WO2021117771A1 - ペプチドエマルション製剤の調製方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】所望のペプチドエマルション製剤を調製することのできる、ペプチドエマルション製剤の調製方法を提供する。 【解決手段】ペプチドエマルション製剤を調製する方法であって、式（１）で表されるアミノ酸配列からなる化合物、またはその薬学上許容される塩、および、ＷＡＰＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳＡＹＧＳＬ（配列番号：１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、またはその薬学上許容される塩を含む水溶液と、油性製剤とを混合してから振動撹拌を付与する工程と、前記振動撹拌後の予備混合液を、膜型フィルターに通過させて乳化させる膜乳化工程とを含むペプチドエマルション製剤の調製方法。

Description

ペプチドエマルション製剤の調製方法
　本発明は、ペプチドエマルション製剤の調製方法に関する。
　互いに混じり合わない２種の液体の一方を、微粒子にして他方に分散させることを「乳化」といい、この乳化により、互いに混じり合わない２種の液体の一方が、他の液体中に微粒子状で分散した製剤を、エマルション製剤という。このエマルション製剤は、食品業界、農薬業界、化粧品業界などで広く使用され、医薬品業界においても外用剤、経口剤、注射剤としてしばしば用いられる。上記エマルション製剤は特に、連続相が油で、非連続相が水滴である場合をＷ／Ｏ型エマルション製剤と呼び、連続相が水で、非連続相が油滴である場合をＯ／Ｗ型エマルション製剤と呼ぶ。
　医薬品業界では、その目的に応じてＷ／Ｏ型エマルション製剤とＯ／Ｗ型エマルション製剤が使い分けられ、多くの場合、いずれかの形態として維持されることは薬効、安全性、品質の観点から非常に重要である。特に、親水性ペプチドやタンパク質のような親水性の薬物を油中に分散させる際にはＷ／Ｏ型エマルション製剤が用いられることが多い。
　Ｗ／Ｏ型エマルション製剤を調製する方法として、例えば、連続相の液体に、非連続相形成のための液体を、ピストン等で圧入して分散させる方法、多孔体を介して連続相の液体に非連続相形成のための液体をピストン等で圧入して分散させる方法、複数の薬液の混合液を２つのシリンジ間を交互に往復移動させるといった方法が挙げられる。
　例えば特許文献１には、フィルター部を有し、前記フィルター部が、第１および第２メッシュ部と繊維とによって構成されており、前記繊維が、第１メッシュ部と第２メッシュ部との間の空間内に充填されて繊維集合体を構成している、ことを特徴とするエマルション調製用デバイスが示されている。また特許文献２には、乳化装置が設備されていない場所、例えば、一般の家庭においても簡便にエマルション調製を行うことができるエマルション調製用デバイスとして、ポンプ式容器が連通可能に形成された導管部に多孔体を設けたことを特徴とするエマルション調製用デバイスが示されている。特には、掌中でエマルションを調製できるデバイスであって、
（ａ）コネクタ同士を突き合わせた間に円盤状の多孔体を挟んでおり、
（ｂ）両側に注射用シリンジが接続可能であり、
（ｃ）上記多孔体が親水性のとき、Ｏ／Ｗ型エマルションを生成することが可能であり、
（ｄ）或いは上記多孔体が疎水性のとき、Ｗ／Ｏ型エマルションを調製することが可能である
ことを特徴とするエマルション調製用デバイスが示されている。
　特許文献３には、均一な孔径を有する多孔質膜の孔径に対して、１～２０倍の平均粒子径を有する乳化油脂組成物を予め作成し、該乳化油脂組成物を、前記均一な孔径を有する多孔質膜に通過させることで、再乳化する乳化油脂組成物の製造方法が示されている。また特許文献４には、径を均一かつ任意に制御することのできるエマルション粒子の簡単な製造方法として、分散相となるべき液体を、均一な細孔径を有するミクロ多孔膜体を通して連続相となるべき液体中に圧入するエマルションの製造方法が示されている。
　更に特許文献５には、少なくとも生理活性ペプチド水溶液とオイルアジュバントを含み、生理活性ペプチド水溶液に対するオイルアジュバントの含有割合が０．５～５容量倍である混合液を調製し；当該混合液を、コネクタにより連結された２個のシリンジ間で移動させることを特徴とする生理活性ペプチドエマルション製剤の調製方法が示されている。
国際公開第２０１３／１３３２０９号公報 特開２００５－１８６０２６号公報 特開平０６－０３９２５９号公報 特開平０２－０９５４３３号公報 国際公開第２００７／０８３７６３号公報
　上述の通り、薬液を乳化させる方法は幾つか提案されている。しかしペプチドを含む薬液を用いる場合、薬液に含まれるペプチドの種類によっては、乳化させることができず、仮に乳化させることができても、ペプチドエマルション製剤に調製後、分離しやすいといった問題がある。エマルションを得るべく従来の方法を採用した場合、エマルションを調製できず、また調製したエマルションが不安定であったり、工程が非常に煩雑であったりすることから、短時間でより簡便に安定したエマルションを得ることが求められている。
　更に、特許文献３では予備乳化のために撹拌型の乳化機、例えばケミスターラーあるいはホモミキサー等を使用している。しかし、フィルター部または多孔体由来の不純物をできる限り軽減すべきという衛生上の観点、また作業性向上の観点から、近年では、薬液中に撹拌子を浸漬させることなく撹拌することが求められており、ディスポーザブルの調製器具を用いて簡便に調製することが求められている。
　本発明は、これらの事情に鑑みてなされたものであって、その目的は、所望のペプチドエマルション製剤を調製する方法、好ましくは、所望のペプチドエマルション製剤を簡便にかつ短時間で調製することのできる方法を提供することにある。
　本発明者らは、所望のペプチドを含むペプチドエマルション製剤を調製する方法について鋭意研究を行った結果、２種のペプチドを含む水溶液と、油性製剤とを混合してから振動撹拌を付与する工程と、前記振動撹拌後の予備混合液を、膜型フィルターに通過させて乳化させる膜乳化工程とを含むようにすればよいことを見出した。
　すなわち、本発明は、以下のものに関する。
〔１〕
　ペプチドエマルション製剤を調製する方法であって、
　式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 （式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
で表されるアミノ酸配列からなる化合物、またはその薬学上許容される塩、および、
　ＷＡＰＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳＡＹＧＳＬ（配列番号：１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、またはその薬学上許容される塩
を含む水溶液と、
　油性製剤とを混合してから振動撹拌を付与する工程と、
　前記振動撹拌後の予備混合液を、膜型フィルターに通過させて乳化させる膜乳化工程と
を含むペプチドエマルション製剤の調製方法。
〔２〕
　前記膜乳化工程において、前記振動撹拌後の予備混合液を、前記膜型フィルターに１回または２回以上通過させて乳化させる、〔１〕に記載のペプチドエマルション製剤の調製方法。
〔３〕
　前記膜乳化工程において、前記振動撹拌後の予備混合液を、前記膜型フィルターに１回通過させて乳化させる、〔１〕に記載のペプチドエマルション製剤の調製方法。
〔４〕
　さらに、前記膜乳化工程で得られた乳化物を、膜型フィルターを介することなく連結された２つの容器間で１回または数回以上往復移動をさせる工程を含む、〔１〕～〔３〕のいずれかに記載のペプチドエマルション製剤の調製方法。
〔５〕
　前記往復移動の回数が２回以上である、〔４〕に記載のペプチドエマルション製剤の調製方法。
〔６〕
　前記往復移動の回数が３０回以下である、〔４〕または〔５〕に記載のペプチドエマルション製剤の調製方法。
〔７〕
　前記往復移動の回数が２０回以下である、〔４〕～〔６〕のいずれかに記載のペプチドエマルション製剤の調製方法。
〔８〕
　前記往復移動の回数が１０回以下である、〔４〕～〔７〕のいずれかに記載のペプチドエマルション製剤の調製方法。
〔９〕
　前記往復移動の回数が１回である、〔４〕に記載のペプチドエマルション製剤の調製方法。
〔１０〕
　前記振動撹拌が、手振りによる撹拌である、〔１〕～〔９〕のいずれかに記載のペプチドエマルション製剤の調製方法。
〔１１〕
　前記膜型フィルターは、ポリアミド、ポリエステル、フッ素樹脂、ポリエーテルスルホン、ポリプロピレン、セルロースアセテート、セルロース混合エステル、およびグラスファイバーからなる群より選択される１種以上を含む成分で形成されている、〔１〕～〔１０〕のいずれかに記載のペプチドエマルション製剤の調製方法。
〔１２〕
　前記膜型フィルターは、ポリアミド、ポリエステル、フッ素樹脂、ポリプロピレン、セルロースアセテート、およびグラスファイバーからなる群より選択される１種以上を含む成分で形成されている、〔１〕～〔１１〕のいずれかに記載のペプチドエマルション製剤の調製方法。
〔１３〕
　前記膜型フィルターが、１層、または同じ成分もしくは異なる成分の層が互いに重なった複数層から形成される、〔１〕～〔１２〕のいずれかに記載のペプチドエマルション製剤の調製方法。
〔１４〕
　前記フッ素樹脂は、ポリテトラフルオロエチレンおよびポリフッ化ビニリデンからなる群より選択される１種以上である、〔１１〕～〔１３〕のいずれかに記載のペプチドエマルション製剤の調製方法。
〔１５〕
　前記フッ素樹脂が、ポリテトラフルオロエチレンである、〔１１〕～〔１４〕のいずれかに記載のペプチドエマルション製剤の調製方法。
〔１６〕
　前記油性製剤は、不完全フロイントアジュバントである、〔１〕～〔１５〕のいずれかに記載のペプチドエマルション製剤の調製方法。
〔１７〕
　前記油性製剤は、モンタナイドである、〔１〕～〔１６〕のいずれかに記載のペプチドエマルション製剤の調製方法。
〔１８〕
　前記ペプチドエマルション製剤は、Ｗ／Ｏ型のペプチドエマルション製剤である、〔１〕～〔１７〕のいずれかに記載のペプチドエマルション製剤の調製方法。
〔１９〕
　前記ペプチドエマルション製剤は、賦形剤を含むものである、〔１〕～〔１８〕のいずれかに記載のペプチドエマルション製剤の調製方法。
〔２０〕
　前記賦形剤は、精製白糖、グリシン、乳糖、ブドウ糖、マルトース、塩化ナトリウム、シュクロース、マンニトール、トレハロース、およびトレハロース水和物からなる群より選択される１種以上を含むものである、〔１９〕に記載のペプチドエマルション製剤の調製方法。
〔２１〕
　前記ペプチドエマルション製剤は、ｐＨ調整剤を含むものである、〔１〕～〔２０〕のいずれかに記載のペプチドエマルション製剤の調製方法。
〔２２〕
　前記ｐＨ調整剤は、クエン酸、乳酸、酒石酸、塩酸、硫酸、硝酸、コハク酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トロメタモール、ヒスチジン、Ｌ－アルギニン、およびメグルミンからなる群より選択される１種以上を含むものである、〔２１〕に記載のペプチドエマルション製剤の調製方法。
〔２３〕
　前記ｐＨ調整剤は、酒石酸、コハク酸、塩酸、水酸化ナトリウム、トロメタモール、Ｌ－アルギニン、およびメグルミンからなる群より選択される１種以上を含むものである、〔２１〕または〔２２〕に記載のペプチドエマルション製剤の調製方法。
〔２４〕
　前記ペプチドエマルション製剤は、抗酸化剤を含むものである、〔１〕～〔２３〕のいずれかに記載のペプチドエマルション製剤の調製方法。
〔２５〕
　前記抗酸化剤は、メチオニン、アスコルビン酸、エデト酸ナトリウム、およびピロ亜硫酸ナトリウムからなる群より選択される１種以上を含むものである、〔２４〕に記載のペプチドエマルション製剤の調製方法。
〔２６〕
　前記抗酸化剤がメチオニンである、〔２４〕または〔２５〕に記載のペプチドエマルション製剤の調製方法。
〔２７〕
　前記ペプチドエマルション製剤は、可溶化剤を含むものである、〔１〕～〔２６〕のいずれかに記載のペプチドエマルション製剤の調製方法。
〔２８〕
　前記可溶化剤は、αシクロデキストリン、βシクロデキストリン、γシクロデキストリン、ヒドロキシプロピルβシクロデキストリン、スルホブチルエーテルβシクロデキストリン等の天然型シクロデキストリン、ヒドロキシエチル－β－シクロデキストリン（ＨＥ－β－ＣＤ）、ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（ＨＰ－β－ＣＤ）、メチル－β－シクロデキストリン（Ｍ－β－ＣＤ）、スルホブチルエーテル－β－シクロデキストリン（ＳＢＥ－β－ＣＤ）等のシクロデキストリン誘導体、エチレンジアミン、トリエタノールアミン、ジエタノールアミン等のアミン、アスパラギン酸、グリシン、リン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、コハク酸、Ｌ－アルギニンデオキシコール酸ナトリウム、ウルソデスオキシコール酸等の酸、尿素、エチル尿素、メグルミン、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、サリチル酸ナトリウム、およびニコチン酸アミドからなる群より選択される１種以上を含むものである、〔２７〕に記載のペプチドエマルション製剤の調製方法。
〔２９〕
　前記可溶化剤は、βシクロデキストリン、ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（ＨＰ－β－ＣＤ）、酒石酸、およびコハク酸からなる群より選択される１種以上を含むものである、〔２７〕または〔２８〕に記載のペプチドエマルション製剤の調製方法。
〔３０〕
　式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 （式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
で表されるアミノ酸配列からなる化合物、またはその薬学上許容される塩、および、
　ＷＡＰＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳＡＹＧＳＬ（配列番号：１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、またはその薬学上許容される塩
を含む水溶液と、
　油性製剤とを含有する、長時間の安定がなされたペプチドエマルション製剤。
〔３１〕
　式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 （式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
で表されるアミノ酸配列からなる化合物、またはその薬学上許容される塩、および、
　ＷＡＰＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳＡＹＧＳＬ（配列番号：１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、またはその薬学上許容される塩
を含む水溶液と、
　油性製剤と、
　膜型フィルターとを含有する、長時間の安定がなされたペプチドエマルション製剤を調製するためのキット。
〔３２〕
　式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 （式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
で表されるアミノ酸配列からなる化合物、またはその薬学上許容される塩、および、
　ＷＡＰＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳＡＹＧＳＬ（配列番号：１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、またはその薬学上許容される塩
を含む水溶液と、
　油性製剤とを含有する長時間の安定がなされたペプチドエマルション製剤を調製するための、膜型フィルターを少なくとも含有してなるエマルション調製用デバイス。
　本発明によれば、従来の方法では調製することが容易でなかった、所望のペプチドエマルション製剤を簡便に調製することができる。
図１は、実施例における透過率のプロファイルの１例を示す図である。 図２は、実施例における透過率のプロファイルを、フィルターの材質とポンピングの回数別に示した図である。 図３は、実施例における透過率のプロファイルを、フィルターの材質とポンピングの回数別に示した図である。 図４は、実施例においてポリアミドを材質とするフィルターを用いた場合の、透過率のプロファイルをポンピングの回数別に示した図である。
　本発明者らは、所望のペプチドエマルション製剤を調製する方法、好ましくは、所望のペプチドエマルション製剤を、簡便にかつ短時間で調製することのできるペプチドエマルション製剤の調製方法を実現すべく、鋭意研究を行った。特に本発明者らは、ペプチドの中でも、油性製剤と混合した場合にペプチドエマルション製剤を調製することが困難で、また、安定化し難く乳化後も短時間で分離しやすい、
　式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 （式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
で表されるアミノ酸配列からなる化合物、または、
　式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 （式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
で表されるアミノ酸配列からなる化合物、または、
　その薬学上許容される塩、ならびに、
　ＷＡＰＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳＡＹＧＳＬ（配列番号：１）、ＣＷＡＰＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳＡＹＧＳＬ（配列番号：２）、およびＷＡＰＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳＡＹＧＳＬＣ（配列番号：３）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチド、または、
　その薬学上許容される塩
との組み合わせを対象に、鋭意研究を行った。
　その結果、上記ペプチドを含むペプチドエマルション製剤の調製方法として、
前記化合物等および前記ペプチド等を含む水溶液と、油性製剤とを混合してから振動撹拌を付与する工程と、前記振動撹拌後の予備混合液を、膜型フィルターに通過させて乳化させる膜乳化工程とを含むようにすればよいことを見出した。以下、上記ペプチドを含むペプチドエマルション製剤を「所望のペプチドエマルション製剤」、または単に「ペプチドエマルション製剤」ということがある。
　まず、本発明のペプチドエマルション製剤の調製方法で使用するペプチド等について説明する。
　本発明のペプチドエマルション製剤の調製方法では、
　式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 （式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
で表されるアミノ酸配列からなる化合物、または、
　式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 （式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
で表されるアミノ酸配列からなる化合物、または、
　その薬学上許容される塩、ならびに、
　ＷＡＰＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳＡＹＧＳＬ（配列番号：１）、ＣＷＡＰＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳＡＹＧＳＬ（配列番号：２）、およびＷＡＰＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳＡＹＧＳＬＣ（配列番号：３）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチド、ならびに国際公開公報２０１８／１８１６４８号、または国際公開公報２０１９／１３１７２２号に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、または、
　その薬学上許容される塩
を用いる。
　本明細書において、ペプチドは左側がＮ末端であり、各アミノ酸記号はそれぞれ以下のアミノ酸残基であることを示している。
Ａ：アラニン残基
Ｒ：アルギニン残基
Ｎ：アスパラギン残基
Ｄ：アスパラギン酸残基
Ｃ：システイン残基
Ｑ：グルタミン残基
Ｅ：グルタミン酸残基
Ｇ：グリシン残基
Ｈ：ヒスチジン残基
Ｉ：イソロイシン残基
Ｌ：ロイシン残基
Ｋ：リジン残基
Ｍ：メチオニン残基
Ｆ：フェニルアラニン残基
Ｐ：プロリン残基
Ｓ：セリン残基
Ｔ：スレオニン残基
Ｗ：トリプトファン残基
Ｙ：チロシン残基
Ｖ：バリン残基
　前記式（１）で表されるアミノ酸配列からなる化合物とは、ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号：４）で表されるＷＴ１癌抗原ペプチドのＮ末端にシステイン残基を結合した、ＣＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号：５）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドと、ＣＭＴＷＮＱＭＮＬ（配列番号：６）で表されるＷＴ１癌抗原ペプチドのＮ末端から２つめのメチオニン残基をチロシン残基に改変した、ＣＹＴＷＮＱＭＮＬ（配列番号：７）で表されるペプチドのＮ末端システイン残基同士をジスルフィド結合したものである。本発明の調製方法は、例えば国際公開公報２０１４／１５７６９２号、または国際公開公報２０１６／１８６１７７号に記載の公知の方法、または国際特許出願番号ＰＣＴ／ＪＰ２０１９／３９３８３に記載の方法・用途において利用することができる。
　前記式（１）で表されるアミノ酸配列からなる化合物の塩、もしくは前記式（２）で表されるアミノ酸配列からなる化合物の塩、またはＷＡＰＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳＡＹＧＳＬ（配列番号：１）、ＣＷＡＰＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳＡＹＧＳＬ（配列番号：２）もしくはＷＡＰＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳＡＹＧＳＬＣ（配列番号：３）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドの塩としては、薬学上許容される塩であれば特に制限されない。本発明における「塩」としては、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。例えば、酸付加塩としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、リン酸塩などの無機酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、酢酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、安息香酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩などの有機酸塩が挙げられ、塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩などの無機塩基塩、トリエチルアンモニウム塩、トリエタノールアンモニウム塩、ピリジニウム塩、ジイソプロピルアンモニウム塩などの有機塩基塩などが挙げられ、さらにはアルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸などの塩基性あるいは酸性アミノ酸といったアミノ酸塩が挙げられる。
　前記式（１）で表されるアミノ酸配列からなる化合物またはその塩、前記式（２）で表されるアミノ酸配列からなる化合物またはその塩、ＷＡＰＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳＡＹＧＳＬ（配列番号：１）、ＣＷＡＰＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳＡＹＧＳＬ（配列番号：２）、およびＷＡＰＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳＡＹＧＳＬＣ（配列番号：３）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドまたはその塩の水和物、エタノール溶媒和物などの溶媒和物も、本発明の化合物またはペプチドに含まれる。さらに、本発明の化合物またはペプチドには、前記式（１）で表されるアミノ酸配列からなる化合物もしくは前記式（２）で表されるアミノ酸配列からなる化合物またはその塩またはＷＡＰＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳＡＹＧＳＬ（配列番号：１）、ＣＷＡＰＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳＡＹＧＳＬ（配列番号：２）、およびＷＡＰＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳＡＹＧＳＬＣ（配列番号：３）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドのあらゆるジアステレオマー、エナンチオマーなどの存在し得るあらゆる立体異性体、およびあらゆる態様の結晶形も包含される。
　前記式（１）または前記式（２）で表されるアミノ酸配列からなる化合物またはその塩、およびＷＡＰＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳＡＹＧＳＬ（配列番号：１）、ＣＷＡＰＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳＡＹＧＳＬ（配列番号：２）、およびＷＡＰＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳＡＹＧＳＬＣ（配列番号：３）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドまたはその塩は、例えば国際公開公報２０１４／１５７６９２号に記載の公知の方法で製造することができる。
　上述の通り、特に上記２種類のペプチドを用いた場合に、従来の方法では長時間安定したペプチドエマルション製剤が得られ難いか、短時間で調製することが難しいことに鑑みて本発明の調製方法を見出すに至った。以下、本発明の調製方法について説明する。
　〔上記ペプチドを含む水溶液と、油性製剤とを混合してから振動撹拌を付与する工程〕
　まず、上記２種類のペプチドを含む水溶液（ペプチド含有水溶液）と、油性製剤とを混合してから振動撹拌を付与する。
　前記ペプチド含有水溶液中のペプチドの割合は、例えば１ｍＬ中０．１～１００ｍｇとすることができる。前記ペプチド含有水溶液には、前記ペプチドに加え、必要に応じて更に、薬学的に許容される他の任意の成分を更に含有していてもよい。任意の成分としては、界面活性剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、可溶化剤、防腐剤、賦形剤、増粘剤、安定化剤、粘稠化剤、抗酸化剤、乳化剤、分散剤、等張化剤、キレート剤等が例示される。必要に応じて、これら任意の成分の１種以上が含まれていてもよい。前記任意の成分の含有量は、目的等に応じて適宜設定すればよい。前記ペプチド含有水溶液の調製方法として、前記ペプチドと前記任意の成分とを混合し、撹拌する方法や、前記方法により得られた溶液を凍結乾燥または噴霧乾燥したものを、再度、水に溶解する方法や、前記凍結乾燥または噴霧乾燥した乾燥製剤と溶媒とを混合する方法が挙げられる。
　本発明における「賦形剤」とは、一般に医薬品製剤に用いられる賦形剤を表す。特に制限はされないが、例えば、精製白糖、グリシン、乳糖、ブドウ糖、マルトース、塩化ナトリウム、シュクロース、マンニトール、トレハロース、トレハロース水和物が挙げられ、これらのうちの１種以上を用いることができる。
　本発明における「ｐＨ調整剤」とは、一般に医薬品製剤に用いられるｐＨ調整剤を表す。ｐＨ調整剤として、酸とその塩および塩基とその塩からなる群より選択される１種以上が挙げられる。具体的には、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、リン酸二ナトリウム、リン酸二カリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウムおよびリン酸三ナトリウムなどの無機酸またはその塩、酢酸、クエン酸、酒石酸、コハク酸、乳酸、マレイン酸、酢酸ナトリウム水和物、無水酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム水和物、クエン酸二水素ナトリウム、酒石酸ナトリウムなどの有機酸またはその塩、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア水等の無機塩基、あるいはトロメタモール、ヒスチジン、Ｌ－アルギニン、およびメグルミン等の有機塩基が挙げられ、これらのうちの１種以上を用いることができる。好ましくはクエン酸、乳酸、酒石酸、コハク酸、塩酸、硫酸、硝酸等の酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トロメタモール、ヒスチジン、Ｌ－アルギニン、およびメグルミン等の塩基からなる群より選択される１種以上であり、さらに好ましくは酒石酸、コハク酸、塩酸等の酸、水酸化ナトリウム、トロメタモール、Ｌ－アルギニン、およびメグルミン等の塩基からなる群より選択される１種以上である。
　本発明における「抗酸化剤」とは、一般に医薬品製剤に用いられる抗酸化剤を表す。具体的には、メチオニン、アスコルビン酸、エデト酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウムが挙げられ、これらのうちの１種以上を用いることができる。
　本発明における「可溶化剤」とは、一般に医薬品製剤に用いられる可溶化剤を表す。具体的には、αシクロデキストリン、βシクロデキストリン、γシクロデキストリン、ヒドロキシプロピルβシクロデキストリン、スルホブチルエーテルβシクロデキストリン等の天然型シクロデキストリン、ヒドロキシエチル－β－シクロデキストリン（ＨＥ－β－ＣＤ）、ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（ＨＰ－β－ＣＤ）、メチル－β－シクロデキストリン（Ｍ－β－ＣＤ）、スルホブチルエーテル－β－シクロデキストリン（ＳＢＥ－β－ＣＤ）等のシクロデキストリン誘導体、エチレンジアミン、トリエタノールアミン、ジエタノールアミン等のアミン、アスパラギン酸、グリシン、リン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、コハク酸、Ｌ－アルギニンデオキシコール酸ナトリウム、ウルソデスオキシコール酸等の酸、尿素、エチル尿素、メグルミン、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、サリチル酸ナトリウム、ニコチン酸アミドが挙げられ、これらのうちの１種以上を用いることができる。好ましくは、βシクロデキストリン、ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（ＨＰ－β－ＣＤ）、酒石酸、およびコハク酸からなる群より選択される１種以上である。
　前記ペプチド含有水溶液と混合させる、本発明の「油性製剤」とは、非水系溶媒を主溶媒とする製剤を表す。前記油性製剤は、医薬品上許容される油を含む。医薬品上許容される油として、流動パラフィン、パラフィン、ゲル化炭化水素、ワセリン等の鉱物油、オリーブ油、サフラワー油、大豆油、つばき油、とうもろこし油、なたね油、ひまわり油、綿実油、落花生油等の植物油、ラード、スクワラン、魚油等の動物油が挙げられ、これらのうちの１種以上を用いることができる。油性製剤には、前記油以外に、薬学的に許容される他の任意の成分を更に含有していてもよい。任意の成分としては、界面活性剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、可溶化剤、防腐剤、増粘剤、安定化剤、粘稠化剤、抗酸化剤、分散剤、等張化剤、キレート剤等が例示される。必要に応じて、これら任意の成分の１種以上が含まれていてもよい。前記ｐＨ調整剤、抗酸化剤、可溶化剤として、前述したものを用いることができる。前記任意の成分の含有量は、目的等に応じて適宜設定すればよい。
　前記界面活性剤として、非イオン性界面活性剤、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性イオン界面活性剤が挙げられる。前記非イオン性界面活性剤として、例えばポリオキシエチレンアルキルエーテル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリソルベート、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル等を用いることができ、陰イオン界面活性剤として、例えばラウリル乳酸ナトリウム等を用いることができる。前記陽イオン界面活性剤として、例えばベンザルコニウム塩化物、ベンゼトニウム塩化物等が挙げられる。前記両性イオン界面活性剤として、例えばレシチン等が挙げられる。前記界面活性剤として、これらのうちの１種以上を用いることができる。
　前記油性製剤として、前記鉱物油と、植物由来の界面活性剤を含むものが好ましい。
　前記油性製剤として、例えば、抗原水溶液を鉱油で包みミセルを作り乳化する油乳剤として、油性アジュバントなどが挙げられる。前記油性アジュバントとしては、例えば、流動パラフィン、ラノリン、完全フロイントアジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｆｒｅｕｎｄ‘ｓ　Ａｄｊｕｖａｎｔ（ＣＦＡ））または不完全フロイントアジュバント（Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　Ａｄｊｕｖａｎｔ（ＩＦＡ））などが挙げられる。また、前記不完全フロイントアジュバントには、モンタナイド（例えば、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ５１）などが挙げられる。
　本発明における「混合」とは、物理的に２つ以上の異なる種類の成分を、適当な均質状態にする行為を表す。例えば、ペプチド含有水溶液に対し、等量の油性製剤を添加した後、１０秒間以上の手振りによる「振動攪拌」で「混合」された均質状態が得られる。
　混合させる前記ペプチド含有水溶液と前記油性製剤の質量比は、例えば１：１０～１０：１の範囲内とすることができる。好ましくは、１：５～５：１の範囲内であり、より好ましくは１：２～２：１の範囲内であり、更に好ましくは１：１である。
　前記ペプチド含有水溶液と前記油性製剤の混合方法は、前記ペプチド含有水溶液に対して前記油性製剤を添加する、または、前記油性製剤に対して前記ペプチド含有水溶液を添加する、のいずれであってもよい。
　本発明における「振動撹拌」とは、撹拌対象物に振動を与えて撹拌する手法を表す。前記振動撹拌の方法として、振とう方式が、旋回方式、上下運動方式等である撹拌が挙げられる。具体的には、例えば手振り、外部振動付与による撹拌が挙げられる。前記手振りの場合、手振りの時間、手振りの方法、手振りの回数について限定されないが、手振りの時間は、例えば数秒から数十秒間、具体的には５秒間以上、１０秒間以上、１５秒間以上、２０秒間以上、２５秒間以上、３０秒間以上、３５秒間以上、４０秒間以上、４５秒間以上、５０秒間以上、６０秒間以上、９０秒間以上、２分間以上、３分間以上、４分間以上、５分間以上振ることが挙げられる。また、５分間以下、４分間以下、３分間以下、２分間以下、９０秒間以下、６０秒間以下、５０秒間以下、４０秒間以下、３０秒間以下、２０秒間以下、１０秒間以下、５秒間以下振ることが挙げられる。手振りの方法は具体的に、限定されず、例えば垂直方向、水平方向、斜め方向に振ることが挙げられ、好ましくは垂直方向に上下に振る。手振りの回数は具体的に、５０回以下、４０回以下、３０回以下、２５回以下、２０回以下、１５回以下、１０回以下、５回以下、３回以下、２回、または３回以上、５回以上、１０回以上、１５回以上、２０回以上、２５回以上、３０回以上、４０回以上、５０回以上、振ることが挙げられる。なお手振り回数は、１往復を１回とカウントする。また、外部振動付与による撹拌としては、例えばボルテックスミキサー（振とう方式が旋回方式であって、回転数が約１００～３０００ｒｐｍ）において、５～５０秒間撹拌させることが挙げられ、例えば５秒間、１０秒間、１５秒間、２０秒間、２５秒間、３０秒間、３５秒間、４０秒間、４５秒間、５０秒間攪拌させることができる。手振りの速度は、具体的に、限定されず、例えば１秒間に１回、２回または３回の速度で振ることが挙げられる。なお、スターラーやホモミキサーは渦を形成するが振動をほとんど生じさせないため、本発明の振動撹拌の方法には含まれない。
　〔振動撹拌後の予備混合液を、膜型フィルター通過させて乳化させる膜乳化工程〕
　次に、振動撹拌後の予備混合液を、膜型フィルターに通過させ、乳化させることで乳化物を得る。前記振動撹拌後の予備混合液は、目視上、油相または水相が予備混合液中で分離しておらず、均一な白濁液の状態で膜型フィルターに通過させればよい。振動撹拌から膜型フィルターに通過させるまでの時間は特定の時間に限定されない。振動撹拌後、例えば３０分以内、２０分以内、または１０分以内に膜型フィルターに通過させることが挙げられる。振動撹拌後、５分以内、４分以内、３分以内、２分以内、または１分以内に膜型フィルターに通過させることが好ましく、振動撹拌後ただちに膜型フィルターに通過させることがより好ましい。
　本発明では、振動撹拌後の予備混合液を、膜型フィルターに１回または２回以上通過させる。複数回通過させる場合は、作業性向上の観点から、例えば２０回以下、更には１０回以下、更には５回以下、４回以下、３回以下、または２回以下とすることができる。また、例えばディスポーザブルタイプの調製器具を想定した場合には、膜型フィルターを一方向へ１回のみ通過させることができる。
　前記膜型フィルターに２回以上通過させる場合には、例えば、振動撹拌後の予備混合液を、膜型フィルターに対して同方向からもしくは逆方向から、または同方向と逆方向を交互に組み合わせることにより、2回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回または１０回以上通過させてもよい。
　本発明における「膜型フィルター」とは、厚みが数μｍから数ｍｍである多孔質のフィルターを表す。下記の材質の膜型フィルターを採用する場合、例えば１μｍ～５０００μｍの範囲内とすることができ、限定されないが一例として、１７μｍ、１２７μｍまたは１５０μｍの場合が挙げられる。
　前記膜型フィルターとして、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、テトラフルオロエチレン－ヘキサフルオロプロピレン共重合体（ＦＥＰ）、テトラフルオロエチレン－パーフルオロアルキルビニルエーテル共重合体（ＰＦＡ）、エチレン－テトラフルオロエチレン共重合体（ＥＴＦＥ）、ポリクロロトリフルオロエチレン（ＰＣＴＦＥ）、エチレン－クロロトリフルオロエチレン共重合体（ＥＣＴＦＥ）、ポリフッ化ビニル（ＰＶＦ）等のフッ素樹脂、ナイロンを含む各種の脂肪族ポリアミドおよび芳香族ポリアミド等を含むポリアミド（ＰＡ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、ポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）、ポリトリブチレンテレフタレート（ＰＴＴ）等のポリエステル、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、アクリル共重合体、ポリエチレン、親水性ポリプロピレン等のポリプロピレン等を含むポリオレフィンなどの合成樹脂；セルロースアセテート、ＭＣＥ（セルロース混合エステル）などの繊維；グラスファイバー（ＧＦ）；またはこれらの複合物；を含む成分で形成されていることが挙げられ、本発明の膜型フィルターとして、これらの成分を、主骨格成分として含む多孔質膜が挙げられ、膜型フィルターは１種の成分または２種以上の成分で構成されていてもよい。
　前記膜型フィルターは、これらの中でも、ポリテトラフルオロエチレン、ポリフッ化ビニリデンを含むフッ素樹脂、ナイロンを含むポリアミド、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、ポリプロピレン、セルロースアセテート、セルロース混合エステル、およびグラスファイバーからなる群より選択される１種以上を含む成分で形成されていることが好ましい。前記膜型フィルターは、前記成分が主骨格成分であることがより好ましい。
　前記膜型フィルターは更に、ポリテトラフルオロエチレン、ポリフッ化ビニリデンを含むフッ素樹脂、ポリアミド、ポリエステル、ポリプロピレン、セルロースアセテート、およびグラスファイバーからなる群より選択される１種以上を含む成分で形成されていることがより好ましい。前記成分が主骨格成分であることが更に好ましい。
　前記膜型フィルターは、例えば、前記成分が１種または複数種（２種、３種、４種または５種）以上の成分からなり、１層、または同じ成分もしくは異なる成分の層が互いに重なった複数層（２層、３層、４層、５層、６層、７層、８層、９層または１０層）を形成してもよい。
　前記膜型フィルターの中でも、フッ素樹脂を含む成分で形成されていることがより更に好ましく、前記フッ素樹脂の中でもポリテトラフルオロエチレン、ポリフッ化ビニリデンの１種以上が特に好ましく、更に特には、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）を含む成分で形成されていることが好ましく、最も好ましくは、疎水性のポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）が主骨格成分として含まれていることが好ましい。
　前記膜型フィルターの主骨格成分が、ポリアミドの場合、膜型フィルターの孔径は例えば１～１０μｍの範囲内とすることができ、例えば５μｍとすることが挙げられる。ポリエステルの場合、膜型フィルターの孔径は例えば５～３０μｍの範囲内とすることができ、例えば１７μｍとすることが挙げられる。前記膜型フィルターの主骨格成分が、ＰＴＦＥの場合、膜型フィルターの孔径は例えば０．１～５０μｍの範囲内とすることができ、中でも疎水性ＰＴＦＥの場合、膜型フィルターの孔径は例えば０．３～５０μｍの範囲内とすることができ、０．４～３０μｍの範囲内であることが好ましく、１μｍ、３μｍまたは５μｍであることが更に好ましく、５μｍであることが更に好ましい。また親水性ＰＴＦＥの場合は、膜型フィルターの孔径は例えば０．１～１０μｍの範囲内とすることが挙げられ、例えば０．１μｍ、０．２μｍまたは０．５μｍとすることが挙げられ、０．２μｍあることが更に好ましい。ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）の場合は、膜型フィルターの孔径は例えば０．１～３μｍの範囲内とすることができ、例えば０．２２μｍまたは０．４５μｍとすることが挙げられる。前記膜型フィルターの主骨格成分がグラスファイバーの場合は、膜型フィルターの孔径は例えば０．５～５μｍの範囲内とすることができ、例えば０．７μｍ、１μｍまたは３．１μｍとすることが挙げられる。前記膜型フィルターの主骨格成分がポリプロピレンの場合、膜型フィルターの孔径は例えば０．１～５μｍの範囲内とすることが挙げられ、例えば０．２２μｍまたは０．４５μｍとすることが挙げられる。
　前記膜型フィルターは、疎水性、親水性、耐久性等の向上といったフィルター改質を目的として、前記主骨格成分の表面に、該主骨格成分とは別の成分、例えば高分子層、キチン、キトサン等の人工角質層等が１層以上コーティングされたものや、前記主骨格成分の表面が、シランカップリング剤等により、所望の官能基で修飾されたものであってもよい。また、膜型フィルターの空隙に、前述した薬学的に許容される他の任意の成分が予め存在したものを用いてもよい。
　本発明では、振動撹拌後の予備混合液を、膜型フィルターに１回または２回以上通過させることで足りるが、前記膜型フィルターは、例えば、物理的な強度を増す目的等により、同じ成分もしくは異なる成分からなる膜型フィルターを複数層（２層、３層、４層、５層、６層、７層、８層、９層または１０層）に重ねて用いることもできる。
　本発明の方法によれば、前記振動撹拌を付与する工程と、前記膜乳化工程とを含む工程により、所望のＷ／Ｏ型のペプチドエマルション製剤を早期に調製することができる。すなわち、後記の更なる工程を行わなくとも、所望のＷ／Ｏ型のペプチドエマルションを短時間で調製することが可能である。
　膜乳化の操作方法として、容器中の予備混合液を、フィルターを介して引き抜いて膜乳化を行う方法、具体的に例えば、シリンジ等の注射用容器、バイアル、アンプル等の容器中の予備混合液の全量を、フィルターの取り付けられた空の注射用容器に装着のピストン（「プランジャーロッド」または「投与ホルダー」ともいう）を引き抜いて吸い上げることにより膜乳化を行う、いわゆる「引き抜き」による膜乳化の方法が挙げられる。または、シリンジ等の注射用容器中の予備混合液を、フィルターを介して押し出して膜乳化を行う方法、具体的に例えば、予備混合液の全量が入った注射用容器に装着のピストン（「プランジャーロッド」または「投与ホルダー」ともいう）を押し込み、予備混合液の全量を、前記注射用容器に連結されかつフィルターの取り付けられた空のシリンジ等の注射用容器、バイアル、アンプル等の容器に押し出すか、前記注射用容器に装着されたフィルターを介して、空のシリンジ等の注射用容器、バイアル、アンプル等の容器に押し出して膜乳化を行う、いわゆる「押し出し」による膜乳化の方法を用いてもよい。
　上記では、例としてＷ／Ｏ型のペプチドエマルション製剤の調製方法について説明したが、本発明の調製方法はこれに限られず、連続相が水で、非連続相が油滴であるＯ／Ｗ型エマルション製剤の作製にも適用することができる。
　より長時間にわたり安定である、Ｗ／Ｏ型またはＯ／Ｗ型のペプチドエマルション製剤を得るには、さらに、前記膜乳化工程で得られた乳化物を、フィルターを介することなく連結された２つの容器間で１回以上往復移動させる工程を含むことができる。なお、上記往復移動に用いる「容器」とは、シリンジ等の注射用容器、バイアル、アンプル等が挙げられる。上記容器の素材は限定されず、例えばプラスチック製ないしはガラス製のものを用いることができる。上記容器として、好ましくは注射用容器、例えばシリンジを用いることが挙げられる。本発明における「往復移動させる工程」とは連結された容器のうち、一方の容器に存在する液体を、ピストン（「プランジャーロッド」または「投与ホルダー」ともいう）等を用いて、他方の容器に移動させ、再び元の注射用容器に移動させる行為を表す。
　前記往復移動させる工程の具体例として例えば、前記乳化物の入った注射用容器の先端部のフィルターニードルを取り外し、代わりにコネクタ（「連結ユニット」ともいう）を取り付け、必要に応じて空気抜きを行った後、前記コネクタの他方に空の注射用容器を取り付ける。そして、前記乳化物を、連結された２つの注射用容器間で１回以上往復移動させることが挙げられる。なお、本発明において、往復移動の回数は、１往復を１回としてカウントする。
　前記乳化物を容器間で往復移動する際に用いる２つの容器は、同一形状の容器であってもよく、または、互いに異なる形状の容器であってもよい。
　前記容器の形状として、例えば、内径が１～１０ｍｍ、容量が１～３ｍＬのものが挙げられ、内径が１０ｍｍ、容量が３ｍＬの容器を用いることできる。前記コネクタの形状として、例えば、内径が０．５～２ｍｍ、流路長さが１５ｍｍ以下のものが挙げられ、内径が１ｍｍ、流路長さが１５ｍｍのコネクタを用いることができる。
　上記乳化物を容器間で往復移動させる１つの態様として、前記往復移動を１回のみ、すなわち１往復のみ行うことが挙げられる。この態様によれば、より安定なペプチドエマルション製剤を、短時間で調製することができる。また別の態様として、前記往復移動を数回以上、すなわち数往復以上行うことが挙げられる。この態様によれば、長時間にわたりより安定したペプチドエマルション製剤を調製することができる。数回以上の往復移動を行う場合における「数回以上」とは、例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１５回、２０回、２５回、または３０回などが挙げられ、例えば３０回以下、２５回以下、２０回以下、１５回以下、１０回以下、５回以下、４回以下、３回以下、または２回以上、３回以上、４回以上、５回以上、１０回以上、１５回以上、２０回以上、３０回以上、２５回以上とすることができる。
　前記乳化物を容器間で往復移動させる速度は、医療従事者が一般的に行う速度であればよく、通常は１秒間に１回、２回または３回程度の速度であるが、これに限定されない。
　上記の好ましい態様、すなわち前記膜乳化工程後、さらに、フィルターを介することなく連結された２つの容器間で１回以上往復移動させる工程を経て作製されたペプチドエマルション製剤は、簡便にかつ短時間で得られるものであって、なおかつ長時間安定といった効果を有する。本発明における「長時間の安定」とは、一般的な医療現場において、ペプチドエマルション製剤を調製してから患者に投与するまでの間、ペプチドエマルション製剤から油相または水相が分離しない状態をいう。具体的な時間は限定されないが、例えば約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約８時間、約１２時間、または約２４時間の間、調製したペプチドエマルション製剤から油相または水相が分離しない状態などが挙げられる。
　本発明のペプチドエマルション製剤の調製方法は、上述した工程に加えて更に、必要に応じて、超音波を用いて分散する工程、調製時に発生した気泡を抜き取る工程等を含んでいてもよい。
　本発明における「キット」は、上記２種類のペプチド、溶解用水、油性製剤および膜型フィルター、好ましくは前述した膜型フィルターを含み、更に、シリンジ、注射針、送液チューブ等の注射用器具（プランジャーロッド等を含んでもよい）および／またはバイアル、アンプル等の容器を含んでもよい。
　本発明における「エマルション調製用デバイス」は、膜型フィルター、好ましくは前述した膜型フィルターを少なくとも含んでいればよく、例えば更に、シリンジ等の注射用容器（プランジャーロッド等を含んでもよい）および／またはバイアル、アンプル等の容器を含む形態、またはそれらと組み合わせて用いる形態であってもよい。
　本発明の別の態様としては、前記振動撹拌を付与する工程に変えて、２種のペプチドを含む水溶液と油性製剤とを、別々の容器に入れてフィルターを挟んで連結することもできる。その場合、２種のペプチドを含む水溶液および／または油性製剤を、１回または２回以上膜型フィルターに通過させて乳化させる膜乳化工程により、所望のＷ／Ｏ型またはＯ／Ｗ型のペプチドエマルション製剤を調製することもできる。
　以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明する。本発明は以下の実施例によって制限を受けるものではなく、前述および後述する趣旨に合致し得る範囲で、適宜変更を加えて実施することも可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
［１．予備混合方法の検討］
［１．１　実施例乳化物１の調製］
　ＷＡＰＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳＡＹＧＳＬ（配列番号：１）のアミノ酸配列で表されるペプチドの凍結乾燥製剤と、下記式（１）で示されるペプチドの凍結乾燥製剤を、注射用水に溶解させ、ペプチド濃度が３．５質量％のペプチド水溶液１．０ｍＬを得た。
　式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　そしてペプチド水溶液１．０ｍＬの入ったバイアルに、油性製剤（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ５１ＶＧ）１．０ｍＬを注入してから、予備混合として、手振りで約１０秒間振り、予備混合液を得た。
　その後、予備混合液の全量を、フィルターニードル（表１に示す材質・孔径の膜型フィルター）の取り付けられた空のシリンジ（Ｂ．ＢＲＡＵＮ製、容量３．０ｍＬ、内径１０ｍｍ）に、ピストンを引き抜いて吸い上げることにより膜乳化を行い、乳化物を得た（乳化操作方法：引き抜き）。
　膜型フィルターとして、ポリアミド（孔径５μｍ、Ｂ．ＢＲＡＵＮ社製、品番：ＦＮ－５０１９、フィルターニードル）、グラスファイバー（孔径：３．１μｍ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、品番：Ｆ２５００ ２０、直径３０ｍｍ）、またはＰＶＤＦ（孔径：０．４５μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、品番：Ｈｉｌｌｅｘ ＨＶ／ＳＬＨＶ０３３ＲＳ、直径３３ｍｍ）を用いた。なお、前記シリンジで吸い上げることによる膜型フィルターの通過はいずれも１回のみとした。
［１．２　比較例乳化物１の調製］
　前記予備混合工程において、手振りではなく、スターラー（回転数６２０ｒｐｍ）を用いた後、前記引き抜き法により乳化物を得た。予備混合工程以外の工程については、実施例乳化物１の調製と同様にして比較例乳化物１を得た。
［１．３　乳化物の形態評価］
　５０ｍＬ程度の水の入った１００ｍＬビーカーに、得られた乳化物をゆっくりと一滴のみ落とした。液滴が水中に分散せず、滴状に水面に浮いた場合はＷ／Ｏエマルションが得られたと判断した。一方、液滴が水中に速やかに分散した場合はＯ／Ｗエマルションが得られたと判断した。同一条件につき３回の評価を行った。そして３回のうち、Ｗ／Ｏエマルションが３回得られた場合は非常に良好「◎」と評価し、２回得られた場合は良好「〇」と評価し、１回得られた場合は可能「△」と評価し、１回も得られない場合は不良「×」と評価した。その結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　表１に示される通り、予備混合として振動撹拌を行うことで、精度よくＷ／Ｏエマルションを調製することができた。
［２．フィルターの材質と孔径のバリエーション］
［２．２　実施例乳化物２の調製］
　実施例１と同様にして手振りで予備混合液を得た後、予備混合液の全量を、フィルターニードルの取り付けられたシリンジ（Ｂ．ＢＲＡＵＮ製、容量３ｍＬ、内径１０ｍｍ）に、ピストンを引き抜いて吸い上げることにより膜乳化を行い、乳化物を得た（乳化操作方法：引き抜き）。または、予備混合液の全量をシリンジに採取した後、採取したシリンジの先端にフィルターを取り付け、前記予備混合液の全量が入ったシリンジのピストンを押し込むことにより膜乳化を行い、乳化物を得た（乳化操作方法：押し出し）。
　次いで、上記乳化物の入ったシリンジに取り付けられた使用済のフィルターニードルまたはフィルターを外し、代わりにコネクタ（内径１ｍｍ、流路長さ１５ｍｍ）を前記シリンジに接続し、上記コネクタの他方の端に、空のシリンジ（Ｂ．ＢＲＡＵＮ製、容量３ｍＬ、内径１０ｍｍ）を連結させた。そして、前記乳化物を、２つのシリンジ間で２０回往復させた。この往復移動させる操作を、以下、ポンピングと呼ぶことがある。後記する［４．ポンピングの効果］における往復移動についても同じである。
　前記フィルターニードルまたはフィルターとして、表２に示す種々の材質、孔径の膜型フィルターを使用した。なお、ナイロン、セルロースアセテート、グラスファイバー、および親水性ポリプロピレンはＭｅｍｂｒａｎｅ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社製を使用し、ポリアミドはＢ．ＢＲＡＵＮ社製を使用し、ポリエステルはＦＯＲＴＥ　ＧＲＯＷ　ＭＥＤＩＣＡＬ社製を使用し、疎水性ＰＴＦＥ、ＰＶＤＦ、およびセルロース混合エステルはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社製を使用した。また、親水性ＰＴＦＥはアドバンテック東洋社製、ポリエーテルスルホンはＰＡＬＬ社製、アクリル共重合体はＢｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製を使用した。
［２．３　乳化物の形態評価］
　５０ｍＬ程度の水の入った１００ｍＬビーカーに、得られた乳化物をゆっくりと一滴のみ落とした。液滴が水中に分散せず、滴状に水面に浮いた場合はＷ／Ｏエマルションが得られたと判断した。一方、液滴が水中に速やかに分散した場合はＯ／Ｗエマルションが得られたと判断した。同一種類のフィルターにつき、３回の評価を行った。３回のうちＷ／Ｏエマルションが３回得られた場合は非常に良好「◎」と評価し、２回得られた場合は良好「〇」と評価し、１回得られた場合は可能「△」と評価し、１回も得られない場合は不良「×」と評価した。その結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　表２の結果に示される通り、好ましくは、ナイロンを含むポリアミド、ポリエステル、疎水性ＰＥＦＥ、親水性ＰＴＦＥ、ＰＶＤＦ、セルロース混合エステル、セルロースアセテート、グラスファイバー、および親水性ポリプロピレンを材質とするフィルターを用いることによって、当該方法により精度良くＷ／Ｏエマルションを調製できた。
［３．本発明の調製方法の再現性評価］
［３．１　実施例乳化物３の調製］
　実施例１と同様に手振りで予備混合液を得た後、予備混合液の全量を、膜型フィルター（材質：疎水性ＰＴＦＥ、孔径：５μｍ）の取り付けられたシリンジ（Ｂ．ＢＲＡＵＮ製、容量３ｍＬ、内径１０ｍｍ）に、ピストンを引き抜いて吸い上げることにより膜乳化を行い、乳化物を得た（乳化操作方法：引き抜き）。前記疎水性ＰＴＦＥのフィルターとして、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製のものを使用した。
［３．２　乳化物の形態評価］
　５０ｍＬ程度の水の入った１００ｍＬビーカーに、得られた乳化物をゆっくりと一滴のみ滴下した。液滴が水中に分散せず、滴状に水面に浮いた場合はＷ／Ｏエマルションが得られたと判断した。一方、液滴が水中に速やかに分散した場合はＯ／Ｗエマルションが得られたと判断した。そして、Ｗ／Ｏエマルションを調製できた場合は良好、Ｗ／Ｏエマルションを調製できなかった場合は不良と評価した。
［３．３　調製方法の再現性評価］
　上記の乳化物の調製および乳化物の形態評価を１０回行った。その結果、１０回全てにおいてＷ／Ｏエマルションを調製できた。すなわち、１０回全ての乳化物の形態評価の結果が良好であり、本発明の調製方法を採用することで、再現性良くＷ／Ｏエマルションを調製できることがわかった。
［４．ポンピングの効果］
［４．１　実施例乳化物４の調製］
　実施例１と同様にして手振りで予備混合液を得た後、予備混合液の全量を、表３に示す膜型フィルターの取り付けられたシリンジ（Ｂ．ＢＲＡＵＮ製、容量３ｍＬ、内径１０ｍｍ）に、ピストンを引き抜いて吸い上げることにより膜乳化を行い、乳化物を得た（乳化操作方法：引き抜き）。
　一部の例については、得られた乳化物の入ったシリンジに取り付けられた使用済のフィルターニードルを外し、代わりにコネクタ（内径１ｍｍ、流路長さ１５ｍｍ）を前記シリンジに接続し、上記コネクタの他方の端に、別の空のシリンジ（Ｂ．ＢＲＡＵＮ製、容量３ｍＬ、内径１０ｍｍ）を連結させた。そして、前記乳化物を、２つのシリンジ間で１回以上往復させた。
　前記表３に示す膜型フィルターとして、ポリアミドはＢ．ＢＲＡＵＮ社製を使用し、ポリエステルはＦＯＲＴＥ　ＧＲＯＷ　ＭＥＤＩＣＡＬ社製を使用し、セルロース混合エステルはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、疎水性ＰＴＦＥはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社製を使用した。
［４．２　乳化物の分散安定性の評価］
　得られた乳化物の分散安定性を、粒度分布・分散安定性分析装置（装置名：ＬＵＭｉＳｉｚｅｒ（登録商標）、ＬＵＭ社製）を用いて評価した。測定は、乳化物を２５℃にて回転数２０００ｒｐｍで２時間または３時間遠心させ、その間５分毎に遠心分離セルの底部から約２５ｍｍまでの領域に測定光を照射し、該領域の遠心方向の位置ごとの透過率のプロファイルから評価した。
　（測定条件）
　測定セル：縦５ｍｍ×横１０ｍｍ×高さ５０ｍｍ直方体、光路長２ｍｍ
　サンプル充填量：０．４ｍＬ
　光源の波長：８７０ｎｍ
　上記評価で得られた結果のうち、疎水性ＰＴＦＥを使用し、ポンピング往復回数が０回の場合の結果を、一例として図１に示す。図１において縦軸は透過率、横軸は測定セルを横から見た際の位置を示す。この図１は、遠心開始から２時間遠心後まで一定時間間隔で求めた透過率のプロファイルを重ねたものである。本実施例では、分散安定性として、遠心後に水相が安定で分離しないことを評価した。詳細には、図１に示す通り、水相分離判断領域、すなわち、上記プロファイルのうち、横軸の１２３～１３０ｍｍの位置（プロファイルの右端から７マス目分）の透過率の変化量で、水相の分離の程度を判断し、水相の分散安定性を評価した。本実施例では、プロファイルの水相分離判断領域において２時間遠心後の透過率を求めた。
　各膜型フィルターを用いた例について、５分間遠心後のプロファイルと、２時間遠心後のプロファイルを並べたものを図２および図３に示す。これらのプロファイルのうち、２時間遠心後のプロファイルから、水相分離判断領域における２時間遠心後の透過率を求めた。なお、フィルターの材質がポリアミドの場合は、ポンピングの回数を０～３回、５回、１０回、１５回、２０回、２５回および３０回行い、それぞれの回数でのプロファイルを得た。該プロファイルを図４に示す。表３にはこのうち、０回、１回、５回、１０回および１５回の場合の２時間遠心後の透過率を示す。
　表３に、上記透過率を示す。本実施例では、上記「２時間遠心後の透過率」が１５％以下の場合を、水相の分離が十分に抑えられて、特に長期の分散安定性に特に優れていると評価した。この合格基準は、医療現場において、製剤後８時間以上は乳化物が安定であることに相当する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　図２、図３および表３の結果において、好ましくはポンピングを行うことによって、水相の分離が十分に抑えられ、長期にわたり分散安定性により優れたエマルション製剤が得られることが示された。また、図４では、ポンピングを１回以上行うことにより、ポンピングなしの場合よりも分散安定性がより改善されることが示された。

Claims (24)

  1. 　ペプチドエマルション製剤を調製する方法であって、
    　式（１）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、ＣとＣの間の結合はジスルフィド結合を表す。）
    で表されるアミノ酸配列からなる化合物、またはその薬学上許容される塩、および、
    　ＷＡＰＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳＡＹＧＳＬ（配列番号：１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、またはその薬学上許容される塩
    を含む水溶液と、
    　油性製剤とを混合してから振動撹拌を付与する工程と、
    　前記振動撹拌後の予備混合液を、膜型フィルターに通過させて乳化させる膜乳化工程と
    を含むペプチドエマルション製剤の調製方法。
  2. 　前記膜乳化工程において、前記振動撹拌後の予備混合液を、前記膜型フィルターに１回または２回以上通過させて乳化させる、請求項１に記載のペプチドエマルション製剤の調製方法。
  3. 　前記膜乳化工程において、前記振動撹拌後の予備混合液を、前記膜型フィルターに１回通過させて乳化させる、請求項１に記載のペプチドエマルション製剤の調製方法。
  4. 　さらに、前記膜乳化工程で得られた乳化物を、膜型フィルターを介することなく連結された２つの容器間で１回または数回以上往復移動をさせる工程を含む、請求項１～３のいずれかに記載のペプチドエマルション製剤の調製方法。
  5. 　前記往復移動の回数が１回である、請求項４に記載のペプチドエマルション製剤の調製方法。
  6. 　前記振動撹拌が、手振りによる撹拌である、請求項１～５のいずれかに記載のペプチドエマルション製剤の調製方法。
  7. 　前記膜型フィルターは、ポリアミド、ポリエステル、フッ素樹脂、ポリエーテルスルホン、ポリプロピレン、セルロースアセテート、セルロース混合エステル、およびグラスファイバーからなる群より選択される１種以上を含む成分で形成されている、請求項１～６のいずれかに記載のペプチドエマルション製剤の調製方法。
  8. 　前記膜型フィルターは、ポリアミド、ポリエステル、フッ素樹脂、ポリプロピレン、セルロースアセテート、およびグラスファイバーからなる群より選択される１種以上を含む成分で形成されている、請求項１～７のいずれかに記載のペプチドエマルション製剤の調製方法。
  9. 　前記フッ素樹脂は、ポリテトラフルオロエチレンおよびポリフッ化ビニリデンからなる群より選択される１種以上である、請求項７または８に記載のペプチドエマルション製剤の調製方法。
  10. 　前記フッ素樹脂が、ポリテトラフルオロエチレンである、請求項７～９のいずれかに記載のペプチドエマルション製剤の調製方法。
  11. 　前記油性製剤は、不完全フロイントアジュバントである、請求項１～１０のいずれかに記載のペプチドエマルション製剤の調製方法。
  12. 　前記油性製剤は、モンタナイドである、請求項１～１１のいずれかに記載のペプチドエマルション製剤の調製方法。
  13. 　前記ペプチドエマルション製剤は、Ｗ／Ｏ型のペプチドエマルション製剤である、請求項１～１２のいずれかに記載のペプチドエマルション製剤の調製方法。
  14. 　前記ペプチドエマルション製剤は、賦形剤を含むものである、請求項１～１３のいずれかに記載のペプチドエマルション製剤の調製方法。
  15. 　前記賦形剤は、精製白糖、グリシン、乳糖、ブドウ糖、マルトース、塩化ナトリウム、シュクロース、マンニトール、トレハロース、およびトレハロース水和物からなる群より選択される１種以上を含むものである、請求項１４に記載のペプチドエマルション製剤の調製方法。
  16. 　前記ペプチドエマルション製剤は、ｐＨ調整剤を含むものである、請求項１～１５のいずれかに記載のペプチドエマルション製剤の調製方法。
  17. 　前記ｐＨ調整剤は、クエン酸、乳酸、酒石酸、塩酸、硫酸、硝酸、コハク酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トロメタモール、ヒスチジン、Ｌ－アルギニン、およびメグルミンからなる群より選択される１種以上を含むものである、請求項１６に記載のペプチドエマルション製剤の調製方法。
  18. 　前記ｐＨ調整剤は、酒石酸、コハク酸、塩酸、水酸化ナトリウム、トロメタモール、Ｌ－アルギニン、およびメグルミンからなる群より選択される１種以上を含むものである、請求項１６または１７に記載のペプチドエマルション製剤の調製方法。
  19. 　前記ペプチドエマルション製剤は、抗酸化剤を含むものである、請求項１～１８のいずれかに記載のペプチドエマルション製剤の調製方法。
  20. 　前記抗酸化剤は、メチオニン、アスコルビン酸、エデト酸ナトリウム、およびピロ亜硫酸ナトリウムからなる群より選択される１種以上を含むものである、請求項１９に記載のペプチドエマルション製剤の調製方法。
  21. 　前記抗酸化剤がメチオニンである、請求項１９または２０に記載のペプチドエマルション製剤の調製方法。
  22. 　前記ペプチドエマルション製剤は、可溶化剤を含むものである、請求項１～２１のいずれかに記載のペプチドエマルション製剤の調製方法。
  23. 　前記可溶化剤は、αシクロデキストリン、βシクロデキストリン、γシクロデキストリン、ヒドロキシプロピルβシクロデキストリン、スルホブチルエーテルβシクロデキストリン等の天然型シクロデキストリン、ヒドロキシエチル－β－シクロデキストリン（ＨＥ－β－ＣＤ）、ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（ＨＰ－β－ＣＤ）、メチル－β－シクロデキストリン（Ｍ－β－ＣＤ）、スルホブチルエーテル－β－シクロデキストリン（ＳＢＥ－β－ＣＤ）等のシクロデキストリン誘導体、エチレンジアミン、トリエタノールアミン、ジエタノールアミン等のアミン、アスパラギン酸、グリシン、リン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、コハク酸、Ｌ－アルギニンデオキシコール酸ナトリウム、ウルソデスオキシコール酸等の酸、尿素、エチル尿素、メグルミン、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、サリチル酸ナトリウム、およびニコチン酸アミドからなる群より選択される１種以上を含むものである、請求項２２に記載のペプチドエマルション製剤の調製方法。
  24. 　前記可溶化剤は、βシクロデキストリン、ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（ＨＰ－β－ＣＤ）、酒石酸、およびコハク酸からなる群より選択される１種以上を含むものである、請求項２２または２３に記載のペプチドエマルション製剤の調製方法。
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