所述。
式(5)所示的化合物和SEQ ID NO: 240, 241所示的肽的给药是否导致诱导对目标肽 (SEQ ID NO: 2, 4)为特异性的CTL是基于下述再刺激所致的IFNγ产生的测定来判断，该再刺激是用肽 (SEQ ID NO: 2, 4)对来自给予了式(5)所示的化合物和SEQ ID NO:240, 241所示的肽的上述小鼠的脾细胞进行的再刺激。
具体地，将式(5)所示的化合物以80 mg/mL溶解于二甲基亚砜(DMSO)，进而用注射用水稀释至10 mg/mL，通过与等量的弗氏不完全佐剂(IFA)混合来进行乳化。将乳化的化合物以500 μg/处在小鼠尾根部的2处进行皮内给药。此外，将SEQ ID NO: 240, 241所示的肽以80 mg/mL溶解于二甲基亚砜(DMSO)，进而用注射用水稀释至11 mg/mL，通过与等量的弗氏不完全佐剂(IFA)混合来进行乳化。将乳化的化合物以550 μg/处在小鼠尾根部的2处进行皮内给药。一周后，将小鼠用CO2气体安乐死，分离脾脏并制备脾细胞。使用IFNγELISPOT 测定试剂盒用于测定IFNγ产生。在制备脾细胞的前一天，将ELISPOT板用抗-小鼠IFNγ抗体处理并在次日用含有10% FBS的RPMI1640培养基封闭。将制备的来自HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞以0.25×106 细胞/孔并且来自HLA-A2402转基因小鼠的脾细胞以1.5×106 细胞/孔接种于进行了封闭的ELISPOT板。将肽 (SEQ ID NO: 2, 4) 以40 mg/mL溶解于DMSO，进而用含有10% FBS的RPMI1640培养基稀释至40 μg/mL。将稀释的肽 (SEQ IDNO: 2)以终浓度10 μg/mL添加至来自HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞。另外，将稀释的肽(SEQ ID NO: 4)以终浓度10 μg/mL添加至来自HLA-A2402转基因小鼠的脾细胞。将添加有肽的脾细胞在37℃、5% CO2下培养17 hr，由此在体外进行肽再刺激。培养后，除去上清，依照所附操作规程使ELISPOT板显色。通过ImmunoSpot Analyzer (由C.T.L.制造)测定显色的斑点数目。
使用HLA-A0201转基因小鼠的IFNγ ELISPOT测定的结果示于图 15，使用HLA-A2402转基因小鼠的IFNγ ELISPOT测定的结果示于图 16。
在各附图中，纵轴表示接种细胞中发生了反应的细胞数。图 15中，黑色条棒和白色条棒表示在SEQ ID NO: 2所示的目标肽的存在或不存在的下培养来自HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞的结果，并且图 16中，黑色条棒和白色条棒表示在SEQ ID NO: 4所示的目标肽的存在或不存在的下培养来自HLA-A2402转基因小鼠的脾细胞的结果。即，黑色条棒和白色条棒的数值差异表示通过式(5)所示的化合物和SEQ ID NO: 240, 241所示的肽的给药在小鼠体内诱导的目标的各肽特异性CTL的数量。
在各附图中，未检测到白色条棒的数值。这意味着各转基因小鼠的脾细胞在目标肽的不存在下并不反应。作为该试验的结果，在来自给予了式(5)所示的化合物的HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞中检测到SEQ ID NO: 2所示的目标肽特异性的IFNγ产生，并且在来自给予了式(5)所示的化合物的HLA-A2402转基因小鼠的脾细胞中检测到SEQ ID NO:4所示的目标肽特异性的IFNγ产生。另一方面，在来自给予了SEQ ID NO: 240所示的肽的HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞中，SEQ ID NO: 2所示的目标肽特异性的IFNγ产生极其少；然而，在来自给予了SEQ ID NO: 240所示的化合物的HLA-A2402转基因小鼠的脾细胞中检测到SEQ ID NO: 4所示的目标肽特异性的IFNγ产生。此外，在来自给予了SEQ ID NO:241所示的肽的HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞中，SEQ ID NO: 2所示的目标肽特异性的IFNγ产生极其少。尽管在来自给予了SEQ ID NO: 241所示的肽的HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞中检测到SEQ ID NO: 4所示的目标肽特异性的IFNγ产生；然而，当与来自给予了式(5)所示的化合物的HLA-A2402转基因小鼠的脾细胞相比，其数量非常小。
由此，已经明确了本发明的式(5)所示的化合物能够有效地诱导SEQ ID NO: 2所示的肽特异性的CTL以及SEQ ID NO: 4所示的肽特异性的CTL。另一方面，SEQ ID NO: 240,241所示的含有肽间隔物的长链肽不能有效地诱导SEQ ID NO: 2所示的肽特异性的CTL以及SEQ ID NO: 4所示的肽特异性的CTL。
试验例 10
对于参考例3中合成的肽和实施例 6和9中合成的化合物(缀合物)，通过与试验例3中相同的方法进行溶解度测定。各溶解度示于表 66。
实施例 11 - 12
通过与实施例2中相同的方法，合成了由SEQ ID NO: 242 – 243的氨基酸序列组成的肽。质谱的结果示于表 67。表 67中记载的肽是本发明的化合物。
实施例13
通过与实施例1中相同的方法，合成了式10所示的各化合物(缀合物)。质谱的结果示于表 68，其中C与C之间的键是二硫键。
参考例12
通过与实施例1中相同的方法，合成了式11所示的各化合物(缀合物)。质谱的结果示于表 69，其中C与C之间的键是二硫键。表中记载的肽不是本发明的化合物，因此将其记载为参考例。
实施例14
式(12)所示的化合物的合成:
其中C与C之间的键是二硫键
步骤1. Fmoc-Cys(Mmt)-Ala-SBn (Mmt是4-甲氧基三苯甲基)的合成
(Fmoc-C(Mmt)A-SBn的合成)
将Fmoc-Cys(Mmt)-OH (4.80 g)、N,N-二异丙基乙胺 (2.56 mL)、六氟磷酸(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷子基鏻 (4.50 g)和通过已知方法(例如，Journal of OrganicChemistry, Vol. 64, No. 24 8761-8769)合成的H-Ala-SBn在氯仿 (20 ml)中的溶液在室温搅拌1 hr。将反应混合物通过柱色谱(洗脱溶剂，己烷/乙酸乙酯)纯化，得到目标化合物Fmoc-C(Mmt)A-SBn (2.80 g)。
步骤2. H-Cys(Mmt)-Ala-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH的合成
(C(Mmt)ACYTWNQMNL的合成)
将步骤1中所得的Fmoc-Cys(Mmt)-Ala-SBn(11mg)、通过已知方法(例如WO07/063903)合成的H-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH (21 mg)、N,N-二异丙基乙胺 (200 μL)、3,3’,3’’-膦烷三基三丙酸盐酸盐(1 mg)、4-巯基苯乙酸(1 mg)和0.1M 磷酸钠缓冲液 (pH 7.5, 200 μL)在 DMF (400 μL)中的溶液在室温搅拌4 hr。向该反应混合物添加二乙基胺(200 μL)并将该混合物进一步搅拌15 min。将反应混合物通过反相HPLC纯化，得到目标化合物 C(Mmt)ACYTWNQMNL (7 mg)。
质谱:LC-ESI/MS m/z=810.2 [M+2H]2+ (计算值=810.5)。
步骤3. (H-Cys(Mmt)-Ala-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH) (H-Cys-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH) 二硫键的合成
[即，式(13)所示化合物的合成:
其中C与C之间的键是二硫键。
将步骤2中所得的H-Cys(Mmt)-Ala-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH(51 mg)和实施例1, 步骤1中所得的(H-Cys(Npys)-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH (43 mg)在DMF (4 mL)中的溶液在室温搅拌2 hr。将反应混合物通过反相HPLC纯化，得到39 mg的目标化合物(H-Cys(Mmt)-Ala-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH) (H-Cys-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH) 二硫键 [即， 式(13)所示的化合物]。
质谱:LC-ESI/MS m/z=1414.4 [M+2H]2+ (计算值=1415.2)。
步骤4. H-Cys(SPy)-Asn-Lys-Arg-Tyr-Phe-Lys-Leu-Ser-His-Leu-Gln-Met-His-Ser-Arg-Lys-OH的合成
(C(SPy)NKRYFKLSHLQMHSRK的合成)
将参考例1中所得的H-Cys-Asn-Lys-Arg-Tyr-Phe-Lys-Leu-Ser-His-Leu-Gln-Met-His-Ser-Arg-Lys-OH (182 mg)和2,2’-联吡啶二硫化物(0.2M 异丙醇溶液, 544 μL)的20% w/w乙酸水(4 mL)溶液在室温搅拌17 hr。将反应混合物通过反相HPLC纯化，得到目标化合物H-Cys(SPy)-Asn-Lys-Arg-Tyr-Phe-Lys-Leu-Ser-His-Leu-Gln-Met-His-Ser-Arg-Lys-OH (177 mg)。
质谱:LC-ESI/MS m/z=1143.5 [M+2H]2+ (计算值=1142.9)。
步骤5. 式(12)所示的化合物的合成:
其中C与C之间的键是二硫键
将步骤3中所得的(H-Cys(Mmt)-Ala-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH)(H-Cys-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH) 二硫键[即，式(13)所示的化合物] (9 mg)、步骤4中所得的H-Cys(SPy)-Asn-Lys-Arg-Tyr-Phe-Lys-Leu-Ser-His-Leu-Gln-Met-His-Ser-Arg-Lys-OH (24 mg)和三异丙基硅烷(10 μL)在三氟乙酸(190 μL)中的溶液在室温搅拌1 hr。将反应混合物通过反相HPLC纯化，得到目标化合物即式12所示的化合物 (5 mg)。
质谱:LC-ESI/MS m/z=1577.2 [M+3H]3+ (计算值=1577.9)。
实施例 15 - 16
通过与实施例14中相同的方法，合成了式14或15所示的各化合物(缀合物)。质谱的结果示于表 70，其中C与C之间的键是二硫键。
参考例13
通过与实施例2中相同的方法，合成了由SEQ ID NO: 244的氨基酸序列组成的肽。表 71示出质谱的结果。表中记载的肽不是本发明的化合物，因此将其记载为参考例。
试验例 11
使用HLA-A0201转基因小鼠的体内CTL诱导能力的评价
对于实施例13中合成的式(10)所示的化合物，通过使用HLA-A0201转基因小鼠的体内CTL诱导试验来评价CTL诱导能力。式(10)所示的化合物:
其中C与C之间的键是二硫键；特别是上述式(1)的化合物，其中癌抗原肽A是RMFPNAPYL (SEQ ID NO:2)和癌抗原肽B是WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO:244)。RMFPNAPYL (SEQ ID NO:2)是HLA-A0201-限制性WT1肽，并且WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ IDNO:244)是MHC II类-限制性WT1肽 (即，辅助肽)。
HLA-A0201转基因小鼠如试验例 2和5中所记载。
式(10)所示的化合物的给药是否导致诱导对目标肽 (SEQ ID NO: 2)为特异性的CTL是基于下述再刺激所致的IFNγ产生的测定来判断，该再刺激是用肽 (SEQ ID NO: 2)对来自给予了式(10)所示的化合物的上述小鼠的脾细胞进行的再刺激。辅助肽(SEQ IDNO: 244)是否在活体中起作用是通过比较在将来自给予了式(10)所示的化合物的上述小鼠的脾细胞和来自给予了SEQ ID NO: 2所示的肽的上述小鼠的脾细胞用肽(SEQ ID NO:2)进行再刺激时的IFNγ产生细胞的数量来判断。
具体地，将SEQ ID NO: 2所示的化合物以80 mg/mL溶解于二甲基亚砜(DMSO)，进而用注射用水稀释至3 mg/mL，通过与等量的弗氏不完全佐剂(IFA)混合来进行乳化。将乳化的化合物以150 μg/处在小鼠尾根部的2处进行皮内给药。此外，将式(10)所示的化合物以80 mg/mL溶解于二甲基亚砜(DMSO)，进而用注射用水稀释至8.5 mg/mL，通过与等量的弗氏不完全佐剂 (IFA)混合来进行乳化。将乳化的化合物以425 μg/处在小鼠尾根部的2处进行皮内给药。将每一只小鼠的式(10)所示的化合物的给药量中所含的SEQ ID NO: 2的肽的摩尔数控制为与每一只小鼠的SEQ ID NO: 2所示的肽的给药量中所含的摩尔数相等。此外，将各乳液中所含的DMSO的浓度也设置到相同水平。一周后，将小鼠用CO2气体安乐死，分离脾脏并制备脾细胞。使用IFNγ ELISPOT 测定试剂盒用于测定IFNγ产生。在制备脾细胞的前一天，将ELISPOT板用抗-小鼠IFNγ抗体处理并在次日用含有10% FBS的RPMI1640培养基封闭。将制备的来自HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞以0.125×106 细胞/孔接种在进行了封闭的ELISPOT板上。将肽 (SEQ ID NO: 2)以40 mg/mL溶解于DMSO，进而用含有10% FBS的RPMI1640培养基稀释至40 μg/mL。将进行了稀释的肽 (SEQ ID NO: 2)以终浓度10 μg/mL添加至来自HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞。将添加有肽的脾细胞在37℃、5% CO2下培养19 hr，由此在体外进行肽再刺激。培养后，除去上清，依照所附操作规程使ELISPOT板显色。通过ImmunoSpot Analyzer (由C.T.L.制造)测定显色的斑点数目。
使用HLA-A0201转基因小鼠的IFNγ ELISPOT测定的结果示于图 17。图 17中，纵轴表示接种细胞中发生了反应的细胞数，并且横轴表示给药于小鼠的化合物或肽。图 17中，黑色条棒表示在用SEQ ID NO: 2所示的肽脉冲的同时培养来自HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞的结果，并且白色条棒表示没有脉冲的情形下的培养结果。即，黑色条棒与白色条棒的数值差异表示肽特异性CTL的数量，并且表示SEQ ID NO: 2所示的肽或式(10)所示的化合物的给药导致在小鼠体内诱导SEQ ID NO: 2所示的肽特异性的CTL。图17中，未检测到白色条棒的数值。这意味着HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞在没有用目标肽脉冲的情形下根本没有反应。作为该试验的结果，在来自HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞中检测到SEQ IDNO: 2所示的肽特异性的IFNγ产生。此外，图 17中，通过式(10)所示的化合物的给药诱导的SEQ ID NO: 2所示的肽特异性的IFNγ产生细胞的数量高于通过SEQ ID NO: 2所示的肽的给药诱导的肽特异性的IFNγ产生细胞的数量。
由上述明确了，式(10)所示的化合物可以诱导SEQ ID NO: 2所示的肽特异性的CTL。当给予了式(10)所示的化合物时，与SEQ ID NO: 2所示的肽的给药相比，观察到许多SEQ ID NO: 2所示的肽特异性的IFNγ产生细胞。据推测，由式(10)所示的化合物制造的SEQ ID NO: 244所示的辅助肽的反应性细胞的诱导增强了SEQ ID NO: 2所示的肽特异性的CTL。因此，这强烈暗示了式(10)所示的化合物在小鼠体内受到二硫键的切断和ERAP-1的适当修整，并且实际上被加工成SEQ ID NO: 2和244所示的肽。
即，明确了作为本发明化合物的一个实施方案的式(10)所示的化合物是其中不同的两种肽经由式(1)中所示的二硫键形成复合物的缀合物，并且是实际上能够在体内诱导CTL和辅助肽反应性细胞的WT1癌抗原肽缀合物疫苗。
比较例3
使用HLA-A0201转基因小鼠的体内CTL诱导能力的评价
对于参考例12中合成的式(11)所示的化合物，通过使用HLA-A0201转基因小鼠的体内CTL诱导试验来评价CTL诱导能力。式(11)所示的化合物:
其中C与C之间的键是二硫键；特别是上述式(1)的化合物，其中癌抗原肽A是RMFPNAPYL (SEQ ID NO:2)且癌抗原肽C是WAPVLDFAPPGASAYGSLC (SEQ ID NO:243)。RMFPNAPYL (SEQ ID NO:2)是HLA-A0201-限制性WT1肽，并且WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ IDNO:244)是MHC II类-限制性WT1肽 (即，辅助肽)。
HLA-A0201转基因小鼠如试验例 2和5中所记载。
式(11)所示的化合物的给药是否导致诱导对目标肽 (SEQ ID NO: 2)为特异性的CTL是基于下述再刺激所致的IFNγ产生的测定来判断，该再刺激是用肽 (SEQ ID NO: 2)对来自给予了式(11)所示的化合物的上述小鼠的脾细胞进行的再刺激。辅助肽(SEQ IDNO: 244)是否在活体中起作用是通过比较在将来自给予了式(11)所示的化合物的上述小鼠的脾细胞和来自给予了SEQ ID NO: 2所示的肽的上述小鼠的脾细胞用肽(SEQ ID NO:2)进行再刺激时的IFNγ产生细胞的数量来判断。
通过与试验例 11中相同的方法，进行CTL诱导试验。
使用HLA-A0201转基因小鼠的IFNγ ELISPOT测定的结果示于图 18。图 18中，纵轴表示接种细胞中发生了反应的细胞数，并且横轴表示给药于小鼠的化合物或肽。图 18中，黑色条棒表示在用SEQ ID NO: 2所示的肽脉冲的同时培养来自HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞的结果，并且白色条棒表示没有脉冲的情形下的培养结果。即，黑色条棒与白色条棒的数值差异表示肽特异性CTL的数量，并且表示SEQ ID NO: 2所示的肽或式(11)所示的化合物的给药导致在小鼠体内诱导SEQ ID NO: 2所示的肽特异性的CTL。图18中，未检测到白色条棒的数值。这意味着HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞在没有用目标肽脉冲的情形下根本没有反应。作为该试验的结果，在来自HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞中检测到SEQ IDNO: 2所示的肽特异性的IFNγ产生。另一方面，在图 18中，未能通过式(11)所示的化合物的给药检测到通过SEQ ID NO: 2所示的肽的给药诱导的SEQ ID NO: 2所示的肽特异性的IFNγ产生细胞的增加。
试验例 11和比较例3的结果暗示，当将WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 244)用作MHC II类-限制性WT1肽时，上述式(1)中作为癌抗原肽B的WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQID NO: 244)，与作为癌抗原肽C的WAPVLDFAPPGASAYGSLC (SEQ ID NO: 243)相比，是本发明的更优选的实施方案。
试验例 12
使用HLA-A0201转基因小鼠和HLA-A2402转基因小鼠的体内CTL诱导能力的评价
通过使用HLA-A0201转基因小鼠和HLA-A2402转基因小鼠的体内CTL诱导试验来评价实施例14中合成的式12所示的化合物的CTL诱导能力。式(12)所示的化合物中所含的RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2)是HLA-A0201-限制性WT1肽，CYTWNQMNL (SEQ ID NO:4)是HLA-A2402-限制性WT1肽，并且CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO:22)是MHC II类-限制性WT1肽(即，辅助肽)
其中C与C之间的键是二硫键。
HLA-A0201转基因小鼠和HLA-A2402转基因小鼠如试验例2和5中所记载。
式(12)所示的化合物的给药是否导致诱导对目标肽 (SEQ ID NO: 2, 4)为特异性的CTL是基于下述再刺激所致的IFNγ产生的测定来判断，该再刺激是用肽 (SEQ ID NO:2, 4)对来自给予了式(12)所示的化合物的上述小鼠的脾细胞进行的再刺激。辅助肽(SEQID NO: 22)是否在活体中起作用是通过比较在将来自给予了式(12)所示的化合物的上述小鼠的脾细胞和来自给予了式(5)所示的化合物的上述小鼠的脾细胞用肽(SEQ ID NO: 2,4)进行再刺激时的IFNγ产生细胞的数量来判断。
具体地，将式(5)所示的化合物以80 mg/mL溶解于二甲基亚砜(DMSO)，进而用注射用水稀释至3 mg/mL，通过与等量的Montanide ISA51VG混合来进行乳化。将乳化的化合物以150 μg/处在小鼠尾根部的2处进行皮内给药。此外，将式(12)所示的化合物以80 mg/mL溶解于二甲基亚砜(DMSO)，进而用注射用水稀释至6 mg/mL，通过与等量的MontanideISA51VG混合来进行乳化。将乳化的化合物以300 μg/处在小鼠尾根部的2处进行皮内给药。将每一只小鼠的式(12)所示的化合物的给药量中所含的式(5)所示的化合物的摩尔数控制为与每一只小鼠的式(5)所示的化合物的给药量中所含的摩尔数相等。此外，将各乳液中所含的DMSO的浓度也设置到相同水平。一周后，将小鼠用CO2气体安乐死，分离脾脏并制备脾细胞。使用IFNγ ELISPOT 测定试剂盒用于测定IFNγ产生。在制备脾细胞的前一天，将ELISPOT板用抗-小鼠IFNγ抗体处理并在次日用含有10% FBS的RPMI1640培养基封闭。将制备的来自HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞、以及来自HLA-A2402转基因小鼠的脾细胞各自以0.25×106 细胞/孔接种于进行了封闭的ELISPOT板。将肽 (SEQ ID NO: 2, 4)以40 mg/mL溶解于DMSO，进而用含有10% FBS的RPMI1640培养基稀释至40 μg/mL。将稀释的肽 (SEQ IDNO: 2)以终浓度10 μg/mL添加至来自HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞。另外，将稀释的肽(SEQ ID NO: 4)以终浓度10 μg/mL添加至来自HLA-A2402转基因小鼠的脾细胞。将添加有肽的脾细胞在37℃、5% CO2下培养17 hr，由此在体外进行肽再刺激。培养后，除去上清，依照所附操作规程使ELISPOT板显色。通过ImmunoSpot Analyzer (由C.T.L.制造)测定显色的斑点数目。
使用HLA-A0201转基因小鼠的IFNγ ELISPOT测定的结果示于图 19，使用HLA-A2402转基因小鼠的IFNγ ELISPOT测定的结果示于图 20。
在各附图中，纵轴表示接种细胞中发生了反应的细胞数。图 19中，黑色条棒和白色条棒表示在SEQ ID NO: 2所示的目标肽的存在或不存在的下培养来自HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞的结果，并且图 20中，黑色条棒和白色条棒表示在SEQ ID NO: 4所示的目标肽的存在或不存在的下培养来自HLA-A2402转基因小鼠的脾细胞的结果。即，黑色条棒和白色条棒的数值差异表示通过式(5)和式(12)所示的化合物的给药在小鼠体内诱导的目标的各肽特异性CTL的数量。
在各附图中，未检测到白色条棒的数值。这意味着各转基因小鼠的脾细胞在目标肽的不存在下并不反应。作为该试验的结果，在来自给予了式(5)和式(12)所示的化合物的HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞中检测到SEQ ID NO: 2所示的目标肽特异性的IFNγ产生，并且在来自给予了式(5)和式(12)所示的化合物的HLA-A2402转基因小鼠的脾细胞中检测到SEQ ID NO: 4所示的目标肽特异性的IFNγ产生。图 19中，通过式(12)所示的化合物的给药诱导的SEQ ID NO: 2所示的肽特异性的IFNγ产生细胞的数量高于通过式(5)所示的化合物的给药诱导的肽特异性的IFNγ产生细胞的数量。另一方面，图 20中，通过式(12)所示的化合物的给药诱导的SEQ ID NO: 4所示的肽特异性的IFNγ产生细胞的数量并未与通过式(5)所示的化合物的给药诱导的肽特异性的IFNγ产生细胞的数量有很大差异。
由上述明确了，式(12)所示的化合物可以诱导SEQ ID NO: 2, 4所示的肽特异性的CTL。当给予了式(12)所示的化合物时，与式（5）所示的化合物的给药相比，观察到许多SEQ ID NO: 2所示的肽特异性的IFNγ产生细胞。据推测，由式(12)所示的化合物制造的SEQ ID NO: 22所示的辅助肽的反应性细胞的诱导增强了SEQ ID NO: 2所示的肽特异性的CTL。式12所示的化合物的给药和式(5)所示的化合物的给药之间在SEQ ID NO: 4所示的肽特异性的IFNγ产生细胞的数量上没有很大差异据推测可归因于因为HLA-A2402转基因小鼠并不表达人MHC II类，所以没有诱导SEQ ID NO: 22所示的辅助肽的反应性细胞的缘故。因此，这强烈暗示了式(12)所示的化合物在小鼠体内受到二硫键的切断和ERAP-1的适当修整，并且实际上被加工成SEQ ID NO: 2, 4和22所示的肽。
即，明确了作为本发明化合物的一个实施方案的式(12)所示的化合物是其中不同的3种肽经由二硫键形成复合物的缀合物，并且是实际上能够在体内诱导CTL和辅助肽反应性细胞的WT1癌抗原肽缀合物疫苗。
试验例 13
使用HLA-A0201转基因小鼠和HLA-A2402转基因小鼠的体内CTL诱导能力的评价
通过使用HLA-A0201转基因小鼠和HLA-A2402转基因小鼠的体内CTL诱导试验来评价实施例15中合成的式(14)所示的化合物的CTL诱导能力。式(14)所示的化合物中所含的RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2)是HLA-A0201-限制性WT1肽，CYTWNQMNL (SEQ ID NO:4)是HLA-A2402-限制性WT1肽，WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO:244)是MHC II类-限制性WT1肽(即，辅助肽)，
其中C与C之间的键是二硫键。
HLA-A0201转基因小鼠和HLA-A2402转基因小鼠如试验例2和5中所记载。
式(14)所示的化合物的给药是否导致诱导对目标肽 (SEQ ID NO: 2, 4)为特异性的CTL是基于下述再刺激所致的IFNγ产生的测定来判断，该再刺激是用肽 (SEQ ID NO:2, 4)对来自给予了式(14)所示的化合物的上述小鼠的脾细胞进行的再刺激。辅助肽(SEQID NO: 244)是否在活体中起作用是通过比较在将来自给予了式(14)所示的化合物的上述小鼠的脾细胞和来自给予了式(5)所示的化合物的上述小鼠的脾细胞用肽(SEQ ID NO: 2)进行再刺激时的IFNγ产生细胞的数量来判断。
通过与试验例 12中相同的方法，进行CTL诱导试验。将式(14)所示的化合物以80mg/mL溶解于二甲基亚砜(DMSO)，用注射用水稀释到5.6 mg/mL，与等量的MontanideISA51VG混合，得到乳液。将乳化的化合物以280 μg/处在小鼠尾根部的2处进行皮内给药。
使用HLA-A0201转基因小鼠的IFNγ ELISPOT测定的结果示于图 21，使用HLA-A2402转基因小鼠的IFNγ ELISPOT测定的结果示于图 22。
在各附图中，纵轴表示接种细胞中发生了反应的细胞数。图 21中，黑色条棒和白色条棒表示在SEQ ID NO: 2所示的目标肽的存在或不存在的下培养来自HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞的结果，并且图 22中，黑色条棒和白色条棒表示在SEQ ID NO: 4所示的目标肽的存在或不存在的下培养来自HLA-A2402转基因小鼠的脾细胞的结果。即，黑色条棒和白色条棒的数值差异表示通过式(5)和(14)所示的化合物的给药在小鼠体内诱导的目标的各肽特异性CTL的数量。
在各附图中，未检测到白色条棒的数值。这意味着各转基因小鼠的脾细胞在目标肽的不存在下并不反应。作为该试验的结果，在来自给予了式(5)和(14)所示的化合物的HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞中检测到SEQ ID NO: 2所示的目标肽特异性的IFNγ产生，并且在来自给予了式(5)和(14)所示的化合物的HLA-A2402转基因小鼠的脾细胞中检测到SEQ ID NO: 4所示的目标肽特异性的IFNγ产生。图 21和22中，通过式(14)所示的化合物的给药诱导的SEQ ID NO: 2, 4所示的肽特异性的IFNγ产生细胞的数量高于通过式(5)所示的化合物的给药诱导的肽特异性的IFNγ产生细胞的数量。
由上述明确了，式(14)所示的化合物可以诱导SEQ ID NO: 2和4所示的肽特异性的CTL。据推测，由式(14)所示的化合物制造的SEQ ID NO: 244所示的辅助肽的反应性细胞的诱导增强了SEQ ID NO: 2所示的肽特异性的CTL的诱导, 并且与式(5)所示的化合物的给药相比，当给予式(14)所示的化合物时，观察到许多SEQ ID NO: 2所示的肽特异性的IFNγ产生细胞。另一方面，与式(5)所示的化合物的给药相比，当给予式(14)所示的化合物时，观察到许多SEQ ID NO: 4所示的肽特异性的IFNγ产生细胞。据推测，SEQ ID NO: 244所示的肽结合于HLA-A2402转基因小鼠中表达的小鼠MHC II类，从而诱导辅助肽的反应性细胞，这使得增强了SEQ ID NO: 4所示的肽的特异性CTL的诱导。因此，这强烈暗示了式(14)所示的化合物在小鼠体内受到二硫键的切断和ERAP-1的适当修整，并且实际上被加工成SEQ IDNO: 2, 4和244所示的肽。
即，明确了作为本发明化合物的一个实施方案的式(14)所示的化合物是其中不同的3种肽经由二硫键形成复合物的缀合物，并且是实际上能够在体内诱导CTL和辅助肽反应性细胞的WT1癌抗原肽缀合物疫苗。
试验例 14
使用HLA-A0201转基因小鼠的体内CTL诱导能力的评价
对于作为实施例1中合成的式(5)所示的化合物和参考例1中合成的SEQ ID NO:22所示的肽的混合物的混合疫苗，通过使用HLA-A0201转基因小鼠的体内CTL诱导试验来评价CTL诱导能力。式(5)所示的化合物中所含的RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2)是HLA-A0201-限制性WT1肽，CYTWNQMNL (SEQ ID NO:4)是HLA-A2402-限制性WT1肽，并且CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO:22)是MHC II类-限制性WT1肽 (即，辅助肽)，
其中C与C之间的键是二硫键。
HLA-A0201转基因小鼠如试验例 2和5中所记载。
式(5)所示的化合物的给药是否导致诱导对目标肽 (SEQ ID NO: 2)为特异性的CTL是基于下述再刺激所致的IFNγ产生的测定来判断，该再刺激是用肽 (SEQ ID NO: 2)对来自给予了式(5)所示的化合物的上述小鼠的脾细胞进行的再刺激。混合有式（5）的辅助肽(SEQ ID NO: 22)是否在活体中起作用是通过比较在将来自单独给予了式(5)所示的化合物的上述小鼠的脾细胞和来自给予了式(5)所示的化合物与SEQ ID NO: 22所示的肽的混合疫苗的上述小鼠的脾细胞用肽(SEQ ID NO: 2)进行再刺激时的IFNγ产生细胞的数量来判断。
具体地，将式(5)所示的化合物以80 mg/mL溶解于二甲基亚砜(DMSO)，进而用注射用水稀释至3 mg/mL，通过与等量的Montanide ISA51VG混合来进行乳化。将乳化的化合物以150 μg/处在小鼠尾根部的2处进行皮内给药。此外，将式(5)所示的化合物和SEQ ID NO:22所示的肽以80 mg/mL溶解于二甲基亚砜(DMSO)，用注射用水稀释并混合，以使对于稀释后的浓度而言，式(5)所示的化合物为3 mg/mL，SEQ ID NO: 22所示的肽为2.7 mg/mL。将进行了稀释的溶液与等量的Montanide ISA51VG混合，得到乳液。将含有150 μg/处的式(5)所示的化合物和137 μg/处的SEQ ID NO: 22所示的肽的混合疫苗在小鼠尾根部的2处进行皮内给药。将各乳液的DMSO浓度设置到相同水平。一周后，将小鼠用CO2气体安乐死，分离脾脏并制备脾细胞。使用IFNγ ELISPOT 测定试剂盒用于测定IFNγ产生。在制备脾细胞的前一天，将ELISPOT板用抗-小鼠IFNγ抗体处理并在次日用含有10% FBS的RPMI1640培养基封闭。将制备的来自HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞以0.25×106 细胞/孔接种在进行了封闭的ELISPOT板上。将肽 (SEQ ID NO: 2)以40 mg/mL溶解于DMSO，进而用含有10% FBS的RPMI1640培养基稀释至40 μg/mL。将进行了稀释的肽 (SEQ ID NO: 2)以终浓度10 μg/mL添加至来自HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞。将添加有肽的脾细胞在37℃、5% CO2下培养17hr，由此在体外进行肽再刺激。培养后，除去上清，依照所附操作规程使ELISPOT板显色。通过ImmunoSpot Analyzer (由C.T.L.制造)测定显色的斑点数目。
使用HLA-A0201转基因小鼠的IFNγ ELISPOT测定的结果示于图 23。
图23中，纵轴表示接种细胞中发生了反应的细胞数。图 23中，黑色条棒和白色条棒表示在SEQ ID NO: 2所示的目标肽的存在或不存在的下培养来自HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞的结果。即，黑色条棒和白色条棒的数值差异表示通过含有式(5)所示的化合物和辅助肽（SEQ ID NO: 22）的混合疫苗的给药在小鼠体内诱导的目标的各肽特异性CTL的数量。
图23中，未检测到白色条棒的数值。这意味着各转基因小鼠的脾细胞在目标肽的不存在下并不反应。作为该试验的结果，在来自单独给予了式(5)所示的化合物、以及给予了含有辅助肽 (SEQ ID NO: 22)的混合疫苗的HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞中，检测到SEQ ID NO: 2所示的目标肽特异性的IFNγ产生。图 23中，通过含有辅助肽 (SEQ ID NO:22)的混合疫苗的给药诱导的SEQ ID NO: 2所示的肽特异性的IFNγ产生细胞的数量高于通过单独给予式(5)所示的化合物诱导的肽特异性的IFNγ产生细胞的数量。
由上述明确了，含有式(5)所示的化合物和SEQ ID NO: 22所示的肽的混合疫苗可以诱导SEQ ID NO: 2所示的肽特异性的CTL。此外，与式(5)所示的化合物的单独给药相比，当给予混合疫苗时，观察到许多SEQ ID NO: 2所示的肽特异性的IFNγ产生细胞。据推测，含有在混合疫苗中的SEQ ID NO: 22所示的辅助肽的反应性细胞的诱导增强了SEQ ID NO:2所示的肽特异性的CTL的诱导。因此，明确了与式(5)所示的化合物的单独给药相比，含有式(5)所示的化合物和辅助肽的混合疫苗可以在小鼠体内强诱导CTL。
试验例 15
使用HLA-A0201转基因小鼠的体内CTL诱导能力的评价
对于实施例1中合成的式(5)所示的化合物和参考例13中合成的SEQ ID NO: 244所示的肽的混合疫苗的CTL诱导能力，通过使用HLA-A0201转基因小鼠的体内CTL诱导试验来评价。式(5)所示的化合物中所含的RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2)是HLA-A0201-限制性WT1肽，CYTWNQMNL (SEQ ID NO:4)是HLA-A2402-限制性WT1肽，并且WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQID NO:244)是MHC II类-限制性WT1肽 (即，辅助肽)，
其中C与C之间的键是二硫键。
HLA-A0201转基因小鼠如试验例2和5中所记载。
式(5)所示的化合物的给药是否导致诱导对目标肽 (SEQ ID NO: 2)为特异性的CTL是基于下述再刺激所致的IFNγ产生的测定来判断，该再刺激是用肽 (SEQ ID NO: 2)对来自给予了式(5)所示的化合物的上述小鼠的脾细胞进行的再刺激。混合有式（5）的辅助肽(SEQ ID NO: 244)是否在活体中起作用是通过比较在将来自单独给予了式(5)所示的化合物的上述小鼠的脾细胞和来自给予了式(5)所示的化合物与SEQ ID NO: 244所示的肽的混合疫苗的上述小鼠的脾细胞用肽(SEQ ID NO: 2)进行再刺激时的IFNγ产生细胞的数量来判断。
通过与试验例 14中相同的方法，进行CTL诱导试验。为了得到混合疫苗，将式(5)所示的化合物和SEQ ID NO: 244所示的肽以80 mg/mL溶解于二甲基亚砜(DMSO)，用注射用水稀释并混合，以使对于稀释后的浓度而言，式(5)所示的化合物为3 mg/mL，SEQ ID NO:244所示的肽为2.3 mg/mL。将进行了稀释的溶液与等量的Montanide ISA51VG混合，得到乳液。将含有150 μg/处的式(5)所示的化合物和115 μg/处的SEQ ID NO: 244所示的肽的混合疫苗在小鼠尾根部的2处进行皮内给药。
使用HLA-A0201转基因小鼠的IFNγ ELISPOT测定的结果示于图 24。
图24中，纵轴表示接种细胞中发生了反应的细胞数。图 24中，黑色条棒和白色条棒表示在SEQ ID NO: 2所示的目标肽的存在或不存在的下培养来自HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞的结果。即，黑色条棒和白色条棒的数值差异表示通过含有式(5)所示的化合物和辅助肽（SEQ ID NO: 244）的混合疫苗的给药在小鼠体内诱导的目标的各肽特异性CTL的数量。
图24中，未检测到白色条棒的数值。这意味着各转基因小鼠的脾细胞在目标肽的不存在下并不反应。作为该试验的结果，在来自单独给予了式(5)所示的化合物、以及给予了含有辅助肽 (SEQ ID NO: 244)的混合疫苗的HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞中，检测到SEQ ID NO: 2所示的目标肽特异性的IFNγ产生。图 24中，通过含有辅助肽 (SEQ ID NO:244)的混合疫苗的给药诱导的SEQ ID NO: 2所示的肽特异性的IFNγ产生细胞的数量高于通过单独给予式(5)所示的化合物诱导的肽特异性的IFNγ产生细胞的数量。
由上述明确了，含有式(5)所示的化合物和SEQ ID NO: 244所示的肽的混合疫苗可以诱导SEQ ID NO: 2所示的肽特异性的CTL。此外，与式(5)所示的化合物的单独给药相比，当给予混合疫苗时，观察到许多SEQ ID NO: 2所示的肽特异性的IFNγ产生细胞。据推测，含有在混合疫苗中的SEQ ID NO: 244所示的辅助肽的反应性细胞的诱导增强了SEQ IDNO: 2所示的肽特异性的CTL的诱导。因此，明确了与式(5)所示的化合物的单独给药相比，含有式(5)所示的化合物和辅助肽的混合疫苗可以在小鼠体内强诱导CTL。
作为制造含有两种WT1 抗原肽的疫苗的一个实施方案，可以提及含有作为单一制剂的两个不同的肽的混合疫苗。当制造混合疫苗时，要混合的癌抗原肽的性质带来一个问题。如表 60和表 66所示，两种WT1 抗原肽的混合物的制造意味着将具有不同的溶解度即性质的两种肽加工成一个制剂。相反，本发明的缀合物是一种化合物，其中两种WT1 抗原肽经由二硫键结合，并表现出单一的溶解度即性质。这意味着本发明的缀合物具有单一性质并且还如试验例 2中所示具有与两种WT1 抗原肽对应的性质。在这一方面，其表明本发明的缀合物是下述化合物，其能够诱导对两种WT1 抗原肽的响应而无需像混合疫苗那样考虑两种WT1 抗原肽之间的相互作用等。
试验例 16
使用HLA-A0201转基因小鼠的体内CTL诱导能力的评价
对于实施例1中合成的(5)所示的化合物和参考例2中合成的SEQ ID NO: 24所示的肽的混合疫苗的CTL诱导能力，通过使用HLA-A0201转基因小鼠的体内CTL诱导试验来评价。式(5)所示的化合物中所含的RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2)是HLA-A0201-限制性WT1肽，CYTWNQMNL (SEQ ID NO:4)是HLA-A2402-限制性WT1肽，并且CNKRYFKLSHLQMHSRKTG (SEQID NO:24)是MHC II类-限制性WT1肽 (即，辅助肽)，
其中C与C之间的键是二硫键。
HLA-A0201转基因小鼠如试验例2和5中所记载。
式(5)所示的化合物的给药是否导致诱导对目标肽 (SEQ ID NO: 2)为特异性的CTL是基于下述再刺激所致的IFNγ产生的测定来判断，该再刺激是用肽 (SEQ ID NO: 2)对来自给予了式(5)所示的化合物的上述小鼠的脾细胞进行的再刺激。混合有式（5）的辅助肽(SEQ ID NO: 24)是否在活体中起作用是通过比较在将来自单独给予了式(5)所示的化合物的上述小鼠的脾细胞和来自给予了式(5)所示的化合物与SEQ ID NO: 24所示的肽的混合疫苗的上述小鼠的脾细胞用肽(SEQ ID NO: 2)进行再刺激时的IFNγ产生细胞的数量来判断。
具体地，将式(5)所示的化合物以80 mg/mL溶解于二甲基亚砜(DMSO)，进而用注射用水稀释至3 mg/mL，通过与等量的Montanide ISA51VG混合来进行乳化。将乳化的化合物以150 μg/处在小鼠尾根部的2处进行皮内给药。此外，将式(5)所示的化合物和SEQ ID NO:24所示的肽以80 mg/mL溶解于二甲基亚砜(DMSO)，用注射用水稀释。将它们混合以使对于稀释后的浓度而言，式(5)所示的化合物为3 mg/mL，SEQ ID NO: 24所示的肽为3.11 mg/mL。将进行了稀释的溶液与等量的Montanide ISA51VG混合，得到乳液。将含有150 μg/处的式(5)所示的化合物和156 μg/处的SEQ ID NO: 24所示的肽的混合疫苗在小鼠尾根部的2处进行皮内给药。将各乳液的DMSO浓度设置到相同水平。一周后，将小鼠用CO2气体安乐死，分离脾脏并制备脾细胞。使用IFNγ ELISPOT 测定试剂盒用于测定IFNγ产生。在制备脾细胞的前一天，将ELISPOT板用抗-小鼠IFNγ抗体处理并在次日用含有10% FBS的RPMI1640培养基封闭。将制备的来自HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞以0.25×106 细胞/孔接种在进行了封闭的ELISPOT板上。将肽 (SEQ ID NO: 2) 以40 mg/mL溶解于DMSO，进而用含有10%FBS的RPMI1640培养基稀释至40 μg/mL。将稀释的肽 (SEQ ID NO: 2)以终浓度10μg/mL添加至来自HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞。将添加有肽的脾细胞在37℃、5% CO2下培养19hr，由此在体外进行肽再刺激。培养后，除去上清，依照所附操作规程使ELISPOT板显色。通过ImmunoSpot Analyzer (由C.T.L.制造)测定显色的斑点数目。
使用HLA-A0201转基因小鼠的IFNγ ELISPOT测定的结果示于图 25。
图25中，纵轴表示接种细胞中发生了反应的细胞数。图 25中，黑色条棒和白色条棒表示在SEQ ID NO: 2所示的目标肽的存在或不存在的下培养来自HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞的结果。即，黑色条棒和白色条棒的数值差异表示通过含有式(5)所示的化合物和辅助肽（SEQ ID NO: 24）的混合疫苗的给药在小鼠体内诱导的目标的各肽特异性CTL的数量。
图25中，未检测到白色条棒的数值。这意味着各转基因小鼠的脾细胞在目标肽的不存在下并不反应。作为该试验的结果，在来自单独给予了式(5)所示的化合物、以及给予了含有辅助肽 (SEQ ID NO: 24)的混合疫苗的HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞中，检测到SEQ ID NO: 2所示的目标肽特异性的IFNγ产生。图 25中，通过含有辅助肽 (SEQ ID NO:24)的混合疫苗的给药诱导的SEQ ID NO: 2所示的肽特异性的IFNγ产生细胞的数量高于通过单独给予式(5)所示的化合物诱导的肽特异性的IFNγ产生细胞的数量。
由上述明确了，含有式(5)所示的化合物和SEQ ID NO: 24所示的肽的混合疫苗可以诱导SEQ ID NO: 2所示的肽特异性的CTL。此外，与式(5)所示的化合物的单独给药相比，当给予混合疫苗时，观察到许多SEQ ID NO: 2所示的肽特异性的IFNγ产生细胞。据推测，含有在混合疫苗中的SEQ ID NO: 24所示的辅助肽的反应性细胞的诱导增强了SEQ ID NO:2所示的肽特异性的CTL的诱导。因此，明确了与式(5)所示的化合物的单独给药相比，含有式(5)所示的化合物和辅助肽的混合疫苗可以在小鼠体内强诱导CTL。
试验例 17
使用HLA-A0201转基因小鼠的体内CTL诱导能力的评价
实施例11中合成的SEQ ID NO: 242是在N-末端具有扩展半胱氨酸的SEQ ID NO:244所示的肽。试验例 15中的混合疫苗中的SEQ ID NO: 244表现出CTL诱导增强活性。在该试验中，对于实施例1中合成的(5)所示的化合物和SEQ ID NO: 242所示的肽的混合疫苗的CTL诱导能力，通过使用HLA-A0201转基因小鼠的体内CTL诱导试验来评价。式(5)所示的化合物中所含的RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2)是HLA-A0201-限制性WT1肽，CYTWNQMNL (SEQ IDNO:4)是HLA-A2402-限制性WT1肽，并且含有在CWAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 242)中的WAPVLDFAPPGASAYGSL(SEQ ID NO: 244)是MHC II类-限制性WT1肽 (即，辅助肽)，
其中C与C之间的键是二硫键。
HLA-A0201转基因小鼠如试验例2和5中所记载。
式(5)所示的化合物的给药是否导致诱导对目标肽 (SEQ ID NO: 2)为特异性的CTL是基于下述再刺激所致的IFNγ产生的测定来判断，该再刺激是用肽 (SEQ ID NO: 2)对来自给予了式(5)所示的化合物的上述小鼠的脾细胞进行的再刺激。混合有式（5）的辅助肽(SEQ ID NO: 242)是否在活体中起作用是通过比较在将来自单独给予了式(5)所示的化合物的上述小鼠的脾细胞和来自给予了式(5)所示的化合物与SEQ ID NO: 242所示的肽的混合疫苗的上述小鼠的脾细胞用肽(SEQ ID NO: 2)进行再刺激时的IFNγ产生细胞的数量来判断。
通过与试验例 16中相同的方法，进行CTL诱导试验。为了得到混合疫苗，将式(5)所示的化合物和SEQ ID NO: 242所示的肽以80 mg/mL溶解于二甲基亚砜(DMSO)，用注射用水稀释并混合，以使对于稀释后的浓度而言，式(5)所示的化合物为3 mg/mL，SEQ ID NO:242所示的肽为2.42 mg/mL。将进行了稀释的溶液与等量的Montanide ISA51VG混合，得到乳液。将含有150 μg/处的式(5)所示的化合物和121 μg/处的SEQ ID NO: 242所示的肽的混合疫苗在小鼠尾根部的2处进行皮内给药。
使用HLA-A0201转基因小鼠的IFNγ ELISPOT测定的结果示于图 26。
图26中，纵轴表示接种细胞中发生了反应的细胞数。图 26中，黑色条棒和白色条棒表示在SEQ ID NO: 2所示的目标肽的存在或不存在的下培养来自HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞的结果。即，黑色条棒和白色条棒的数值差异表示通过含有式(5)所示的化合物和辅助肽（SEQ ID NO: 242）的混合疫苗的给药在小鼠体内诱导的目标的各肽特异性CTL的数量。
图26中，未检测到白色条棒的数值。这意味着各转基因小鼠的脾细胞在目标肽的不存在下并不反应。作为该试验的结果，在来自单独给予了式(5)所示的化合物、以及给予了含有辅助肽 (SEQ ID NO: 242)的混合疫苗的HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞中，检测到SEQ ID NO: 2所示的目标肽特异性的IFNγ产生。图 26中，通过含有辅助肽 (SEQ ID NO:242)的混合疫苗的给药诱导的SEQ ID NO: 2所示的肽特异性的IFNγ产生细胞的数量高于通过单独给予式(5)所示的化合物诱导的肽特异性的IFNγ产生细胞的数量。
由上述明确了，含有式(5)所示的化合物和SEQ ID NO: 242所示的肽的混合疫苗可以诱导SEQ ID NO: 2所示的肽特异性的CTL。此外，与式(5)所示的化合物的单独给药相比，当给予混合疫苗时，观察到许多SEQ ID NO: 2所示的肽特异性的IFNγ产生细胞。据推测，含有在混合疫苗中的SEQ ID NO: 242所示的肽中所含的SEQ ID NO: 244所示的辅助肽的反应性细胞的诱导增强了SEQ ID NO: 2所示的肽特异性的CTL的诱导。因此，明确了与式(5)所示的化合物的单独给药相比，含有式(5)所示的化合物和辅助肽的混合疫苗可以在小鼠体内强诱导CTL。
试验例 18
使用HLA-A0201转基因小鼠的体内CTL诱导能力的评价
实施例12中合成的SEQ ID NO: 243是在N-末端具有扩展半胱氨酸的SEQ ID NO:244所示的肽。试验例 15中的混合疫苗中的SEQ ID NO: 244表现出CTL诱导增强活性。在该试验中，对于实施例1中合成的(5)所示的化合物和SEQ ID NO: 243所示的肽的混合疫苗的CTL诱导能力，通过使用HLA-A0201转基因小鼠的体内CTL诱导试验来评价。式(5)所示的化合物中所含的RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2)是HLA-A0201-限制性WT1肽，CYTWNQMNL (SEQ IDNO:4)是HLA-A2402-限制性WT1肽，并且含有在WAPVLDFAPPGASAYGSLC (SEQ ID NO: 243)中的 WAPVLDFAPPGASAYGSL(SEQ ID NO: 244)是MHC II类-限制性WT1肽 (即，辅助肽)，
其中C与C之间的键是二硫键。
HLA-A0201转基因小鼠如试验例2和5中所记载。
式(5)所示的化合物的给药是否导致诱导对目标肽 (SEQ ID NO: 2)为特异性的CTL是基于下述再刺激所致的IFNγ产生的测定来判断，该再刺激是用肽 (SEQ ID NO: 2)对来自给予了式(5)所示的化合物的上述小鼠的脾细胞进行的再刺激。混合有式（5）的辅助肽(SEQ ID NO: 243)是否在活体中起作用是通过比较在将来自单独给予了式(5)所示的化合物的上述小鼠的脾细胞和来自给予了式(5)所示的化合物与SEQ ID NO: 243所示的肽的混合疫苗的上述小鼠的脾细胞用肽(SEQ ID NO: 2)进行再刺激时的IFNγ产生细胞的数量来判断。
通过与试验例 16中相同的方法，进行CTL诱导试验。为了得到混合疫苗，将式(5)所示的化合物和SEQ ID NO: 243所示的肽以80 mg/mL溶解于二甲基亚砜(DMSO)，用注射用水稀释并混合，以使对于稀释后的浓度而言，式(5)所示的化合物为3 mg/mL，SEQ ID NO:243所示的肽为2.42 mg/mL。将进行了稀释的溶液与等量的Montanide ISA51VG混合，得到乳液。将含有150 μg/处的式(5)所示的化合物和121 μg/处的SEQ ID NO: 243所示的肽的混合疫苗在小鼠尾根部的2处进行皮内给药。
使用HLA-A0201转基因小鼠的IFNγ ELISPOT测定的结果示于图 27。
图27中，纵轴表示接种细胞中发生了反应的细胞数。图 27中，黑色条棒和白色条棒表示在SEQ ID NO: 2所示的目标肽的存在或不存在的下培养来自HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞的结果。即，黑色条棒和白色条棒的数值差异表示通过含有式(5)所示的化合物和辅助肽（SEQ ID NO: 243）的混合疫苗的给药在小鼠体内诱导的目标的各肽特异性CTL的数量。
图27中，未检测到白色条棒的数值。这意味着各转基因小鼠的脾细胞在目标肽的不存在下并不反应。作为该试验的结果，在来自单独给予了式(5)所示的化合物、以及给予了含有辅助肽 (SEQ ID NO: 243)的混合疫苗的HLA-A0201转基因小鼠的脾细胞中，检测到SEQ ID NO: 2所示的目标肽特异性的IFNγ产生。图 27中，通过含有辅助肽 (SEQ ID NO:243)的混合疫苗的给药诱导的SEQ ID NO: 2所示的肽特异性的IFNγ产生细胞的数量高于通过单独给予式(5)所示的化合物诱导的肽特异性的IFNγ产生细胞的数量。
由上述明确了，含有式(5)所示的化合物和SEQ ID NO: 243所示的肽的混合疫苗可以诱导SEQ ID NO: 2所示的肽特异性的CTL。此外，与式(5)所示的化合物的单独给药相比，当给予混合疫苗时，观察到许多SEQ ID NO: 2所示的肽特异性的IFNγ产生细胞。据推测，含有在混合疫苗中的SEQ ID NO: 243所示的肽中所含的SEQ ID NO: 244所示的辅助肽的反应性细胞的诱导增强了SEQ ID NO: 2所示的肽特异性的CTL的诱导。因此，明确了与式(5)所示的化合物的单独给药相比，含有式(5)所示的化合物和辅助肽的混合疫苗可以在小鼠体内强诱导CTL。
作为制造含有两种WT1 抗原肽的疫苗的一个实施方案，可以提及含有作为单一制剂的两个不同的肽的混合疫苗。当制造混合疫苗时，要混合的癌抗原肽的性质带来一个问题。如表 60和表 66所示，两种WT1 抗原肽的混合物的制造意味着将具有不同的溶解度即性质的两种肽加工成一个制剂。相反，本发明的缀合物是一种化合物，其中两种WT1 抗原肽经由二硫键结合，并表现出单一的溶解度即性质。这意味着本发明的缀合物具有单一性质并且还如试验例 2中所示具有与两种WT1 抗原肽对应的性质。在这一方面，其表明本发明的缀合物是下述化合物，其能够诱导对两种WT1 抗原肽的响应而无需像混合疫苗那样考虑两种WT1 抗原肽之间的相互作用等。
试验例 19
在过滤器过滤后使用HLA-A2402转基因小鼠评价体内CTL诱导能力
将经由二硫键形成的SEQ ID NO: 4所示的同型二聚体和式(5)所示的化合物以3-10 mg/mL溶解于注射用水。以CTL诱导活性作为指标，使用HLA-A2402转基因小鼠 (C57BL/6CrHLA-A2402/Kb)来评价各化合物的药理学活性。为了对HLA-A2402转基因小鼠给药，将化合物溶解于注射用水，通过使用低蛋白结合的过滤器(用于注射剂的灭菌处理的级别的膜过滤器)的过滤进行灭菌，与弗氏不完全佐剂混合，得到乳液。
将该乳化的化合物皮内给药至HLA-A2402转基因小鼠的尾根部。一周后，将该小鼠用CO2气体安乐死，分离脾脏或腹股沟淋巴结，制备脾细胞或淋巴结细胞。使用IFNγELISPOT 测定试剂盒用于测定IFNγ产生。在制备细胞的前一天，将ELISPOT板用抗-小鼠IFNγ抗体处理并在次日用含有10% FBS的RPMI1640培养基封闭。将制备的来自小鼠的细胞接种于进行了封闭的ELISPOT板。将肽 (SEQ ID NO: 4) 以40 mg/mL溶解于DMSO，进而用含有10% FBS的RPMI1640培养基稀释至40 μg/mL。将稀释的肽 (SEQ ID NO: 4)以终浓度10 μg/mL添加至来自HLA-A2402转基因小鼠的脾细胞或淋巴结细胞。将添加有肽的细胞在37℃,5% CO2下培养16-20 hr，由此在体外进行肽再刺激。培养后，除去上清，依照所附操作规程使ELISPOT板显色。通过ImmunoSpot Analyzer (由C.T.L.制造)测定显色的斑点数目。
产业实用性
本发明的化合物可用作有效地诱导CTL并且容易制造的癌疫苗的活性成分。本申请基于在日本提交的专利申请No.2013-072173 (申请日: 2013年3月29日)和2013-158383(申请日: 2013年7月31日)，将其全部内容并入本说明书。
序列表
<110> Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd.
International Institute of Cancer Immunology, Inc.
<120> WT1抗原肽缀合物疫苗
<130> 672495
<150> JP 2013-072173
<151> 2013-03-29
<150> JP 2013-158383
<151> 2013-07-31
<160> 244
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 449
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro
1 5 10 15
Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala
20 25 30
Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr
35 40 45
Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro
50 55 60
Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly
65 70 75 80
Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe
85 90 95
Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe
100 105 110
Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe
115 120 125
Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile
130 135 140
Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr
145 150 155 160
Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe
165 170 175
Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln
180 185 190
Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser
195 200 205
Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp
210 215 220
Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln
225 230 235 240
Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser
245 250 255
Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Ser Thr Gly Tyr Glu
260 265 270
Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile
275 280 285
His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro
290 295 300
Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys
305 310 315 320
Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys
325 330 335
Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro
340 345 350
Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp
355 360 365
Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln
370 375 380
Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr
385 390 395 400
His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys
405 410 415
Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val
420 425 430
Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala
435 440 445
Leu
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 2
Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 3
Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu
1 5
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 4
Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu
1 5
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 5
Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
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Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val
1 5
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 7
Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu
1 5
<210> 8
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 8
Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His
1 5 10 15
<210> 9
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 9
Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu
20 25 30
<210> 10
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 10
Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His
1 5 10 15
Ser Arg Lys His Thr Gly
20
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<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 11
Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys
1 5 10 15
Leu Glu Ser
<210> 12
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 12
Ser Gly Gln Ala Tyr Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys
1 5 10 15
Leu Glu Ser
<210> 13
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 13
Cys Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu
1 5 10
<210> 14
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 14
Cys Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu
1 5 10
<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 15
Cys Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu
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<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
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Cys Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu
1 5 10
<210> 17
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 17
Cys Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val
1 5 10
<210> 18
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 18
Cys Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu
1 5 10
<210> 19
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 19
Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys
1 5 10 15
<210> 20
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 20
Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His
1 5 10 15
Ser Arg Lys
<210> 21
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 21
Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His
1 5 10 15
Ser Arg Lys His
20
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 22
Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg
1 5 10 15
Lys
<210> 23
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 23
Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg
1 5 10 15
Lys His
<210> 24
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 24
Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg
1 5 10 15
Lys His Thr Gly
20
<210> 25
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 25
Ser Gly Gln Ala Tyr Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys
1 5 10 15
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 26
Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
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<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
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Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 29
Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala
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<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 30
Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val
1 5
<210> 31
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 31
Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala
1 5
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 32
Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu
1 5
<210> 33
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 33
Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val
1 5
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 34
Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala
1 5
<210> 35
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 35
Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala
1 5
<210> 36
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 36
Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala Gln Trp
1 5
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 37
Ser Gly Ala Ala Gln Trp Ala Pro Val
1 5
<210> 38
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 38
Gly Ala Ala Gln Trp Ala Pro Val Leu
1 5
<210> 39
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 39
Ala Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe
1 5
<210> 40
<211> 9
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<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 40
Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala
1 5
<210> 41
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 41
Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala
1 5
<210> 42
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 42
Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser
1 5
<210> 43
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 43
Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala
1 5
<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 44
Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr
1 5
<210> 45
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 45
Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala
1 5
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 46
Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Ser Phe
1 5
<210> 47
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 47
Pro Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile
1 5
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 48
Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys
1 5
<210> 49
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 49
Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp
1 5
<210> 50
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 50
Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala
1 5
<210> 51
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 51
Gly Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys
1 5
<210> 52
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 52
Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu
1 5
<210> 53
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 53
Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser
1 5
<210> 54
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 54
Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala
1 5
<210> 55
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 55
His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe
1 5
<210> 56
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 56
Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr
1 5
<210> 57
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 57
Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val
1 5
<210> 58
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 58
Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe
1 5
<210> 59
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 59
Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe
1 5
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 60
Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr
1 5
<210> 61
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 61
Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala
1 5
<210> 62
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 62
Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala
1 5
<210> 63
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 63
Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys
1 5
<210> 64
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 64
Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg
1 5
<210> 65
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 65
Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr
1 5
<210> 66
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 66
Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe
1 5
<210> 67
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 67
Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro
1 5
<210> 68
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 68
Gly Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro Ser
1 5
<210> 69
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 69
Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg
1 5
<210> 70
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 70
Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met
1 5
<210> 71
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 71
Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe
1 5
<210> 72
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 72
Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala
1 5
<210> 73
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 73
Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr
1 5
<210> 74
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 74
Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser
1 5
<210> 75
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 75
Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu
1 5
<210> 76
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 76
Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile
1 5
<210> 77
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 77
Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg
1 5
<210> 78
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 78
Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg Asn
1 5
<210> 79
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 79
Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln
1 5
<210> 80
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 80
Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr
1 5
<210> 81
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 81
Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr
1 5
<210> 82
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 82
Ile Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val
1 5
<210> 83
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 83
Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe
1 5
<210> 84
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 84
Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr
1 5
<210> 85
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 85
Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala
1 5
<210> 86
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 86
Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe
1 5
<210> 87
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 87
Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn
1 5
<210> 88
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 88
Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe
1 5
<210> 89
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 89
Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe Lys
1 5
<210> 90
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 90
His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met
1 5
<210> 91
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 91
Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln
1 5
<210> 92
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 92
Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser
1 5
<210> 93
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 93
Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu
1 5
<210> 94
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 94
Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr
1 5
<210> 95
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 95
Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val
1 5
<210> 96
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 96
Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr
1 5
<210> 97
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 97
Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys
1 5
<210> 98
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 98
Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr
1 5
<210> 99
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 99
Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser
1 5
<210> 100
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 100
Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala
1 5
<210> 101
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 101
Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu
1 5
<210> 102
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 102
Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu
1 5
<210> 103
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 103
Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu
1 5
<210> 104
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 104
Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg
1 5
<210> 105
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 105
Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr
1 5
<210> 106
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 106
Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr
1 5
<210> 107
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 107
Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn
1 5
<210> 108
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 108
Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu
1 5
<210> 109
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 109
Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr
1 5
<210> 110
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 110
Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met
1 5
<210> 111
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 111
Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr
1 5
<210> 112
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 112
Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser
1 5
<210> 113
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 113
Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu
1 5
<210> 114
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 114
Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys
1 5
<210> 115
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 115
Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met
1 5
<210> 116
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 116
Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp
1 5
<210> 117
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 117
Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln
1 5
<210> 118
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 118
Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln Met
1 5
<210> 119
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 119
Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu
1 5
<210> 120
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 120
Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys
1 5
<210> 121
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 121
Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val
1 5
<210> 122
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 122
Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala
1 5
<210> 123
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 123
Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala
1 5
<210> 124
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 124
Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val
1 5
<210> 125
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 125
Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys
1 5
<210> 126
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 126
Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys Trp
1 5
<210> 127
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 127
Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Ser
1 5
<210> 128
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 128
Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Ser Thr
1 5
<210> 129
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 129
Gly Gln Ser Asn His Ser Thr Gly Tyr
1 5
<210> 130
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 130
Thr Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr
1 5
<210> 131
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 131
Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Thr
1 5
<210> 132
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 132
Glu Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile
1 5
<210> 133
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 133
Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu
1 5
<210> 134
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 134
His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala
1 5
<210> 135
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 135
Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr
1 5
<210> 136
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 136
Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg
1 5
<210> 137
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 137
Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile
1 5
<210> 138
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 138
Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val
1 5
<210> 139
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 139
Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe
1 5
<210> 140
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 140
Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg
1 5
<210> 141
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 141
His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile
1 5
<210> 142
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 142
Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val
1 5
<210> 143
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 143
Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg
1 5
<210> 144
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 144
Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg
1 5
<210> 145
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 145
Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val
1 5
<210> 146
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 146
Gln Asp Val Arg Arg Val Pro Gly Val
1 5
<210> 147
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 147
Asp Val Arg Arg Val Pro Gly Val Ala
1 5
<210> 148
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 148
Arg Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr
1 5
<210> 149
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 149
Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu Val
1 5
<210> 150
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 150
Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala
1 5
<210> 151
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 151
Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr
1 5
<210> 152
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 152
Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys
1 5
<210> 153
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 153
Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg
1 5
<210> 154
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 154
Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg Pro Phe
1 5
<210> 155
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 155
Glu Thr Ser Glu Lys Arg Pro Phe Met
1 5
<210> 156
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 156
Thr Ser Glu Lys Arg Pro Phe Met Cys
1 5
<210> 157
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 157
Ser Glu Lys Arg Pro Phe Met Cys Ala
1 5
<210> 158
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 158
Glu Lys Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr
1 5
<210> 159
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 159
Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys
1 5
<210> 160
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 160
Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg
1 5
<210> 161
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 161
Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr
1 5
<210> 162
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 162
Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe
1 5
<210> 163
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 163
Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu
1 5
<210> 164
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 164
Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu
1 5
<210> 165
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 165
Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met
1 5
<210> 166
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 166
Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg
1 5
<210> 167
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 167
Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr
1 5
<210> 168
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 168
His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys
1 5
<210> 169
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 169
Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr
1 5
<210> 170
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 170
His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Gln Cys
1 5
<210> 171
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 171
Gly Glu Lys Pro Tyr Gln Cys Asp Phe
1 5
<210> 172
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 172
Lys Pro Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp
1 5
<210> 173
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 173
Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg
1 5
<210> 174
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 174
Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe
1 5
<210> 175
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 175
Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg
1 5
<210> 176
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 176
Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp Gln Leu
1 5
<210> 177
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 177
Arg Phe Ser Arg Ser Asp Gln Leu Lys
1 5
<210> 178
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 178
Phe Ser Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg
1 5
<210> 179
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 179
Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln
1 5
<210> 180
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 180
Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg
1 5
<210> 181
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 181
Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly
1 5
<210> 182
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 182
Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val
1 5
<210> 183
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 183
His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys
1 5
<210> 184
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 184
Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe
1 5
<210> 185
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 185
Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys Thr
1 5
<210> 186
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 186
Phe Gln Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys
1 5
<210> 187
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 187
Gln Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe
1 5
<210> 188
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 188
Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg
1 5
<210> 189
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 189
Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser
1 5
<210> 190
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 190
Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His
1 5
<210> 191
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 191
Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu
1 5
<210> 192
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 192
Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys
1 5
<210> 193
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 193
Arg Ser Asp His Leu Lys Thr His Thr
1 5
<210> 194
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 194
Asp His Leu Lys Thr His Thr Arg Thr
1 5
<210> 195
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 195
His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr
1 5
<210> 196
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 196
Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe
1 5
<210> 197
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 197
Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys
1 5
<210> 198
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 198
Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg
1 5
<210> 199
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 199
Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg Trp
1 5
<210> 200
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 200
Lys Pro Phe Ser Cys Arg Trp Pro Ser
1 5
<210> 201
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 201
Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys
1 5
<210> 202
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 202
Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys
1 5
<210> 203
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 203
Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe
1 5
<210> 204
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 204
Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala
1 5
<210> 205
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 205
Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg
1 5
<210> 206
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 206
Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser
1 5
<210> 207
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 207
Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu
1 5
<210> 208
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 208
Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val
1 5
<210> 209
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 209
Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg
1 5
<210> 210
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 210
Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His
1 5
<210> 211
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 211
Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His His
1 5
<210> 212
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 212
Ser Asp Glu Leu Val Arg His His Asn
1 5
<210> 213
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 213
Asp Glu Leu Val Arg His His Asn Met
1 5
<210> 214
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 214
Val Arg His His Asn Met His Gln Arg
1 5
<210> 215
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 215
Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn
1 5
<210> 216
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 216
His His Asn Met His Gln Arg Asn Met
1 5
<210> 217
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 217
Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys
1 5
<210> 218
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 218
Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu
1 5
<210> 219
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 219
Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His His Asn
1 5 10 15
Met His Gln Arg Asn
20
<210> 220
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 220
Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu
1 5
<210> 221
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 221
Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala
1 5
<210> 222
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 222
Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala Leu
1 5
<210> 223
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 223
Arg Tyr Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu
1 5
<210> 224
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 224
Phe Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu
1 5
<210> 225
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 225
Arg Leu Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu
1 5
<210> 226
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 226
Arg Met Met Pro Asn Ala Pro Tyr Leu
1 5
<210> 227
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 227
Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Val
1 5
<210> 228
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 228
Tyr Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu
1 5
<210> 229
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa is Ser or Ala
<400> 229
Xaa Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu
1 5
<210> 230
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa is selected from the group consisting of Ser, Ala, Abu,Arg,
Lys, Orn, Cit, Leu, Phe and Asn
<400> 230
Xaa Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu
1 5
<210> 231
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 231
Ala Tyr Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu
1 5
<210> 232
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 232
Phe Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val
1 5
<210> 233
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 233
Ser Met Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val
1 5
<210> 234
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 234
Ser Leu Met Glu Gln Gln Tyr Ser Val
1 5
<210> 235
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 235
Arg Tyr Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu
1 5
<210> 236
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 236
Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg Asn
1 5 10
<210> 237
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 肽
<400> 237
Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro
1 5 10 15
Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu
20
<210> 238
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 238
Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met
1 5 10 15
Asn Leu
<210> 239
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 239
Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro
1 5 10 15
Tyr Leu
<210> 240
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 240
Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Cys
1 5 10 15
Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu
20
<210> 241
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 241
Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg
1 5 10 15
Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu
20
<210> 242
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 242
Cys Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr
1 5 10 15
Gly Ser Leu
<210> 243
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 243
Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly
1 5 10 15
Ser Leu Cys
<210> 244
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 244
Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly
1 5 10 15
Ser Leu

Claims (20)

1.式(1)所示的化合物或其药学上可接受的盐，
其中Xa和Ya各自为单键，
癌抗原肽A是由选自下述氨基酸序列中的任意氨基酸序列组成的肽:
RMFPNAPYL (SEQ ID NO:2)，
ALLPAVPSL (SEQ ID NO:5)，
SLGEQQYSV (SEQ ID NO:6) 和
RVPGVAPTL (SEQ ID NO:7)，
癌抗原肽A的N-末端氨基酸的氨基与式(1)中的Ya结合，并且癌抗原肽A的C-末端氨基酸的羰基与式(1)中的羟基结合，
R1是癌抗原肽C，
癌抗原肽C具有不同于癌抗原肽A的序列的序列，该癌抗原肽C是由选自下述氨基酸序列中的任意氨基酸序列组成的肽:
CMTWNQMNL (SEQ ID NO:3) 和
CYTWNQMNL (SEQ ID NO:4)，
并且癌抗原肽C的半胱氨酸残基的硫醚基与式(1)中的硫醚基结合。
2.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中式(1)所示的化合物是式(4)所示的化合物:
其中C与C之间的键是二硫键。
3.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中式(1)所示的化合物是式(5)所示的化合物:
其中C与C之间的键是二硫键。
4.组合物，其包含根据权利要求1-3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述组合物包含：选自式(4)所示的化合物和式(5)所示的化合物中的化合物，
其中C与C之间的键是二硫键，
其中C与C之间的键是二硫键；以及
至少一个由选自下述氨基酸序列中的氨基酸序列组成的肽:
CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO:22)，
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO:23)，
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO:24)，
WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO:244)，
CWAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO:242) 和
WAPVLDFAPPGASAYGSLC (SEQ ID NO:243)。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述组合物包含式(4)所示的化合物：
其中C与C之间的键是二硫键。
7.根据权利要求5所述的组合物，其中所述组合物包含式(5)所示的化合物：
其中C与C之间的键是二硫键。
8.根据权利要求4-7中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含至少一个由选自下述氨基酸序列中的氨基酸序列组成的肽:
WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO:244)，
CWAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO:242) 和
WAPVLDFAPPGASAYGSLC (SEQ ID NO:243)。
9.组合物，其包含：式(4)所示的化合物：
其中C与C之间的键是二硫键，和
由氨基酸序列WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO:244)组成的肽。
10.组合物，其包含：式(5)所示的化合物：
其中C与C之间的键是二硫键，和
由氨基酸序列WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO:244)组成的肽。
11.药物组合物，其包含根据权利要求1-3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或根据权利要求4-10中任一项所述的组合物、和药学上可接受的载体。
12.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含式(4)所示的化合物：
其中C与C之间的键是二硫键。
13.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含式(5)所示的化合物：
其中C与C之间的键是二硫键。
14.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含：式(4)所示的化合物：
其中C与C之间的键是二硫键，和
由氨基酸序列WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO:244)组成的肽。
15.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含：式(5)所示的化合物：
其中C与C之间的键是二硫键，和
由氨基酸序列WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO:244)组成的肽。
16.根据权利要求11-15中任一项所述的药物组合物，其用于治疗表达WT1基因的癌或与WT1基因表达水平增加相关的癌。
17.根据权利要求11-15中任一项所述的药物组合物，其用于在癌的细胞免疫疗法中诱导CTL。
18.根据权利要求11-15中任一项所述的药物组合物，其用作癌疫苗。
19.根据权利要求16-18中任一项所述的药物组合物，其中所述癌是：选自白血病、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤和恶性淋巴瘤的血液癌；或选自胃癌、大肠癌、肺癌、乳腺癌、生殖细胞癌、肝癌、皮肤癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌、卵巢癌和脑肿瘤的实体癌。
20.制备式(1)所示的化合物的方法，包括在添加于癌抗原肽A的N-末端的半胱氨酸残基和癌抗原肽C的半胱氨酸残基之间形成二硫键，其中
所述癌抗原肽A是由选自下述氨基酸序列中的氨基酸序列组成的肽：
RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2)，
ALLPAVPSL (SEQ ID NO: 5)，
SLGEQQYSV (SEQ ID NO: 6)，和
RVPGVAPTL (SEQ ID NO: 7)；和
所述癌抗原肽C是由选自下述氨基酸序列中的氨基酸序列组成的肽：
CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 3)，和
CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 4)。
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