CN110049759A - 用于治疗剂的肠道递送的制剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供含有pH敏感性纳米粒的制剂，其用于治疗剂的肠道递送。所述纳米粒包含pH敏感性聚合物，其保护所述治疗剂免于在胃中被降解，并允许其在小肠或结肠中释放。所述纳米粒制剂在口服给药时特别有效地保护敏感性生物治疗剂免于降解，并且可以避免这些药剂通过注射给药。本发明还提供用于制备所述制剂的方法，以及使用所述制剂治疗疾病的方法。

Description

用于治疗剂的肠道递送的制剂

背景

多年来，已将蛋白质和肽用于治疗诸如糖尿病、心脏病和癌症的疾病，并且用于疫苗中。在大多数情况下，由于胃中的酸性条件，这些药剂的口服递送都是失败的。此外，体外实验表明，许多蛋白质和肽在消化道中天然存在的酶的存在下迅速失活或破坏。最后，在过量的氢离子或羟基离子存在下，治疗性蛋白质或肽可能在化学上或物理上不稳定。因此，通常将治疗性蛋白质或肽通过肠胃外的方式递送给患者。

糖尿病的特征在于慢性高血糖水平。截至2014年，全球估计有3.87亿人患有糖尿病，其中欠发达国家和发展中国家的糖尿病患者人数尤其多。据估计，到2035年糖尿病患者人数将达到5.92亿人。因此，糖尿病是一个重要的全球性问题。

胰岛素是一种肽类激素，其用于治疗一些形式的糖尿病。因为其半衰期较短并且在胃肠道中降解，通常将其以液体注射剂的形式递送。因为胰岛素必须频繁以可注射的形式给药，所以患者(特别是儿童)觉得这不方便。因此，非常需要开发更方便的非注射形式的胰岛素，例如口服剂型。

尽管期望口服递送肽、蛋白质和其它生物制剂，但合适的制剂的设计具有挑战性。已经提出了不同的涂层来保护治疗性蛋白质免受胃酸的降解，包括使用pH敏感性聚合物。人胃肠道的pH从胃(pH为2-3)到小肠(pH为6.5-7.0)，到结肠(7.0-7.8)逐渐增加。在胃中，pH敏感性聚合物理想地抵抗胃液的降解作用，从而保护药物分子。胃排空后，药物进入肠道，pH敏感性聚合物变得可溶。因此，药物可以通过药物溶解和通过聚合物基质中的孔扩散的组合以受控的方式在肠内释放。

已经使用多种方法制备用于蛋白质或肽治疗剂的口服递送的pH敏感性颗粒。所述方法包括冻干、喷雾干燥、多重乳液-溶剂蒸发、纳米沉淀和凝聚(Current Drug Therapy，7：219-234，2012)。然而，这些方法中的每一个都有其缺陷。

溶剂蒸发是通过将药物和载体在溶剂中溶解然后蒸发溶剂来制备固体溶液或分散体的常用方法。将所得到的固体物质磨碎，并筛分。然而，该方法难以扩大规模，以及实现物理和化学稳定性。

药物和聚合物的共沉淀已被用作增加亲脂性药物溶出的手段。通过将药物和聚合物在水混溶性溶剂中的溶液转移到含有稳定剂的水溶液中来制备纳米沉淀物。通过快速溶剂扩散而瞬间形成共沉淀物。

在乳化-蒸发方法中，将含有药物和聚合物的溶液在水不混溶溶剂(例如二氯甲烷或氯仿)中乳化为含有乳化剂的水溶液。随后将油/水乳液中的溶剂蒸发，从而形成微粒和/或纳米粒。乳化-扩散方法与乳化-蒸发方法类似，但是使用部分水溶性溶剂(例如苯甲醇)。需要大量的水来诱导溶剂从油/水乳液中扩散，从而形成颗粒。

在盐析方法中，将聚合物和药物的有机溶液乳化为含有电解质(例如MgCl₂)和稳定剂(例如聚乙烯醇)的水相。随后将足量的水添加到乳液中，以诱导有机溶剂扩散到水中，导致聚合物沉淀，以及微粒和/或纳米粒形成。需要复杂的纯化阶段以除去大量的乳化剂和电解质。

PCT申请WO 2010/113177公开了含有胰岛素和甲基丙烯酸/甲基丙烯酸甲酯共聚物(EUDRAGIT L100)的口服胰岛素pH敏感性递送剂。所述试剂通过使用液体石蜡的双乳液技术制备，但其不稳定。

美国公开的专利申请US 2010/021549描述了含有胰岛素和诸如羟丙基甲基纤维素苯二甲酸酯(HPMCP)和醋酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯(HPMCAS)的pH敏感性聚合物的核-壳颗粒。胰岛素从颗粒中的释放在酸性介质中是缓慢的，但在中性介质是快速的。所述颗粒是通过流化床喷涂技术制备的，直径为约2mm。

Jelvehgari等人(AAPS PharmSciTech，第11卷第3期，2010年9月，Development ofpH-sensitive Insulin Nanoparticles using Eudragit L100-55 and Chitosan withDifferent Molecular Weights)描述了使用甲基丙烯酸/甲基丙烯酸甲酯共聚物(EUDRAGIT L100)和不同分子量的壳聚糖形成含有胰岛素的纳米粒。简言之，将0.4mL的10mg/mL胰岛素与0.2％壳聚糖混合，之后注射入24ml的0.2％(w/v)Eudragit L100-55的乙醇溶液中。在注射期间，将混合物以500RPM搅拌以使药物和聚合物沉淀，并将所得到的乳白色分散体经20μm孔过滤器过滤。胰岛素负荷效率为18-30％。颗粒的粒度范围为约135nm至约200nm。

粒度是决定用于口服递送的基于聚合物的制剂的吸收、分布和体内性能的关键因素。通常而言，纳米粒的细胞摄取效率比微粒高。Bakhru等人(Oral Delivery of Proteinsby Biodegradable Nanoparticles，Adv Drug Deliv Rev 2013；65：811)和Panyam，J.与Labhasetwar，V.(Biodegradable Nanoparticles for Drug and Gene Delivery toCells and Tissue，Adv Drug Deliv Rev 2003；55：329)的报告称，在Caco-2细胞中，粒度为100nm的聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)的细胞摄取比1μm微粒高2.5倍，并且比10μm微粒高6倍。在大鼠中观察到了类似的现象，其中PLGA纳米粒的细胞摄取分别比1μm微粒和10μm微粒高15倍和250倍。粒度＜100nm的纳米粒在派尔集合淋巴结中被有效吸收，然后被吸收到体循环中(Woitiski CB等人，Strategies Toward the Improved Oral Delivery ofInsulin Nanoparticles via Gastrointestinal Uptake and Translocation，BioDrugs2008；22：223)。

需要对于用于口服递送的pH敏感性颗粒的工业生产而言也是成本有效且易于扩大规模的改进方法。还需要不涉及水不溶性或有毒有机溶剂或者完全避免使用有机溶剂的制备pH敏感性颗粒的方法。此外，仍然需要用于以高负荷效率和良好生物利用度口服递送蛋白质、肽和其它治疗剂的pH敏感性颗粒。

发明概述

本发明提供组合物，其包含用于治疗剂的肠道递送的纳米粒，以及制备所述纳米粒的方法。

本发明的一个方面是组合物，其用于治疗剂的口服制剂。所述组合物包含平均粒度为50nm或更小的多种纳米粒，从而提供高生物利用度。所述组合物包含pH敏感性聚合物和分子量为约10000道尔顿或更小的治疗剂。在优选的实施方案中，所述治疗剂的分子量为约1000至约10000道尔顿。在某些实施方案中，所述治疗剂与所述纳米粒缔合、所述治疗剂粘附至所述纳米粒，或者所述治疗剂嵌入在所述纳米粒内。在某些实施方案中，所述纳米粒基本上由所述pH敏感性聚合物和所述治疗剂组成。在一些实施方案中，所述组合物还包含选自表面活性剂、脂质、粘膜粘着剂聚合物及其组合的组分。在某些实施方案中，所述组合物在大于约5.0的pH下解离。在某些优选的实施方案中，在pH小于约2.0的水溶液中，在2小时内小于5％的所述治疗剂从所述纳米粒中释放。

在一些实施方案中，上述纳米粒的平均粒度为约10nm至约30nm。在一些实施方案中，所述治疗剂是肽、蛋白质、核酸、小分子药物或其组合。在某些优选的实施方案中，所述治疗剂是胰岛素。在一些实施方案中，所述pH敏感性聚合物包括含有羧基的阴离子型聚合物，或者由含有羧基的阴离子型聚合物构成。在一些实施方案中，所述pH敏感性聚合物是甲基丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸的阴离子型共聚物，例如聚(甲基丙烯酸-共-甲基丙烯酸甲酯)1∶1、聚(甲基丙烯酸-共-甲基丙烯酸甲酯)1∶2。在一些实施方案中，所述pH敏感性聚合物是羟丙基甲基纤维素(例如羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯或醋酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯)的阴离子型聚合物。

本发明的另一个方面是用于治疗剂的口服制剂的组合物，所述组合物包含平均粒度为100nm或更小的多种纳米粒。所述组合物包含pH敏感性聚合物和分子量大于约10000道尔顿的治疗剂。在优选的实施方案中，所述治疗剂的分子量大于约10000道尔顿至约400000道尔顿。在某些实施方案中，所述组合物基本上由所述pH敏感性聚合物和所述治疗剂组成。在一些实施方案中，所述组合物还包含选自表面活性剂、脂质、粘膜粘着剂聚合物及其组合的组分。在优选的实施方案中，所述组合物在大于约5.0的pH下解离。在某些优选的实施方案中，在pH小于约2.0的水溶液中，在2小时内小于5％的治疗剂从纳米粒中释放。在一些实施方案中，所述治疗剂是肽、蛋白质、核酸、抗体、载体、病毒样颗粒、疫苗或其组合。在某些优选的实施方案中，所述治疗剂是抗体。在一些实施方案中，所述抗体选自抗-EGFR、抗-Her2、抗-RSV、抗白细胞介素和抗-TNF。在一些实施方案中，所述抗体选自西妥昔单抗、曲妥珠单抗、帕利珠单抗、托珠单抗和阿达木单抗。在一些实施方案中，所述pH敏感性聚合物是甲基丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸的阴离子型共聚物，例如聚(甲基丙烯酸-共-甲基丙烯酸甲酯)1∶1、聚(甲基丙烯酸-共-甲基丙烯酸甲酯)1∶2。在一些实施方案中，所述pH敏感性聚合物是羟丙基甲基纤维素(例如羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯或醋酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯)的阴离子型聚合物。

本发明的又一个方面是制备治疗剂的可口服给药制剂的方法。所述方法包括以下步骤：(a)提供包含所述治疗剂和所述pH敏感性聚合物的水溶液，所述溶液的pH大于约5.5，并且含有纳米粒；以及(b)将所述溶液的pH降低至小于约4.0，从而使所述治疗剂和所述聚合物共沉淀，并且所述聚合物包裹所述治疗剂，并且其中所述聚合物能够在大于约5.0的pH下解离，以释放所述治疗剂。在某些实施方案中，步骤(a)包括提供包含所述治疗剂和pH敏感性聚合物的pH低于5.0的水溶液，然后通过加入pH为5.5-8的缓冲液或含有诸如牛磺胆酸盐或另一种胆汁酸的表面活性剂、脂质、缓冲剂和任选存在地用于维持所述治疗剂活性的一种或多种稳定剂的溶液，将pH升高至高于5.5。在一些实施方案中，通过加入含有约3mM作为表面活性剂的牛磺胆酸钠、约0.75mM作为脂质的磷脂酰胆碱、约106mM氯化钠和约28mM磷酸钠且用NaOH调节至pH 6.5的溶液，使pH升高至高于5.5。在一些实施方案中，使用诸如乙酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、磷酸盐、Tris等缓冲剂，或使用诸如氢氧化钠的碱将pH升至高于5.0。在一些实施方案中，在步骤(b)中通过加入HCl降低pH。在某些实施方案中，所述方法还包括将步骤(b)得到的制剂进行冻干。

在上述方法的一些实施方案中，所述治疗剂的分子量小于约10000道尔顿，并且所得到的制剂包含平均粒度为约50nm或更小的多种纳米粒。在一些实施方案中，所述治疗剂的分子量大于约10000道尔顿，并且所得到的制剂包含平均粒度为约100nm或更小的多种纳米粒。在一些实施方案中，所述pH敏感性聚合物是甲基丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸的阴离子型共聚物，例如聚(甲基丙烯酸-共-甲基丙烯酸甲酯)1∶1、聚(甲基丙烯酸-共-甲基丙烯酸甲酯)1∶2。在一些实施方案中，所述pH敏感性聚合物是羟丙基甲基纤维素(例如羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯或醋酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯)的阴离子型聚合物。在一些实施方案中，所述治疗剂是肽、蛋白质、核酸、小分子药物或其组合。在优选的实施方案中，治疗剂的口服制剂通过上述方法制备。

本发明的另一个方面是治疗疾病或有助于治疗疾病的方法。所述方法包括将任意上述组合物向需要其的个体口服给药。所述组合物包含有助于治疗疾病的治疗剂。在一些实施方案中，所述治疗剂是胰岛素，并且所述疾病是婴儿、儿童或青少年中的糖尿病、胰岛素缺乏相关的代谢综合征或糖尿病酮症酸中毒。在其它实施方案中，所述治疗剂是抗肿瘤抗体，并且所述疾病是癌症。在某些实施方案中，所述治疗剂是抗炎抗体，并且所述疾病是炎性疾病。

本发明还可以通过以下实施方案列表总结。

1.治疗剂的口服制剂，所述制剂包含平均粒度为50nm或更小的多种纳米粒，所述纳米粒包含pH敏感性聚合物和分子量为约10000道尔顿或更小的治疗剂。

2.如实施方案1所述的制剂，其中所述纳米粒基本上由所述pH敏感性聚合物和所述治疗剂组成。

3.如实施方案1所述的制剂，其中所述纳米粒还包含选自表面活性剂、脂质、粘膜粘着剂聚合物及其组合的组分。

4.如前述实施方案中任一项所述的制剂，其中所述纳米粒在大于约5.0的pH下解离，释放所述治疗剂。

5.如前述实施方案中任一项所述的制剂，其中在pH小于约2.0的水性溶液中2小时后，小于5％的所述治疗剂从所述纳米粒中释放。

6.如前述实施方案中任一项所述的制剂，其中所述纳米粒的平均粒度为约10nm至约30nm。

7.如前述实施方案中任一项所述的制剂，其中所述治疗剂是肽、蛋白质、核酸、小分子药物或其组合。

8.如前述实施方案中任一项所述的制剂，其中所述治疗剂是胰岛素。

9.如前述实施方案中任一项所述的制剂，其中所述pH敏感性聚合物是醋酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯或甲基丙烯酸甲酯/甲基丙烯酸酯共聚物。

10.如前述实施方案中任一项所述的制剂，其中所述纳米粒的平均粒度为约45nm或更小，或约40nm或更小，或约35nm或更小，或约30nm或更小，或约25nm或更小，或约5nm至约50nm，或约5nm至约20nm，或约5nm至约30nm，或约5nm至约40nm，或约10nm至约40nm，或约20nm至约40nm，或约20nm至约50nm。

11.如前述实施方案中任一项所述的制剂，其中所述pH敏感性聚合物在约37℃，在pH约5.0至pH约8.0，或约4.5至约8.5，或约5.5至约8.0，或约6.0至约8.5，或约6.5至约8.5下基本上可溶于水。

12.如前述实施方案中任一项所述的制剂，其中所述pH敏感性聚合物在约37℃，在pH约1.5至pH约3.5，或约1.0至约4.0，或约2.0至约4.0，或约1.0至约6.0，或约1.0至约6.5，或约1.0至约7.0，或约1.0至约7.5下基本上不溶于水。

13.治疗剂的口服制剂，所述制剂包含平均粒度为100nm或更小的多种纳米粒，所述纳米粒包含pH敏感性聚合物和分子量大于10000道尔顿的治疗剂。

14.如实施方案13所述的制剂，其中所述纳米粒基本上由所述pH敏感性聚合物和所述治疗剂组成。

15.如实施方案13或实施方案14所述的制剂，其中所述纳米粒还包含选自表面活性剂、脂质、粘膜粘着剂聚合物及其组合的组分。

16.如实施方案13-15中任一项所述的制剂，其中所述纳米粒在大于约5.0的pH下解离或溶解，释放所述治疗剂。

17.如实施方案13-16中任一项所述的制剂，其中在pH小于约2.0的水性溶液中2小时后，小于5％的所述治疗剂从所述纳米粒中释放。

18.如实施方案13-17中任一项所述的制剂，其中所述治疗剂选自蛋白质、核酸、抗体、载体、病毒样颗粒、疫苗及其组合。

19.如实施方案18所述的制剂，其中所述治疗剂为选自抗-EGFR、抗-Her2、抗-RSV、抗白细胞介素和抗-TNF的抗体，或者为选自西妥昔单抗、曲妥珠单抗、帕利珠单抗、托珠单抗和阿达木单抗的抗体。

20.如权利要求13-19中任一项所述的制剂，其中所述pH敏感性聚合物是醋酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯或甲基丙烯酸甲酯/甲基丙烯酸酯共聚物。

21.如实施方案13-20中任一项所述的制剂，其中所述纳米粒的平均粒度为约90nm或更小或者约80nm或更小。

22.如实施方案13-21中任一项所述的制剂，其中所述pH敏感性聚合物在约37℃，在pH约5.0至pH约8.0，或约4.5至约8.5，或约5.5至约8.0，或约6.0至约8.5，或约6.5至约8.5下基本上可溶于水。

23.如实施方案13-22中任一项所述的制剂，其中所述pH敏感性聚合物在约37℃，在pH约1.5至pH约3.5，或约1.0至约4.0，或约2.0至约4.0，或约1.0至约6.0，或约1.0至约6.5，或约1.0至约7.0，或约1.0至约7.5下基本上不溶于水。

24.制备治疗剂的可口服给药制剂的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)提供包含所述治疗剂和含有pH敏感性聚合物的纳米粒的水性介质，所述介质的pH为约5.0或更高；以及

(b)将所述介质的pH降低至小于约4.0，由此所述聚合物与所述治疗剂紧密缔合。

25.如实施方案24所述的方法，其中步骤(a)包括提供包含所述治疗剂和pH敏感性聚合物的pH低于5.0的水溶液，然后通过加入含有表面活性剂、脂质和缓冲剂的溶液将所述pH升高至5.0或以上。

26.如实施方案25所述的方法，其中通过加入含有pH 5-8的缓冲剂和一种或多种稳定化赋形剂的溶液，或者含有0至约10mM作为所述表面活性剂的牛磺胆酸钠、0至约1.5mM作为所述脂质的磷脂酰胆碱、0至约150mM氯化钠和0至约50mM作为所述缓冲剂的磷酸钠的溶液，将所述pH升高至高于5.0。

27.如实施方案24-26中任一项所述的方法，其中在步骤(b)中通过加入HCl来降低所述pH。

28.如实施方案24-27中任一项所述的方法，其还包括：

(c)将步骤(b)中所得的制剂冻干。

29.如实施方案24-28中任一项所述的方法，其中所述治疗剂的分子量为约10000道尔顿或更小，并且所述所得的制剂包含平均粒度为约50nm或更小的多种纳米粒，或者其中所述治疗剂的分子量大于约10000道尔顿，并且所述所得的制剂包含平均粒度为约100nm或更小的多种纳米粒。

30.如实施方案24-29中任一项所述的方法，其中所述pH敏感性聚合物是醋酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯或甲基丙烯酸甲酯/甲基丙烯酸酯共聚物。

31.如实施方案24-30中任一项所述的方法，其中所述治疗剂选自肽、蛋白质、核酸、抗体、载体、疫苗及其组合。

32.治疗剂的口服制剂，其通过包括如实施方案24-31中任一项所述的方法的方法制备。

33.有助于治疗疾病的方法，所述方法包括将如实施方案1-23中任一项所述的制剂向需要其的个体口服给药，其中所述制剂包含有助于治疗所述疾病的治疗剂。

34.如实施方案33所述的方法，其中所述治疗剂是胰岛素，并且所述疾病选自婴儿、儿童或青少年中的糖尿病、胰岛素缺乏相关的代谢综合征和糖尿病酮症酸中毒。

35.如实施方案33所述的方法，其中所述治疗剂是抗肿瘤抗体，并且所述疾病是癌症。

36.如实施方案33所述的方法，其中所述治疗剂是抗炎抗体，并且所述疾病是炎性疾病。

附图简述

图1是用于制备本发明的纳米粒口服递送制剂的无溶剂方法的流程图。

图2是用于制备本发明的纳米粒口服递送制剂的改进的无溶剂方法的流程图。

图3是用于制备本发明的纳米粒口服递送制剂的基于溶剂的方法的流程图。

图4示出通过无溶剂方法制备的胰岛素制剂中胰岛素释放的时间过程。释放介质是模拟胃液(SGF)或模拟肠液(SIF)。胰岛素浓度以通过介质的HPLC分级分离获得的胰岛素峰的曲线下面积(AUC)的单位表示。

图5示出在禁食状态模拟胃液(FaSSGF)和禁食状态模拟肠液(FaSSIF)中胰岛素从胰岛素制剂释放的时间过程。释放的胰岛素的量使用胰岛素特异性ELISA进行测量。

图6示出在FaSSGF和FaSSIF中胰岛素从胰岛素制剂释放的时间过程(使用ELISA)。

图7示出在FaSSGF和FaSSIF中胰岛素从胰岛素制剂释放的时间过程(使用HPLC)。

图8示出使用动态激光散射(DLS)的粒度测量。

图9示出在FaSSGF和FaSSIF中胰岛素从胰岛素制剂释放的时间过程(使用ELISA)。

图10示出在FaSSGF和FaSSIF中胰岛素从胰岛素制剂释放的时间过程(使用ELISA)。

图11示出在FaSSGF和FaSSIF中胰岛素从胰岛素制剂释放的时间过程(使用HPLC)。

图12示出在FaSSGF和FaSSIF中胰岛素从胰岛素制剂释放的时间过程(使用ELISA)。

图13示出在FaSSGF和FaSSIF中胰岛素从胰岛素制剂释放的时间过程(使用HPLC)。

图14示出使用DLS的粒度测量。

图15示出在FaSSGF和FaSSIF中胰岛素从胰岛素制剂释放的时间过程(使用ELISA)。

图16示出在FaSSGF和FaSSIF中胰岛素从胰岛素制剂释放的时间过程(使用HPLC)。

图17示出冻干压力曲线。

图18示出冻干温度曲线。

图19示出人个体响应于给药胰岛素制剂和对照的餐后血糖的变化。

图20示出给药各种胰岛素制剂后3只犬的平均标准化血糖。

图21示出在pH 2.1和pH 6.5中的抗EGFR抗体的释放曲线(使用尺寸排阻(SEC)HPLC)。

图22示出在FaSSGF和FaSSIF中抗Her2抗体的释放曲线(使用ELISA)。

图23示出在pH 2.1和pH 6.5中的抗RSV抗体的释放曲线(使用SEC-HPLC)。

图24示出在pH 2.1和pH 6.5中的抗RSV抗体的释放曲线(使用ELISA)。

图25示出在pH 2.1和pH 6.5中的抗TNF抗体的释放曲线(使用ELISA)。

图26示出在pH 2.1和pH 6.5中的抗IL6抗体的释放曲线(使用ELISA)。

图27示出使用A280通过分光光度法测量的在FaSSGF和FASSIF中抗坏血酸的释放曲线。

图28示出使用DLS对含抗坏血酸纳米粒的粒度的测量。

图29示出通过基于溶剂的方法包封的白蛋白的释放曲线。

图30示出胰岛素从通过基于溶剂的方法包封的胰岛素释放的时间过程。

图31示出通过基于溶剂的方法包封的含有胰岛素和2％海藻酸的纳米粒制剂的胰岛素释放的时间过程。

发明详述

本发明提供pH敏感性纳米粒和微粒组合物、制备所述组合物的方法，以及用于口服递送治疗剂以治疗疾病或医学病症的方法。本发明的方法和制剂能够通过形成纳米粒形式的治疗剂与pH敏感性聚合物的稳定缔合以在胃环境中保护多种治疗剂。所述纳米粒能够使治疗剂在小肠中进行pH依赖性吸收，导致高生物利用度。

不希望将本发明限制于任何特定机理或分子结构，相信本发明的纳米粒在纳米粒的聚合物链和治疗剂的分子之间提供稳定的缔合，其中，在低pH下，治疗剂保持与聚合物链紧密缔合，从而保护治疗剂免于在低pH下降解。在本发明中使用的pH敏感性聚合物通常含有在低pH下为中性(质子化)但在中性pH下带负电(去质子化)的取代基，导致粒度发生pH依赖性变化，从而使得颗粒在约中性pH下具有纳米级大小，但在低pH下具有微米大小。产生纳米粒不需要外部能量，例如超声处理或加热。在低pH下(例如在胃环境中)较大的粒度可以增强对治疗剂的保护，而在中性pH下较小的粒度促进治疗剂的吸收。在一些实施方案中，所述纳米粒可以在中性pH下完全解离，并且其分子组分变得完全溶解。在其它实施方案中，所述纳米粒在中性pH下不解离，但是具有如此小的尺寸，使得可以通过细胞吸收或旁细胞转运获得良好的生物利用度。

本发明的纳米粒组合物的重要性质是它们的粒度非常小，这导致比之前颗粒组合物获得的更高的生物利用度。在中性pH下，所述纳米粒的大小部分由治疗剂的分子大小决定。通常而言，治疗剂的分子大小越大，在中性pH下存在的纳米粒的尺寸越大。虽然原则上可以用本发明的方法制备纳米粒大小的连续体，反映治疗剂的分子大小的连续性以及聚合物的pH依赖性，但为方便起见，纳米粒组合物在本文中被根据治疗剂分子量的区分为“低分子量”或“高分子量”。

在本发明的低分子量实施方案中，所述纳米粒制剂包含平均粒度为50nm或更小，或者约45nm或更小，或者约40nm或更小，或者约35nm或更小，或者约30nm或更小，或者约25nm或更小的多种纳米粒。如本文中所使用，“粒度”是指颗粒的流体力学直径。平均流体力学直径可以使用例如动态光散射(DLS)来测定。优选地，低分子量实施方案的纳米粒的平均粒度小于约50nm，或者为约10nm至约30nm，或者约15nm至约25nm。在其它实施方案中，所述纳米粒的平均粒度为约5nm至约50nm，或者约5nm至约20nm，或者约5nm至约30nm，或者约5nm至约40nm，或者约10nm至约40nm，或者约20nm至约40nm，或者约20nm至约50nm。所述纳米粒包含pH敏感性聚合物和治疗剂，所述治疗剂的分子量为约10000道尔顿或更小，或者约9000道尔顿或更小，8000道尔顿或更小、7000道尔顿或更小、6000道尔顿或更小、5000道尔顿或更小、4000道尔顿或更小、3000道尔顿或更小、2000道尔顿或更小、1500道尔顿或更小。在一些实施方案中，所述治疗剂的分子量为约1000至约10000道尔顿，或者约1000道尔顿至约5000道尔顿，或者约1000道尔顿至约3000道尔顿，或者约1000道尔顿至约4000道尔顿，或者约500道尔顿至约5000道尔顿，或者约3000道尔顿至约5000道尔顿，或者约5000道尔顿至约10000道尔顿。在其它实施方案中，低分子量形式的纳米粒组合物含有一种或多种治疗剂，所述治疗剂的分子量为约1000道尔顿至约15000道尔顿，或约5000道尔顿至约15000道尔顿，或约3000道尔顿至约8000道尔顿。

在本发明的高分子量实施方案中，所述纳米粒制剂包含平均粒度为约100nm或更小，或者约90nm或更小，或者约80nm或更小，或者约110nm或更小，或者约120nm或更小，或者约130nm或更小，或者约140nm或更小，或者约150nm或更小，或者约30nm至约90nm，或者约30nm至约100nm，或者约40nm至约100nm，或者约50nm至约100nm，或者约60nm至约90nm的多种纳米粒。所述纳米粒包含pH敏感性聚合物和分子量为约10000道尔顿或更高(例如15000道尔顿或更高、20000道尔顿或更高、25000道尔顿或更高、30000道尔顿或更高、40000道尔顿或更高，或者50000道尔顿或更高)的治疗剂。在一些实施方案中，所述治疗剂的分子量为约50000道尔顿或更高，例如60000道尔顿或更高、70000道尔顿或更高、80000道尔顿或更高，或者90000道尔顿或更高。在其它实施方案中，所述治疗剂的分子量大于约10000道尔顿，例如约11000道尔顿至约20000道尔顿，或者至约30000道尔顿，或者至约40000道尔顿，至约50000道尔顿、至约70000道尔顿、至约100000道尔顿、至约150000道尔顿、至约200000道尔顿、至约300000道尔顿，或者至约500000道尔顿。

本发明的纳米粒的pH依赖性溶解度由包含在纳米粒中并形成纳米粒的基质的一种或多种聚合物或共聚物的pH依赖性溶解度决定。已知适用于药物组合物的多种pH依赖性聚合物。这样的聚合物应该是无毒的、非致敏性的、可以纯的形式获得的，并且在生理学和药理学上都是惰性的。优选地，它们还是不可代谢的。在某些优选的实施方案中，所述pH敏感性聚合物是具有沿聚合物主链长度周期性分布的多个羧基的阴离子型聚合物。在一些实施方案中，通过调节聚合物链上羧基或其它取代基的量或分布，可以精细调节聚合物的水溶性的pH依赖性，以及由所述聚合物形成的纳米粒或微粒的大小。在某些实施方案中，所述pH敏感性聚合物是甲基丙烯酸和丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯的共聚物。在某些实施方案中，所述pH敏感性聚合物是甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物，或甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯共聚物。在一些实施方案中，所述pH敏感性聚合物是聚(甲基丙烯酸-共-甲基丙烯酸甲酯)1∶1、聚(甲基丙烯酸-共-甲基丙烯酸甲酯)1∶2，或二者的组合，并且聚(甲基丙烯酸-共-甲基丙烯酸甲酯)的羧基与酯基的比率(羧基/酯基比)可以进行操纵以控制聚合物的pH敏感性。在某些实施方案中，所述pH敏感性聚合物优选是甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物，例如甲基丙烯酸甲酯与甲基丙烯酸的摩尔比为约1∶1的甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物。在某些实施方案中，所述pH敏感性聚合物的分子量为约60,000至约200,000道尔顿。在一些实施方案中，所述pH敏感性聚合物是纤维素衍生物，例如邻苯二甲酸乙酸纤维素(CAP)、醋酸琥珀酸纤维素(CASE)、醋酸偏苯三酸纤维素(CAT)、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(HPMCP)，或醋酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯(HPMCAS)、紫胶或聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯(PVAP)。在某些实施方案中，所述pH敏感性聚合物优选是醋酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯，例如分子量为约10,000道尔顿至约500,000道尔顿。可将所有上述聚合物单独使用或组合使用，以获得所需的pH敏感性，从而控制药物释放或粒度，并在口服给药时改善药物的生物利用度。

用于本发明的pH依赖性聚合物在酸性pH下不溶，而在中性和/或碱性pH下可溶。在一些实施方案中，所述pH敏感性聚合物在约37℃、pH为约5.0至pH约8.0，或者约4.5至约8.5，或者约5.5至约8.0，或者约6.0至约8.5，或者约6.5至约8.5下基本可溶于水。所述pH敏感性聚合物在约37℃、pH为约1.5至pH约3.5，或者约1.0至约4.0，或者约2.0至约4.0，或者约1.0至约6.0，或者约1.0至约6.5，或者约1.0至约7.0，或者约1.0至约7.5下也基本上不溶于水。

所述pH敏感性聚合物溶解度的一个有用量度是作为pH或其它条件的函数的治疗剂的释放。如本文中所使用，治疗剂的“释放”是指包含缔合的治疗剂的小纳米粒从包含缔合的治疗剂的微粒中释放，或者是指治疗剂的单个分子从微粒或纳米粒释放。这种释放可以非常快速，例如在数秒或数分钟内，或者其可以很缓慢，需要数小时甚至更长时间才可以释放大量的治疗剂。一个重要参数是微粒和/或纳米粒在酸性pH下保留治疗剂的能力。在某些实施方案中，当颗粒在23℃下暴露于0.01N HCl溶液中约6小时后，少于约33重量％的治疗剂从所述颗粒中释放。在其它实施方案中，当颗粒在约23℃下暴露于pH约6.8的磷酸盐缓冲盐水溶液约1小时后，多于40重量％的治疗剂从所述颗粒中释放。优选地，微粒/纳米粒同时具有这两种性质(即在低pH下释放非常缓慢，并且在高pH下快速且完全释放)。在高pH下，治疗剂应该在生理学或药理学相关的时间范围内(例如在10分钟、30分钟、60分钟、90分钟或120分钟内)高度释放(例如超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％，或超过90％)。在低pH下，治疗剂在通过胃所需的时间内基本上不释放。在某些实施方案中，在pH小于约2.0下，少于5％的治疗剂在2小时内从颗粒中释放。

在某些实施方案中，治疗剂与pH敏感性聚合物的重量比为约10∶1至约1∶12，例如约10∶1、约9∶1、约8∶1、约7∶1、约6∶1、约5∶1、约4∶1、约3∶1、约2∶1、约1∶1、约1∶2、约1∶3、约1∶4、约1∶5、约1∶6、约1∶7、约1∶8、约1∶9、约1∶10、约1∶11、约1∶12。在一些实施方案中，所述重量比为约5∶1至约1∶5，或约3∶1至约1∶3，或约2∶1至约1∶2，或者为约1∶1。

在一些实施方案中，所述纳米粒基本上由pH敏感性聚合物和治疗剂组成。在一些实施方案中，所述纳米粒和/或纳米粒组合物和/或药物组合物基本上不含溶剂。在其它实施方案中，所述纳米粒还可包含一种或多种组分，例如缓冲剂、表面活性剂、脂质、粘膜粘着剂聚合物、稳定化赋形剂及其组合。这些另外的组分可用于在制备纳米粒期间或在从纳米粒释放药剂后维持治疗剂的溶解度，或可用于防止纳米粒聚集或促进纳米粒在水溶液或水中的可悬浮性，并且还可以改善治疗剂的生物利用度。它们还可以改善纳米粒的可储存性或有效半衰期，并且可在冻干后有助于保持纳米粒的结构和/或治疗剂的生物利用度。粘膜粘着剂聚合物可以改善纳米粒与肠粘膜表面的粘附，从而改善在肠上皮细胞中的吸收并最终进入血液。

表面活性剂可包括阴离子型表面活性剂，包括油酸钠、辛酸钠、十二烷基硫酸钠、脱氧胆酸盐或脱氧胆酸钠、牛磺胆酸盐或牛磺胆酸钠、丁二酸二辛基磺酸钠和硬脂酰富马酸钠；非离子型表面活性剂，包括聚氧乙烯醚、聚山梨酯80和烷基糖苷；以及阳离子型表面活性剂，包括季铵化合物。

脂质可包括例如磷脂(中性、阳离子或阴离子)、脂肪酸(例如油酸、辛酸、亚油酸、亚麻酸、油酸钠、亚油酸钠或辛酸钠)、脂肪醇和/或固醇。脂质还包括鞘脂，包括但不限于鞘磷脂；糖鞘脂，包括神经节苷脂、红细胞糖苷脂(globocide)和脑苷脂；以及表面活性剂胺，包括但不限于硬脂酰胺、油酰胺和亚油酰胺。

如本文所用，“磷脂”应理解为甘油的两亲性衍生物，其中其一个羟基被磷酸酯化，并且另两个羟基被长链脂肪酸酯化，所述长链脂肪酸可以是彼此相等的或彼此不同的，并且可以是饱和的或不饱和的。中性磷脂通常是其中其它磷酸羟基被由极性基团(通常为羟基或氨基)取代的醇酯化并且其净电荷为零的磷脂。带电荷的磷脂通常是其中其它磷酸羟基被由极性基团取代的醇酯化并且其净电荷为正或负的磷脂。

磷脂的实例包括磷脂酸(“PA”)、磷脂酰胆碱(“PC”)、磷脂酰甘油(“PG”)、磷脂酰乙醇胺(“PE”)、磷脂酰肌醇(“PI”)、磷脂酰丝氨酸(“PS”)、鞘磷脂(包括脑鞘磷脂)、卵磷脂、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、脑苷脂、二花生酰基磷脂酰胆碱(“DAPC”)、二癸酰基-L-α-磷脂酰胆碱(“DDPC”)、二芥酰基磷脂酰胆碱(“DEPC”)、二月桂酰基磷脂酰胆碱(“DLPC”)、二亚油酰基磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(“DMPC”)、二油酰基磷脂酰胆碱(“DOPC”)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(“DPPC”)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(“DSPC”)、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰胆碱(“POPC”)、二花生酰基磷脂酰甘油(“DAPG”)、二癸酰基-L-α-磷脂酰甘油(“DDPG”)、二芥酰基磷脂酰甘油(“DEPG”)、二月桂酰基磷脂酰甘油(“DLPG”)、二亚油酰基磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油(“DMPG”)、二油酰基磷脂酰甘油(“DOPG”)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(“DPPG”)、二硬脂酰基磷脂酰甘油(“DSPG”)、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰甘油(“POPG”)、二花生酰基磷脂酰乙醇胺(“DAPF”)、二癸酰基-L-α-磷脂酰乙醇胺(“DDPE”)、二芥酰基磷脂酰乙醇胺(“DEPE”)、二月桂酰基磷脂酰乙醇胺(“DLPE”)、二亚油酰基磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(“DMPE”)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(“DOPE”)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(“DPPE”)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(“DSPE”)、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(“POPE”)、二花生酰基磷脂酰肌醇(“DAPI”)、二癸酰基-L-α-磷脂酰肌醇(“DDPI”)、二芥酰基磷脂酰肌醇(“DEPI”)、二月桂酰基磷脂酰肌醇(“DLPI”)、二亚油酰基磷脂酰肌醇、二肉豆蔻酰基磷脂酰肌醇(“DMPI”)、二油酰基磷脂酰肌醇(“DOPI”)、二棕榈酰基磷脂酰肌醇(“DPPI”)、二硬脂酰基磷脂酰肌醇(“DSPI”)、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰肌醇(“POPI”)、二花生酰基磷脂酰丝氨酸(“DAPS”)、二癸酰基-L-α-磷脂酰丝氨酸(“DDPS”)、二芥酰基磷脂酰丝氨酸(“DEPS”)、二月桂酰基磷脂酰丝氨酸(“DLPS”)、二亚油酰基磷脂酰丝氨酸、二肉豆蔻酰基磷脂酰丝氨酸(“DMPS”)、二油酰基磷脂酰丝氨酸(“DOPS”)、二棕榈酰基磷脂酰丝氨酸(“DPPS”)、二硬脂酰基磷脂酰丝氨酸(“DSPS”)、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰丝氨酸(“POPS”)、二花生酰基鞘磷脂、二癸酰基鞘磷脂、二芥酰基鞘磷脂、二月桂酰基鞘磷脂、二亚油酰基鞘磷脂、二肉豆蔻酰基鞘磷脂、鞘磷脂、二油酰基鞘磷脂、二棕榈酰基鞘磷脂、二硬脂酰基鞘磷脂和1-棕榈酰基-2-油酰基鞘磷脂。

如本文中所使用，“脂肪酸”是指其结构是羧基与具有一个或多个碳原子的烃链连接的化合物。所述烃链可以是饱和的或不饱和的(即烷基、烯基或炔基烃链)。而且，烃链可以是直链或支链的。此外，在一些实施方案中，所述烃链中的氢可被取代。

如本文中所使用，“脂肪醇”是指其结构是醇基与具有一个或多个碳原子的烃链连接的化合物。所述烃链可以是饱和的或不饱和的(即烷基、烯基或炔基烃链)。所述烃链可以是直链或支链的。此外，在一些实施方案中，所述烃链中的氢可被取代。

如本文中所使用，除非另有说明，术语“脂肪酸盐”是指由脂肪酸和无机/有机碱之间的反应形成的化合物。此外，该术语涵盖由脂肪醇和无机/有机酸之间的反应形成的化合物。这样的酸的实例包括硫酸和磷酸。脂肪酸盐的烃链可以是饱和的或不饱和的(即烷基、烯基或炔基烃链)。而且，所述烃链可以是直链或支链的。此外，在一些实施方案中，所述烃链中的氢可被取代。

优选地，脂质与pH敏感性聚合物的重量比为约1∶10至约8∶1，例如约1∶10、约1∶9、约1∶8、约1∶7、约1∶6、约1∶5、约1∶4、约1∶3、约1∶2、约1∶1、约2∶1、约3∶1、约4∶1、约5∶1、约6∶1、约7∶1、约8∶1。

粘膜粘着剂聚合物可包括例如羟丙基甲基纤维素、海藻酸和泊洛沙姆。优选地，粘膜粘着剂聚合物的分子量为约10,000道尔顿至约150,000道尔顿，或者约10,000道尔顿至约300,000道尔顿，或者约10,000道尔顿至约600,000道尔顿。

在一些实施方案中，所述低分子量治疗剂是肽、蛋白质、核酸、小分子药物(即分子量为1500道尔顿或更小的任何种类的治疗剂)，或其组合。肽可包括抗肿瘤肽(例如亮丙瑞林)、治疗代谢性疾病的肽(例如甘精胰岛素、胰高血糖素样肽-1受体激动剂)、肽激素(例如EPO)、抗感染剂(例如替拉凡星、蛋白酶抑制剂)、镇痛/麻醉肽(例如脑啡肽)和抗炎肽。蛋白质可包括抗肿瘤蛋白质(例如抗VEGF剂、干扰素、细胞因子)、治疗代谢性疾病的蛋白质(例如胰岛素、胰高血糖素)、蛋白质激素(例如降钙素、促性腺激素释放激素)、抗感染蛋白质(例如干扰素)、抗炎蛋白质(抗TNF-α剂)、单克隆抗体、疫苗、酶和酶抑制剂。核酸可包括适体、小干扰RNA、反义寡核苷酸，以及用于基因编辑和基因治疗的核酸，包括诸如腺病毒载体和慢病毒载体的病毒载体。优选的低分子量治疗剂是胰岛素。

如本文中所使用，术语“胰岛素”是指任意天然存在或重组胰岛素。因此，用于本发明的胰岛素包括例如胰岛素类似物和衍生物。可以使用来自任何合适物种的胰岛素，例如人、猪、牛、狗、羊。在优选的实施方案中，所述胰岛素是重组人胰岛素。天然存在的胰岛素和合成胰岛素包括单体胰岛素、聚合胰岛素和/或纤维样胰岛素；应当理解，胰岛素分子可根据pH呈现不同的形式。

在高分子量实施方案中，所述治疗剂可以是例如蛋白质、核酸、抗体、病毒样颗粒、疫苗，或其组合。蛋白质(如本文所限定的高分子量或低分子量)可包括抗肿瘤蛋白质(例如抗VEGF剂、干扰素、细胞因子)、治疗代谢性疾病的蛋白质(例如胰岛素、胰高血糖素)、蛋白质激素(例如降钙素、促性腺激素释放激素)、抗感染蛋白质(例如干扰素)、抗炎蛋白质(抗TNF-α剂)、多克隆抗体、单克隆抗体、疫苗、酶和酶抑制剂。核酸(如本文所限定的高分子量或低分子量)包括适体、小干扰RNA、反义寡核苷酸、基因编辑和基因疗法。

抗体是用于本发明的优选的高分子量治疗剂。这样的抗体可以是多克隆的、单克隆的、人的、人源化的、嵌合的或重组的，也可以是这样的抗体的抗原结合片段。单克隆抗体可以是天然存在或重组的免疫球蛋白分子。抗体可以是任何类别的免疫球蛋白，例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE。用于本发明的抗体包括抗体类似物和衍生物，例如抗体片段(Fab、Fc、Fv)、双抗体、三抗体、小抗体、纳米抗体、诸如scFv的单结构域抗体和抗体融合蛋白质。优选的抗体包括分别与EGFR、Her2、RSV、白细胞介素和TNF结合的抗体，包括西妥昔单抗、曲妥珠单抗、帕利珠单抗、托珠单抗和阿达木单抗。

在某些优选的实施方案中，本发明的组合物是药物组合物，其包含本发明的多种任意纳米粒或微粒(其为水性介质中的悬浮液或冻干材料)，以及一种或多种赋形剂，例如一种或多种载体、填充剂、粘合剂、缓冲剂、助流剂、溶液、溶剂、表面活性剂、电解质、盐、润滑剂、崩解剂、溶胀剂、抗氧化剂，或不是纳米粒或微粒形式的其它治疗剂。所述药物组合物还可含有本发明的两种或更多种不同类型的纳米粒，所述纳米粒具有不同的治疗剂，或者具有在不同纳米粒中具有不同释放曲线的相同治疗剂。所述药物组合物还可含有不携带治疗剂的“空白”pH依赖性纳米粒。所述药物组合物优选配制为用于口服递送，例如以胶囊剂、片剂或液体口服混悬剂的形式。所述药物组合物的特定实施方案配制为用于儿科使用。在一个实施方案中，所述制剂是饮料，或者适用于重构为饮料，例如诸如橙汁的水果或蔬菜汁，或者在诸如牛奶或酸奶的乳制品中。

填充剂包括乳糖、蔗糖、葡萄糖、淀粉、微晶纤维素、微细纤维素、甘露醇、山梨糖醇、磷酸氢钙、硅酸铝、无定形硅、氯化钠、淀粉和磷酸氢钙二水合物。在某些实施方案中，所述填充剂不是水溶性的，但其可以吸收水。在某些其它实施方案中，所述填充剂是滚圆助剂。滚圆助剂可包括交聚维酮、卡拉胶、壳聚糖、果胶酯酸、甘油酯、β-环糊精、纤维素衍生物、微晶纤维素、粉状纤维素、交联聚维酮、交聚维酮和聚环氧乙烷中的一种或多种。在一个实施方案中，所述填充剂包括微晶纤维素。

粘合剂包括纤维素醚、甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、丙基纤维素、羟丙基纤维素、低取代羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素(羟丙甲纤维素，例如羟丙甲纤维素2910、METHOCELE)、羧甲基纤维素、淀粉、预胶化淀粉、阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)、交联聚乙烯吡咯烷酮、海藻酸钠、微晶纤维素和低取代羟丙基纤维素。在某些实施方案中，所述粘合剂选自湿性粘合剂。在一种类型的实施方案中，所述粘合剂选自纤维素醚，例如，羟丙甲纤维素。

崩解剂包括淀粉、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、交联聚乙烯吡咯烷酮、羟乙酸淀粉钠、低取代羟丙基纤维素和羟丙基淀粉。

助流剂包括各种分子量的聚乙二醇、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硅酸钙、热解法二氧化硅、碳酸镁、十二烷基硫酸镁、硬脂酸铝、硬脂酸、棕榈酸、十六烷醇、油脂剂和滑石粉。

润滑剂包括硬脂酸、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸铝和硅化滑石粉。

药物组合物还可包含诸如任何基于水的介质的水性介质，例如水、盐水溶液、糖溶液、输液溶液或缓冲液。水性介质可含有一种或多种水溶性有机溶剂，例如乙醇、甲醇、四氢呋喃、二甲基亚砜等，但在某些实施方案中，所述药物组合物不含溶剂。水性介质优选是无菌的，并且适合用作活性剂的载体，并且如果存在有机溶剂，则优选地具有低浓度的水溶性有机溶剂。水性介质的实例包括但不限于注射用水、盐水溶液、林格氏溶液、D5W或诸如葡萄糖和其它电解质的水混溶性物质的其它溶液。

药物组合物可含有药学上可接受的盐，如由药学上可接受的无毒酸或碱制备的盐，所述无毒酸或碱包括无机酸和碱以及有机酸和碱。用于本文中提供的组合物的合适的药学上可接受的碱加成盐包括由铝、钙、锂、镁、钾、钠和锌制成的金属盐，或由赖氨酸、N，N′-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(N-甲基葡糖胺)和普鲁卡因制成的有机盐。合适的无毒酸包括无机和有机酸，例如乙酸、海藻酸、邻氨基苯甲酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙烯磺酸、甲酸、富马酸、糠酸、半乳糖醛酸、葡糖酸、葡糖醛酸、谷氨酸、乙醇酸、氢溴酸、盐酸、羟乙磺酸、乳酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、粘酸、硝酸、双羟萘酸、泛酸、苯乙酸、磷酸、丙酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、磺胺酸、硫酸、酒石酸和对甲苯磺酸。无毒酸包括盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和甲磺酸。因此，具体盐的实例包括盐酸盐和甲磺酸盐。

本发明提供了数种制备治疗剂的口服制剂的方法。一种方法是无溶剂方法，其涉及治疗剂与pH敏感性聚合物缔合以形成含有所述药剂和聚合物的纳米粒。本发明提供了含有可溶性治疗剂和pH敏感性聚合物的水溶液。所述溶液最初的pH为约5.0-5.5，随后溶液的pH降低至小于约4.0，由此治疗剂和聚合物缔合。如此形成的聚合物-治疗剂络合物在酸性pH下保持稳定。当将络合物向哺乳动物个体口服给药时，所述治疗剂在胃环境中基本上不降解，并且在较高pH的肠环境中以生物可利用的形式释放。

在该方法的实施方案中，首先将治疗剂和聚合物加入酸性水溶液(即，pH低于约5.5)中，然后通过加入含有表面活性剂、脂质和诸如乙酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、磷酸盐、Tris等的缓冲剂或者诸如氢氧化钠的碱的溶液，将pH升高至高于约5.5。所述聚合物在酸性pH下不溶解，并形成与治疗剂缔合的微粒或纳米粒(取决于pH)。所述微粒在pH大于5.5的水溶液中变成小纳米粒，并且在一些实施方案中，所述纳米粒解离，释放分子形式或不与聚合物颗粒缔合的形式的可溶性治疗剂。在一个实施方案中，通过加入含有约3mM牛磺胆酸钠、约0.75mM磷脂酰胆碱、约106mM氯化钠和约28mM磷酸钠且用NaOH调节至pH 6.5的溶液，使pH升高至高于5.5。在一些实施方案中，然后通过加入HCl将pH降低至小于约4.0。该方法使得产生具有紧密缔合的治疗剂的非常小的纳米粒且在口服给药后有高生物利用度。在实施方案中，所述治疗剂是胰岛素，并且所形成的纳米粒的小粒度低于50nm，优选地低于30nm，例如平均粒度为约18nm，并且纳米粒的形成实现了约100％的胰岛素与纳米粒缔合。任选地，然后可将所述制剂冻干、储存，并且之后在水性介质中重构用于口服给药。冻干的纳米粒可以配制成用于口服给药的混悬剂、胶囊剂或片剂剂型。与冻干前相比，冻干的纳米粒在重构时释放为相同或相似大小的纳米粒。由此形成的纳米粒将不会解离，并且治疗剂不会在酸性pH下释放，即使药剂是在酸性pH下高度可溶的，例如胰岛素。

在另一个实施方案中(在本文中称为“改进的无溶剂”方法)，将治疗剂和聚合物加入适于配制所述治疗剂的第一水性介质中，并将含有诸如乙酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、磷酸盐、Tris等的缓冲剂或诸如氢氧化钠的碱并且pH为约6.5的第二水性介质加入至所述第一水性介质中，以将pH升高至高于5.0，并形成第三水性介质。然后将所述第三水性介质冻干。纳米粒在冻干处理之前形成，并且在冻干材料重构后仍然存在。由此形成的纳米粒不会溶解或解离，并且治疗剂不会在胃环境的酸性pH下释放，即使药剂是在酸性pH下高度可溶的。冻干的纳米粒可以配制为用于口服给药的混悬剂、胶囊剂或片剂剂型。

在上述无溶剂方法的优选的实施方案中，治疗剂在水性介质中的浓度为约0.05％至约1.0％w/v，更优选地为约0.1％至约0.3％w/v。在上述无溶剂方法的优选的实施方案中，所述聚合物在水性介质中的浓度为约0.5％至约10％w/v，更优选地为约1.0％至约3.0％w/v。

本发明的另一个方面是制备治疗剂的可口服给药制剂的基于溶剂的方法。所述方法包括将一体积的含有所述治疗剂的水性介质加入至约2-10体积的含有溶解于水混溶性非水性溶剂(例如有机溶剂)中的pH敏感性聚合物的水性介质中，由此所述治疗剂和pH敏感性聚合物形成含有所述治疗剂的纳米粒或微粒。然后可将悬浮液离心，并收集沉淀的纳米粒或微粒，以储存或再悬浮在另一水性介质中。

在基于溶剂的方法的优选的实施方案中，所述治疗剂在水溶液中的浓度为约0.05％至约1.0％w/v，更优选地为约0.1％至约0.3％w/v。在优选的实施方案中，所述聚合物在水溶液中的浓度为约0.5％至约10％w/v，更优选地为约1.0％至约3.0％w/v。

在基于溶剂的方法中，所述水混溶性溶剂可以是任意极性有机溶剂，例如具有1至6个碳原子的直链、支链或环状醇，或者其可含有至少一种酮、二酮、不饱和酮或环酮。在优选的实施方案中，所述溶剂是乙醇。

本发明的另一方面是治疗疾病或医学病症，或者有助于治疗疾病或医学病症的方法。所述方法包括将含有根据本发明的纳米粒制剂的组合物(例如药物组合物)向需要其的个体口服给药。所述制剂包含有助于治疗所述疾病的治疗剂。优选地，所述治疗剂是如果单独口服给药或使用常规口服药物制剂会降解或难以吸收的治疗剂。所述个体可以是哺乳动物，例如人。

在一些实施方案中，所述治疗剂是胰岛素，并且将本发明的含有胰岛素的组合物口服给药，以治疗婴儿、儿童或青少年中的糖尿病、胰岛素缺乏相关的代谢综合征和糖尿病酮症酸中毒。所述糖尿病可以是1型或2型，并且所述个体可以是需要胰岛素给药的任何哺乳动物或人。本发明的组合物的口服给药可以代替个体的全部或部分常规胰岛素疗法(例如肠胃外给药的胰岛素)。

在其它实施方案中，所述治疗剂是抗肿瘤抗体(即，通过任何机制导致肿瘤细胞死亡的抗体)，并且将其向个体给药以治疗所述个体的癌症。抗肿瘤抗体包括但不限于抗EGFR(例如西妥昔单抗)、抗Her2(例如曲妥珠单抗)、抗RSV(例如帕利珠单抗)、抗白细胞介素(例如托珠单抗)。所述癌症可以是易于用一种或多种抗体治疗的任何癌症，例如乳腺癌、结直肠癌或头颈癌。

在另外的其它实施方案中，所述治疗剂是抗炎抗体，并且所述疾病是炎性疾病。抗炎抗体包括但不限于针对肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞介素-6(IL-6)受体拮抗剂的抗体。炎性疾病包括但不限于克罗恩病、类风湿性关节炎、多关节幼年特发性关节炎和全身性幼年特发性关节炎。

通过该方法形成的纳米粒或微粒可以任何剂型使用，包括丸剂、片剂、胶囊剂、饮料、液体混悬剂或冻干粉末。该组合物可以通过任意给药途径使用，包括口服、吸入、含服、舌下、经鼻、栓剂或肠胃外形式。优选地，所述制剂用于肠内给药，甚至更优选地用于口服给药。

术语“制剂”和“组合物”在本文中可互换使用。

实施例

实施例1.材料和方法

禁食状态模拟胃液(FaSSGF).人FaSSGF从Biorelevant(英国，伦敦)获得。其含有0.08mM牛磺胆酸钠、0.02mM卵磷脂、34.2mM氯化钠和25.1mM盐酸。该溶液的pH为1.6。

禁食状态模拟肠液(FaSSIF).人FaSSIF从Biorelevant(英国，伦敦)获得。其含有3mM牛磺胆酸钠、0.75mM卵磷脂、105.9mM氯化钠、28.4mM磷酸二氢钠和8.7mM氢氧化钠。该溶液的pH为6.5。

无溶剂方法.将治疗剂溶解，并将pH敏感性聚合物在治疗剂可溶的酸性水性介质中悬浮。然后，通过加入含有3mM牛磺胆酸钠、0.75mM磷脂酰胆碱、106mM氯化钠和28mM磷酸钠的溶液将pH升高至5.5或更高，或者使用诸如乙酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、磷酸盐、Tris的缓冲剂将pH升高至高于5.0，或者用NaOH将pH调节至6.5。在pH 6.5下，存在聚合物的纳米粒。随后，用HCl将pH降低至小于4.0，以使治疗剂和颗粒紧密缔合。任选地，然后将该悬浮液冻干。

改进的无溶剂方法.将高分子量治疗剂和pH敏感性聚合物在水性介质中混合，随后向其中加入pH 6.5的溶液，形成具有缔合有治疗剂的纳米粒，然后将悬浮液冻干。然后用适当的水溶液或缓冲液重构冻干的样品。

基于溶剂的方法.将pH敏感性聚合物在100％乙醇中溶解，使溶液中的最终浓度为约1％至约5％。然后将一体积水溶液中的治疗剂加入到2-10体积的含有聚合物的有机溶液中。然后将溶液离心，并收集沉淀的纳米粒。

改进的基于溶剂的方法.将pH敏感性聚合物在100％乙醇中溶解，使溶液中的最终浓度为约1％至约5％。取一体积在酸性pH(约pH 4.0或更低)的水溶液中的治疗剂(其中药剂可溶)，并将pH升高至约5.0或更高，导致治疗剂沉淀。然后，将如此制备的治疗剂加入到2-10体积的含有聚合物的有机溶液中，于是聚合物与沉淀的治疗剂缔合。然后将溶液离心，并收集含有聚合物和治疗剂的纳米粒。

胰岛素酶联免疫吸附测定(ELISA).使用人Iso-胰岛素Instant ELISA试剂盒(Affymetrix/eBioscience Inc.，美国加利福尼亚州圣地亚哥)进行胰岛素的检测和定量。在分析前将样品稀释100,000倍，并按照试剂盒方案的推荐进一步连续稀释。

胰岛素高效液相色谱法(HPLC).使用Agilent Zorbax C8柱通过HPLC进行胰岛素的检测和定量。使用的溶剂是乙腈：水：三氟乙酸，并且监测到洗脱的胰岛素峰(280nm处的吸光度)。洗脱曲线如下表1所示：

时间(分钟)	水％	乙腈％	TFA％
				0	55	35	10
3.75	25	65	10
				6.25	15	75	10
7.5	0	90	10
				9.75	0	90	10
10.0	55	35	10
				12.0	55	35	10

表1

冻干.对于冻干，将等分试样的溶液在-50℃下冷冻2小时，然后在75毫托的压力下以1℃的升温速率加热至20℃。进行冻干，直到与样品接触的皮拉尼压力计达到75毫托或更低。

胰岛素纳米粒制剂.表2示出制备的包含胰岛素作为治疗剂、EUDRAGIT L 100作为pH敏感性聚合物的多种纳米粒制剂的组合物。在下面的实施例中将对制剂进行进一步讨论。

实施例2.冻干后胰岛素纳米粒的溶解度

胰岛素制剂1的组合物描述于表2中。将制剂冻干，然后用1mL的pH为6.5的缓冲液重构10mg冻干粉末(含有1mg胰岛素)，形成纳米粒。然后向溶液中加入100μL的1N HCl，从而使含有聚合物(EUDRAGIT L 100)和胰岛素的颗粒沉淀。离心后上清液的HPLC分析未显示任何胰岛素，尽管胰岛素在HCl中高度可溶，这证明胰岛素已与颗粒紧密缔合。然而，当离心后的沉淀物于pH为7.2的PBS中溶解时，先前沉淀的聚合物变得悬浮，使得以在PBS中溶解或悬浮的形式完全回收胰岛素(1mg)(基于RP-HPLC分析)。

实施例3.胰岛素纳米粒的粒度分布和溶解度

将制剂2的两个5-ml样品调节至pH为2.5，这导致微粒沉淀。然后将样品在3000rpm下离心，以使颗粒沉淀。用HPLC对上清液进行分析，显示没有胰岛素，这表明胰岛素与沉淀的颗粒紧密缔合。向每个样品的团粒中加入5mL的FaSSIF或FaSSGF，以使颗粒在pH为6.5(FaSSIF)或pH小于2.0(FaSSGF)下重新悬浮。监测胰岛素的释放曲线，数据显示在图4中。数据表明，胰岛素在FaSSIF(pH 6.5)中释放，但在FaSSGF(酸性pH)中几乎不释放。使用Zetasizer(Malvern Instruments，英国马尔文镇)和制造商提供的软件对重新悬浮的颗粒的大小进行分析。重新悬浮的颗粒的Z平均直径为20.76nm。

实施例4.酸性和中性pH下胰岛素纳米粒的HPLC分析

使用EUDRAGIT S-100作为聚合物，按照无溶剂方法制备制剂3。当溶液的pH降低至3.5时，颗粒不溶解。当将颗粒转移到pH为7.2的PBS时，沉淀的颗粒变得完全悬浮或可溶，从而使胰岛素在PBS中完全恢复。

实施例5.冻干制剂在橙汁中重构

按照无溶剂方法制备制剂4。当pH降低至3.5时，尽管胰岛素在酸性pH下高度可溶，颗粒也不溶解。通过离心使颗粒沉淀，然后将沉淀物在pH为7.2的PBS中溶解，胰岛素含量完全恢复(基于RP-HPLC分析)。也可将沉淀物在普通的市售橙汁中重构，并且橙汁的分析表明液体中没有游离胰岛素。然而，在将pH调节至6.0时，含有胰岛素的颗粒保留在上清液中。该结果表明，在橙汁或另一种果汁或酸性饮料中重构的制剂可用作糖尿病患者的儿科制剂。

实施例6.含有粘膜粘着剂聚合物的胰岛素纳米粒制剂

按照无溶剂方法制备制剂5。然后将制剂在3mL火石玻璃小瓶中分为1.2mL等分试样，并冻干。HPLC分析显示，重构的冻干粉末完全释放胰岛素，因为用包埋胰岛素的聚合物在pH 5.9下是可溶的。

按照改进的无溶剂方法制备含有粘膜粘着剂聚合物泊洛沙姆的制剂6。将pH调节至3.5。然后将制剂在3mL火石玻璃小瓶中分成1.2mL等分试样，并冻干。HPLC分析显示，重构的冻干粉末不释放胰岛素，因为用包埋胰岛素的聚合物在pH 3.5下是不可溶的。

按照无溶剂方法制备含有粘膜粘着剂聚合物泊洛沙姆的制剂7。然后将制剂在3mL火石玻璃小瓶中分成1.2mL等分试样，并冻干。HPLC分析显示，重构的冻干粉完全释放胰岛素，因为包埋胰岛素的聚合物在pH 5.9下是可溶的。

按照改进的无溶剂纳米粒形成方法制备含有粘膜粘着剂聚合物海藻酸盐、羟丙甲纤维素和泊洛沙姆的制剂8。然后将制剂在3mL火石玻璃小瓶中分成1.2mL等分试样，并冻干。最终pH为5.9。HPLC分析显示，重构的冻干粉末完全释放胰岛素，因为包埋胰岛素的聚合物在pH 5.9下是可溶的。

实施例7.含有脂肪酸渗透性增强剂的纳米粒的粒度

通过将胰岛素和EUDRAGIT加入酸性水溶液中，然后加入NaOH，然后加入pH 6.5的缓冲液，来制备含有辛酸作为渗透性增强剂的制剂9。向该溶液中加入渗透性增强剂辛酸，并将该制剂的pH调节至5.6。该制剂的平均粒度为23nm。将该制剂的1mL等分试样分配在20mL小瓶中，并冻干。HPLC分析显示，重构的冻干粉完全释放胰岛素，因为包埋胰岛素的聚合物在pH 5.6下是可溶的。

通过将胰岛素和Eudragit加入酸性水溶液中，随后加入NaOH，然后加入pH为6.5的缓冲液，来制备含有油酸作为渗透性增强剂的制剂10。向该溶液中加入渗透性增强剂油酸，并使该制剂的pH达到5.6。该制剂的粒度为18.6nm。将该制剂的1mL等分试样分配在20mL小瓶中，并冻干。HPLC分析显示，重构的冻干粉完全释放胰岛素，因为包埋胰岛素的聚合物在pH 5.9下是可溶的。

实施例8.用FaSSIF或FaSSGF重构的冻干纳米粒制剂中胰岛素的释放

如DLS测量，制剂11的平均粒度为18.28nm。将1mL样品分配在两个20mL小瓶中，并冻干。将一个小瓶用FaSSGF重构，并将pH调节至小于2.0。用pH为6.5的FaSSIF重构第二个小瓶。使用胰岛素特异性ELISA监测胰岛素释放曲线24小时。在每个时间点，将样品在10,000rpm下离心5分钟，并通过ELISA测定上清液的胰岛素含量。如图5所示，释放曲线表明，胰岛素仅在pH为6.5而不是在小于2.0的酸性pH下释放到上清液中。

含有粘膜粘着剂聚合物HPMC的制剂12通过DLS测量的平均粒度为23.11nm。将1mL等分试样分配在两个20mL小瓶中，并冻干。将一个小瓶用FaSSGF重构，并将pH调节至小于2.0。将第二个小瓶用pH为6.5的FaSSIF重构。监测胰岛素释放曲线24小时。在每个时间点，将样品在10,000rpm下离心5分钟，并通过HPLC和ELISA测定上清液的胰岛素含量。图6和图7示出通过两种不同的方法测定的释放曲线。HPLC和ELISA均表明，在纳米粒包含粘膜粘着剂聚合物下，胰岛素仅在pH为6.5而不是在小于2.0的酸性pH下释放到上清液中。

含有粘膜粘着剂聚合物海藻酸盐的制剂13通过DLS测量的平均粒度为18.79nm(图8)。将1mL等分试样分配在两个20mL小瓶中，并冻干。将一个小瓶用FaSSGF重构，并将pH调节至小于2.0。将第二个小瓶用pH为6.5的FaSSIF重构。通过ELISA监测胰岛素释放曲线24小时。在每个时间点，将样品在10,000rpm下离心5分钟，并测定上清液的胰岛素含量。图9示出释放曲线。在纳米粒中包含海藻酸盐下，胰岛素仅在pH为6.5而不是在小于2.0的酸性pH下释放到上清液中。

含有粘膜粘着剂聚合物壳聚糖的制剂14通过DLS测量的平均粒度为1577nm。这种大粒度可能是由于壳聚糖在pH 6.5下的不溶性导致的。将1mL等分试样分配在两个20mL小瓶中，并冻干。将一个小瓶用FaSSGF重构，并将pH调节至小于2.0。将第二个小瓶用pH为6.5的FaSSIF重构。监测胰岛素释放曲线24小时。在每个时间点，将样品在10,000rpm下离心5分钟，并通过ELISA和HPLC测定上清液的胰岛素含量。图10和图11示出两种方法的释放曲线。在纳米粒中包含壳聚糖下，胰岛素仅在pH为6.5而不是在小于2.0的酸性pH下释放到上清液中。

含有辛酸作为渗透性增强剂的制剂15通过DLS测量的平均粒度为23.67nm。将1mL等分试样分配在两个20mL小瓶中，并冻干。将一个小瓶用FaSSGF重构，并将pH调节至小于2.0。将第二个小瓶用pH为6.5的FaSSIF重构。监测胰岛素释放曲线24小时。在每个时间点，将样品在10,000rpm下离心5分钟，并通过ELISA和HPLC测定上清液的胰岛素含量。图12和图13示出释放曲线。在纳米粒中包含辛酸下，胰岛素仅在pH为6.5而不是在小于2.0的酸性pH下释放到上清液中。

含有油酸作为渗透性增强剂的制剂16通过DLS测得的平均粒度为18.55nm(图14)。将1mL等分试样分配在两个20mL小瓶中，并冻干。将一个小瓶用FaSSGF重构，并将pH调节至小于2.0。将第二个小瓶用pH为6.5的FaSSIF重构。监测胰岛素释放曲线24小时。在每个时间点，将样品在10,000rpm下离心5分钟，并通过ELISA和HPLC测定上清液的胰岛素含量。图15和图16示出释放曲线。在纳米粒中包含油酸下，胰岛素仅在pH为6.5而不是在小于2.0的酸性pH下释放到上清液中。

实施例9.用口服胰岛素制剂治疗糖尿病

通过基于溶剂的方法制备的制剂的功效在患有2型糖尿病并且服用每日剂量为100mg二甲双胍和夜间42单位胰岛素的人类个体上进行测试。该用药方案被认为是阳性对照。用药一共停止一天，用作阴性对照。

按照如下方法制备纳米粒制剂。在150mL烧杯中称量212mg胰岛素，然后加入5mL的0.01N HCl以溶解胰岛素。然后，在乙醇中加入1.072g的EUDRAGIT L 100，然后加入105mLpH为6.5的缓冲液。该混合物的pH为5.7l；然后使用5N NaOH将其调节至5.95(以得到制剂16)，或使用HCl将其调节至pH 3.3(以得到制剂17)。将16mL的各制剂加入到6个50mL小瓶中，用橡胶塞部分堵塞，并冻干。当与样品接触的皮拉尼压力计测得的压力达到隔板设定压力时，认为冻干步骤完成(图17和图18)。然后用15mL注射用水重构制剂，以获得2mg/mL的最终浓度。个体口服15mL含有2mg/mL胰岛素的该制剂，每晚一剂。所有药物均在餐后立即服用。在餐后两小时使用具有OneTouch 测试条的OneTouch 血糖仪(LifeScan，Inc.)测量血糖水平。第一次读数作为时间0。数据表明，在服用二甲双胍和胰岛素(阳性对照)后，血糖稳定下降，但在没有服用药物的情况下(阴性对照)，血糖水平高于200mg/dl。实验数据显示，口服给药制剂17(pH为5.9)或制剂18(pH为3.5)能够降低餐后血糖过多。从大约2小时开始，血糖水平稳定下降至正常血糖水平(约100mg/d1)(图19)。

实施例10.用口服胰岛素制剂控制血糖

进行实验以将犬在单次口服剂量的EUDRAGIT L100-胰岛素(制剂16)后的血糖反应与单次皮下注射市售HUMULIN R胰岛素(Lilly，USA)后的血糖反应进行比较。

三只非幼稚雌性比格犬在第2天通过经口灌服给药单次在USP注射用无菌水中2mg/kg剂量的制剂16，并且在第4天通过皮下注射给药单次0.5U/kg剂量的HUMULIN R胰岛素。第一天，在喂食前、食物移除后即刻及食物移除后1、2、3、4和6小时测量血糖水平。在第2天和第4天，在喂食之前、在食物移除后但在给药之前立即以及在给药之后1、2、3、4、6和24小时(喂食之前)测量血糖水平。在第5天完成研究数据收集后，将动物放回畜棚。研究设计如表3所示。犬中没有死亡，并且没有注意到发生与测试制品相关的临床观察或不良反应。结果如图20所示。

口服给药所述口服胰岛素制剂后三只犬的血糖在喂食后6小时范围内为对照血糖水平的80％至98％。相反，皮下给药HUMULIN得到80-134％的对照血糖水平，因此表明与皮下给药HUMULIN相比，口服给药纳米粒胰岛素制剂后会长期保持较低血糖。口服给药制剂16导致三只犬中的两只在给药后2小时内达到正常血糖水平。与第1天(未用药)的值相比，给药HUMULIN后1小时内导致较低的血糖，但是给药后3-6小时血糖较高(对照值的120％至174％)。这些观察结果表明，纳米粒-胰岛素制剂的口服给药更好地模拟分泌后体内内源性胰岛素的作用，提供更好的葡萄糖体内平衡。总体而言，与皮下给药HUMULIN后相比，口服给药制剂16后的血糖水平较低，并且更稳定(波动较少)。

表3.犬胰岛素研究的设计

实施例11.无溶剂法制备抗EGFR抗体口服制剂

ERBITUX(西妥昔单抗)是表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂，适用于治疗头颈癌和结直肠癌。推荐的初始剂量为400mg/m²，以120分钟静脉内输注(最大输注速率10mg/min)给药。西妥昔单抗市售形式为5mg/mL溶液，其含有8.48mg/mL氯化钠、1.88mg/mL磷酸氢二钠七水合物、0.41mg/mL磷酸二氢钠一水合物和注射用水，USP。将该剂型的400μL西妥昔单抗加入到10mL小瓶中的20mg EUDRAGIT L 100中，然后加入2mLpH为6.5的缓冲液(表4)。

将该溶液等分为1.2mL样品，将其置于10mL小瓶中，并冻干。将一个样品用1mL的FaSSGF重构，并将第二个样品用1mL的FaSSIF重构。在0、1、2、4、8和24小时取120μL样品，置于1.5mL离心管中，并在10,000rpm下离心5分钟。将各样品的40μL上清液注射用于尺寸排阻色谱-HPLC分析。使用Tosohaas G3000SWXL柱进行SEC-HPLC。释放曲线表明，西妥昔单抗未在FaSSGF(酸性pH)中释放到上清液中，但是在FaSSIF(pH为6.5)中释放到上清液中(图21)。离心24小时FaSSGF样品后，用1mL pH为7.4的PBS重构团粒，由此抗体释放到上清液中。

表4.ERBITUX(西妥昔单抗)的组合物(1mL，最终pH 6.5)

组分	浓度/量
		牛磺胆酸钠	2.5mM
卵磷脂	0.6mM
		磷酸二氢钠	23.6mM
氯化钠	88.2mM
		氢氧化钠	7.2mM
EUDRAGIT L 100	10mg
		ERBITUX	1mg
氯化钠	1.4mM
		磷酸氢二钠七水合物	0.3mM

实施例12.通过无溶剂法制备抗Her-2抗体口服制剂

HERCEPTIN(曲妥珠单抗)适应症为用于乳腺癌的辅助治疗。曲妥珠单抗是一种无菌、白色至浅黄色、不含防腐剂的冻干粉末，其用于静脉内给药。曲妥珠单抗的各市售多用小瓶含有440mg曲妥珠单抗、400mg α，α-海藻糖二水合物、9.9mg L-组氨酸HCl、6.4mg L-组氨酸和1.8mg聚山梨酯20、USP，冻干形式。用20mL注射用水重构得到含有21mg/mL曲妥珠单抗的溶液，pH为约6.0。对于该研究，将200μL曲妥珠单抗的市售剂型加入到10mL小瓶中的70mg EUDRAGIT L 100中。向该溶液中加入7.5mL pH为6.5的缓冲液。之后将该溶液的1.45mL等分试样置于10mL小瓶中，并冻干。将一个样品用1mL的FaSSGF(pH为2.1)重构；并将第二个样品用FaSSIF(pH为6.5)重构。在0、1、2、4、8和24小时取120μL样品，置于1.5mL离心管中，并在10,000rpm下离心5分钟。用功能性ELISA测定评估回收的曲妥珠单抗的活性。为此，在用FaSSGF(pH为1.5-2)或FaSSIF(pH为6.5)重构后，由于曲妥珠单抗制剂缓冲液的缓冲能力，最终pH分别调节至pH 1.5和6.5。然后用ELISA测定缓冲液将样品稀释20,000倍。然后使用人Human IgG total Ready-Set-Go！(Affymetrix/eBioscience Inc.，美国加利福尼亚州圣地亚哥)进行曲妥珠单抗的检测和定量。即使在24小时后，在酸性pH下也未观察到曲妥珠单抗释放到上清液中。然而，在pH为6.5时，大部分抗体在1小时内释放到上清液中(图22)。

表5.HERCEPTIN(曲妥珠单抗)的组合物(1mL，最终pH6.5)

组分	浓度/量
		牛磺胆酸钠	2.9mM
卵磷脂	0.7mM
		磷酸二氢钠磷酸盐	27.6mM
氯化钠	103.1mM
		氢氧化钠	8.5mM
EUDRAGIT L 100	10mg
		HERCEPTIN	1mg
海藻糖	0.519mM
		组氨酸HCl	0.013mM
组氨酸	0.008mM
		聚山梨酯20	0.002mM

实施例13.通过无溶剂法制备抗RSV抗体口服制剂

SYNAGIS(帕利珠单抗)是通过重组DNA技术制备的人源化单克隆抗体(IgG1k)，其针对呼吸道合胞病毒(RSV)F蛋白的A抗原位点中的表位。每100mg单剂量小瓶的帕利珠单抗液体溶液含有100mg帕利珠单抗、3.9mg组氨酸、0.1mg甘氨酸和0.5mg氯化物，体积为1mL，pH为约大6.0。剂型是肌内注射剂。将98μL帕利珠单抗加入到10mL小瓶中的98mg EUDRAGIT L100中。向该溶液中加入9.8mL pH为6.5的缓冲液。然后将两个1.1mL的样品置于10mL小瓶中，并冻干。一个样品用1mL的FaSSGF(pH为2.1)重构，第二个样品用FaSSIF(pH为6.5)重构。在0、1、2、4、8和24小时取120μL样品，置于1.5mL离心管中，并在10,000rpm下离心5分钟。注射各样品的40μL上清液用于SEC-HPLC分析，所述分析使用Tosohaas G3000SWXL柱进行。即使在24小时后，在酸性pH下也未观察到曲妥珠单抗释放。然而，在pH为6.5的FaSSIF中观察到该抗体的完全释放。将FaSSGF样品离心24小时后，用1mLpH为7.4的PBS重构团粒。帕利珠单抗仅在溶液达到中性pH时才释放，即使在酸性介质中保持24小时后也是如此(图23)。除SEC数据外，用功能性ELISA测定法评估抗体活性。为此，在用FaSSGF或FaSSIF重构后，将最终pH分别调节至pH 1.5和6.5。然后用ELISA测定缓冲液将样品稀释20,000倍。然后使用人IgG total Ready-Set-Go！ (Affymetrix/eBioscience Inc.，美国加利福尼亚州圣地亚哥)进行帕利珠单抗的检测和定量。即使在24小时后，在酸性pH下也未观察到帕利珠单抗释放到上清液中。然而，在pH为6.5时，大部分抗体在1小时内释放到上清液中(图24)。

表6.SYNAGIS(帕利珠单抗)的组合物(1mL，最终pH 6.5)

组分	浓度/量
		牛磺胆酸钠	2.7mM
卵磷脂	0.67mM
		磷酸二氢钠磷酸盐	25.00mM
氯化钠	95.00mM
		氢氧化钠	7.9mM
EUDRAGIT L 100	10mg
		SYNAGIS	1mg
组氨酸	0.39mM
		甘氨酸	0.01mM

实施例14.通过无溶剂法制备抗TNF抗体口服制剂

HUMIRA(阿达木单抗)是肿瘤坏死因子(TNF)阻断剂，适用于治疗类风湿性关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩病和斑块状银屑病。阿达木单抗以阿达木单抗的无菌、无防腐剂的溶液形式提供，其用于皮下给药。该药品可以一次性预填充笔或作为一次性使用的1mL预填充玻璃注射器的形式提供。封装在笔内的是一次性使用的1mL预填充玻璃注射器。阿达木单抗的溶液是澄清且无色的，pH为约5.2。每个注射器递送0.8mL(40mg)的药物产品。各0.8mL该剂型含有40mg阿达木单抗、4.93mg氯化钠、0.69mg磷酸二氢钠二水合物、1.22mg磷酸氢二钠二水合物、0.24mg柠檬酸钠、1.04mg柠檬酸一水合物、9.6mg甘露醇、0.8mg聚山梨酯80和注射用水USP。根据需要加入氢氧化钠以调节pH。该剂型是肌内注射剂。用各制剂缓冲液将该制剂稀释至1mg/mL。将2mL阿达木单抗加入到10mL小瓶中的20mgEUDRAGIT L 100中。将该溶液的1.0mL样品置于10mL小瓶中，并冻干。

一个样品用1mL的FaSSGF(pH为2.1)重构，第二个样品用1mL的FaSSIF(pH为6.5)重构。在0、1、2、4、8和24小时取120μL样品，置于1.5mL离心管中，并在10,000rpm下离心5分钟。使用功能性ELISA测定法测定上清液对TNF的活性。为此，用FaSSGF或FaSSIF将各样品稀释10,000倍，并用来自试剂盒阿达木单抗(HUMIRA)ELISA测定试剂盒(Eagle BiosciencesInc.，Nashua，NH，USA)的稀释样品缓冲液进一步稀释6倍。即使在24小时后，在酸性介质中也未观察到阿达木单抗释放到上清液中。然而，在pH为6.5时，大部分抗体在1小时内释放到上清液中(图25)。

表7.HUMIRA(阿达木单抗)的组合物(1mL，最终pH 6.5)

组分	浓度/量
		EUDRAGIT L 100	10mg
HUMIRA	1mg
		氯化钠	6.2mM
磷酸二氢钠	0.9mM
		磷酸二氢钠二水合物	1.5mM
柠檬酸钠	0.24mg
		柠檬酸一水合物	1.3mM
甘露醇	12.0mM

实施例15.通过无溶剂法制备抗IL-6抗体口服制剂

ACTEMRA(托珠单抗)是白细胞介素-6(IL-6)受体拮抗剂，用于治疗：类风湿性关节炎、多关节幼年特发性关节炎和全身性幼年特发性关节炎。其以一次性使用预填充玻璃注射器的形式市售，在0.9mL中提供162mg抗体。非活性成分是L-精氨酸、L-精氨酸盐酸盐、L-甲硫氨酸、L-组氨酸、L-组氨酸盐酸盐一水合物。该剂型是皮下注射剂。对于该研究，用各制剂缓冲液将该制剂稀释至2mg/mL。将1mL托珠单抗加入到10mL小瓶中的20mg EUDRAGIT L100中，然后加入1mL pH为6.5的缓冲液。然后将pH调节至6.8。将该溶液的1.0mL样品置于10mL小瓶中，并冻干。

一个样品用1mL的FaSSGF(pH为2.1)重构，第二个样品用FaSSIF(pH为6.5)重构。在0、1、2、4、8和24小时取120μL样品，置于1.5mL离心管中，并在10,000rpm下离心5分钟。用功能性ELISA测定法评估回收的托珠单抗的活性。为此，在用FaSSGF(pH为1.5-2.0)或FaSSIF(pH为6.5)重构后，最终pH分别调节至pH 1.5和6.5。然后用ELISA测定缓冲液将样品稀释20,000倍。然后使用人IgG total Ready-Set-Go！(Affymetrix/eBioscienceInc.，美国加利福尼亚州圣地亚哥)进行托珠单抗的检测和定量。即使在24小时后，在酸性pH下也未观察到托珠单抗释放到上清液中。然而，在pH为6.5时，大部分抗体在1小时内释放到上清液中(图26)。

表8.冻干ACTEMRA(托珠单抗)的组合物(1mL组合物)

实施例16.通过无溶剂法制备抗坏血酸口服制剂

用以下组合物制备10mL抗坏血酸溶液：

1.75g抗坏血酸

100mg Eudragit

1.75g大豆卵磷脂

2.7mM牛磺胆酸钠

0.7mM大豆卵磷脂

28.36mM磷酸二氢钠

105.85mM氯化钠

1N NaOH至pH 6.5

使用100Kda截止透析膜在pH下相对100mL的FASSIF透析1ml上述制剂，以测试肠道条件下的释放曲线。将1ml另一等分试样调节至pH 2.0，并在pH 1.5下相对100mL的FASSGF进行透析以测试胃条件下的释放曲线。在不同的时间点取样样品的等分试样，分别用FASSIF或FASSGF溶液稀释100倍后，使用Molecular Device UV-VIS分光光度计在260nm下测量抗坏血酸含量。溶解在pH为6.5的FASSIF中的抗坏血酸用作标准品。FASSIF或FASSGF用作空白。

数据(参见图27)表明，抗坏血酸仅在pH 6.5下释放，并且在非常酸性pH下未明显释放。通过DLS测定的最终制剂的平均粒度为34.9nm(图28)。结果表明，所述制剂可用于口服递送维生素C，提供175mg/mL的高负荷。所述制剂易于冻干，并且可以混悬剂、片剂或胶囊剂的粉末形式递送，或者可以儿科制剂的稳定水性混悬剂的形式递送。

实施例17.基于溶剂的方法制备含牛血清白蛋白的纳米粒

将1mL的10mg/mL牛血清白蛋白在10mL乙醇中的1％EUDRAGIT L 100中稀释。将样品在-20℃下保持30分钟，然后在3200rpm下离心。将团粒干燥过夜，并在1mg/mL的FaSSGF(pH为1.5-2.0)或FaSSIF(pH为6.5)中重构。图29中所示的释放曲线表明，白蛋白在中性pH(FaSSIF)下快速释放到上清液中，并且在酸性pH(FaSSGF)下仅缓慢释放。

实施例18.通过基于溶剂的方法制备胰岛素纳米粒

众所周知，胰岛素在酸性pH下可溶，但在中性pH下不溶。通过首先将胰岛素在0.01N HCl中溶解来制备10mg/mL胰岛素溶液。当将0.1mL胰岛素溶液加入1mL乙醇中的2％EUDRAGIT L 100中时，没有可见的沉淀，这表明在酸性pH下胰岛素甚至在90％的有机溶剂中也是可溶的。当该制剂用0.1N NaOH中和时，胰岛素和EUDRAGIT共沉淀。沉淀物含有Z平均粒度为约1110nm的纳米粒。将样品在-20℃下保持30分钟，然后在3200rpm下离心。使用真空离心机将团粒干燥2小时，并测试在FaSSGF和FaSSIF中的释放曲线。图30中显示的数据表明，胰岛素优选地在中性pH下释放到上清液中。

实施例19.通过基于溶剂的方法制备含胰岛素-海藻酸的纳米粒

将100μL水中的2％海藻酸加入到1mL乙醇中的1％EUDRAGIT L 100并进行涡旋。通过将胰岛素溶解在0.01N HCl中来制备10mg/mL胰岛素。随后，将0.1mL0.01N HCl中的10mg/mL胰岛素加入到乙醇溶液中。没有可见的沉淀发生。然而，当该制剂用0.1N NaOH中和时，胰岛素和EUDRAGIT共沉淀。将样品在-20℃下保持30分钟，然后在3200rpm下离心。使用真空离心机将团粒干燥2小时，并测试在FaSSGF和FaSSIF中的胰岛素释放。数据在图31中显示，其表明胰岛素优选在中性pH下释放到上清液中。

实施例20.胰岛素和Eudragit纳米粒的缔合

通过如下无溶剂方法形成含胰岛素的纳米粒。制备具有以下组分的制剂：

1mL 20mg/ml胰岛素储备液

100mg Eudragit L-100

100uL 0.2N NaOH至pH 6.5

2.7mM牛磺胆酸钠

0.7mM大豆卵磷脂

28.36mM磷酸二氢钠

105.85mM氯化钠

根据DLS分析，制剂的粒度为18nm。将1mL等分试样分配在20mL小瓶中，并冻干。将一个小瓶用FaSSGF重构，并将pH调节至pH 1.6。所得到的悬浮液是混浊的。用FASSIF重构第二个小瓶，重构溶液的pH为pH 5.5。所得到的悬浮液为乳白色。第三个小瓶用FASSIF重构，并将pH调节为6.5。所得到的悬浮液为澄清且透明的。将样品转移至截留分子量为50,000Da的透析管中。将样品相对2mL的FASSGF(pH为1.6)、FASSIF(pH为5.5)或FASSIF(pH为6.5)透析，并通过RP-HPLC在0、0.15、0.30、1.0、2.0、4.0和24小时监测透析管的胰岛素释放。HPLC数据表明，在任何pH下24小时的时间段内，胰岛素与纳米粒紧密缔合。24小时后，从透析袋内部取出FASSIF(pH为6.5)样品，并通过RP-HPLC方法测试胰岛素含量。数据表明，透析袋内的样品的2mg/mL胰岛素被完全回收。

如本文中所使用，“基本上由......组成”不排除不会实质上影响权利要求的基本和新颖特征的材料或步骤。本文中对术语“包含”、“包括”、“含有”的任何叙述，特别是在组合物的组分的描述中或在装置的元件的描述中，可以与“基本上由......组成”或“由......组成”互换。

虽然已经结合某些优选的实施方案对本发明进行了描述，但是在阅读前述说明书之后，普通技术人员能够对本文中所述的组合物和方法进行各种改变、等同替换和其它修改。

Claims (30)

1.治疗剂的口服制剂，所述制剂包含平均粒度为50nm或更小的多种纳米粒，所述纳米粒包含pH敏感性聚合物和分子量为约10000道尔顿或更小的治疗剂。

2.如权利要求1所述的制剂，其中所述纳米粒基本上由所述pH敏感性聚合物和所述治疗剂组成。

3.如权利要求1所述的制剂，其中所述纳米粒还包含选自表面活性剂、脂质、粘膜粘着剂聚合物及其组合的组分。

4.如权利要求1所述的制剂，其中所述制剂还包含pH大于约5.0的水性介质。

5.如权利要求1所述的制剂，其中在将所述纳米粒置于pH小于约2.0的水性介质中2小时后，小于5％的所述治疗剂从所述纳米粒中释放。

6.如权利要求1所述的制剂，其中所述纳米粒的平均粒度为约10nm至约30nm。

7.如权利要求1所述的制剂，其中所述治疗剂是肽、蛋白质、核酸、小分子药物或其组合。

8.如权利要求1所述的制剂，其中所述治疗剂是胰岛素。

9.如权利要求1所述的制剂，其中所述pH敏感性聚合物是醋酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯或甲基丙烯酸甲酯/甲基丙烯酸酯共聚物。

10.治疗剂的口服制剂，所述制剂包含平均粒度为100nm或更小的多种纳米粒，所述纳米粒包含pH敏感性聚合物和分子量大于10000道尔顿的治疗剂。

11.如权利要求10所述的制剂，其中所述纳米粒基本上由所述pH敏感性聚合物和所述治疗剂组成。

12.如权利要求10所述的制剂，其中所述纳米粒还包含选自表面活性剂、脂质、粘膜粘着剂聚合物及其组合的组分。

13.如权利要求11所述的制剂，其中所述制剂还包含pH大于约5.0的水性介质。

14.如权利要求11所述的制剂，其中在将所述纳米粒置于pH小于约2.0的水性介质中2小时后，小于5％的所述治疗剂从所述纳米粒中释放。

15.如权利要求11所述的制剂，其中所述治疗剂选自蛋白质、核酸、抗体、病毒样颗粒、载体、疫苗及其组合。

16.如权利要求15所述的制剂，其中所述治疗剂为选自抗-EGFR、抗-Her2、抗-RSV、抗白细胞介素和抗-TNF的抗体，或者为选自西妥昔单抗、曲妥珠单抗、帕利珠单抗、托珠单抗和阿达木单抗的抗体。

17.如权利要求11所述的制剂，其中所述pH敏感性聚合物是醋酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯或甲基丙烯酸甲酯/甲基丙烯酸酯共聚物。

18.制备治疗剂的可口服给药制剂的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)制备包含所述治疗剂和pH敏感性聚合物的水性介质，溶液的pH大于约5.5，由此所述聚合物形成缔合有所述治疗剂的纳米粒；以及

(b)任选地将所述溶液的pH降低至小于约4.0。

19.如权利要求18所述的方法，其中步骤(a)包括提供包含所述治疗剂和pH敏感性聚合物的pH低于5.5的水溶液，然后通过加入含有表面活性剂、脂质和缓冲剂的溶液将所述pH升高至高于5.5。

20.如权利要求19所述的方法，其中通过加入pH5-8的缓冲剂和一种或多种稳定化赋形剂，或者含有0-10mM作为所述表面活性剂的牛磺胆酸钠、0-1.5mM作为所述脂质的磷脂酰胆碱、0-150mM氯化钠和0-50mM作为所述缓冲剂的磷酸钠的溶液，将所述pH升高至高于5.5。

21.如权利要求18所述的方法，其中在步骤(b)中通过加入HCl来降低所述pH。

22.如权利要求18所述的方法，其还包括：

(c)将步骤(b)或者如果未进行步骤(b)时步骤(a)中所得的制剂冻干。

23.如权利要求18所述的方法，其中所述治疗剂的分子量为约10000道尔顿或更小，并且所述所得的制剂包含平均粒度为约50nm或更小的多种纳米粒，或者其中所述治疗剂的分子量大于约10000道尔顿，并且所述所得的制剂包含平均粒度为约100nm或更小的多种纳米粒。

24.如权利要求18所述的方法，其中所述pH敏感性聚合物是醋酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯或甲基丙烯酸甲酯/甲基丙烯酸酯共聚物。

25.如权利要求18所述的方法，其中所述治疗剂选自肽、蛋白质、核酸、抗体、疫苗、载体及其组合。

26.治疗剂的口服制剂，其通过权利要求18所述的方法制备。

27.有助于治疗疾病的方法，所述方法包括将如权利要求1所述的制剂向需要其的个体口服给药，其中所述制剂包含有助于治疗所述疾病的治疗剂。

28.如权利要求27所述的方法，其中所述治疗剂是胰岛素，并且所述疾病选自婴儿、儿童或青少年中的糖尿病、胰岛素缺乏相关的代谢综合征和糖尿病酮症酸中毒。

29.如权利要求27所述的方法，其中所述治疗剂是抗肿瘤抗体，并且所述疾病是癌症。

30.如权利要求27所述的方法，其中所述治疗剂是抗炎抗体，并且所述疾病是炎性疾病。