WO2007083763A1

WO2007083763A1 - 生理活性ペプチドのエマルション製剤の調製方法、および当該製剤を調製するためのキット

Info

Publication number: WO2007083763A1
Application number: PCT/JP2007/050831
Authority: WO
Inventors: Akira Yamada; Kose Michibuchi; Taketeru Obata; Nobutaka Iyama; Tadayo Miyasaka
Original assignee: Greenpeptide Co., Ltd.
Priority date: 2006-01-23
Filing date: 2007-01-19
Publication date: 2007-07-26
Also published as: JPWO2007083763A1

Abstract

　本発明は、非常に簡便に実施することができる上に、非常に微細なエマルションを調製することができる方法と、当該方法で利用することができるキットを提供することを課題とする。本発明に係る生理活性ペプチドエマルション製剤の調製方法は、少なくとも生理活性ペプチド水溶液とオイルアジュバントを含み、生理活性ペプチド水溶液に対するオイルアジュバントの含有割合が０．５～５容量倍である混合液を調製し；当該混合液を、コネクタにより連結された２個のシリンジ間で移動させることを特徴とする。

Description

明細書

生理活性ペプチドのエマルシヨン製剤の調製方法、および当該製剤を調製するためのキット

技術分野

[0001] 本発明は、生理活性ペプチドのエマルシヨン製剤を製造する方法、および当該方法で使用できるエマルシヨン製剤調製用キットに関するものである。

背景技術

[0002] 癌などの悪性腫瘍に対する治療においては、ペプチドを抗原として含むワクチンを投与することによって、悪性腫瘍に対する特異的免疫を増強しょうとする試みがなされている。さらに、免疫増強作用を一層高めるため、アジュバントという免疫助成剤が投与されることもある。この場合、アジュバントは流動パラフィン等の油性成分であるため、ペプチドとアジュバントを水に混合した上でエマルシヨンとし、これを注射剤として投与する。

[0003] しかし、製剤中に含まれるエマルシヨンの中に径の大きなものが含まれていると、生体がこれを異物と認識し、肉腫が形成されるなど様々な副反応が生じるおそれがある。よって、エマルシヨン製剤においては、エマルシヨン径を小さくすることが非常に重要になる。

[0004] 微細なエマルシヨンを製造するための技術としては、様々なものが検討されてヽる。

例えば特開 2005— 152740には、大豆油等の分散相とドデシル硫酸ナトリウム水溶液等の連続相を合流させた直後に流速を急激に低下せしめることを特徴とするエマルシヨンの製造方法と、その方法を実施するための装置が記載されて、る。

[0005] また、特開 2005— 186026には、エマルシヨンを調製するためのデバイスであって、 2個のシリンジをコネクタにより連結し、その間にシラス多孔質ガラス膜製多孔体を挟んだものが開示されている。

発明の開示

[0006] 上述した様に、微細なエマルシヨンを調製するための技術として、従来、様々なものが知られている。しかし、エマルシヨンを製剤として用いる場合には、従来技術で得られるエマルシヨンの径は必ずしも満足できるものでない場合があった。例えば、エマルシヨン製剤におけるエマルシヨン径としては 1 μ m前後が好ましいとされているが、特開 2005— 152740の技術で調製されるエマルシヨンの径は、 16、 12および 8. 9 μ mであ。

[0007] その一方で、特開 2005— 186026の技術によれば、約 2 μ mのエマルシヨンも得られている。しかし特許文献 2には、エマルシヨンに関して単に WZO型エマルシヨンとのみ記載されており、特殊な医薬用のペプチドエマルシヨン製剤を調製するため〖こ如何なる原料を用いればょ、か一切記載されて、な、。

[0008] また、エマルシヨン製剤は安定性に乏しぐ製造した後に出荷した場合、エマルション同士が融合して径が大きくなつて危険性が増すという問題がある。よって、ェマルシヨン製剤の場合には使用直前に調製することが好ましいため、エマルシヨン製剤をできる限り簡便に用時調製するための技術が求められていた。

[0009] そこで本発明が解決すべき課題は、非常に簡便に実施することができる上に、非常に微細なエマルシヨンを調製することができる方法と、当該方法で利用することができるキットを提供することにある。

[0010] 本発明者は、上記課題を解決すベぐ微細なエマルシヨンを容易に得られる条件につき鋭意研究を重ねた。その結果、オイルと水との混合液を、コネクタを介したシリンジ間で繰り返し移動させることによって、上記目的が達成できることを見出して本発明を完成した。

[0011] 本発明に係る生理活性ペプチドのエマルシヨン製剤の調製方法は、

少なくとも生理活性ペプチド水溶液とオイルアジュバントを含み、生理活性ペプチド水溶液に対するオイルアジュバントの含有割合が 0. 5〜5容量倍である混合液を調製し；

当該混合液を、コネクタにより連結された 2個のシリンジ間で移動させることを特徴とする。

[0012] また、本発明に係るエマルシヨン製剤調製用キットは、

生理活性ペプチドを生理食塩水または l〜6wZv%のアルカリ金属炭酸水素塩水溶液に溶解した溶液を凍結乾燥することにより得た生理活性ペプチド組成物を 1種以上；

生理活性ペプチド組成物を溶解することによって、血漿と等張または略等張の生理活性ペプチド溶液を得られる量の水を生理活性ペプチド組成物と同数；およびオイルアジュバントを生理活性ペプチド組成物と同数；

含有することを特徴とする。

図面の簡単な説明

[0013] [図 1]本発明で用いるシリンジの一例を示す模式図である。図中、 1はプランジャを示し、 2はシリンジ筒部のツバを示し、 3はガスケットを示し、 4はノズル (ノック式）を示し、 5は生理活性ペプチド水溶液とオイルアジュバントを含む混合液を示す。

[図 2]本発明で用いるコネクタの一例を示す模式図である。図中、 6はシリンジ装着部位を示し、 7は通液部を示し、 8は気泡抜きを示し、 9はコックを示す。

[図 3]本発明方法に係るボンビングを行なう装置の一部を示す模式図である。図中、 10はボンビング部を示し、 11は固定台を示す。

[図 4]本発明で用いるコネクタの一例を示す模式図である。

発明を実施するための最良の形態

[0014] 本発明に係る生理活性ペプチドエマルシヨン製剤の調製方法は、

[0015] 本発明で用いる生理活性ペプチドの種類は、特に制限されないが、例えば、ヒトゃ動物の疾患予防や治療などに用いる抗原として利用し得るものを挙げることができる。例えば、癌などの悪性腫瘍に対する患者の特異的免疫を高めるワクチン、ウィルスや細菌による感染症の予防や持続感染患者においてウィルスや細菌等に対する特異的免疫を高めるワクチン、またはアレルギー反応を抑制する減感作療法のための抗原等が挙げられる。

[0016] さらに、本発明に用いるペプチドの大きさには特に制限はないが、ペプチドを構成するアミノ酸数において好ましくは 20以下、より好ましくは 4〜20、さらに好ましくは 8 〜20、さらに好ましくは 8〜15、最も好ましくは 9または 10である。ペプチドを構成するアミノ酸数が多過ぎると、溶解性が悪くなり易くなることがあるためである。

[0017] 本発明で用いるオイルアジュバントは、医薬製剤の構成成分として許容されている油性の免疫助成剤であれば特にその種類は問わない。例えば、流動パラフィン、ラノリン、フロイント等を挙げることができる。

[0018] 本発明で用いる水としては、純水、精製水、蒸留水、滅菌水など医薬製剤の構成成分として許容されているものを使用できる。但し、生理活性ペプチドを溶解した場合、その浸透圧が血漿と同等である必要がある。よって、ペプチドが塩類等と共に凍結乾燥されたものである場合には、溶液が血漿と等張または略等張となる様に滅菌水等の量を調整するか、必要に応じて塩ィ匕ナトリウム等の塩類を添加する。なお、略等張は、水溶液中の塩濃度がヒトへの投与に許容される濃度であればよいが、水溶液中の塩濃度が 0. 5〜6wZv%となることが好ましい。ペプチドが塩類等を含まない場合には、生理食塩水やグルコース水溶液などを用いてもよい。また、最終的に、薬理上許容されて!ヽる酸や塩基により pHを調整してもよヽ。

[0019] 本発明では、生理活性ペプチド、オイルアジュバントおよび水を混合して混合液とする。好適には、先ず生理活性ペプチドを水に溶解した上でオイルアジュバントをカロえる。この際の混合割合は、エマルシヨンの形成を容易にするために、生理活性ぺプチド水溶液に対するオイルアジュバントの含有割合で 0. 5〜5容量倍とする。

[0020] 本発明では、上記混合液を調製するに当たり、生理活性ペプチド水溶液とオイルァジュバントの混合物を攪拌し、水相と油相力もなる分離した層を解消することが好ましい。通常、水相である生理活性ペプチド水溶液と油相であるオイルアジュバントを単に混合すると、水相と油相が二層に分離する。しかし、混合液における二層分離を解消しておけば、続くエマルシヨンの調製工程の効率をよりいっそう高めることができる。ここで、水相と油相からなる分離した層を解消するとは、力かる二層に分離した液を攪拌することによって、少なくとも水相と油相による二層の形成が肉眼で観察できなくなることをいうものとする。なお、当該二層間の界面が解消されると、比較的径の大きなエマルシヨンが形成され、混合液は白濁する。 [0021] 例えば、オイルアジュバントを攪拌しつつ生理活性ペプチド水溶液を少量ずつ加えたり、或いは生理活性ペプチド水溶液の一部をオイルアジュバントへカ卩えては攪拌するという操作を繰り返し行う。また、生理活性ペプチド水溶液の全量とオイルアジュバントを一方のシリンジへ挿入して振とう攪拌する力、或いは、生理活性ペプチド水溶液の一部とオイルアジュバントを一方のシリンジへ挿入しては振とう攪拌するという操作を繰り返し、シリンジ内で水相と油相からなる分離した層を解消してもよい。より好ましくは、オイルアジュバントへ生理活性ペプチドを半量カ卩えて 5秒〜 1分間程度攪拌する操作を 2回行う。

[0022] なお、水相と油相力なる分離した層が解消された混合液を静置しておくと、再び相分離が起こる場合があるので、かかる二層を解消した後はできるだけ速やかに次工程へ移行することが好ま U 、。

[0023] 本発明方法では、次に、コネクタにより連結された 2個のシリンジ間で、上記混合液を繰り返し移動させる。即ち、断面積が大きなシリンジ筒から断面積の小さなコネクタへ、また、コネクタ力もシリンジへの移動を繰り返して混合液を激しく攪拌することによつて、径が 1 μ m前後という微細なエマルシヨンを簡便に調製することができる。

[0024] 当該工程で用いるシリンジ筒部の断面積は、コネクタの断面積の 2〜150倍、好ましくは 2〜50倍とする。シリンジ筒部の断面積がコネクタ断面積の 2倍未満であると、上述した効果が十分に発揮されない場合があり、一方、 150倍を超えるとシリンジや装置等に力かる負担が大きくなり過ぎるおそれがある。

[0025] より具体的には、シリンジの筒部の断面積は 50〜500mm²程度とすればよぐコネクタの断面積は 0. 5〜30mm²程度とすればよい。なお、シリンジ筒部やコネクタの断面の形状は特に制限されないが、負担が局所的にかかることを防ぐために円形ゃ楕円形、或いは多角形である略円形が好適であり、円形が特に好ましい。また、当該規定における断面積は、シリンジの筒部の空洞部分における断面積と、コネクタ内に形成されている通路のうち最も細い部分における空洞部分の断面積とする。つまり、本発明で用いるコネクタは、端部においてシリンジと密着させる必要があるため、端部は円錐状に広げる場合がある。この場合においては、中央の通路部の空洞部分の断面積を基準にする。 [0026] コネクタの流路の断面形状を円形にする場合には、当該流路の内径を 0. 8〜1. 7 mmとすることが好ましぐさらに、 0. 9mm以上、 1. 5mm以下とすることが好ましい。微細なエマルシヨンを安定して調製できるからである。なお、流路の太さが均一でない場合は、流路の内径とは、最も細い部分における内径をいうものとする。

[0027] コネクタの流路の長さは 10〜15mmとすることが好ましい。流路の長さが 10mm未満となると、抵抗が少なくなるため、エマルシヨンの調製の効率が悪くなることがある。一方、 15mmより長くなるとコネクタの強度が十分確保できなくなる場合がある。

[0028] なお、本発明のコネクタは、中央部に気泡を抜くための排出口を有する三方活栓としてもよく、排出口を有さない直管状のコネクタのいずれでもよい。但し、液漏れなどを防止する観点力もは、直管状のコネクタを用いることが好ましい。

[0029] 混合液のシリンジ間の移動は、 30回以上繰り返すことが好ましい。回数が多いほど微細なエマルシヨンが形成し易くなり、 30回以上であれば製剤として適するエマルシヨンが形成されると考えられるからである。一方、上限は特に制限されないが、過剰に移動を繰り返してもエマルシヨンが無制限に微細となる訳ではな、ので、例えば目視などで確認しつつ適宜移動を停止すればよい。通常、 150回程度行えば十分である

[0030] また、混合液のシリンジ間の移動を 20回以上繰り返した後に 0. 5〜： L0分間静置し、再度 1回以上、より好ましくは 10回以上移動を繰り返すのも好適な態様である。この態様は、特にエマルシヨンが形成され難い場合に効果を発揮でき、エマルシヨンの形成がより一層容易になる。

[0031] なお、以下では、混合液が一方のシリンジからコネクタを通過して他方のシリンジへ移動するまでを、ボンビング 1回という。即ち、混合液のシリンジ間の移動 1回を、ボンビング 1回とする。

[0032] さらに本発明においては、事前に混合液を攪拌し、水相と油相からなる分離した層を解消してぉヽた場合には、より少なヽポンビングの回数でエマルシヨンが調製できる。この場合には、ボンビングを少なくとも 3回以上で 50回以下、より好ましくは 10〜5 0回ポンビングを行う。

[0033] また、ボンビングの速度は特に制限されな!、が、ボンビングの速度が遅過ぎたりまたは早過ぎる場合にはエマルシヨンが形成され難くなる場合がある。よって、ボンビングの速度は、好ましくは 1分間当たり 30〜90回、より好ましくは 60〜90回の速度で行うことが好ましい。

[0034] 本発明に係るエマルシヨン製剤調製用キットは、 1種以上の生理活性ペプチド組成物と、これと同数の水およびオイルアジュバントを含有する。

[0035] 本発明キットにおける 1種以上の生理活性ペプチド組成物は、それぞれ生理食塩水または l〜6wZv%のアルカリ金属炭酸水素塩水溶液に溶解した溶液を、凍結乾燥することにより得たものである。ここで「1種以上」としたのは、特に患者の免疫活性を増強するためのペプチドエマルシヨン製剤にぉ、ては、患者に応じた生理活性べプチドを複数投与する場合があることを考慮したものであり、好ましくは 2種以上、さらに好ましくは 2種を用いる。また、ここでの生理活性ペプチドは、本発明方法に関して説明したものと同様のものを用いることができる。

[0036] 生理活性ペプチドを溶解するための溶媒としては、生理食塩水または l〜6wZv %のアルカリ金属炭酸水素塩水溶液を用いる。ここでは、生理食塩水と当該アルカリ金属炭酸水素塩水溶液を混合して用いてもょ、。

[0037] 本発明のエマルシヨン製剤調製用キットに含まれるペプチド組成物は、生理活性べプチドをいったん溶媒に溶解したものをバイアルに分注した後に凍結乾燥することにより製造する。これは、利便性の観点力もは溶液の状態のほうがよいが、安定性が悪くなるという問題点があり、凍結乾燥粉末とすることで、安定性が向上するためである。溶媒としては生理食塩水が好適である力生理活性ペプチドの中には生理食塩水に溶解し難いものがある。また、使用される生理活性ペプチドの種類は患者により異なる場合が多、ので、逐一溶媒を検討して、たのではキットの生産性が低下してしまう。そこで本発明では、生理活性ペプチドを溶解するための溶媒として、より好適には l〜6wZv%のアルカリ金属炭酸水素塩水溶液を用いる。当該溶媒は、生理食塩水に対する溶解性が低いペプチドにも溶解性を示すため、キットの生産性を向上することがでさる。

[0038] 本発明のペプチド組成物としては、 2種以上のペプチドを溶媒に溶解し凍結乾燥したものや、 1種類ずつのペプチドを溶解し凍結乾燥した後に混合したものであってもよいが、好ましくはペプチド 1種類ずつを個別に溶解および凍結乾燥し、複数のぺプチドを混合しな、ものであることが好ま、。 2種類以上のペプチドを混合した凍結乾燥粉末の状態で保管すると、使用する場合に問題を生ずる可能性があるためである

[0039] 上記アルカリ金属の炭酸水素塩としては、炭酸水素リチウム、炭酸水素ナトリウムおよび炭酸水素カリウムを挙げることができる力炭酸水素ナトリウムが好適である。また、アルカリ金属の炭酸水素塩水溶液濃度を l〜6wZv%としたのは、 lwZv%未満であるとペプチドの溶解効果が十分に発揮されない場合があり、 6wZv%を超えると、投与するに当たり適切な塩濃度に調整するために水の容量が多くなつてしまい、投与に不適切な状態となってしまうおそれがあるからである。

[0040] 本発明キットにおける水の量は、生理活性ペプチド組成物を溶解することによって、血漿と等張または略等張の生理活性ペプチド溶液を得られる量とする。ここで「略等張」は、前述したものと同義である。

[0041] 本発明キットに含まれる生理活性ペプチド組成物を製造する際において、生理食塩水または炭酸水素塩水溶液の量は、ペプチドを均一溶解できるものであれば特に制限はない。但し、ペプチドと生理食塩水またはアルカリ金属の炭酸水素塩水溶液との比率は、得られるペプチド溶液のペプチド濃度が 0. 4質量％以下、好ましくは 0. 1 〜0. 4質量％、より好ましくは 0. 3〜0. 4質量％となる様にすることが好ましい。

[0042] 本発明キットとしては、さらに筒部の断面積が 50〜500mm²である 2個のシリンジを含有するものや、当該シリンジ用のコネクタを含むものが好適である。コネクタとしては、その断面積が上記シリンジの筒部断面積の 0. 02-0. 5倍であるもの、流路の断面形状が内径 0. 8〜1. 7mmの円形であるもの、また、流路の長さが 10〜15mm であるものが好適である。エマルシヨン製剤にぉヽては患者により使用するペプチドが異なる場合が多いため、エマルシヨン製造用のシリンジやコネクタは逐一交換する必要がある。よって、これらシリンジやコネクタを備えたキットは利便性が高い。

[0043] 本発明のキットに含まれるシリンジは、図 1に示すような一般的なものでよい。但し、本発明では油性であるアジュバントを含む混合液を挿入してボンビングを繰り返すため、シリンジ筒部やガスケットの材質は、表面コートされたものなど耐久性の高いものが好適である。

[0044] 本発明のキットに含まれるシリンジ用のコネクタは、 2つのシリンジを連結するためのものであり、例えば、図 2と 4に示すようなものを用いることができる。図 2に示すコネクタは、気泡を抜くための排出口を有する三方活栓を有する。また、図 4は直管状のコネクタであり、管の左右にシリンジとの結合部を有する。

[0045] 本発明に係るエマルシヨン製剤を調製するには、本発明キットの生理活性ペプチド組成物を水に溶解したものをコネクタにより連結されたシリンジの一方に挿入し、ボンビングする。このボンビングは、図 3に示すように、少なくとも、コネクタにより連結されたシリンジを着脱自在に固定する固定台 11と、当該シリンジの各プランジャを同方向に往復動させる連動機構を有するボンビング装置により行なうことができる。

[0046] 上記固定台は、上記方法やキットにおいて説明したシリンジを着脱自在に固定するものである。この固定台は、シリンジのプランジャが押引されるに連れて筒部が移動しない様に固定するものである必要がある。例えば、図 3において固定台 11にシリンジ筒部のツバを引っ掛け、上力もカバーをして固定する。また、個々の患者に投与すベき製剤を調製するごとに、或いは異なる生理活性ペプチドを用いるごとにシリンジやコネクタを交換する必要が生じる場合があるので、当該固定台は、シリンジが着脱自在なものである必要がある。

[0047] ボンビング装置は、上記固定台に固定したシリンジの各プランジャを同方向に往復動させるための連動機構を有する。この連動機構としては、例えばモーターの回転運動を水平運動に変えるカムによりボンビング部 10を動かし、各プランジャを同方向に往復動させるものが考えられる。また、当該連動機構は、上記固定台自体が動かない様に固定されている場合には、各プランジャを押引するものであればよぐ各プランジャが動かない様に固定されている場合には、上記固定台を往復運動させるものであればよい。

[0048] ボンビング装置は、好適にはプランジャの往復動速度を調整する手段を有する。当該手段としては、例えばモーターの回転数を変える変速機や、モーターの回転自体を制御する装置などを挙げることができる。

[0049] 本発明に係る生理活性ペプチドエマルシヨン製剤の調製方法によれば、エマルション径が極めて微細なペプチドエマルシヨン製剤を簡便に調製することができる。よつて、エマルシヨン製剤を調製して力も使用するまでに時間が力かるとエマルシヨン同士が融合して径が大きくなり思わぬ副作用を生じることがある力本発明方法によれば、例えば病院等で製剤を調製した後直ぐに投与することが可能になる。

[0050] また、本発明エマルシヨン製剤調製用キットは、本発明方法で使用できるものであり、且つ特定の溶媒を用いることによりペプチドの分注を効率良く行なうことができ、製造が容易である。

[0051] 以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例により制限を受けるものではなぐ前 ·後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に含まれる。

実施例

[0052] 実施例 1

表 1に示す前立腺癌治療用または脳腫瘍治療用の生理活性ペプチド (4mg)を 4w Zv%炭酸水素ナトリウム水溶液（lmL)に溶解し、さらにオイルアジュバントとして SE PPIC社製の ISA51VG (lmL)を加え、混合液とした。 2個のシリンジ（ビーブラウン社製、 2mLシリンジ、断面積： 66. 3mm²)を断面積： 2. 43mm²のコネクタで連結し、得られた混合液を一方のシリンジへ挿入した。ここで、シリンジの筒部断面積は、コネクタ断面積の約 27倍である。このシリンジをボンビング装置に設置し、 100回 Z分の速度でボンビングを 100回繰り返した。その結果、表 1に示す通り、 No. 1、 5および 1 4以外はエマルシヨンを形成することができた。次に No. 1、 5および 14において、シリンジを 5mL容のもの（断面積： 111. 63mm²、シリンジの筒部断面積 Zコネクタ断面積 =約 46)に変更した以外は同様の処理を行なった力 No. 1ではエマルシヨンを形成することができたものの、 No. 5と 14では形成できな力つた。次いで、実施例 1 〜 16において 5mLシリンジを使用し、ポンビングを 100回 Z分の速度で 50回繰り返した後に 5分間静置し、さらに同様の速度でボンビングを 50回繰り返したところ、全ての実施例でエマルシヨンを形成することができた。

[0053] [表 1] 生理活性ペプチド 2mL 5mLシリンジ

用途配列シリンジ断 fee

No. 1 DYSARWNEI X 〇〇

No. 2 VYDYNCHVDL O ― 〇

No. 3 HYTNASDGL O ― O

No. 4 TFDYLRSVL 〇 ― O

No. 5 前 DYLRSVLEDF X X O

No. 6 LYCESVHNF 〇 ― O

θ¾

No. 7 CYASGWGSI 〇 ― O

No. 8 用 HYRKWIKDTI O ― 〇

No. 9 TYSVSFDSL o ― 〇

No. 1 0 KYDCFLHPF o ― O

No. 1 1 KYVGIERE 〇 ― 〇

No. 1 2 RYLTQETNKV o ― 〇

No. 1 3 AYDFLYNYL

駟 o ― 〇

No. 1 4 腫 LYAWEPSFし X X 〇

No. 1 5 NYSV YRPGL 〇 ― O

用

No. 1 6 DYVREHKDNI 〇 ― O

[0054] 5分間の静置を介してポンビングを 50回繰り返して形成したエマルシヨンにつ!、て、粒度分布計（日機装社製、マイクロトラック UPA150— EX)を用いて、ボンビング終了後と、さらに 1日間静置した場合におけるエマルシヨンの粒度分布を、動的光散乱法により測定した。各エマルシヨンのメディアン径を表 2に示す。

[0055] [表 2]

メディアン径

生理活性ペプチド

直後 1曰後

No. 1 DYSAR NEI 1.48 1.66

No. 2 VYDYNCHVDL 1.46 1.05

No. 3 HYTNASDGL 1.42 1.10

No. 4 TFDYLRSVL 1.44 0.50

No. 5 DYLRSVLEDF 1.83 1.23

No. 6 LYCESVHNF 2.07 1.47

No. 7 CYASGWGSI 2.25 1.72

No. 8 HYRKWIKDTI 1.48 1.54

No. 9 TYSVSFDSL 1.07 1.81

No. 1 0 YDCFし HPF 1.35 1.40

No. 1 1 KYVGIERE 1.43 1.47

No. 1 2 RYLTQETNKV 1.00 1.72

No. 1 3 AYDFLYNYし 1 ,50 1.73

No. 1 4 LYAWEPSFL 1.26 1.34

No. 5 NYSVRYRPGL 1.47 1.83

No. 1 6 DYVREH DNI 2.11 1.55

[0056] 当該結果の通り、本発明方法と装置によれば、 1 μ m前後という極めて微細なエマルシヨン径を有するペプチドエマルシヨンを簡便に得られることが実証された。

[0057] 実施例 2

本発明のエマルシヨン製剤調製用キットを製造する場合を考慮して、種々の溶媒に関し、実施例 1で使用した No. 1〜 12のペプチドの溶解性を調べた。具体的には、冷喑所保存されていたペプチドを室温に戻した後、低湿度室 (温度： 23. 0°C、湿度: 10%RH)中で約 5mgを秤量し、透明容器へ入れた。そこへ溶媒を 200 μ Lカ卩え、穏やかに攪拌して溶解したか否かを目視で確認した。溶解が確認できなヽ場合には、さらに溶媒を 200 μ Lずつ加えて攪拌する操作を繰り返し、溶媒量 1. 25mLでも溶解しない場合には「不溶」と判断した。結果を表 3に示す。

[0058] [表 3]

[0059] 表中、◎は 5πι₈/ 200 /ζ Lで溶解した場合、〇は少なくとも 5mgZl . 25mLまでで溶解した場合、 Xは 5mg/l. 25mLでも溶解しな力つた場合、一は未実施、 *は 1%酢酸を用いたことを示す。

[0060] 上記結果の通り、先ず注射製剤で汎用されている生理食塩水を用いたところ、半数のペプチドを溶解することができたが、溶解性を示さないペプチドが 8個あった。そこで、 4wZv%炭酸水素ナトリウムを用いたところ、全てのペプチドに溶解性を示した。また、 No. 1、 2、 4、 6、 7、 9のペプチドに関しては 10%または 1%酢酸でも同様の実験を行なつたが、 3個のペプチドが不溶であつた。

[0061] エマルシヨン製剤調製用キットを製造するに当たっては、ペプチドを溶解する溶媒の種類はできるだけ統一して数を少なくする方が生産性は高い。本実施例 2により、生理活性ペプチドに対しては、炭酸水素ナトリウム水溶液が高！ヽ溶解性を示すことが明ら力となった。なお、結果としては示していないが、 1M水酸化ナトリウムでも実験を行なったところ、高い溶解性が示された。しかし、水酸ィ匕ナトリウムは注射剤に適さない。一方、炭酸水素ナトリウムは、注射剤の成分として特に問題はない。

[0062] 以上の結果より、本発明のエマルシヨン製剤調製用キットを製造するに当たり、いつたん生理活性ペプチドを溶解するための溶媒としては炭酸水素ナトリウム水溶液が適することが実証された。

[0063] 実施例 3

上記実施例 1で使用した生理活性ペプチド (No. 1、 3、 6)と、生理食塩水または 4 wZv%炭酸水素ナトリウム水溶液とを表 4に記載の容量で混合してペプチド溶液を得た後に、バイアルへペプチド溶液を充填し、凍結乾燥を行なって生理活性べプチド組成物を得た。

[0064] [表 4]

[0065] 上記生理活性ペプチド組成物の溶解性と安定性について、以下の様に評価した。

まず、上記生理活性ペプチド組成物の 1バイアルに水 lmLを添加し、穏やかに 1分間混合攪拌を行った後に目視にて状態を確認した。結果を表 5に示す。

[0066] [表 5]

〇：完全に溶解したものを示す

[0067] 表 5の結果の通り、生理活性ペプチドをいつたん生理食塩水または炭酸水素ナトリゥム水溶液に溶解した上で凍結乾燥した生理活性ペプチド組成物は、極めて容易に水へ溶解できることが実証された。

[0068] 実施例 4

上記実施例 3で製造した生理活性ペプチド組成物、実施例 1で使用したオイルアジュバントおよび水をそれぞれ別個のノィアルに包装し、また、 5mLシリンジ (筒部断面積： 111. 63mm²)とそのコネクタ（断面積： 2. 43mm²)を加え、表 6に記載のエマルシヨン製剤調製用キットとした。

[0069] 当該エマルシヨン製剤調製用キットを用いて、実施例 1と同様に生理活性ペプチド組成物を水に溶解し、オイルアジュバントをカ卩えた後に、コネクタで連結した 5mLシリンジの一方に挿入し、断続的にボンビングを繰り返したところ、均一で微細なェマルシヨンを調製することができた。

[0070] [表 6]

[0071] 上記結果の通り、本発明のエマルシヨン製剤調製用キットは、エマルシヨン製剤を簡便に用時調製できるものとして極めて有用であることが実証された。

[0072] 実施例 5

コネクタの内径を検討するために、生理食塩水（lmL)とオイルアジュバントとして S EPPIC社製の ISA51VG (lmL)を用いて、以下のようにしてエマルシヨン製剤を調製した。まず、これら生理食塩水とオイルアジュバントを混合した 2個のシリンジ (ビーブラウン社製、 5mL容のもの（断面積： 111. 63mm²) )を準備し、一方のシリンジへ得られた混合液を全量分取し、表 7のコネクタのいずれかで連結して、手動で 5回のポンビングを行った。次いで、このシリンジをポンビング装置に設置し、表 7に記載の条件でボンビングした。 [0073] また、得られたエマルシヨンについて、以下の通りドロップテストを行った。詳しくは、得られたエマルシヨン分散液の 1滴を水面上に滴下し、当該分散液が水中に直ぐ分散しない場合を「良（〇）」、直ぐに分散する場合を「不良（X )」とした。なお、エマルシヨンが適切に形成されていれば、その分散液を水中に滴下しても直ぐには分散しないが、適切に形成されていない場合には、直ぐに分散する。以上の結果を表 7に示す。

[0074] [表 7]

[0075] 表 7の結果から、コネクタの流路の内径が 0. 8mmの場合では、エマルシヨンを安定的に得られない場合があった。しかし、ボンビングの速度を遅くすることによって、ェマルシヨンを得ることができた。また、当該内径が 1. 0〜1. 4mmのコネクタを使用した場合では、微細なエマルシヨンをより一層安定して調製できることがわ力つた。

[0076] 実施例 6

エマルシヨンの調製方法とコネクタの長さを以下のようにして検討した。まず、表 1に記載の NO. 14のペプチド (4mg)を 4WZV%炭酸水素ナトリウム水溶液（lmL)に溶解した。次いで、 2個の 5mL容シリンジを、表 8に記載の直管状のコネクタで連結した。生理活性ペプチド水溶液とオイルアジュバント（lmL)とを一方のシリンジ内にカロえ、表 8に記載の条件でエマルシヨンを調製した。結果を表 8に示す。

[0077] [表 8] コネクタの

：:木クタの

流路の長ポンビング Kロップテス卜内径（mm) 混合方法

さ (mmJ

1 15 生理活性ペプチド水溶液全量と X

5回ボンビング

アジュバン卜とを、

1 15 →1分間静置〇シリンジ内で白港するまで、

→50回ポンビング

1 15 5秒〜 1分間振とう〇

1 15 3回ポンビング o

1 15 1 0回ポンビング〇生理涪性ペプチド半量とアジュパント

1 15 20回ポンビング〇とを白滞するまで 5秒〜 1分間

1 15 振とうした後、さらに残りの半量を 30回ポンビング〇添加して、白濁するまで

1 15 5秒〜 1分間振とう 40回ポンビング o

1 15 50回ポンビング o

1 10 1 50回ボンビング o

[0078] 表 8の結果から、混合工程にお 1ヽて、生理活性ペプチド水溶液を半量ずつオイルアジュバントと振とう混合して水相と油相からなる二層を解消した後にボンビングを行つたほうが、再現性良くエマルシヨンを調製し得ることがわ力つた。また、コネクタの長さは、 10mmのものよりも 15mmのものの方が、少ないポンビング回数でエマルシヨンを調製し得ることがわ力つた。

[0079] 実施例 7

表 1に記載の No. l〜No. 6、 No. 8、 NO. 9および No. l l〜No. 16のペプチドについて、実施例 6で用いた内径 lmm、流路の長さが 10mmの直管状コネクタを用いて、実施例 6と同様の方法でエマルシヨンの調製を行った。結果を表 9と 10に示す

[0080] [表 9]

10]

表 9と 10の結果から、ボンビングの前に混合液の水相と油相からなる二層を解消しておけば、様々な生理活性ペプチドで微細なエマルシヨン製剤をより一層効率的に調製し得ることがわ力つた。

Claims

請求の範囲

[1] 生理活性ペプチドのエマルシヨン製剤を調製する方法であって、

当該混合液を、コネクタにより連結された 2個のシリンジ間で移動させることを特徴とする生理活性ペプチドエマルシヨン製剤の調製方法。

[2] 混合液の調製工程において、生理活性ペプチド水溶液とオイルアジュバントの混合物を攪拌し、水相と油相からなる分離した層を解消する請求項 1に記載の調製方法。

[3] シリンジ筒部の断面積をコネクタの断面積の 2〜50倍とする請求項 1または 2に記載の調製方法。

[4] コネクタの流路の断面形状を円形とし、当該流路の内径を 0. 8〜1. 5mmとする請求項 1〜3の何れか 1項に記載の調製方法。

[5] コネクタの流路の長さを 10〜15mmとする請求項 1〜4の何れ力 1項に記載の調製方法。

[6] 混合液のシリンジ間の移動を 30回以上繰り返す請求項 1〜5の何れか 1項に記載の調製方法。

[7] 混合液のシリンジ間の移動を 20回以上繰り返した後に 0. 5〜10分間静置し、再度 1回以上移動を繰り返す請求項 1〜6の何れか 1項に記載の調製方法。

[8] 生理活性ペプチドのエマルシヨン製剤を調製するためのキットであって、

含有することを特徴とするエマルシヨン製剤調製用キット。

[9] 生理活性ペプチド組成物として、生理活性ペプチドを l〜6wZv%のアルカリ金属炭酸水素塩水溶液に溶解した溶液を凍結乾燥することにより得たものを含有する請求項 8に記載のエマルシヨン製剤調製用キット。

[10] さらに、筒部の断面積が 50〜500mm²である 2個のシリンジを含有する請求項 8または 9に記載のエマルシヨン製剤調製用キット。

[11] さらに、上記シリンジ用のコネクタであって、流路の断面形状が内径 0. 8〜1. 5m mの円形であるコネクタを含有する請求項 8から 10の何れ力 1項に記載のエマルション製剤調製用キット。

[12] 上記コネクタの流路の長さが 10〜15mmである請求項 11に記載のエマルシヨン製剤調製用キット。

[13] 上記コネクタの断面積が上記シリンジの筒部断面積の 0. 02〜0. 5倍である請求項 11または 12に記載のエマルシヨン製剤調製用キット。