MX2014004778A - Nanoparticulas funcionalizadas para suministro intracelular de moleculas biologicamente activas. - Google Patents

Nanoparticulas funcionalizadas para suministro intracelular de moleculas biologicamente activas.

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Abstract

Las nanopartículas biocompatibles funcionalizadas capaces de penetrar a través de una membrana celular de mamífero y suministrar intracelularmente una pluralidad de moléculas bioactivas para modular una función celular se describen en la presente Las nanopartículas biocompatibles funcionalizadas comprenden: una nanopartícula central que varía en tamaño desde alrededor de 5 hasta alrededor de 50nm y que tiene un recubrimiento de polímero sobre la misma, una pluralidad de grupos funcionales covalentemente enlazados al recubrimirnto de polímero, en donde la pluralidad de moléculas bioactivas se enlazan a la pluralidad de los grupos funcionales, y en donde la pluralidad de moléculas bioactivas incluyen al menos un péptido y una propteína, y en donde el péptido es capaz de penetrar a través de la membrana celular de mamífero y entrar en la célula, y en donde la proteína es capaz de proporcionar una nueva funcionalidad dentro de la célula. La proteína puede ser un factor de transcripción seleccionado del grupo que consiste de Oct4, Sox2, Nanog, Lin28, cMyc, y Klf4.

Description

NA OPARTICULAS FUNCIONALIZADAS PARA SUMINISTRO INTRACELULAR DE MOLÉCULAS BIOLÓGICAMENTE ACTIVAS Campo de la Invención La presente invención se refiere generalmente a síntesis orgánica y nanobiotecnología, y, más particularmente, a nanopartículas funcionalizadas para el suministro de moléculas bioactivas en células para modulación de función celular, así como a métodos relacionados con los mismos.
Antecedentes de la Invención La capacidad de las células para proliferar normalmente, migrar y diferenciar a diversos tipos de células es crítica en la embriogénesis y en la función de células maduras, que incluye pero no se limita a las células de sistemas hematopoyéticos y/o cardiovasculares en una variedad de enfermedades hereditarias o adquiridas. Esta capacidad funcional de células madre y/o tipos de células especializadas más diferenciadas se altera en diversas afecciones patológicas, pero se puede normalizar después de la introducción intracelular de componentes biológicamente activos. Por ejemplo, las funciones celulares anormales tal como supervivencia alterada y/o diferenciación de tronco de médula ósea/células progenitoras en neutrófilos se observan en pacientes con neutropenia congénita cíclica o severa que pueden padecer de severas infecciones que amenazan la vida y pueden evolucionar para desarrollar leucemia mielogenosa aguda u otros tumores malignos [Aprikyan et al, Impaired survival of bone marrow hematopoietic progenitor cells in cyclic neutropenia. Blood, 97, 147 (2001); Goran Carlsson et al, Kostmann syndrome: severe congenital neutropenia associated with defective expression of Bcl-2, constitutive mitochondrial reléase of cytochrome C, and excessive apoptosis of myeloid progenitor cells. Blood, 103, 3355 (2004)]. Los trastornos hereditarios o adquiridos tal como neutropenia congénita grave o síndrome de Barth se disparan por diversas mutaciones de gen y se deben a producción deficiente y función de células de la sangre y/o cardíacas del paciente que llevan a neutropenia posterior, cardiomiopatía y/o insuficiencia cardíaca [Makaryan et al., The cellular and molecular mechanisms for neutropenia in Barth syndrome. Eur J Haematol. 88: 195-209 (2012)]. El fenotipo de la enfermedad de neutropenia congénita grave puede ser causado por diferentes mutaciones de substitución, eliminación, inserción o truncamiento en el gen de elastasa de neutrófilos, gen HAX1, o gen de la Proteína del Síndrome Wiskott-Aldrich [Dale et al, Mutations in the gene encoding neutrophil elastase in congenital and cyclic neutropenia. Blood. 96:2317-2322 (2000); Devriendt et al, Constitutively activating mutation in WASP causes X-linked severe congenital neutropenia. Nat Genet . 27:313-7 (2001); Klein et al, HAX1 deficiency causes autosomal recessive severe congenital neutropenia (Kostmann disease) Nat Genet. 39:86-92 (2007)].
Otras enfermedades hereditarias como síndrome de Barth, un trastorno de células madre multi-sistema inducido por presumiblemente mutaciones de pérdida de función en el gen TAZ mitocondrial se asocia con neutropenia (niveles reducidos de neutrófilos de la sangre) que puede causar infecciones fatales graves y algunas veces mortales recurrentes y/o cardiomiopatía que puede llevar a insuficiencia cardíaca que podría resolverse por trasplante de corazón. En la mayoría de los casos, los productos de gen mutante, implicados en la patogenesia y desarrollo de enfermedades humanas hereditarias o adquiridas, afectan distintos eventos intracelulares, que llevan a funciones celulares anormales y el fenotipo de enfermedad específica.
El tratamiento de estos pacientes con factor que estimula colonias de granulocitos (G-CSF) induce cambios conformacionales en la molécula de receptor G-CSF ubicada en la superficie celular, que posteriormente desencadena una cadena de eventos intracelulares que eventualmente restaura la producción de neutrófilos a nivel casi normal y mejora la calidad de vida de los pacientes [Welte and Dale. Pathophysiology and treatment of severe chronic neutropenia. Ann. Hematol. 72, 158 (1996)]. No obstante, los pacientes tratados con G-CSF pueden evolucionar para desarrollar leucemia [Aprikyan et al, Cellular and molecular abnormalities in severe neutropenia predisposing to leukemia. Exp Hematol. 31, 372 (2003); Philip Rosenberg et al, Neutrophil elastase mutations and risk of leukaemia in severe congenital neutropenia. Br J Haematol. 140, 210 (2008); Peter Newburger et al, Cyclic Neutropenia and Severe Congenital Neutropenia in Patients with a Shared ELANE Mutation and Paternal Haplotype: Evidence for Phenotype Determination by Modifying Genes. Pediatr. Blood Cáncer, 55, 314 (2010)], lo cual es porque se están explorando nuevos enfoques alternativos .
Los eventos intracelulares se pueden afectar más efectivamente y regular durante el suministro intracelular de diferentes moléculas biológicamente activas usando nanoparticulas distintamente funcionalizadas . Estas moléculas bioactivas pueden normalizar la función celular o pueden eliminar las células no deseadas cuando sea necesario. Sin embargo, la membrana celular sirve como una barrera activa conservando la cascada de eventos intracelulares de ser afectada por estímulos exógenos.
En consecuencia, hay una necesidad en la técnica por nuevos tipos de moléculas bioactivas que son capaces de penetrar membranas celulares y efectuar los eventos intracelulares de interés. La presente invención satisface estas necesidades y proporciona otras ventajas relacionadas.
Breve Descripción de la Invención La presente invención en algunas modalidades se dirige a métodos de funcionalización de proteínas de enlace y/o péptidos a nanopartículas biocompatibles para modular las funciones celulares. En algunas modalidades, la presente invención se dirige a las nanopartículas biocompatibles funcionalizadas ellas mismas.
En una modalidad, una nanopartícula biocompatible funcionalizada capaz de penetrar a través de una membrana celular de mamífero y que suministra intracelularmente una pluralidad de moléculas bioactivas para modular una función celular, comprende: una nanopartícula central que varía en tamaño desde 5 hasta 50 nm y que tiene un recubrimiento de polímero sobre la misma, una pluralidad de grupos funcionales covalentemente enlazados al recubrimiento de polímero, en donde la pluralidad de moléculas bioactivas se enlazan a la pluralidad de los grupos funcionales, y en donde la pluralidad de moléculas bioactivas incluye al menos un péptido y una proteína, y en donde el péptido es capaz de penetrar a través de la membrana celular de mamífero y entrar en la célula, y en donde la proteína es capaz de proporcionar una nueva funcionalidad dentro de la célula.
La nanopartícula central puede comprender hierro y ser magnética. Los péptidos de la presente invención se pueden enlazar a la proteina (en lugar de enlazarse a la nanoparticula) . Los péptidos y proteínas cada una se puede enlazar a la nanoparticula por medio de una o más moléculas de ligador de interposición. El péptido puede incluir cinco hasta nueve aminoácidos básicos en algunas modalidades, mientras que en otras modalidades el péptido incluye nueve o más aminoácidos básicos. La proteína puede ser un factor de transcripción tal como, por ejemplo, un factor de transcripción seleccionado del grupo que consiste de 0ct4, Sox2, Nanog, Lin28, cMyc, y Klf4.
En otro aspecto, la presente invención se dirige a un método para cambiar una funcionalidad celular dentro de una célula de mamífero. El método novedoso comprende administrar una cantidad efectiva de nanopartículas biocompatibles funcionalizadas a la célula y cambiar la funcionalidad celular dentro de la célula. El cambio de la funcionalidad celular puede implicar un cambio en una propiedad físico-química de la célula, un cambio en propiedad proliferativa de la célula, un cambio en capacidad de sobrevivencia de la célula, o un cambio en propiedad fenotípica morfológica de la célula. El cambio de la funcionalidad celular puede implicar una capacidad adquirida de la célula para hacer un nuevo tipo de célula que incluye células madre o un tipo de célula más especializado .
Estos y otros aspectos de la presente invención se harán más evidentes con referencia a la siguiente descripción detallada y dibujos adjuntos. Se ha de entender, sin embargo, que diversos cambios, alteraciones, y substituciones se pueden hacer a las modalidades especificas descritas en la presente sin apartarse de su espíritu esencial y alcance. Finalmente, todas de las diversas referencias citadas en la presente se incorporan expresamente en la presente como referencia .
Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 describe una funcionalización multi-etapa de esquema de nanopartículas con base en el enlace simultáneo de péptido y moléculas de proteína a una nanoparticula de acuerdo con una modalidad de la presente invención.
La Figura 2A describe una reacción de una nanoparticula que contiene grupos amina con relaciones equimolares de cadena larga LCl-SPDP y Nanoparticula de ácido yodoacético de acuerdo con una modalidad de la presente invención.
La Figura 2B describe una reducción del enlace de disulfuro de PDP para proporcionar una nanoparticula del grupo SH libre de acuerdo con una modalidad de la presente invención.
La Figura 2C describe una reacción de cadena larga LC1-SMCC con los grupos de lisina de una nanopartícula de proteina de acuerdo con una modalidad de la presente invención .
La Figura 2D describe una reacción de una nanopartícula multifuncional con la proteina que se habían reaccionado con SMCC y contiene un nanopartícula de grupo maleimida reactivo terminal de acuerdo con una modalidad de la presente invención.
La Figura 2E describe una reacción de un grupo amino de un péptido con LC2-S CC. La reacción entonces se sigue posteriormente por una reacción con mercaptoetanol para convertir la maleimida terminal a una nanopartícula de alcohol de acuerdo con una modalidad de la presente invención .
La Figura 2F describe una reacción de una gota funcional (y proteína enlazada) con un péptido modificado al grupo carboxilo libre en la nanopartícula nanopartícula de acuerdo con una modalidad de la presente invención.
La Figura 3A describe una reacción de una nanopartícula que contiene grupos amina con nanopartícula LC1-SPDP de acuerdo con una modalidad de la presente invención.
La Figura 3B describe una reducción del enlace de disulfuro de PDP para proporcionar una nanopartícula del grupo SH libre de acuerdo con una modalidad de la presente invención .
La Figura 3C describe una reacción de cadena larga LC2-SMCC con los grupos de lisina de una nanoparticula de proteina de acuerdo con una modalidad de la presente invención.
La Figura 3D describe una reacción de una nanoparticula multifuncional con la proteina que se había reaccionado con SMCC y contiene una nanoparticula de grupo maleimida reactivo terminal de acuerdo con una modalidad de la presente invención .
Estos y otros aspectos de la presente invención se harán más fácilmente evidentes para aquellos que poseen experiencia ordinaria en la técnica cuando se hace referencia a la siguiente descripción detallada en conjunto con los dibujos que se acompañan.
Descripción Detallada de la Invención Con objeto de suministrar moléculas biológicamente activas intracelularmente, los inventores de la presente invención presentan un dispositivo universal con base en nanopartículas de penetración de membrana celular con moléculas biológicamente activas covalentemente ligadas. Para este fin, los inventores presentan en la presente un método de funcionalización novedoso que asegura una unión covalente de proteínas y péptidos a nanopartículas . Las nanopartículas permeables a la célula modificadas de la presente invención proporcionan un mecanismo universal para suministro intracelular de moléculas biológicamente activas para regulación y/o normalización de función celular.
La capacidad de las células para proliferar normalmente, migrar y diferenciar a diversos tipos de células es crítica en la embriogénesis y en la función de células maduras, que incluye pero no se limita al tronco/progenitor y células más diferenciadas de sistemas hematopoyéticos y cardiovasculares en una variedad de enfermedades hereditarias o adquiridas. Esta capacidad funcional de las células madre y/o tipos de células especializadas más diferenciadas se altera en diversas afecciones patológicas debido a alteraciones aberrantes en eventos intracelulares , pero se puede normalizar tras la introducción intracelular de componentes biológicamente activos. Por ejemplo, la supervivencia alterada y diferenciación de células progenitoras de médula ósea humana en neutrófilos que se observa en pacientes con neutropenia congénita cíclica o severa que padecen de infecciones graves que amenazan la vida y pueden evolucionar para desarrollar leucemia, se puede normalizar por inhibidor de molécula pequeña que penetra la membrana celular de elastasa de neutrófilos, que interfiere con eventos intracelulares aberrantes y aparentemente restaura el fenotipo normal. No obstante, tales moléculas pequeñas que especifican a productos mutantes objetivos causando la enfermedad están raramente disponibles que es porque los dispositivos que penetran la membrana celular eficiente alternativa son necesarios para suministro intracelular de moléculas biológicamente activas capaces de modular la función celular.
Los métodos descritos en la presente utilizan nanoparticulas biocompatibles, que incluyen por ejemplo, partículas de óxido de hierro superparamagnético similares a aquellas previamente descritas en la literatura científica. Este tipo de nanoparticulas se pueden usar en ajustes clínicos para formación de imágenes por resonancia magnética de células de médula ósea, ganglios linfáticos, bazo e hígado [ver, por ejemplo, Shen et al, Monocrystalline iron oxide nanocompounds (MION) / physicochemical properties. Magn. Reson. ed., 29, 599 (1993); Harisinghani et . al, MR lymphangiography using ultrasmall superparamagnetic iron oxide in patients with primary abdominal and pelvic malignancies. Am. J. Roentgenol. 172, 1347 (1999)]. Estas nanoparticulas de óxido de hierro magnético contienen ~5 nm de núcleo recubierto con dextrano reticulado y que tiene -45 nm de tamaño de partícula global. De forma importante, se ha demostrado que estas nanoparticulas que contienen péptido derivado de Tat permeable a la membrana de célula reticulada eficientemente interioriza en células hematopoyéticas y progenitoras neurales en cantidades de hasta 30 pg de nanoparticulas de hierro superparamagnético por célula [Lewin et al, Tat peptide-derivatized magnetic nanoparticles allow in vivo tracking and recovery of progenitor cells. Nat . Biotechnol. 18, 410 (2000)]. Además, la incorporación de nanoparticula no afecta características proliferativas y de diferenciación de células progenitoras primitivas CD34+ derivadas de médula ósea o la viabilidad celular [Maite Lewin et al, Nat. Biotechnol. 18, 410 (2000)]. Estas nanoparticulas se pueden usar para seguimiento in vivo de las células etiquetadas .
Las células etiquetadas conservan sus capacidades de diferenciación y también se pueden detectar en muestras de tejido usando la formación de imágenes por resonancia magnética. Aquí presentamos dispositivos basado en nanoparticula novedosos que ahora son funcionalizados para llevar a péptidos y proteínas que pueden servir como excelentes vehículos para el suministro intracelular de moléculas biológicamente activas para soluciones de reprogramación celular para dirigir eventos intracelulares y modular la función celular y las propiedades.
Descripción General de Conjugados Nanoparticula-Péptido/Proteina : Las nanoparticulas con base en hierro u otro material con recubrimiento biocompatible (por ejemplo, polisacárido de dextrano) con grupos funcionales X/Y, a cuyos ligadores de diversas longitudes se enlazan, que, sucesivamente se enlazan covalentemente a proteínas y/o péptidos (u otras moléculas pequeñas) a través de sus grupos funcionales X/Y.
Grupos funcionales que se pueden usar para la reticulación incluyen: -NH2 (por ejemplo, lisina, un —NH2) ; -SH, -COOH, -NH-C (NH) (NH2) , carbohidrato, -hidroxilo (OH) , -enlazado por medio de la fotoquímica de un grupo azido en el ligador.
Los reactivos de reticulación pueden incluir: S CC [4- (N-maleimido-metil) ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo] También está disponible Sulfo-S CC, el derivado de Sulfosuccinimidilo para los grupo amino y tiol de reticulación.
LC-SMCC (Cadena larga SMCC) . También Sulfo-LC-SMCC.
SPDP [N-Succinimidil-3- (pipridilditio) -proprionato] También Sulfo-SPDP. Reacciona con aminas y proporciona grupos tiol .
LC-SPDP (Cadena larga SPDP) . También Sulfo-LC-SPDP.
Reactivo EDC [Clorohidrato-3- ( 3- Dimetilaminopropil) carbodiimida de 1-Etilo] usado para ligar grupo -COOH con grupo —NH2.
SM(PEG)n donde n=l,2,3,4 24 unidades de glicol.
También el derivado Sulfo-S ( PEG) n .
SPDP (PEG) n donde n=l,2,3,4 12 unidades de glicol.
También el derivado Sulfo-SPDP ( PEG) n .
Molécula PEG que contiene ambos grupos carboxilo y amina .
Molécula PEG que contiene ambos grupos carboxilo y sulfhidrilo .
Tapar y bloquear reactivos incluye: Anhídrido citracónico específico para NH Maleimida de Etilo específico para SH Mercaptoetanol— específico para maliemida En vista de lo anterior, hemos tratado nanopartículas biocompatibles para producir aminas funcionales en la superficie, que a su vez se usaron para enlazar químicamente proteínas y péptidos cortos.
En el caso de proteínas de enlace, por ejemplo Proteína Fluorescente Verde o un factor de transcripción, para nanopartículas superparamagnéticas o alternativas, el siguiente protocolo se puede usar: Gotas superparamagnéticas que contienen grupos funcionales amino en el exterior se pueden adquirir comercialmente de diversos fabricantes. Pueden variar desde 20-50 nm en tamaño y 101 -1020 nanopartículas por mi con 10 o más grupos amina por nanopartícula . Las nanopartículas se colocan en la solución amortiguadora de reacción correcta (0.1 M solución amortiguadora de fosfato, pH 7.2) por el uso de una unidad de filtro centrífugo Amicon (microcolumna) con un corte molecular de 10,000 daltones . Aproximadamente 4 lavados se requieren generalmente para asegurar sistema de amortiguación adecuado. Las nanopartículas se remueven de la unidad de filtro como se recomienda por el fabricante (invirtiendo el dispositivo de columna/filtro al girar en velocidad baja) .
SMCC (de Thermo Fisher) se disolvió en dimetilformamida (DMF) obtenida de ACROS (vial sellado y anhidro) en la concentración 1 mg/ml . La muestra se sella y usa casi inmediatamente .
Diez (10) microlitros de la solución se agregan a nanopartículas en 200 microlitros de volumen. Esto proporciona un gran exceso de SMCC a los presentes grupos amina disponibles, y la reacción se permite para proceder por una hora. El exceso de SM y DMF se puede eliminar usando una columna de filtro de centrifuga Amicon con un corte de 3,000 daltones. Cinco intercambios de volumen se requieren generalmente para asegurar intercambiador de solución amortiguadora adecuado. Es importante que el exceso de SMCC se elimine en esta etapa.
Cualquier molécula basada en péptido, como un ejemplo Proteina Fluorescente Verde (GFP) comercialmente disponible o GFP recombinante purificado u otras proteínas se agregan a la solución que contiene una cierta cantidad de etilen glicol para la congelación a -30 °C. A 3 microgramos de la proteina en 14 microlitros, 10 microlitros de una solución de DTT recién preparada (ditiotreitol, reactivo de Cleland) en PBS se agregan con vórtice vigoroso. Debido a que las proteínas usualmente contienen más de una cisteína, hay una tendencia para reticular diferentes moléculas GFP. Por lo tanto, el exceso de DTT reduce la unión de ditiol y libera GFP. La reacción se permite para proceder por dos horas a 4°C y luego el exceso de reactivo se remueve por una unidad de filtro centrífugo Amicon con un corte 3,000 PM.
Las nanopartículas activadas y las soluciones de proteína se combinan y permiten reaccionar por dos horas, después de que la proteína sin reaccionar se remueve por una unidad de filtro centrífugo Amicon que tiene un corte PM apropiado (en el ejemplo con GFP esto es 50, 000 daltones de corte) . La muestra se almacena a -80°C. En lugar de usar columnas de filtro de centrifugación Amicon, columnas de centrifugación pequeñas que contienen componentes de filtración de tamaño sólido, tal como columnas Bio Rad P también se pueden usar. Estas son columnas de exclusión de tamaño. También se debe señalar que SMCC también se puede adquirir como un derivado sulfo (Sulfo-SMCC) , haciéndolo más soluble en agua. DMSO también se puede sustituir por DMF como el portador solvente para el reactivo de etiquetado; nuevamente, debería ser anhidro.
Todos los otros reactivos de reticulación se pueden aplicar en una forma similar. SPDP también se aplica al proteina/péptido aplicable de la misma manera como SMCC. Esto es más fácilmente soluble en DMF. El ditiol se separa por una reacción con DTT por una hora o más. Después de la eliminación de subproductos y material sin reaccionar, esto se purifica por el uso de una columna de filtro centrifuga Amicon con 3,000 MW de corte.
Otros medios más directos y controlados para etiquetar una nanopartícula con un péptido y proteina sería usar dos diferentes reactivos de acoplamiento bifuncionales . La secuencia de reacción es algo similar a esa de la Figura 1. El ácido yodoacético se usa para introducir un número seleccionado de grupos "carboxilo" en la superficie de nanopartícula .
El péptido que contiene el LC-SMCC se trata con aminomercaptoetanol . Esto crea una unión a través del grupo sulfhidrilo y proporciona un grupo amino libre. Este grupo amino se acopla entonces al grupo carboxilo en la nanoparticula usando EDC. El EDC se conoce como clorhidrato de l-etil-3 [3-dimetilaminopropil] carbodiimida . Esta etapa de acoplamiento se realiza en el último esquema de reacción.
La Figura 1 muestra la descripción general de los aductos de nanoparticulas magnéticas proteina/péptido . La nanoparticula magnética se recubre con un polisacárido y luego se funcionaliza . Se puede adquirir con aminas en la superficie. Estos se pueden alterar/transformar en cualquiera de otros formatos funcionales. El extensor/conector físicamente enlaza las dos unidades juntas.
Diversos grupos funcionales se pueden usar para enlazar químicamente la nanoparticula a la proteína por medio de reacciones de reticulación. La variedad de grupos funcionales disponibles no permite las numerosas proteínas/péptidos para enlazarse a la nanoparticula, una etapa a la vez.
Similarmente, diversos reactivos de reticulación o catalizadores reactivos se pueden usar para reticular nanoparticulas con proteínas/péptidos por medio de reactivos hetero-bifuncionales . También se debe señalar que estos reactivos de reticulación vienen en diversas longitudes. Por ejemplo muchos de ellos contienen la notación LC, refiriéndose a los extensores o "cadenas largas". El compuesto pegilado también está disponible en diversas longitudes. De esta manera los ligadores de diversas longitudes se pueden agregar a las nanoparticulas y proporcionar diferentes longitudes de enlace para moléculas más grandes, tal como proteínas y moléculas pequeñas, tal como péptidos.
Frecuentemente proteínas en diferentes momentos pueden contener los mismos grupos funcionales, haciendo difícil de etiquetar la nanopartícula con las diversas proteínas. Hay reactivos que permiten un cambio en grupos funcionales; por lo tanto, podemos cambiar los grupos funcionales en proteínas, dándonos así la selectividad en una forma de manera gradual sin interferencia de las otras proteínas. Esto requiere cambiar los grupos funcionales en proteínas.
Diversos reactivos se pueden usar para alterar proteínas de manera que diferentes químicos se pueden usar para enlazar proteínas con grupos como funcionales. Por ejemplo, un compuesto, tal como SPDP, se puede usar para convertir amina a un sulfhidrilo, que es entonces receptiva hacia la reacción con una porción de maleimida.
Cuando las proteínas de enlace a la gota (nanopartícula) en una forma gradual, a menudo grupos residual y activo de proteínas que se enlazaron previamente pueden interferir con los químicos de acoplamiento. Por lo tanto los reactivos de cubierta permanentes o reversibles se pueden usar para bloquear estas porciones activas de interferencia con reactivos que están a punto de ser utilizados para enlazar una segunda o tercera proteina a la nanoparticula .
Los numerosos diferentes compuestos de cubierta se pueden usar para bloquear la porción sin reaccionar. Necesitan usarse de forma juiciosa como los compuestos de cubierta también pueden interfieren con actividad de proteina. Más usados a menudo cuando una segunda etapa de enlace químico se requiere y este grupo funcional puede interferir .
Para mostrar que las proteínas se pueden enlazar a las gotas (nanopartículas ) usando las químicas indicadas anteriormente, proporcionamos la síntesis de nanoparticula magnéticas, que contenía Proteína Fluorescente Verde derivada de Jelly fish. LCC-SMCC se usó en este esquema de síntesis.
La N-hidroxisuccinimida se hace reaccionar químicamente con los grupos amina libres en la nanoparticula con objeto de formar un enlace químico. Esto proporciona un grupo terminal maleimida que puede reaccionar con GFP. Se conoce que GFP tiene dos cisteínas y las cisternas de diversas moléculas GFP pueden reaccionar para formar enlaces de disulfuro. Para eliminar tal interferencia, la molécula se reduce primero con reactivo de Cleland.
La proteína se purifica y luego se permite reaccionar con gotas que contienen el grupo LC-maleimida . La reacción se permite para proceder por 1 hora y la reacción se purifica en filtro de centrifugación Amicon (50K de corte) . Las imágenes se tomaron en el microscopio electrónico de fluorescencia.
Los múltiples tipos de grupos funcionales se pueden crear en una nanoparticula . Esto permite la adición de tres o más diferentes proteínas a enlazarse.
Una primera comienza con una amina en la superficie.
El reactivo de Traut se puede usar para convertir alguna de aquellas aminas a sulfhidrilo. Además el ácido yodoacético se puede usar para convertir algunas aminas a ácido carboxílico .
Para ambos proteínas y péptidos, las aminas se convierten a los grupos funcionales con diferente longitud de ligador como se describe en más detalla abajo. Esto sirve como un grupo generalizado para enlazar proteínas y péptidos.
La Figura 1 describe representación esquemática de funcionalización de nanoparticula y enlace de péptidos y proteínas a nanoparticula.
Las síntesis y recubrimiento se realizan como sigue: NHS-LC-SPDP comercialmente disponible a través de Thermo Fisher es un extensor de cadena larga con reactivos de acoplamiento bifuncionales en cada lado, que son específicos para aminas y un disulfuro que se puede convertir a un sulfuro .
Un extremo tiene un éster de N-Hidroxisuccinimida, mientras que el otro extremo del extensor contiene un grupo piridilditiol . Este grupo ditiol se puede reducir para producir un sulfhidrilo. NHS-LC-SPDP se permite para reaccionar con las nanoparticulas y la reacción se puede despejar de NHS-LC-SPD no incorporado. Las nanoparticulas acopladas se reducen luego como se muestra en la Figura 1.
Producción de Proteínas Acopladas: Las proteínas biológicamente activas purificadas usando columnas de afinidad contienen un grupo épsilon-amino libre del residuo de lisina de terminal carboxi agregado para facilitar enlazar a las nanoparticulas. NHS-LC-SMCC se usa como el reactivo de acoplamiento bifuncional. La molécula tiene un extensor de cadena LCI. Un extremo tiene el reactivo de N-Hidroxisuccinimida específico para aminas. El otro extremo contiene el grupo de maleimida, muy específico para grupos sulfhidrilo. Una vez que el material se acopla a una proteína y se separa de la mezcla de reacción, la proteína acoplada de maleimida se agregará al sulfhidrilo que contiene nanopartícula . El material resultante se separó por filtración de gel.
Acoplamiento de Péptido a Nanopartícula: En este caso el péptido también contiene una lisina carboxi-terminal que servirá como la base para el acoplamiento éster-LC-maleimida NHS. La molécula tiene un extensor de cadena LC2. Todos los procedimientos son similares a aquellos descritos arriba para la proteina.
Durante la optimización, el péptido permeable a la membrana y las proteínas se mezclarán en diferentes relaciones para alcanzar el número máximo de moléculas acopladas a nanopartícula . Con base en estudios previamente publicados, 3-4 moléculas de péptido que penetra la célula de enlace de superficie por nanopartícula son suficientes para eficiente suministro intracelular de nanopartículas superparamagnéticas .
El uso de brazo extensor LC2 proporciona un medio importante para incrementar el número de moléculas basadas en péptido de enlace. La concentración diferente de uso de NHS-LC-SPDP permite mayor número de péptido anclado y molécula de proteína a la superficie de nanopartículas, y por lo tanto, penetración más eficiente y consecuentemente, actividad de reprogramación celular más robusta.
Enlace de Péptidos y Proteínas en Una Nanopartícula: Esto se puede realizar usando el procedimiento mostrado en la Figura 1. En este caso, las relaciones de proteínas y péptidos etiquetados SMCC se agregan a la gotas y permiten reaccionar.
Otros medios más directos y controlados de etiquetar una nanopartícula con un péptido y proteína sería usar dos diferentes reactivos de acoplamiento bifuncionales (Figuras 2A-F) . La secuencia de reacción es algo similar a esa de la Figura 1 con algunas modificaciones descritas abajo. Ácido yodoacético se usa para introducir un número seleccionado de grupos "carboxilo" en la superficie de nanoparticula . Esto se realiza en la etapa I; ver las Figuras 2A-F, etapas (I-VII) .
El péptido que contiene el NH-LC-SMCC se trata con aminoetanol. Esto crea una unión a través del grupo sulfhidrilo y proporciona un grupo amino libre. Este grupo amino se acopla entonces al grupo carboxilo en la nanoparticula usando EDAC (EDC) . EDAC se conoce como clorohidrato de l-etil-3 [3-dimetilaminopropil] carbodiimida . Esta etapa de acoplamiento se realiza por último en el esquema de reacción.
En otro aspecto, la presente invención también se dirige a un método para suministrar moléculas bioactivas enlazadas a nanoparticulas funcionalizadas para modulación de actividad intracelular . Por ejemplo, células humanas, fibroblastos u otros tipos de célula que son ya sea comercialmente disponibles u obtenidos usando procedimientos experimentales estándar o modificados se blindan primero bajo condiciones estériles en una superficie sólida con o sin un sustrato al cual las células adhieren (células alimentadoras, gelatina, martigel, fibronectina, etc.). Las células blindadas se cultivan por un tiempo con una combinación de factor específico que permite la división/proliferación celular o mantenimiento de viabilidad celular aceptable. Los ejemplos son suero y/o diversos factores de crecimiento, que lueqo pueden retirarse o refrescarse y los cultivos continuaron. Las células blindadas se cultivan en la presencia de nanopartículas permeables a la célula biocompatibles funcionalizadas con moléculas bioactivas enlazadas usando diversos métodos descritos en la presente en la presencia o ausencia de campo magnético. El uso de un imán en el caso de nanoparticula superparamagnéticas rinde un aumento importante en el área de superficie de contacto entre las células y las nanopartículas y de tal modo refuerza la penetración mejorada adicional de nanopartículas funcionalizadas a través de la membrana celular. Cuando sea necesario, la población celular se trata repetidamente con las nanopartículas funcionalizadas para suministrar las moléculas bioactivas intracelularmente .
Las células se suspenden en medio de cultivo, y las nanopartículas no incorporadas se remueven por centrifugación o separación celular, dejando células que se presentan como grupos. Las células agrupadas entonces se re-suspenden y re-cultivan en medio fresco por un periodo adecuado. Las células se pueden tomar a través de múltiples ciclos de separación, re-suspensión, y re-cultivo, hasta que un efecto biológico consecuente provocado por las moléculas bioactivas específicas suministradas intracelularmente se observa.
Un uso de la invención es la separación por exclusión de un compuesto (o compuestos) para un efecto sobre reprogramación celular. Esto implica combinar el compuesto enlazado a la nanoparticula usando uno o más de los métodos en la presente descritos con una población celular de interés, cultivar por un periodo adecuado y luego determinar cualquier efecto modulador que resulta de los compuesto (s) . Esto puede incluir el inicio de la reprogramación celular y la generación de células madre pruripotentes, diferenciación o transdiferenciación de las células a tipos de célula más especializadas o diferentes especializadas, examen de las células para toxicidad, cambio metabólico, o un efecto sobre actividad contráctil y otras funciones.
Otro uso de la invención es la formulación de células especializadas como un medicamento o en un dispositivo de suministro pretendido para el tratamiento de un cuerpo humano o animal. Esto permite al clínico administrar las células en o alrededor del tejido dañado (sin el corazón, músculo, hígado, etc.) ya sea desde la vasculatura o directamente en el músculo o pared del órgano, permitiendo de tal modo a las células especializadas injertarse, limitar el daño, y participar en re-crecimiento de la musculatura del tejido y restauración de función especializada.
Un uso de la presente invención implica nanopartículas funcionalizadas con otras proteínas tal como factores de transcripción Oct4 y Sox2 asi como para asegurar la reprogramación celular y generación de tipos de células madres o más diferenciadas con la preservación del genoma intacto.
Otro uso de la presente invención es la separación por exclusión de un compuesto (o compuestos) para un efecto sobre reprogramación celular. Esto implica combinar el compuesto enlazado a la nanoparticula usando los métodos descritos en la presente con una población celular de interés, cultivar por un periodo adecuado y luego determinar cualquier efecto modulador que resulta de los compuesto ( s ) . Esto puede incluir iniciación de la reprogramación celular y generación de células madre pluripotentes , diferenciación o transdiferenciación de las células a tipos de célula más especializadas o diferentes especializadas, examen de las células para toxicidad, cambio metabólico, o un efecto sobre la actividad contráctil y otras funciones.
Todavía otro uso de la presente invención es la formulación de células especializadas como un medicamento o en un dispositivo de suministro pretendido para tratamiento de un cuerpo humano o animal. Esto permite al clínico administrar las células en o alrededor del tejido dañado (sin el corazón, músculo, hígado, etc.) ya sea desde la vasculatura o directamente en el músculo o pared del órgano, permitiendo de tal modo a las células especializadas injertarse, limitar el daño, y participar en re-crecimiento de la musculatura del tejido y restauración de función especializada .
A modo de ilustración adicional y no de limitación, los siguientes Ejemplos describen otros aspectos de la presente invención .
Ejemplos Ejemplo 1 GFP se ligó a la partícula superparamagnética usando LC-SMM como el reticulante (enlazado a los grupos amina de las gotas) que luego se acopló directamente a los grupos sulhidrilos en GFP. LC-SMCC (de Thermo Fisher) se disolvió en dimetxlformamida (DMF) obtenida de ACROS (vial sellado y anhidro) en la concentración 1 mg/ml. La muestra se selló y usó casi inmediatamente.
Diez (10) microlitros de la solución se agregó a nanopartículas en 200 microlitros de volumen. Esto proporciona un gran exceso de SMCC a los presentes grupos amina disponibles, y la reacción se permitió para proceder por una hora. El exceso de SMCC y DMF se removió usando un filtro de centrifugación Amicon con un corte de 3,000 daltones. Cinco intercambios de volumen se requirieron para asegurar intercambiador de solución amortiguadora adecuado.
Fue importante que el exceso de SMCC se elimine en esta etapa .
Cualquier molécula basada en péptido, como un ejemplo Proteina Fluorescente Verde (GFP) comercialmente disponible o GFP recombinante purificado u otras proteínas) se agregaron a la solución que contiene una cierta cantidad de etilen glicol para la congelación a -30 °C. A 3 microgramos de la proteína en 14 microlitros, 10 microlitros de una solución DTT recién preparada (ditiotreitol , reactivo de Cleland) en PBS se le agregaron con vórtice vigoroso. Debido a que las proteínas usualmente contienen más de una cisteína, hubo una tendencia para reticular diferentes moléculas GFP. Por lo tanto, el exceso de DTT reduce la unión de ditiol y liberó el GFP. La reacción se permitió para proceder por dos horas a 4°C y luego el exceso de reactivo se removió por una unidad de filtro centrífugo Amicon con un 3,000 MW de corte.
Las nanopartículas activadas y las soluciones de proteína se combinaron y permiten reaccionar por dos horas, después de que la proteína sin reaccionar se removió por una unidad de filtro centrífugo Amicon que tiene un corte MW apropiado (en el ejemplo con GFP es 50,000 dalton de corte). La muestra se almacenó a -80°C. También se debe señalar que un derivado sulfo de SMCC (Sulfo-SMCC) , que es más soluble en agua, se puede usar. DMSO también se puede sustituir por DMF como el portador solvente para el reactivo de etiquetado; nuevamente, debería ser anhidro.
Ejemplo 2 En este método los grupos amino de lisina se usaron para la reacción de acoplamiento a grupos sulhidrilo sobre la gota. Las gotas equilibradas recientemente con solución amortiguadora de fosfato 0.1 M a pH 7.2, se usaron en estos estudios. LC-SPDP a 1 mg/ml (en DMF) se preparó recientemente. 10 microlitros de solución SPDP se agregó a la suspensión de gota bajo vórtice vigoroso y permiten reaccionar por una hora. Posteriormente, el material sin reaccionar se removió por centrifugación y las nanopartículas lavadas con solución amortiguadora de fosfato usando un filtro de centrifugación Amicon con un corte 10K. El enlace de disulfuro de SPDP se rompió usando reactivo de Cleland; 1 mg se agregó a la solución y la reacción se permitió para proceder por una hora. Los subproductos y reactivo de Clelands sin reaccionar se eliminaron por medio de un filtro de centrifugación Amicon con un corte 10K.
Aunque la reacción anterior procedió, GFP se bloqueó usando N-etilmaleimida . El exceso de etilmaleimida se agregó a la solución GFP. La reacción procedió por una hora a temperatura ambiente y los materiales no buscados eliminados usando un filtro de centrifugación Amicon con un corte 3K. El GFP se permitió luego reaccionar con exceso de S CC por una hora. Posteriormente, GFP se purificó en una columna de giro y luego reaccionó con PDP-nanopartículas . La reacción procedió por una hora y el producto final se purificó usando un filtro de centrifugación Amicon con un corte de 50K.
Ejemplo 3 Los fibroblastos humanos comercialmente disponible u obtenidos usando procedimientos experimentales estándares como se describen [ oretti et al, ouse and human induced pluripotent stem cells as a source for multipotent Isll cardiovascular progenitors. FASEB J. 24:700 (2010)] se siembran en placas a 150,000 células de densidad bajo condiciones estériles en una superficie sólida con o sin células alimentadoras pre-sembradas en placas a 150,000-200,000 de densidad en placas de seis pozos. Las células alimentadoras obtenidas ya sea comercialmente o usando procedimientos de laboratorio estándares. Las células blindadas se cultivan por algún tiempo con una combinación de factor especifico que permite la división/proliferación celular o mantenimiento de viabilidad celular aceptable en medio de cultivo que contiene suero, que luego puede retirarse o refrescarse y los cultivos continuar bajo condiciones estériles en un incubador humidificado con C02 al 5% y 02 ambiente.
Las células colectadas en el fondo de un tubo cónico o las células blindadas se tratan con 50 microlitros de suspensión que contiene nanoparticulas permeables a la célula biocompatibles funcionalizadas con moléculas bioactivas enlazadas usando diversos métodos descritos en la presente en la presencia o ausencia de campo magnético.
El uso del campo magnético en el caso de nanoparticulas superparamagnéticas presta un aumento importante en el área de superficie de contacto entre la células y nanoparticulas y asegurando de este modo la penetración mejorada de nanoparticulas funcionalizadas a través de la membrana celular. De forma importante, similar a protección mediada por PEG poli(etilen glicol) de diversos fármacos basados en proteina (PEG-GCSF, Amgen, CA; PEG-Interferon, Schering-Plough/Merck, NJ) a los cuales PEG se enlaza, las nanoparticulas usadas en conjunto con péptidos acoplados incrementa el tamaño del polipéptido y enmascara la superficie de la proteina, reduciendo de este modo la degradación de proteina por enzimas proteoliticas y que resulta en una estabilidad más larga de las moléculas de proteina usadas Si es necesario, la población celular se trata repetidamente con las nanoparticulas funcionalizadas para suministrar las moléculas bioactivas intracelularmente .
Las células se suspenden en medio de cultivo, y las nanoparticulas no incorporadas se remueven por centrifugación por 10 minutos a aproximadamente 1200 x g, dejando células que se presentan como grupos en el sedimento. Las células agrupadas entonces se re-suspenden, lavan nuevamente usando procedimiento similar y re-cultivan en medio fresco por un periodo adecuado. Las células se pueden tomar a través de múltiples ciclos de separación, re-suspensión, y re-cultivo en un medio de cultivo hasta que un efecto biológico consecuente provocado por las moléculas bioactivas especificas suministradas intracelularmente se observa.
En este ejemplo especifico con proteina fluorescente verde, las nanoparticulas que penetran la célula suministran la proteina dentro de las células, que confiere adquisición de fluorescencia verde novedosa por las células objetivo. Esta propiedad recientemente adquirida permite la clasificación posterior y separación de las células con proteina intracelularmente suministrada de alto grado de homogeneidad que se puede usar además para diversas aplicaciones. De forma importante, el uso de nanoparticulas funcionalizadas permeables a la célula con proteina enlazada provista de cualquier integración en el genoma de la célula, asegurando asi que cada célula con propiedad novedosa (en este caso fluorescente) mantiene genoma intacto y conserva la integridad de ADN celular.
La presente invención se puede realizar en otras formas especificas sin apartarse del espíritu o características esenciales de los mismos. Las modalidades precedentes son por lo tanto para considerarse ilustrativas y no limitativas de la invención descrita en la presente. El alcance de la invención es por lo tanto indicado por las reivindicaciones adjuntas antes que por la descripción anterior, y todos los cambios que vienen dentro del significado e intervalo de la equivalencia de las reivindicaciones se pretenden que se abarquen en la presente.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Una nanoparticula biocompatible funcionalizada capaz de penetrar a través de una membrana celular de mamífero y suministrar intracelularmente una pluralidad de moléculas bioactivas para modular una función celular, caracterizada porque comprende: una nanoparticula central que varía en tamaño desde 5 hasta 50 nm y que tiene un recubrimiento de polímero sobre la misma, una pluralidad de grupos funcionales covalentemente enlazados al recubrimiento de polímero, en donde la pluralidad de moléculas bioactivas se enlazan a la pluralidad de grupos funcionales, y en donde la pluralidad de moléculas bioactivas incluye al menos un péptido y una proteína, y en donde el péptido es capaz de penetrar a través de la membrana celular de mamífero y entrar en la célula, y en donde la proteína es capaz de proporcionar una nueva funcionalidad dentro de la célula.
2. La nanoparticula biocompatible funcionalizada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la nanoparticula comprende hierro.
3. La nanoparticula biocompatible funcionalizada de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el péptido se enlaza a la proteína.
4. La nanoparticula biocompatible funcionalizada de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el péptido y la proteina cada una se enlazan a la nanoparticula por medio de una o más moléculas de ligador de interposición.
5. La nanoparticula biocompatible funcionalizada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el péptido incluye cinco hasta nueve aminoácidos básicos.
6. La nanoparticula biocompatible funcionalizada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el péptido incluye nueve o más aminoácidos básicos.
7. La nanoparticula biocompatible funcionalizada de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la proteina es un factor de transcripción.
8. La nanoparticula biocompatible funcionalizada de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el factor de transcripción se selecciona del grupo que consiste de Oct4, Sox2, Nanog, Lin28, cMyc, y Klf4.
9. Un método para cambiar una funcionalidad celular dentro de una célula de mamífero, caracterizado porque comprende administrar una cantidad efectiva de una nanoparticula biocompatible funcionalizada de conformidad con la reivindicación 1 a la célula y cambiar la funcionalidad celular dentro de la célula.
10. El método para cambiar una funcionalidad celular dentro de una célula de mamífero de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el cambio de la funcionalidad celular implica un cambio en una propiedad fisico-química de la célula.
11. El método para cambiar una funcionalidad celular dentro de una célula de mamífero de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el cambio de la funcionalidad celular implica un cambio en propiedad proliferativa de la célula.
12. El método para cambiar una funcionalidad celular dentro de una célula de mamífero de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el cambio de la funcionalidad celular implica un cambio en capacidad de sobrevivencia de la célula.
13. El método para cambiar una funcionalidad celular dentro de una célula de mamífero de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el cambio de la funcionalidad celular implica un cambio en propiedad fenotípica morfológica de la célula.
14. El método para cambiar una funcionalidad celular dentro de una célula de mamífero de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el cambio de la funcionalidad celular implica una capacidad adquirida de la célula para hacer un nuevo tipo de célula que incluye una células madre o un tipo de célula más especializado.
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