CN103656665A - 抗肿瘤药物复合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种协同的纳米复合物，其特征在于，所述的纳米复合物包含与蛋白质结合的抗肿瘤药物和凋亡素，其中，所述的抗肿瘤药物和凋亡素的质量比例为1:100-100:1，所述的蛋白质、抗肿瘤药物和凋亡素分别占复合物总质量的10%-98%、0.01%-50%和0.01%-50%，条件是所述蛋白质、抗肿瘤药物和凋亡素的质量之和为100%；所述的复合物粒径为50-500nm。本发明的复合物可通过物理混合的方法制备得到。本发明的复合物可混悬在稀释液中形成新的抗肿瘤复合物。该复合物不会因加入乳化剂和增溶剂而引起过敏反应。另外，该复合物利用凋亡素和化疗药物不同的抗肿瘤机理，发挥强力的协同作用，可降低化疗药物的给药剂量，从而降低其毒副作用。

Description

抗肿瘤药物复合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种抗肿瘤药物复合物以及所述复合物的制备方法。

背景技术

恶性肿瘤是人类最难对付的顽症之一。近年来，肿瘤的发病率急剧上升，其治疗难度大、死亡率高，己成为人类死亡的第二大病因。据报道，全世界每年约有600万人死于恶性肿瘤；中国癌症患者约450万人，死亡率逾30％，已成为严重的社会问题。目前，临床上常采用的治疗恶性肿瘤的手段包括手术、化疗及放疗等。对于早期肿瘤，手术切除辅以其它疗法往往可取得较好的治疗效果；而对于晚期肿瘤，多以放、化疗综合治疗以延缓病情的发展，但均伴随严重的免疫系统抑制或毒副作用，难以有效提高患者的生存率和生活质量。因而，探寻疗效好、不良反应较小的治疗手段或药物一直是肿瘤治疗的研究热点和努力方向。

在抗肿瘤领域，由于大多数药物的溶解性较差，因此药学研究者一直致力于通过制剂手段改善这一局面。通常现有的制剂手段是将该类药物制成微乳、脂质体、纳米粒等新型剂型以改善药物原有性质。如美国专利6,046,230中提到将水不溶性药物溶于有机溶剂（如乙醇等）和其它混合增溶剂（如PEG300和聚氧乙烯类表面活性剂的混合物）中，然后与生理盐水混合形成纳米乳剂以提高药物的溶解性。如FDA批准了阿霉素脂质体用于卵巢癌治疗，该制剂以PEG-STEALTH为载体制成包载阿霉素的脂质体用于注射给药，该递药系统能够避开体内免疫系统的吞噬，从而起到延长体内循环时间，提高药物生物利用度的作用，同时还可增加肿瘤细胞内的药物蓄积浓度。

紫杉醇为抗肿瘤药中最为经典的药物。它本是一种天然产物，是从红豆杉树皮或针叶中提取的一种四环二萜类化合物，具有稳定微管并促进其聚合和组装的独特抗肿瘤作用，被誉为20世纪抗肿瘤药物研究的最大发现（J.Am.Chem.Soc.93:2325(1971)）。由于水溶性低，口服生物利用度差，传统的紫杉醇注射液采用聚氧乙烯蓖麻油-无水乙醇混合助溶剂进行溶解，所得制剂商品名为泰素(Taxol)，是目前肺癌、乳腺癌、头颈癌等的一线化疗药物。临床上助溶剂的使用对化疗治疗可产生以下影响：①降低化疗疗效，由于溶剂在血液中形成的胶束包裹了紫杉醇，从而改变了紫杉醇的生物利用度，使其呈现非线性药代动力学表现，同时这种胶束还会包裹合并的药物，影响合用药物的生物利用度从而影响药效；②增加毒性反应，溶剂本身会产生严重的过敏反应及骨髓抑制作用，另外，有证据证明聚氧乙烯蓖麻油会引起神经轴突变性和脱髓鞘反应，从而使病人在化疗前需要激素预处理以避免严重过敏反应发生及治疗中需要或增加生长因子支持，另外，这种溶剂延长了紫杉醇神经病变持续的时间以及造成病人体液潴留；③泰素使用前需要抗组胺预处理，配制时需要稀释到较大体积，且耗时较长，往往需要病人住院。而紫杉醇白蛋白纳米粒无需预处理，30分钟输注完毕，门诊即可完成。综上，泰素在临床应用时存在过敏、中性粒细胞减少和神经毒性等严重的不良反应，使其安全性和有效性受到影响。

因此，以改善水溶性、增加靶向性、减少不良反应为目标的紫杉醇制剂研究备受关注。由美国生物科学公司(American BioScience Inc.)研发的紫杉醇-人血白蛋白纳米微粒冻干粉针(Abraxane)现已在全球多个国家上市。Ⅲ期临床研究结果显示，其过敏反应发生率不到1%，较Taxol显著降低，响应率也明显提高。

众所周知，白蛋白是人体内最常见的天然蛋白，是人体内难溶于水的营养物质、维生素和其他化合物的天然转运载体，白蛋白携带着大分子物质穿梭于血管壁，从血循环中进入血管壁另一侧的组织中。这个天然生理过程，被称为血管内皮的胞膜窖转运功能。肿瘤组织通过高主动性对白蛋白的摄取获取难溶于水的营养物质保证肿瘤组织的生长。Abraxane就是利用了紫杉醇和白蛋白在高速剪切力的作用下形成由包被蛋白的水不溶性药物纳米颗粒和药物分子所结合的游离蛋白组成的纳米颗粒系统，该颗粒系统可以转化为易再分散的注射用无菌干粉（国际专利申请WO98/14174）。上述给药系统能将紫杉醇主动转运到肿瘤细胞内，使肿瘤细胞内药物浓度显著升高，图1数据显示了放射性标记的紫杉醇和白蛋白结合型紫杉醇在人类乳腺癌细胞株（代号MX-1）的裸鼠异体移植瘤中随时间累积的曲线。在相同给药剂量下，白蛋白结合紫杉醇组的AUC较紫杉醇组高33%。目前可能的解释为：①肿瘤及周围的基质细胞会分泌白蛋白结合蛋白，使得与白蛋白结合的药物富集于肿瘤(Kratz F.J ControlRelease.2008;132[3]：171-183)；②肿瘤细胞特异性的血管分化和高渗漏性血管，使得白蛋白结合型紫杉醇较游离紫杉醇更易进入肿瘤细胞(Gardner ER等，Clin Cancer Res.2008;14[13]:4200-4205)；③白蛋白结合型紫杉醇的形式较游离紫杉醇具有更强的通过内皮细胞能力(Desai等，Clin Cancer Res.2006;12[4]:1317-1324)。

此外，中国专利申请03108361.7对该给药系统的工艺进行了优化，不但简化了工艺流程，降低了生产成本，而且还提高了该给药系统在可注射的生理溶液中的稳定性。总之，应用白蛋白结合技术最大的优势体现在避免了使用表面活性剂，降低过敏反应的发生机率；但仍然存在总体疗效有限，大剂量使用时，紫杉醇对全身副作用较大的问题。

近年来肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TNF related apoptosis inducingligand，TRAIL）作为肿瘤坏死因子超家族的一员，受到诸多研究者和制药公司的关注。现有技术公开了TRAIL全分子由281个氨基酸组成，分子量约为32000道尔顿，其N-末端第15～40位氨基酸为疏水区域形成的跨膜结构，N-末端第95～281位或114～281位氨基酸组成的C-末端胞外区域为亲水性区域。TRAIL的活性形式为胞外亲水性区域与锌离子络合形成的同源三聚体。与其他肿瘤坏死因子或化疗药物相比，TRAIL可快速启动细胞凋亡信号途径，强力诱导肿瘤和转化细胞凋亡，对正常组织细胞则基本无影响。有研究显示，随着TRAIL浓度的增加，其对人胶质瘤U87细胞的诱导凋亡作用明显增强，对正常细胞基本无杀伤作用（参见Henning Walczak等，Nat Med，2002，8：808-815）。TRAIL的这一优点使其在肿瘤治疗方面有着广阔的应用前景。由美国Genetech和Immunex公司联合研制开发的TRAIL已于2001年经FDA批准进入I期临床研究；国内恰尔生物技术有限公司研制的TRAIL注射剂目前已经结束Ⅲ期临床研究，正处于揭盲阶段。基于TRAIL的潜在应用优势，国内外已有研究者通过生物工程技术，利用工程菌重组表达产生TRAIL全分子N-末端第95～281位或第114～281位氨基酸所形成的亲水性蛋白分子，称之为重组人凋亡素2配体。

有文献报道，凋亡素与化疗药物合用可增加其对肿瘤细胞的抑制和凋亡作用（参见Naka T等，Cancer Res，2002，62：5800-5906；Heather Wahl等，GynecolOncol，2007，105：104-112；Thomas J等，Cancer Immunol Immun，2006，55：76-84），两者具有协同的抗肿瘤效果。但是，仍存在以下缺陷：①TRAIL的生物半衰期较短（人体的T_1/2<0.6小时），为维持其有效血药浓度，用药频繁且给药剂量大，而大剂量TRAIL具有发热、乏力、白细胞降低及中性粒细胞降低等毒副作用；②TRAIL和化疗药物组织分布广泛，对肿瘤细胞无专属的靶向治疗作用；③由于肿瘤细胞的多药耐药特性，TRAIL与化疗药物合用的疗效仍然有限，至今尚未取得令人瞩目的进展。利用纳米递药系统克服上述缺陷是治疗肿瘤的一种新思路。

中国专利申请201010263759.0提供了一种包载抗肿瘤药物复合物的注射用脂质体，利用脂质体的保护作用和长循环效果，可显著提高蛋白药物TRAIL的稳定性，延长TRAIL和化疗药物的体内滞留时间；利用脂质体对肿瘤的EPR效应，使更多药物浓集于肿瘤组织；利用TRAIL和化疗药物不同的抗肿瘤机理，产生明显的协同作用，有望显著提高药物的抗肿瘤效果，降低毒副作用。但是，因为TRAIL和化疗药物的理化性质差异很大，难以包载在同一个脂质体中，并且TRAIL的包封率和载药量很低，很大程度上限制了该复合物脂质体的进一步生产和临床应用。而TRAIL与白蛋白在高压均质的作用下可行程稳定的二硫键，很好的够解决脂质体的上述不足。且目前尚无专利提供由蛋白稳定的活性肿瘤药物和凋亡素组成的用于治疗肿瘤的复合物专利和文献报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种新型的供体内输送的抗肿瘤药物复合物，特别是一种含有抗肿瘤药物、凋亡素和蛋白质结合的抗肿瘤药物通过电荷作用或化学键结合形成的纳米复合物。

本发明的另一个目的是提供所述纳米复合物的制备方法，所述的制备方法简便，对抗肿瘤药物和凋亡素的包封率和载药量都很高。

本发明的纳米复合物利用纳米系统的被动肿瘤靶向作用及凋亡素和抗肿瘤药物不同抗肿瘤机理的协同作用，提高抗肿瘤效果，降低毒副作用。

本发明的目的是通过下列构思来实现的：一种协同的纳米复合物，它包含与蛋白质结合的抗肿瘤药物和凋亡素，其中，所述的抗肿瘤药物和凋亡素的质量比例为1:100-100:1，所述的蛋白质、抗肿瘤药物和凋亡素分别占复合物总质量的10%-98%、0.01%-50%和0.01%-50%，条件是所述蛋白质、抗肿瘤药物和凋亡素的质量之和为100%；所述的复合物粒径为50-500nm。

在优选的实施方案中，所述的抗肿瘤药物和凋亡素的质量比例为1:10-10:1，更好的是1:8-8:1。

在另一个实施方案中，所述的复合物粒径优选为100-150nm。

本发明中的术语具有如下定义：

本文中使用的“凋亡素”指人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TNF-relatedapoptosis inducing ligand,TRAIL）、重组人凋亡素2配体（Recombinant HumanApo-2ligand，Apo2-L）和表达TRAIL或Apo2-L的基因及相关TRAIL（PEG，PLGA）修饰产物。

所述的TRAIL全分子由281个氨基酸组成，分子量约为32000道尔顿，其N-末端第15～40位氨基酸为疏水区域形成的跨膜结构，N-末端第95～281位或114～281位氨基酸组成的C-末端胞外区域为亲水性区域。TRAIL的活性形式为胞外亲水性区域与锌离子络合形成的同源三聚体。

所述的Apo2-L是由工程菌重组表达产生的TRAIL全分子的N-末端第95～281位或第114～281位氨基酸所形成的亲水性蛋白分子，也可以是N-末端第95与114位之间任何一位氨基酸到第281位氨基酸所形成的亲水性蛋白分子。

所述的表达TRAIL或Apo2-L的基因可以通过工程菌表达TRAIL全分子或Apo2-L及相关TRAIL（PEG，PLGA）修饰产物。

所述的凋亡素每次的给药剂量为10～5000μg/kg，优选的每次给药剂量为50～1000μg/kg；给药方案为每天给药或间隔给药，每一疗程的给药剂量为0.14～70mg/kg，优选的每一疗程的给药剂量为0.7～14mg/kg。

本文中使用的“抗肿瘤药物”或“化疗药物”选自阿霉素、盐酸阿霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、羟基喜树碱、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、卡氮芥、卡铂、顺铂、环磷酰胺、放线菌素D、博来霉素、柔红霉素、正定霉素、丝裂霉素、阿克拉霉素、干扰素、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、龟臼乙叉甙、三苯氧胺、舒尼替尼、阿糖胞苷等。其中优选的药物为阿霉素、盐酸阿霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、羟基喜树碱、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、顺铂、卡铂、放线菌素D、舒尼替尼、伊马替尼、吉非替尼、厄罗替尼、索拉非尼和拉帕替尼。

在一个实施方案中，上述药物的每一疗程的给药剂量分别为：所述的阿霉素和盐酸阿霉素的给药剂量为0.5～4.0mg/kg，优选的给药剂量为1.0～2.5mg/kg；所述的紫杉醇和多烯紫杉醇的给药剂量为2.0～10.0mg/kg，优选的给药剂量为3.0～6.0mg/kg；所述的喜树碱和羟基喜树碱的给药剂量为0.1～1.0mg/kg，优选的给药剂量为0.125～0.4mg/kg；所述的长春碱的给药剂量为0.05～0.4mg/kg，优选的给药剂量为0.1～0.2mg/kg；所述的长春新碱的给药剂量为5.0～100.0μg/kg，优选的给药剂量为20.0～60.0μg/kg；所述的长春地辛的给药剂量为0.05～0.4mg/kg，优选的给药剂量为0.06～0.2mg/kg；所述的长春瑞滨的给药剂量为0.2～2.0mg/kg，优选的给药剂量为0.5～1.5mg/kg；所述的顺铂的给药剂量为1.0～20.0mg/kg，优选的给药剂量为2.5～12.0mg/kg；所述的卡铂的给药剂量为1.0～20.0mg/kg，优选的给药剂量为1.5～12.0mg/kg；所述的放线菌素D的给药剂量为1.0～10.0μg/kg，优选的给药剂量为2.0～7.0μg/kg；所述的舒尼替尼的给药剂量为1.0～10.0mg/kg，优选的给药剂量为2.0～5.0mg/kg；所述的伊马替尼的给药剂量为1.0～10.0mg/kg，优选的给药剂量为2.5～6.8mg/kg；所述的吉非替尼的给药剂量为1.0～10.0mg/kg，优选的给药剂量为1.0～5.0mg/kg；所述的厄罗替尼的给药剂量为1.0～10.0mg/kg，优选的给药剂量为2.0～8.5mg/kg；所述的索拉非尼的给药剂量为1.0～10.0mg/kg，优选的给药剂量为2.0～7.6mg/kg；所述的拉帕替尼的给药剂量为1.0～10.0mg/kg，优选的给药剂量为1.8～7.2mg/kg。

所述的作为载体计划用于本发明的蛋白类包括白蛋白(含有35个半脱氨酸)、免疫球蛋白、酶蛋白、胰岛素(含有6个半脱氨酸)、血红蛋白(每一个α₂β₂单位有6个半胱氨酸残基)、溶菌酶(含有8个半胱氨酸残基)、免疫球蛋白、α-2-巨球蛋白、纤维连接素、玻璃连接素、纤维蛋白原、脂肪酶等。其中蛋白质、肽、酶、抗体及其它们的混合物是本发明常规用的稳定剂。

本发明也提供了一种制备所述抗肿瘤药物纳米复合物的方法，包括下列步骤：

（1）使抗肿瘤药物溶于有机溶剂，生成疏水相；

（2）使凋亡素和蛋白质溶于水性溶剂，形成亲水相；

（3）将步骤（1）得到的疏水相滴加到步骤（2）得到的亲水相，形成所述的抗肿瘤药物纳米复合物。

在优选的实施方案中，所述步骤（1）中的有机溶剂选自氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、甲醇、四氢呋喃、二氯六环、乙腈、丙酮、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、甲基吡咯烷酮或其混合物。

所述步骤（2）中的水性溶剂为pH=4.0-6.5的酸性水溶剂，选自盐酸、醋酸、磷酸、柠檬酸、柠檬酸二钠或其混合物。

具体来说，本发明制备所述抗肿瘤药物纳米复合物方法的机理在于（以紫杉醇和白蛋白为例）：①电荷作用。紫杉醇与白蛋白通过上述方法形成纳米混悬剂后，其Zeta电位值-15mv左右，而凋亡素蛋白等电点9.21，在生理pH条件下带正电荷，二者可通过静电作用形成纳米复合物。药动学实验表明，纳米复合物中凋亡素的体内半衰期显著延长。②高压均质过程形成二硫键交联。人血白蛋白含有35个半胱氨酸，凋亡素含有一个半胱氨酸，同上制备紫杉醇白蛋白纳米混悬剂的工艺，将一定量的凋亡素按比例加入到水相中，二者在高压均质过程可通过二硫键交联。可形成白蛋白包衣的化疗药物的纳米混悬剂，表面白蛋白通过二硫键链接一定数量的凋亡素。

本发明的纳米复合物可为静脉、皮下、肌内、膜内、腹膜内或其它静脉途径给药的形式。

本发明的抗肿瘤药物复合物对于肺癌、乳腺癌、卵巢癌、脑胶质瘤、肝癌、胰腺导管癌、肠癌等有较好的治疗效果，疗效均优于抗肿瘤药物单独用药。

本发明的纳米复合物可混悬在适宜的可供体内输送的稀释液中，形成新的抗肿瘤复合物。该复合物以未加修饰的形式递送抗肿瘤药物，因此不会因加入乳化剂和增溶剂而引起过敏反应。另外，该复合物利用凋亡素和抗肿瘤药物不同的抗肿瘤机理，发挥强力的协同作用，提高化疗药物对于肿瘤的治疗效果，可降低化疗药物的给药剂量，从而降低其毒副作用。

附图说明

图1显示现有技术（WO98/14174）中白蛋白结合型紫杉醇和游离紫杉醇给药后在人类肿瘤异体移植瘤中药时曲线，其中，肿瘤中白蛋白结合型紫杉醇的曲线下面积（AUC）是传统紫杉醇的1.33倍（p<0.0001）,其中，nab-Paclitaxel表示一种白蛋白结合型紫衫醇；CrEL Paclitaxel表示溶于聚氧乙烯蓖麻油（cremephore）中的紫杉醇。

图2是白蛋白结合型紫杉醇和TRAIL复合物（处方5）的电镜照片。

图3是白蛋白结合型长春瑞滨和TRAIL复合物（处方18）的粒径测定图。

图4显示了白蛋白结合型长春瑞滨和TRAIL复合物（处方18）的稳定性情况。

图5A为白蛋白结合型紫杉醇和TRAIL复合物（处方28）在肺癌模型中的药效图。

图5B为白蛋白结合型紫杉醇和TRAIL复合物（处方28）在乳腺癌模型中的药效图。

图5C为白蛋白结合型紫杉醇和TRAIL复合物（处方28）在卵巢癌模型中的药效图。

图6为包载凋亡素和化疗药物羟基喜树碱复合物（处方7）的药效学结果。

图7为包载凋亡素和化疗药物索拉非尼复合物（处方45）的生存曲线图。

图8是实施例8中白蛋白结合型多西紫杉醇和TRAIL复合物在乳腺癌裸鼠模型的药时曲线。

图9是实施例9中包载凋亡素和阿霉素复合物的剂量与药效学的关系。

下面基于具体实施例对本发明作详尽的阐述，这些实施例仅供阐述用，并非用来限定本发明的保护范围。

具体实施方法

实施例1：包载凋亡素和化疗药物复合物的微射流法制备和表征

将下表1处方1-12中的化疗药物溶于疏水相（或称为有机溶剂），生成油相；磁力搅拌或IKA高剪切力作用下，将溶解药物的油相逐滴加入以pH7.4磷酸缓冲液（PBS）溶解的凋亡素和白蛋白溶液中，搅拌或剪切力作用一段时间后得粗乳。采用微摄流仪（超高压微射流纳米均质机，美国必宜）高压均质，筛选均质压力，均质后得较细的乳剂。40°C旋转蒸发15-30分钟中除去有机溶剂即得到紫杉醇纳米混悬剂。该制剂呈透明、有淡蓝色乳光的溶液，冻干后形成粉末即可。

表1、包载凋亡素和化疗药物等复合物处方中各组分的比例（w/w%）

以处方5所制备的纳米复合物为代表，在室温条件下，取适量加水稀释，然后滴加在覆盖碳膜的铜网上，晾干，在透射电镜下观察并拍摄照片，结果见图2。从照片可以看到紫杉醇-TRAIL纳米复合物的形态为类球形。

实施例2、包载凋亡素和化疗药物复合物的高压乳匀法制备和表征

将表2中的处方13~20采用高压乳匀法工艺制备：按处方量称取脂溶性辅料（药物+疏水相），在搅拌状态下滴加入事先配好的水相溶液（蛋白质+凋亡素+亲水相）中，另将处方量药物逐量并搅拌加入，最终混匀并定容至处方量。将混合好的溶液置于高压乳匀机中，先以500巴(bar)的压力乳匀2~3个循环，再以750bar的压力乳匀2~3个循环，最后以1000bar的压力乳匀2~3个循环。制得包载凋亡素和化疗药物的纳米复合物，冻干即可。

表2、包载凋亡素和化疗药物等复合物处方中各组分的比例（w/w%）

以处方18为代表，将制备的纳米复合物稀释适宜的倍数，采用激光粒度测定仪测定其粒径和ζ电位。稳定性研究中，将样品于60℃、40℃、25℃、4℃的条件下保存3天，观察其外观、粒径及ζ电位的变化，评价样品稳定性。

经测定，处方18所制得的纳米复合物的平均粒径为155.5±8.3nm，ζ电位为-13.6±0.4mV（见图3）。稳定性结果如图4所示，4～40℃条件下，纳米复合物的外观颜色均一，呈乳白色，粒径范围为151.4~159.6nm，ζ电位范围为-12.6~-14.2mV。在60℃条件下保存，复合物的外观由乳白色变为淡黄色，观察期内粒径逐渐变大，增幅有10%左右，表明温度的升高会使纳米复合物聚集，致使系统的稳定性下降。

将表2B中的处方21-24采用高压乳匀法工艺加上SSNPP制备：按处方量称取脂溶性辅料（药物+疏水相），在搅拌状态下滴加入事先配好的水相溶液（蛋白质+凋亡素+亲水相）中，另将处方量药物逐量并搅拌加入，最终混匀并定容至处方量。将混合好的溶液置于高压乳匀机中，先以500巴(bar)的压力乳匀2~3个循环，再以750bar的压力乳匀2~3个循环，最后以1000bar的压力乳匀2~3个循环。制得包载凋亡素和化疗药物的纳米复合物，冻干即可。

实施例3、包载凋亡素和化疗药物复合物的超声法制备和表征

将表3中的处方25~38采用超声法工艺制备：将处方量的药物逐量并搅拌加入，最终混匀并定容至处方量。将混合好的溶液置于超声乳匀机（UTS，德国IKA）中，先以50~100w的功率超声5分钟，以形成初乳，再以200w的功率超声10分钟，即得包载凋亡素和化疗药物的纳米复合物，冻干即可。

表3包载凋亡素和化疗药物等复合物处方中各组分的比例（w/w%）

实施例4、包载凋亡素和化疗药物复合物的制备

按表4中的处方37～40，采用超声法、高压乳匀法和微射流法等三种方法分别制备包载凋亡素和化疗药物的纳米复合物。处方41~46采用微射流法制备。

表4包载凋亡素和化疗药物等复合物处方中各组分的比例（w/w%）

实施例5、包载凋亡素和化疗药物紫杉醇复合物的抗肿瘤药效学试验

以实施例3中处方28为代表进行包载凋亡素和紫杉醇的白蛋白复合物的抗肿瘤药效学试验。

肿瘤细胞：肺腺癌细胞株A549，乳腺癌细胞株MCF7，卵巢癌细胞株SKOV3，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液培养。

动物：Balb-c裸小鼠，4周龄，雌性。试验组及阴性对照组每组6只裸小鼠。

肿瘤细胞的接种：采用右腋皮下接种模型，无菌条件下取生长旺盛的肿瘤细胞，以匀浆法制备成约2.0E7/ml细胞悬液，于每只裸鼠右腋皮下接种0.1ml癌细胞悬液。

给药方案为尾静脉注射，每3天给药1次，共给药5次。各制剂组给药开始后的肿瘤体积变化情况见图5A、5B、5C。结果显示，各药物治疗组的肿瘤体积和重量均显著小于生理盐水组（p<0.01），表明各制剂对肺癌、乳腺癌和卵巢癌细胞接种的皮下肿瘤均有一定的治疗效果；且相比单用游离化疗药物，复合物对肿瘤具有更强的治疗效果。本发明所制得的复合物比现有临床使用的方案显示出更好的治疗效果。

实施例6、包载凋亡素和化疗药物羟基喜树碱复合物的抗肿瘤药效学试验。

以实施例1中处方7为代表进行包载凋亡素和羟基喜树碱白蛋白复合物的抗肿瘤药效学试验。

肿瘤细胞：大肠癌细胞株SW620，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液培养。

动物：Balb-c裸小鼠，4周龄，雌雄各半。试验组及阴性对照组每组6只裸小鼠。

评价方法：每只小鼠移植一定量的肿瘤细胞，接种2周后开始给药，每3天给药1次，共给药5次。以肿瘤的体积评价包载凋亡素和羟基喜树碱白蛋白复合物的抗肿瘤效果。

结果见图6显示，复合物组的肿瘤体积和重量均显著小于生理盐水组（p<0.01），表明该制剂对大肠癌细胞接种的皮下肿瘤均有一定的治疗效果；且相比单用游离化疗药物，复合物对肿瘤具有更强的协同增效效果。

实施例7、包载凋亡素和化疗药物索拉非尼复合物的抗肿瘤药效学试验。

以实施例4中处方45为代表进行包载凋亡素和索拉非尼白蛋白复合物的抗肿瘤药效学试验。

肿瘤细胞：肝癌癌细胞株HepG2，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液培养。

评价方法：实验设计分成阴性对照、单药索拉非尼、凋亡素和化疗药物索拉非尼复合物三组，每只小鼠移植一定量的肝癌肿瘤细胞，接种2周后开始给药，连续给药3个周期，以全体小鼠的无疾病进展（PFS）及总生存时间（OS）为观察终点，以评价复合物的抗肿瘤效果。

结果见图7显示，复合物组的PFS及OS明显长于对照组及单药组，表明该制剂对肝癌细胞接种的皮下肿瘤有一定的治疗效果；且PLGA-TRAIL和化疗药复合后有协同增效作用。

实施例8、包载凋亡素和化疗药物多西紫杉醇复合物的药动学评价

以实施例4中的处方38为代表进行裸小鼠的体内药动学试验。

同实施例3建立裸鼠乳腺癌细胞株MCF7移植肿瘤模型，在接种肿瘤细胞4周后进行试验。

给药方案：取96只模型裸小鼠，分成2组：凋亡素溶液组和包载凋亡素和多西紫杉醇白蛋白复合物组。每组分别尾静脉注射给药0.4ml（相当于凋亡素2.5mg/kg），于给药后的0.083，0.25，0.5，1，4，8，12和24小时摘眼球取血0.5ml，置于肝素化的EP管中，5000rpm离心10分钟分离血浆，取上清置于-70℃冰箱备用。取血后处死裸小鼠，剥离肿瘤瘤体，-70℃保存。每个时间点重复采集6只小鼠样品。实验结束后，以ELISA方法检测样品中凋亡素的含量。

由图8的药时曲线可见，复合物组24小时的肿瘤内各时间点凋亡素的浓度明显高于溶液剂组。在0.5小时时间点，复合物组的药物浓度是溶液组的6.5倍，说明复合物作为药物载体能显著提高凋亡素在肿瘤部位的蓄积。因此，本发明可将两种药物集中输送至肿瘤部位，发挥协同抗肿瘤作用。

实施例9、包载凋亡素和化疗药物复合物剂量与药效学的关系

以处方1为代表，与阿霉素白蛋白（DOX-HSA）纳米复合物、TRAIL白蛋白纳米复合物等的药效学，并考察了剂量与药效学的关系。结果表明，包载凋亡素和阿霉素复合物中，当阿霉素的给药剂量为1.5mg/kg时，它的抑瘤效果和5mg/kg单方阿霉素纳米粒相仿。目前临床肿瘤化疗的最大问题不在于抗肿瘤药物的疗效，而在于抗肿瘤药物的毒性和耐药性。复方TRAIL复合物能够在确保抗肿瘤疗效的同时大幅度减少给药剂量，就有可能降低毒副作用，因此具有良好的临床应用前景（见图9）。

由此可见，本发明的复合物可混悬在适宜的可供体内输送的稀释液中，形成新的抗肿瘤复合物。该复合物以未加修饰的形式递送化疗药物，因此不会因加入乳化剂和增溶剂而引起过敏反应。另外，该复合物利用凋亡素和化疗药物不同的抗肿瘤机理，发挥强力的协同作用，提高化疗药物对于肿瘤的治疗效果，可降低化疗药物的给药剂量，从而降低其毒副作用。

Claims (10)

1.一种协同的纳米复合物，其特征在于，所述的纳米复合物包含与蛋白质结合的抗肿瘤药物和凋亡素，其中，所述的抗肿瘤药物和凋亡素的质量比例为1:100-100:1，所述的蛋白质、抗肿瘤药物和凋亡素分别占复合物总质量的10%-98%、0.01%-50%和0.01%-50%，条件是所述蛋白质、抗肿瘤药物和凋亡素的质量之和为100%；所述的复合物粒径为50-500nm。

2.如权利要求1所述的纳米复合物，其特征在于，所述的抗肿瘤药物和凋亡素的质量比例为1:10-10:1。

3.如权利要求2所述的纳米复合物，其特征在于，所述的抗肿瘤药物和凋亡素的质量比例为1:8-8:1。

4.如权利要求1所述的纳米复合物，其特征在于，所述的复合物粒径为100-150nm。

5.如权利要求1所述的纳米复合物，其特征在于，所述的凋亡素选自人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体、重组人凋亡素2配体、表达TRAIL或Apo2-L的基因及PEG或PLGA修饰的TRAIL产物；

所述的TRAIL全分子由281个氨基酸组成，分子量为32000道尔顿，其N-末端第15～40位氨基酸为疏水区域形成的跨膜结构，N-末端第95～281位或114～281位氨基酸组成的C-末端胞外区域为亲水性区域；

所述的Apo2-L是由工程菌重组表达产生的TRAIL全分子的N-末端第95～281位或第114～281位氨基酸所形成的亲水性蛋白分子，也可以是N-末端第95与114位之间任何一位氨基酸到第281位氨基酸所形成的亲水性蛋白分子；

所述的表达TRAIL或Apo2-L的基因可以通过工程菌表达TRAIL全分子或Apo2-L及相关TRAIL（PEG，PLGA）修饰产物；

所述的抗肿瘤药物选自阿霉素、盐酸阿霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、羟基喜树碱、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、卡氮芥、卡铂、顺铂、环磷酰胺、放线菌素D、博来霉素、柔红霉素、正定霉素、丝裂霉素、阿克拉霉素、干扰素、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、龟臼乙叉甙、三苯氧胺、舒尼替尼、阿糖胞苷等。其中优选的药物为阿霉素、盐酸阿霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、羟基喜树碱、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、顺铂、卡铂、放线菌素D、舒尼替尼、伊马替尼、吉非替尼、厄罗替尼、索拉非尼和拉帕替尼；

所述的蛋白质选自白蛋白、免疫球蛋白、酶蛋白、胰岛素、血红蛋白、溶菌酶、免疫球蛋白、α-2-巨球蛋白、纤维连接素、玻璃连接素、纤维蛋白原、脂肪酶。

6.如权利要求1－4任一所述的纳米复合物，其特征在于，它选自白蛋白结合型紫杉醇和TRAIL复合物、白蛋白结合型紫杉醇和TRAIL复合物、白蛋白结合型长春瑞滨和TRAIL复合物、白蛋白结合型长春瑞滨和TRAIL复合物、白蛋白结合型紫杉醇和TRAIL复合物、白蛋白结合型紫杉醇和TRAIL复合物、白蛋白结合型紫杉醇和TRAIL复合物和白蛋白结合型多西紫杉醇和TRAIL复合物。

7.如权利要求1-6任一所述的纳米复合物，其特征在于，它为静脉、皮下、肌内、膜内或腹膜内注射给药形式。

8.如权利要求1-6任一所述的抗肿瘤药物纳米复合物的制备方法，包括：

（1）使抗肿瘤药物溶于有机溶剂，生成疏水相；

（2）使凋亡素和蛋白质溶于水性溶剂，形成亲水相；

（3）将步骤（1）得到的疏水相滴加到步骤（2）得到的亲水相，形成所述的抗肿瘤药物纳米复合物，

其中，所述的抗肿瘤药物、凋亡素或蛋白质是如权利要求1-5任一所定义的物质。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中的有机溶剂选自氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、甲醇、四氢呋喃、二氯六环、乙腈、丙酮、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、甲基吡咯烷酮或其混合物；

所述步骤（2）中的水性溶剂为pH=4.0-6.5的酸性水溶剂，选自盐酸、醋酸、磷酸、柠檬酸、柠檬酸二钠或其混合物。

10.如权利要求1-7任一所述的纳米复合物在制备治疗肺癌、乳腺癌、卵巢癌、脑胶质瘤、肝癌、胰腺导管癌或肠癌的增效药物中的应用。

Images