KR100951719B1 - 세포투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자의 복합체 및그 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 세포투과성 펩타이드와 형광표지 자성 나노입자의 복합체 및 그 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 세포내 투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자를 화학적으로 결합시킴으로써, 내포작용(endocytosis) 없이, 형광표지 자성나노입자를 세포 내로 안정하게 직접 도입시킬 수 있는 세포투과성 펩타이드-형광표지 자성나노입자 복합체 및 이를 함유하는 세포 영상용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 기존의 바이러스성 펩타이드 수송체에서 탈피하여 높은 안정성을 보이고, 최적의 표적 지향화를 통한 영상진단용법의 효과를 극대화하며, 부작용을 최소화하여 혁신적인 치료기술을 제시할 수 있다.
수송도메인, 투과기능성, 펩타이드, 자성나노입자, 세포영상, 조영제
Description
본 발명은 세포투과성 펩타이드와 형광표지 자성 나노입자의 복합체 및 그 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 세포내 투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자를 화학적으로 결합시킴으로써, 내포작용(endocytosis) 없이, 형광표지 자성나노입자를 세포 내로 안정하게 직접 도입시킬 수 있는 세포투과성 펩타이드-형광표지 자성나노입자 복합체 및 이를 함유하는 세포 영상용 조성물에 관한 것이다.
분자영상(Molecular Imaging)은 최근 급속히 발전하고 있는 분야로, 세포 내에서 일어나는 여러 분자수준의 변화, 즉 유전자의 발현, 생화학적 현상, 생물학적 변화들을 영상으로 평가하는 기법이다. 기존의 의학 영상방법이 비특이적인 물리적, 화학적 성상의 차이를 이용하여 영상신호를 만들고, 이 영상신호의 의미를 임상적으로 추정 이용하는데 반하여 분자 영상법에서는 분자 수준, 유전자 수준의 작 용에서 나오는 영상신호를 이용함에 따라, 보다 특이적 영상이라는 특징이 있다. 이러한 분자 영상법을 이용하여 유전자 변화, 단백질 변화, 대사 변화, 세포내 생물학적 변화 등을 다양하게 영상화할 수 있다.
세포나 조직 내에서 각종 유전자의 발현 위치, 정도, 기간 등을 확인하는 기존의 분자생물학적 연구방법은 대상 조직이나 세포를 조직검사를 통하여 채취하여야 하므로 대상물의 희생이나 환자 조직의 손상이 야기된다. 따라서 기존의 연구방법을 이용하게 된다면 실험동물의 희생이 필수적이므로 한 개체 내에서 반복실험이 불가능하다. 그러나 분자영상의 경우 영상 리포터 유전자(imaging reporter gene)를 이용하여 영상으로 평가하므로 실험동물의 손상이 거의 없고, 한 개체 내에서 반복실험이 가능하므로 시간에 따른 유전자 발현의 차이를 영상을 이용하여 추적 가능하다. 즉, 분자 영상법은 생체 조직을 손상하지 않고, 반복적으로 영상화 할 수 있으며, 영상을 통한 정량분석이 가능하다는 장점이 있다.
영상 진단법 중, 최첨단 진단방법인 핵자기공명 단층촬영술 (MRI, magnetic reasonance image)의 사용이 증가되고 있다. MRI는 기본적으로 양성자에서 나오는 신호를 측정하는 것이다. MRI는 처음에 비침습적인 진단법에 목표를 두었으나, 1988년 첫 MRI 조영제(contrast agent)가 시판된 이후, 조영제와 같이 사용하면 진단상의 민감도와 특이도를 향상시킬 수 있음이 밝혀졌으며, 최근에는 MRI 혈관 조영술, 관류영상에 이르기까지 MRI 조영제의 사용영역이 점차 증대되고 있다.
이러한 MRI 조영제는 자장에 미치는 영향에 따라 상자성, 초상자성 제제로 구분되며, 각각 양성 조영제 및 음성 조영제라고도 불리운다. 전자는 T1 감쇄효과 가 우세하여 T1 강조영상에서 밝은 신호로 보이며, 후자는 T2 감쇄효과가 우세하여 T2 영상에서 신호를 어둡게 만드는 것으로, 초상자성 물질에는 산화철을 이용하는데, 입자 크기에 따라 두 가지로 구분할 수 있다. 입자 크기가 50nm 이상의 경우를 SPIO(superparamagnetic iron oxide)라고 하며, 그 이하의 크기를 가지는 것을 USPIO(ultrasmall superparamagnetic iron oxide)라고 한다. 초상자성 물질을 적용하는 경우는 음성 조영을 필요로 하는 경우로, 조영제가 전달된 부분의 신호를 감소시켜 주변 조직보다 이미지를 더 어둡게 한다 (Susanne, M. et al., Invest. radio., 37:167, 2002).
현재 주로 연구가 되고 있는 산화철 조영제는 SPIO를 기본으로 하는 콜로이드로, 나노 크기의 마그네타이트 또는 마그네마이트를 주물질로 하고 덱스트란이나 전분 등의 고분자성 탄수화물로 코팅이 되어 있다. 마그네틱 나노입자는 콜로이드 용액의 산화철 용액인데 나노입자들의 큰 이완신호 때문에 조영제로서 사용된다. 산화철 용액의 나노입자 크기는 코어부분의 크기와 코팅의 두께, 응집의 양상에 따라 다양한 분포를 갖는다 (Gro, C. et al., Cells Mater., 3:163, 2002). Gd 조영제는 수밀리몰 농도에서 우수한 조영효과를 나타내는 반면, SPIO는 수 나노몰 농도로도 조영 효과가 뛰어나기 때문에 MRI 조영제로서 연구 가능성 및 효과의 잠재성이 크다고 본다 (Bulte, J.W. et al., Res. Med., 25:148, 1992; Knauth, M. et al., Am. J. Neuroradiol., 22:99, 2001; Lacava, L.M. et al., Biophys., 252:367, 2002).
조영제로 이용하기 위해서는 높은 포화 자화도를 가지면서 작고 균일한 안정 한 마그네틱 용액이 제조되어야 한다. 순수한 마그네틱 입자는 다음과 같은 제한 때문에 이용하지 못한다. (1) 응집현상이 크다. (2) 충분히 안정하지 않으면 본래 구조가 변해서 자기적인 특성이 변할 수 있다. (3) 생체 환경에 접하게 되면 빠르게 생분해가 일어날 수 있다. (4) 자체만으로는 독성이 있다. 따라서 이러한 문제를 줄이기 위해서 고분자가 코팅된 SPIO와 USPIO가 개발되고 있다 (Lind, K. et al., J. Drug Target., 10:221, 2002; Bellin, M. F. et al., J. Radiol., 34:257, 2000; Bonnemain, B. et al., Review. J. Drug Target., 6:167, 1998; Muller, R. N. et al., Invest Radiol., 25:34, 1990).
그러나, 고분자가 코팅된 자성나노입자를 세포영상 및 생체 의학분야에서 사용하기 위해서는 목표로 하는 세포 또는 병변 부위에만 빠른 시간내에 약물이 전달되어 타겟 세포 또는 조직만을 치료 나아가 파괴하는 표적 지향형 접근법이 필요하다. 이전 보고에 의하면, 줄기세포 치료법을 임상에 도입하는 전단계의 실험으로 줄기세포와 다른 포유동물 세포에 나노자성입자를 레이블(label)하여 생체 외부(in vitro)에서 세포내 투과능을 보았을 때, 세포 내로 자성입자가 트랜스로케이션 (translocation) 되기 위해 긴 시간의 배양시간이 소요되어 효율적이지 않았다 (Frank, J.A. et al., Academic Radiology, 484:487, 2002).
따라서, 생체 내부 및 외부 모두에서 세포를 손상시키지 않고 생물학적 활성을 지닌 거대 분자를 효과적으로 전달하는 방법이 필요하게 되었다. 이와 같은 방법의 예로서, 지질 펩타이드의 화학적인 추가 또는 폴리라이신이나 폴리아르기닌과 같은 염기성 중합체를 사용하는 방법이 있으나, 이들 방법은 아직 검증되지 않았 다. 수송체로서 사용되는 엽산은 엽산-염 결합체의 형태로 세포 내로 이동된다는 사실이 보고되었으나 (Leamon, C.P. et al., Proc. Natl. Acd. Sci., 88:5572, 1991), 세포질 안으로까지 전달되는지 확인된 바 없다. 또한, 슈도모나스 외독소(Pseudomonas exotoxin)도 수송체의 한 종류로서 사용되고 있으나 (Prior, T.I. et al., Cell, 64:1017, 1991), 이러한 방법에서도 생물학적으로 활성화된 전달대상 물질의 세포 내로의 이동에 관한 효과 및 일반적인 적용 가능성에 대해서는 명확하지 않다. 따라서, 살아있는 세포의 세포질이나 핵 안으로 생물학적 활성을 가지는 물질을 보다 안전하고 효과적으로 전달할 수 있는 방법이 요구되고 있는 실정이다.
이러한 요구에 대한 연구의 결과로서 제시된 것은 세포 투과성 펩타이드(cell penetrating peptide, CPP)가 있으며, 이중 가장 많은 연구가 진행된 것은 인간 면역 결핍 바이러스-1(human immunodeficiency virus-1, HIV-1)의 전사인자인 TAT 단백질이다. 상기 단백질은 세포막을 통과함에 있어, 86개의 아미노산으로 구성된 완전한 형태일 때보다 양전하를 갖는 아미노산들이 집중적으로 분포되어 있는 47번째부터 57번째 아미노산 서열(YGRKKRRQRRR)의 일부분으로 구성된 형태일 경우, 더욱 효과적이라는 것이 밝혀졌다 (Fawell, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:664, 1994). 세포 투과성 펩타이드(cell penetrating peptide, CPP)로서의 효과가 확인된 다른 예로는 HSV-1(herpes simplex virus type 1)의 VP22 단백질의 267번째부터 300번째까지의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 (Elliott, G. et al., Cell, 88:223, 1997), HSV-2의 UL-56 단백질의 84번째부터 92번째까지의 아미 노산 서열을 가지는 펩타이드(GeneBank code:D1047[gi:221784]) 및 드로소필라 속(Drosophila sp.)의 안테나페디아(antennapedia, ANTP) 단백질의 339번째부터 355번째까지의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 (Schwarze, S.R. et al., Trends. Pharmacol. Sci., 21:45, 2000) 등이 있으며, 전기적으로 양성인 아미노산들을 나열한 인위적인 펩타이드의 경우도 그 효과가 확인되었다 (Laus, R. et al., Nature. Biotechnol., 18:1269, 2000).
종래 CPP를 다른 펩타이드 또는 단백질과 연결시켰을 경우 융합 단백질을 효율적으로 세포 내로 수송하는 것이 밝혀진 이후, CPP를 이용한 다양한 응용이 시도되었으나 (대한민국 특허등록 제10-0568457호), 투과기능성 펩타이드가 바이러스에서 유래하기 때문에 안전성 측면에서 문제점을 가진다.
최근 TAT와 유사한 펩타이드 배열을 가지고, 투과기능성 도메인으로 활용된 펩타이드로서 아르기닌(arginine) 등의 양이온성 아미노산을 다량 함유하는 저분자형 프로타민(low molecular weight protamine, LMWP)이 알려져 있다. 특히, LMWP는 프로타민으로부터 유래하는 천연 유래 양이온성 펩타이드로서, 독성에 대한 염려가 없고 대량으로 생산해 낼 수 있는 장점이 있다.
따라서, 기존의 바이러스성 펩타이드 수송체에서 탈피하여 높은 안전성을 보이고, 최적의 표적 지향화를 통한 영상 진단용법에 대한 기술개발이 시급한 실정이나, 아직까지 그 연구성과가 미흡한 실정이다.
이에 본 발명자들은 상기 종래기술의 문제점을 개선하고자 예의 노력한 결과, 형광표지 자성나노입자에 세포 투과성 펩타이드를 화학적인 방법으로 결합시킨 결과, 내포작용(endocytosis)의 과정 없이 안정하게 자성나노입자를 세포내로 전달할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 목적은 형광표지 자성나노입자에 세포 투과성 펩타이드가 결합되어 있는 세포 투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자의 복합체를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 복합체를 함유하는 세포 영상용 조성물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 자성나노입자의 표면을 아미노기로 개질시켜 아미노기를 함유하는 자성나노입자를 제조하는 단계; (b) 상기 제조된 아미노기를 함유하는 자성나노입자에 형광물질을 혼합하여 형광표지 자성나노입자를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 제조된 형광표지 자성나노입자에 세포투과성 펩타이드를 결합시켜 세포투과성 펩타이드와 자성나노입자의 복합체를 제조하는 단계를 포함하는 세포투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자의 복합체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조되는 형광표지 자성나노입자에 세포 투과성 펩타이드가 결합되어 있는 세포 투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자의 복합체 및 상기 복합체를 함유하는 세포 영상용 조성물을 제공한다.
이상 상세히 기술한 바와 같이, 본 발명에 따르면, 기존의 바이러스성 펩타이드 수송체에서 탈피하여 높은 안정성을 보이고, 최적의 표적 지향화를 통한 영상진단용법의 효과를 극대화하며, 부작용을 최소화하여 혁신적인 치료기술을 제시할 수 있다.
본 발명은 일 관점에서, 본 발명은 (a) 자성나노입자의 표면을 아미노기로 개질시켜 아미노기를 함유하는 자성나노입자를 제조하는 단계; (b) 상기 제조된 아미노기를 함유하는 자성나노입자에 형광물질을 혼합하여 형광표지 자성나노입자를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 제조된 형광표지 자성나노입자에 세포투과성 펩타이드를 결합시켜 세포투과성 펩타이드와 자성나노입자의 복합체를 제조하는 단계를 포함하는 세포투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자의 복합체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 세포투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자의 복합체는 운반체 역할하는 세포투과성 펩타이드(cell penetrating peptide, CPP)와 진단하고 자 하는 표적세포 및 조직의 영상화를 가능하게 하는 형광표지 자성나노입자를 화학적 상호작용을 통하여 결합시켜 제조한 것으로, 상기 세포 투과기능성 펩타이드와 자성나노입자의 복합체를 수용액 상태로 생체 내(in vivo)에 도입시킬 경우, 내포작용(endocytosis) 과정 없이 직접 세포 내로 투과되어, 기존의 바이러스성 펩타이드 수송체에서 탈피하여 높은 안정성을 보이고, 최적의 표적 지향화를 통한 영상진단용법의 효과를 극대화하며, 부작용을 최소화할 수 있다.
본 발명에 따른 자성나노입자는 주위 물의 양성자와 일시적인 상호작용이 가능한 초자상성 물질을 의미하고, 바람직하게는 자성나노입자의 직경 크기가 10nm ~ 150nm인 산화철을 의미하며, 보다 바람직하게는 신체 거의 모든 세포 및 장기의 영상을 확인할 수 있는 MRI 조영제를 의미하는 것으로, 페릭 암모늄 사이트레이트(ferric ammonium citrate, FAC), 산화철(ferrum oxide), 초상자성 산화철 입자(SPIO), 당질-덱스트란 코팅된 산화철 나노입자(carboxy-dextran coated iron oxide nanoparticle), 미세초상자성 산화철입자(USPIO), 단일크리스탈린 산화철 나노입자(MION; monocrystalline iron oxide nanoparticles), 다크리스탈린 산화철 나노입자(PION; polycrystalline iron oxide nanoparticles), 구강자성입자(oral magnetic particles, OMP)로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 형광물질은 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate, FITC) 또는 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트(tetramethylrhodamine isothiocyanate, TRITC)가 바람직하며, 이에 한정하지 않고, 현존하는 형광물질을 화학적으로 변형시켜 모두 포함할 수 있다. 예를 들면, 알렉사플루오르(alexa fluor), 로다민 레드-X(rhodamine red-X), 텍사스 레드(texas red), 테트라메틸로드아민(tetramethylrhodamine), 캐스캐이드 블루(cascade blue), DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole), 쿠마린류(coumarine), 루시퍼 옐로우(lucifer yellow), 단실아마이드(dansylaminde) 등이 있다.
한편, 본 발명에 따른 세포투과성 펩타이드는 아르기닌, 라이신 및 히스틴딘으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산의 함량이 70~80%인 펩타이드로, 상기 세포성 펩타이드는 저분자형 프로타민(LMWP, 서열번호 1 : VSRRRRRRGGRRRR), TAT(서열번호 2 : YGRKKRRQRRR), 페너트라틴(penetratin, 서열번호 3 : RQIKIWFQNRRMKWKK) 및 안테나페디아(antennapedia, ANTP), D-아르기닌 올리고 펩타이드(D-arginine oligopeptide, R8 이상) 및 L-아르기닌 올리고 펩타이드(L-arginine oligopeptide, R8 이상)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 따른 세포투과성 펩타이드와 자성나노입자의 복합체는 아미노산의 양전하와 자성나노입자에 코팅된 덱스트란의 음전하 사이의 정전기적 상호작용을 이용하여 결합시키거나, 가교제를 이용하여 화학적 결합을 유도시켜 제조할 수 있으나, 본 발명에서는 생체 내 환경에서의 보다 높은 안정성을 위해 반응활성 기를 자성나노입자 표면에 만들기 위해 표면 개질시킨 후에 가교제를 통해 화학적 결합을 유도한 것으로, 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드는 말단에 자유 아미노기를 가지고 있어, 가교제에 의한 복합제 형성이 용이하다.
본 발명에 따른 가교제는 1,4-비스-말레이미도부탄(1,4-bis- maleimidobutane, BMB), 1,11-비스-말레이미도테트라에틸렌글리콜(1,11-bis-maleimidotetraethyleneglycol, BM[PEO]4), 1-에틸-3-[3-디메틸 아미노프로필] 카보디이미드 하이드로클로라이드(1-ethyl-3-[3-dimethyl aminopropyl] carbodiimide hydrochloride, EDC), 숙시이미딜-4-[N-말레이미도메틸시클로헥산-1-카복시-[6-아미도카프로에이트]](succinimidyl-4-[N-maleimidomethylcyclohexane-1-carboxy-[6-amidocaproate]], SMCC) 및 그의 설폰화염(sulfo-SMCC), 숙시이미딜 6-[3-(2-피리딜디티오)-로피오나미도] 헥사노에이트](succimidyl 6-[3-(2-pyridyldithio)-ropionamido] hexanoate, SPDP) 및 그의 설폰화염(sulfo-SPDP), m-말레이미도벤조일-N-하이드로시숙시이미드 에스터(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester, MBS) 및 그의 설폰화염(sulfo-MBS), 숙시이미딜[4-(p-말레이미도페닐) 부틸레이트](succimidyl[4-(p-maleimidophenyl) butyrate], SMPB) 및 그의 설폰화염(sulfo-SMPB)으로 구성된 군에서 선택할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드와 자성나노입자의 복합체는 도 1에 나타난 바와 같이, 음전하를 띄는 덱스트란(dextran)으로 코팅된 자성나노입자를 암모늄 하이드록사이드(ammonium hydroxide)로 표면 개질시켜 아미노기를 가지는 자성나노입자를 제조한 다음, 상기 아미노기를 가지는 자성나노입자를 형광물질과 반응시켜 형광표지 자성나노입자를 제조하고, 여기에, 가교제와 혼합하여 프리-설프하이드릴기를 가지는 형광표지 자성나노입자를 제조시킨다. 한편, 세포투과성 펩타이드는 가교제로 코팅하여 프리-설프하이드릴(free-sulfhydryl) 기를 가지는 세포 투과성 펩타이드를 제조하고, 여기에 앞서 전술한 프리-설프하이드릴릴(free- sulfhydryl) 기를 가지는 상기 형광표지 자성나노입자를 반응시켜 세포투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자의 복합제를 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 세포투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자의 복합체 제조에 있어서, 자성나노입자의 표면을 아미노기로 개질시키는 것은 암모늄 하이드록사이드(ammonium hydroxide), 에탄올(ethanol), 아미노프로필 트리메틸실란(aminopropyl trimethylsilane, APTMS), N-(3-디메틸프로필)-N-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드(N-(3-dimethylpropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC), N-하이드록시술포숙신이미드(N-hydroxysulfosuccinimide, sulfo-NHS) 및 N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide, NHS)로 구성된 군에서 선택되는 것으로 수행할 수 있다.
본 발명에 따른 세포투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자의 복합체는 S-S 결합에 의해 세포투과성 펩타이드와 자성나노입자 복합체가 결합되어 있어, 세포 내에 존재하는 환원효소 등에 의해 자성나노입자가 세포투과성 펩타이드로부터 해리가 가능함에 따라, 쉽고 간편하게 자성나노입자를 세포 내로 도입시킬 수 있어 세포 영상 및 진단에 용이하게 수행할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 세포투과성 펩타이드와 자성나노입자의 복합체 및 상기 세포투과성 펩타이드와 자성나노입자의 복합체를 함유하는 세포 영상용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 세포 영상용 조성물의 바람직한 투여방법은 비경구적, 예를 들어 농축괴(bolus)주입, 정맥주사 또는 동맥내 주입 또는 폐가 조영되어야 하는 경우 스프레이, 예를 들어 연무제 분사가 있고, 경구 또는 직장 투여도 이용할 수 있으나, 공지된 조영제 투여방법으로도 가능하며, 물론 비경구적 투여가능한 형태는 무균이어야 하고, 생리학적으로 허용되지 않는 제제 및 상자성, 초상자성, 강자성 또는 준강자성 오염물질이 없어야 하며, 본 발명에 따른 조성물은 방부제, 항균제, 비경구적 용액에 통상적으로 사용되는 완충액 및 항산화제, 부형제 및 MR 조영제와 병용가능하고 생성물의 제조, 저장 또는 이용을 방해하지 않는 다른 첨가제를 함유할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 세포 영상용 조성물의 투여량은 사용된 대상조직 또는 기관, 및 측정장치의 특성에 따라 변할 것이나, 감지 가능한 콘트라스트 효과를 달성할 수 있는 한 적은 투여량을 유지하는 것이 바람직하다. 대체적으로 투여량은 대략 LD50 10%, 즉, 1 ~ 1000mg/kg, 바람직하게는 2 ~ 500mg/kg, 특히, 3 ~ 300mg/kg의 범위로 할 수 있다.
본 발명에 따라 제조된 세포 영상 및 추적용 자성나노입자와 세포투과성 펩타이드를 결합시킨 세포투과성 펩타이드와 자성나노입자의 복합체에 의한 세포내 투과능과 고유 세포 특성에 미치는 여부를 확인한 결과, 세포 투과성 펩타이드와 자성나노입자의 복합체의 농도에 의존적으로 세포내 투과능이 증가하는 것으로 나타났고, hMSC(human mesenchymal stem cell)이 골아세포와 지방세포로 분화할 수 있는 능력에 미치는 영향이 없음을 세포를 각기 조건하에서 배양하여 염색한 결과 확인할 수 있었다. 또한, 모델 세포에서 두드러지게 나타나는 세포마커를 사용하여 자성나노입자와 세포 투과성 펩타이드의 복합체를 고농도로 처리하여도 고유의 세포특성은 변하지 않았음을 확인할 수 있었다.
또한, 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드와 자성나노입자의 복합체의 입자크기와 표면 전위를 측정한 결과, 치밀한 조직까지 영상진단이 가능한 입자 직경이 10~50nm로 고르게 분산되어 있는 것으로 나타났고, 양전하를 띈 아미노기와 세포 투과성 펩타이드가 차례로 결합되면서 높아지는 표면 전위를 확인하여 결합과정의 정확성을 나타내었다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
특히, 하기 실시예에서는 자성나노입자로 산화철 조영제인 페럼옥사이드(Ferumoxides) 만을 예시하였으나, 페릭 암모늄 사이트레이트(ferric ammonium citrate(FAC)), 산화철(Ferrum oxide), 초상자성 산화철 입자(SPIO), 당질-덱스트란 코팅된 산화철 나노입자(Carboxy-dextran coated iron oxide nanoparticle), 미세초상자성 산화철 입자(USPIO), 단일크리스탈린 산화철 나노입자(MION; Monocrystalline iron oxide nanoparticles), 다크리스탈린 산화철 나노입자(PION; polycrystalline iron oxide nanoparticles), 구강자성입자(OMP; oral magnetic particles) 등 세포 및 장기의 영상 진단용으로 사용할 경우에도 유사 또는 동일한 효과를 얻을 수 있다는 것은 당업자에게 자명하다 할 것이다.
실시예 1: 세포 투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자의 복합체 제조
1-1: 형광표지 자성나노입자의 제조
암모니아 하이드록사이드(ammonium hydroxide, sigma, USA) 0.5㎖과 5M 소디움 하이드록사이드(sodium hydroxide, sigma, USA) 10㎖과 3차 증류수 4㎖과 에피클로로하이드린(epichlorohydrin, sigma, USA) 4㎖에 음전하를 띄고 있는 덱스트란(dextran)으로 코팅되어 있는 자성나노입자(AMI(Cambridge, MA, USA)) 11.2㎎/㎖를 2㎖ 첨가하여 상온에서 24시간 반응시킨 다음, 3차 증류수(triple deionized water)로 투석하여 미반응된 암모니아 하이드록사이드(ammonium hydroxide)를 제거하였다. 미반응된 암모니아 하이드록사이드(ammonium hydroxide)가 제거된 상기 용액에 5mM 소디움 사이트레이트(sodium citrate)를 첨가하여 알칼리성이었던 환경을 중성으로 조절하고, 상기 용액을 투석막으로 한외여과막(MWCO 3,000)을 사용하여 농축 및 결합되지 않은 반응물을 제거시킨 다음, 여기에 N,N-디메틸포름아마이드(N,N-dimethylformamide, DMF) 120㎕에 용해시킨 형광물질인 FITC(fluorescein isothiocyanate) 3㎎ 또는 TRITC(tetramethylrhodamine isothiocyanate) 3㎎를 각각 혼합하여 25℃에서 교반하에 반응시켰다.
1-2: 세포 투과성 펩타이드-형광표지 자성나노입자 복합체 제조
SMCC 가교제(pierce biotechnology) 14㎎를 DMSO(dimethyl sulfoxide) 0.5㎖ 에 녹인 후, 여기에, 실시예 1-1에서 제조된 형광표지 자성나노입자 용액 6㎖를 차광시켜 상온에서 5시간 동안 교반시킨 다음, 알칼리성 인산 완충용액(PBS, pH 8)으로 한외여과를 2회 수행하였다. 한외여과시킨 상기 형광표지 자성나노입자 함유 용액 6㎖과 인산완충용액(PBS, 10X, pH 8.4) 1㎖에 5mM 농도로 용해된 세포 투과성 펩타이드인 저분자형 프로타민(low molecular weight protamine, LMWP(VSRRRRRRGGRRRR))을 차광시켜 상온에서 2시간 동안 교반시키고, 4℃에서 24시간 교반시켜 세포투과성 펩타이드인 저분자형 프로타민과 형광표지 자성나노입자를 결합시켰다. 결합된 상기 저분자형 프로타민과 형광표지 자성나노입자를 3차 증류수를 사용하여 2회 한외여과를 수행한 후, pH 측정 종이로 결합물의 pH를 확인하였다.
비교예 1: 일반 자성나노입자
음전하를 띄는 덱스트란으로 코팅된 자성나노입자AMI(Cambridge, MA, USA)를 구입하여 사용하였다.
비교예 2: 아미노기를 함유하는 자성나노입자 제조
아미노기를 함유하는 자성나노입자는 실시예 1-1과 동일한 조성 및 제조방법으로 제조하되, 형광물질을 첨가하는 단계를 제외시켰다.
실험예 1: 세포투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자의 복합체의 입자크기 및 분포양상 측정
실시예 1에서 제조된 세포 투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자의 복합체, 대조군으로 사용하기 위한 비교예 1의 자성나노입자 및 비교예 2의 아미노기를 함유하는 자성나노입자를 물에 각각 용해시킨 다음, 탄소가 코팅되어 있는 구리 그리드에 2㎎/㎖ 및 10㎕를 점적시킨 후, 20시간 동안을 자연 건조시켰다. 상기와 같이 건조된 각각의 입자의 크기와 물에서의 분산 정도를 80㎸의 전압하에서 투과전자현미경(transmission electron microscope, TEM, JEM-2000EXII, JEOL, JAPAN)의 250,000배율 및 500,000배율로 확대하여 관찰하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 세포투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자의 복합체(도 2의 (c) 및 (f))는 자성나노입자(도 2의 (a) 및 (d)) 및 아미노기를 함유하는 자성나노입자(도 2의 (b) 및 (e))와 유사하게 전체적으로 입자의 고른 분포도를 보였으며, 스케일 바(scale bar)에 대비하여 확인한 입자의 크기도 10㎚~35㎚로 3가지 군에서 비슷한 양상을 보였다. 이는 세포투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자의 복합체의 화학적 결합과정에서 입자크기와 분포양상에 큰 변화를 가져 오지 않으며, 자성나노입자의 50㎚ 미만 크기의 작고, 균일한 분포를 통해 형광지표 자성나노입자와 세포투과성 펩타이드의 복합체를 함유하는 조영제로서 이용 가능성을 확인한 것이라 할 수 있겠다.
실험예 2: 세포투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자의 복합체의 입자크기 및 표면 전위의 수치화 측정
상기 형광표지 자성나노입자와 투과기능성 펩타이드의 복합체의 입자 크기를 수치화하기 위해 입자크기 분석기(PSSNICOMP, US)를 사용하였다. 실시예 1에서 제조된 형광표지 자성나노입자와 세포투과성 펩타이드의 복합체, 비교예 1의 자성나노입자 및 비교예 2에서 제조된 아미노기를 함유하는 자성나노입자를 물에 용해시켜 2㎎/㎖의 농도로 유리 큐벳(cuvet)에 주입한 다음, 23℃로 632.8㎚ 파장에서 입자크기를 측정하였다.
또한, 형광표지 자성나노입자와 세포투과성 펩타이드의 복합체의 표면전위를 수치화하기 위하여, 제타전위(zeta potential) 측정장치(OTSUKA, JAPAN)를 사용하였다. 실시예 1에서 제조된 형광표지 자성나노입자와 세포투과성 펩타이드의 복합체, 비교예 1의 자성나노입자 및 비교예 2에서 제조된 아미노기를 함유하는 자성나노입자를 물에 용해시켜 2㎎/㎖의 농도로 기기로 주입한 다음, 입자 표면에서 나타나는 전위를 측정하였다.
그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이, 형광표지 자성나노입자와 투과성 펩타이드의 복합체는 대조군(비교예 1의 자성나노입자 및 비교예 2의 아미노기를 함유하는 자성나노입자)과 비교 시, 형광표지 자성나노입자와 투과성 펩타이드의 복합체의 입자의 크기가 26.8㎚로 자성나노입자의 입자크기인 20.4㎚와 아미노기를 함유하는 자성나노입자의 입자크기인 23.8㎚와 큰 차이가 없었으며, 50㎚ 미만으로 치밀한 조직까지 침투 가능한 크기로 분포하고 있는 것을 알 수 있었다. 또한, 입자의 표면전위는 비교예 1의 자성나노입자가 -51.54, 비교예 2의 아미노기를 함유하는 자성나노입자가 -10.72, 실시예 1의 형광표지 자성나노입자와 세포투과성 펩타 이드의 복합체가 16.97로 측정되었다. 이는 음전하를 가지는 덱스트란이 코팅된 자성나노입자가 양전하를 띄는 아미노기와 세포투과성 펩타이드인 LMWP를 결합시킴에 따라, 표면 전위가 양전하로 변하는 것을 확인할 수 있었고, 자성나노입자-LMWP 복합체를 만드는 과정의 정확도를 판단할 수 있었다.
[표 1] 입자크기와 표면전위 측정
| 구분 | 입자크기(nm) | 제타 포텐셜(mV) |
| 자성나노입자(ferumoxides) | 20.4 | -51.54 |
| 아미노기를 함유 자성나노입자 (ferumoxides-NH2) | 23.8 | -10.72 |
| 형광표지 자성나노입자-세포투과성 펩타이드 복합체 (ferumoxides-NH2-LMWP) | 26.8 | 16.97 |
실험예 3: 세포투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자의 복합체의 생체 외(
in vitro
) 세포 투과능 측정
3-1: 세포투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자의 복합체의 세포 투과능 측정
세포투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자의 복합체의 세포투과 정도를 측정하기 위하여, 챔버 슬라이드(4-well chamber slide)에 hMSC(human Mesenchymal Stem cell)을 1×104개씩 분주한 다음, 일반 배지에서 20시간 배양(overnight incubation) 한 후에, 우태혈청(FBS, Fetal Bovine Serum)이 포함하지 않은 DMEM 배지에 실시예 1에서 제조된 형광표지 자성나노입자와 세포 투과성 펩타이드의 복합체의 농도를 0㎍, 36㎍ 및 108㎍로 달리하여 각 웰(well)에 주입시키고, 주입 1시간 후에 인산 완충용액(PBS)으로 2회 세척하여 고정시킨 다음, 핵을 염색하는 염 료(Hoechst 33342, blue)로 처리하여 투과기능성 펩타이드가 고정화된 자성나노입자의 세포 투과능을 공초점 주사전자 현미경(confocal scanning microscope, IX 70, Olympus Co., Tokyo, Japan)로 관찰하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 형광염료(FITC, 녹색)가 결합되어 제조된 실시예 1의 세포투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자의 복합체의 농도를 각각 0㎍, 36㎍ 및 108㎍을 처리해 주었을 때, 도 3의 (b)에 나타낸 36㎍ 농도의 세포투과성와 형광표지 자성나노입자의 복합체와 도 3의 (c)에 나타낸 108㎍ 농도의 세포투과성와 형광표지 자성나노입자의 복합체는 형광의 입자가 세포질 및 핵 내에서 관찰되어 세포투과성와 형광표지 자성나노입자의 복합체가 농도 의존적으로 세포 투과능이 증가함을 관찰할 수 있었고, 자성나노입자가 투과기능성 펩타이드의 고유 전달능에 영향을 주지 않는 것으로 확인되었다.
3-2: 산화철 염색법을 이용한 자성나노입자와 투과기능성 펩타이드의 복합체의 세포 내 투과능 측정
형광표지 자성나노입자와 투과기능성 펩타이드의 복합체의 세포 내 투과 정도를 확인하기 위하여, hMSC(human Mesenchymal Stem cell)을 6-웰(well)에 배양한 후, 프루시안 블루 염색(prussian blue staining, Perl's reagent staining)을 하기 전 배지에 실시예 1에서 제조된 형광표지 자성나노입자와 투과성 펩타이드의 복합체의 농도를 0㎍, 36㎍ 및 108㎍로 달리하여 각각 주입시킨 다음, 20시간 배양(overnight incubation)하였다. 배양 완료 후, 0.25% 트립신(trypsin)을 사용하 여 세포를 웰(well)로부터 분리시키고, 상기 세포를 사이토스핀 슬라이드(cytospin slide)로 2×105개씩 분주하였다. 분주된 상기 세포를 10% NBF(neutral buffered formalin)으로 고정시킨 후에, 인산 완충용액(PBS)으로 2번 세척하고, 2% Perl's reagent를 이용하여 세포 안으로 들어간 산화철 분자를 파란 색으로 염색시킨 다음, Nuclear fast red를 통해 세포를 빨간 색으로 염색시키고, 마운팅(mounting)후에 투과기능성 펩타이드가 고정화된 자성나노입자의 세포 내 전달능을 광학현미경(Optical microscope, CKX41, Olympus Co., Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 도 4의 (b)에 나타낸 36㎍ 농도의 세포투과성와 형광표지 자성나노입자의 복합체와 도 4의 (c)에 나타낸 108㎍ 농도의 세포투과성와 형광표지 자성나노입자의 복합체는 자성나노입자가 세포내에서 염색(blue)된 것을 확인할 수 있었고, 세포투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자의 복합체의 농도가 증가할수록 자성나노입자의 세포 내 전달능이 증가함을 확인할 수 있었다.
3-3: 유체 세포 측정법(flow cytometry)을 이용한 세포투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자의 복합체의 세포 투과능 측정
상기 세포투과성와 형광표지 자성나노입자의 복합체의 세포투과 정도를 정량적으로 확인하기 위하여, 6-웰(well)에 hMSC(human Mesenchymal Stem cell)을 1×105개씩 분주한 다음, 일반 배지에서 20시간 동안 배양(overnight incubation)하였 다. 우태혈청(FBS, Fetal Bovine Serum)을 포함하지 않은 DMEM 배지에 형광염료(FITC)를 결합시켜 제조한 실시예 1의 자성나노입자와 세포투과성 펩타이드의 복합체의 농도를 0㎍, 36㎍ 및 108㎍로 달리하여 각 웰(well)에 주입하였다. 주입 1시간 후에 인산완충용액(PBS)으로 2회 세척한 후, 0.25% 트립신(trypsin)을 사용하여 세포를 웰(well)로부터 분리하고, 인산완충용액(PBS)으로 세척 다음, 원심 분리하여 상층액을 제거하는 과정을 2회 반복하여 세포 밖의 형광염료를 제거하였다. 여기에, 1㎖의 인산 완충용액(PBS)를 첨가하여, 세포를 부유시킨 다음, FACSCalibur(BD, USA)를 사용하여 FL-1(488nm)에서 실시예 1에서 제조된 세포투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자의 복합체의 세포 전달능을 관찰하였다.
그 결과, 도 5에서 나타난 바와 같이, 도 5의 (b)에 나타낸 36㎍ 농도의 세포투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자의 복합체와 도 5의 (c)에 나타낸 108㎍ 농도의 세포투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자의 복합체는 각 처리물질의 농도가 증가함에 따라 형광입자가 포함된 세포가 증가하여 세포 투과성 펩타이드의 농도가 증가할수록 세포투과 능력도 비례적으로 증가함을 알 수 있었다.
실험예 4: 세포투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자의 복합체의 생체 외(
in vitro
)에서 중간엽 줄기세포 분화능에 미치는 영향
4-1: 세포투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자의 복합체의 생체 외(
in vitro
)에서 골아세포 분화능에 미치는 영향
상기 세포투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자의 복합체가 세포 분화능 에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 챔버 슬라이드(4-well chamber slide)에 hMSC(human Mesenchymal Stem cell)를 5×103개씩 분주한 다음, 세포의 안정화를 위해 일반 배지에서 20시간 동안 배양(overnight incubation)하였다. 형광염료(TRITC, red)가 결합되어 제조된 실시에 1의 세포투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자의 복합체의 농도를 0㎍, 36㎍ 및 108㎍로 달리하여 각 웰(well)에 주입한 다음, 24시간 동안 배양하였다. 배양완료 후, calcein(칼세인; 칼슘염색, green)이 함유된 경조직 형성 배지에서 다시 14일 동안 배양하였다. 상기 경조직 형성 배지의 조성은 alpha MEM 배지에 우태혈청(FBS, Fetal Bovine Serum) 15%, L-ascorbic acid 50㎎/㎖, dexamethasone 10-7M, antibiotic-antimycotic solution 1%, beta-glycerol phosphate 10mM 이다. 배양완료 후에 상기 배지를 걷어낸 다음, 인산 완충용액(PBS)으로 2회 세척하였다. 인산 완충용액으로 세척된 상기 세포를 10% NBF(neutral buffered formalin)으로 고정시키고, 핵(Hoechst 33342, blue)을 염색한 다음, 세포투과성 펩타이드가 고정된 자성나노입자의 골아세포로의 분화관여 여부를 공초점 주사형광 현미경(confocal scanning microscope, IX 70, Olympus Co., Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 도 6의 (b)에 나타낸 36㎍ 농도의 세포투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자의 복합체와 도 6의 (c)에 나타낸 108㎍ 농도의 세포투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자의 복합체는 세포투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자의 복합체로 처리하지 않은 군에 비하여 calcein 염 색이 유사하게 고른 분포를 보였고, 빨간색으로 세포 내 염색이 일어남에 따라, 이는 형광표지 자성나노입자와 세포 투과성 펩타이드의 복합체가 세포 내로 투과하였지만 모델 세포의 골아세포 분화능에는 고농도(108㎍)로 처리하여도 영향이 없는 것을 알 수 있었다.
4-2: 세포투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자 복합체의 생체 외(
in vitro
)에서 중간엽 줄기세포 지방세포 분화능에 미치는 영향
hMSC(human Mesenchymal Stem cell)를 6-웰(well)에 1×105개씩 분주한 후, 20시간 동안 배양(overnight incubation)하여 세포를 안정화시키고, 실시예 1에서 제조된 세포투과성-형광표지 자성나노입자 복합체의 농도를 0㎍, 36㎍ 및 108㎍로 달리하여 각 웰(well)에 주입하여 24시간 동안 배양시킨 후, 지질 대사에 관여하는 호르몬인 인슐린(insulin)과 지방산의 일종인 아라키도닉 에시드(arachidonic acid)의 합성을 촉진하는 물질인 인도메타신(indomethacin)이 포함된 지방세포 분화유도 배지에서 3일 동안 배양한 다음, 인슐린(insulin)을 제외한 배지보충제(medium supplement)가 포함되지 않은 유지(maintenance) 배지에서 2일 배양하는 것을 3회 반복한 후에 7일은 유지(maintenance) 배지에서 배양 및 분화를 유도하였다. 분화유도된 상기 세포는 10% NBF(neutral buffered formalin)으로 고정시킨 다음, 60% 아이소프로판올(isopropanol)로 세척하고 완전하게 건조시켜, oil red O solution(sigma, red)으로 지방(fat)을 염색시키고, 물(H2O)로 웰(well)을 세척하여 세포투과성 펩타이드가 고정화된 자성나노입자의 지방세포로의 분화관여 여부를 광학 현미경(Optical microscope)으로 관찰하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 도 7의 (b)에 나타낸 36㎍ 농도의 세포투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자의 복합체와 도 7의 (c)에 나타낸 108㎍ 농도의 세포투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자의 복합체는 도 7의 (a)에 나타낸 세포투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자의 복합체를 주입하지 않은 군(0㎍)과 동일하게 지방 세포분화 양상을 보여주는 oil red O의 염색정도(red)를 나타내었다. 이는 처리한 세포투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자의 복합체가 고농도인 108㎍를 처리하였을 때도 지방세포 분화과정에 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다.
실험예 5: 세포투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자 복합체의 중간엽 줄기세포 고유 특성에 미치는 영향
5-1: 세포투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자 복합체의 중간엽 줄기세포 고유 특성에 미치는 영향의 수치화
상기 세포투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자의 복합체가 중간엽 줄기세포의 고유 특성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, hMSC(human Mesenchymal Stem cell)에서 두드러지게 발현되는 CHEMICON(USA)사에서 구입한 Mouse Anti-Human Endoglin(CD 105) 단일클론항체와 Mouse Anti-STRO-1 단일클론항체를 1차 항체로 사용하였고 동일한 회사에서 구입한 Goat Anti-Mouse IgG (H&L) Fluorescein conjugated affinity purified 2차 항체로 사용하였다(Puchuantes, S. et al., Tissue Antigens, 50:6, 1997). 웰(well)에 hMSC(human Mesenchymal Stem cell)을 1×106개씩 분주한 후, 일반 배지에서 20시간 동안 배양한 다음, 우태혈청(FBS, Fetal Bovine Serum)을 포함하지 않은 DMEM 배지에 실시예 1에서 제조된 세포투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자의 복합체 36㎍/㎖를 각 웰(well)에 주입시키고, 30분, 1시간, 4시간 후에 각각 인산 완충용액(PBS)으로 2회 세척한 다음, 0.25% 트립신(trypsin)을 사용하여 세포를 웰(well)로부터 분리시키고, 인산 완충용액(PBS)으로 세척하였다. 세척된 상기 세포를 원심 분리하여 상층액을 제거하는 과정을 2회 반복하여 세포밖의 입자를 제거시킨 다음, 여기에 1차 항체인 Endoglin(CD 105) 및 STRO-1을 1:25의 비율로 0.5% 송아지혈청-알부민(BSA)을 첨가한 다음, 여기에 인산 완충용액(PBS)에 혼합하고, 4℃에서 20시간 동안 흔들어 반응시켰다. 반응시킨 상기 용액에 0.5% 송아지혈청-알부민(BSA)을 넣은 인산 완충용액(PBS)으로 세척한 다음, 원심 분리하여 상층액을 제거하고, 여기에, 2차 항체를 1:50의 비율로 0.5% 송아지혈청-알부민(BSA)을 넣은 인산 완충용액(PBS)에 혼합 후에, 상온에서 1시간 흔들어 반응시켰다. 반응 후, 300㎕ 인산 완충용액(PBS)에 세포를 부유시켜 FACSCalibur(BD, USA)를 사용하여 FL-1(488nm)에서 세포투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자의 복합체의 세포 전달능을 관찰하였다.
그 결과, 도 8a에 나타난 바와 같이, 형광염료(FITC, green)가 결합된 hMSC(human Mesenchymal Stem cell)마커, STRO-1 및 Endoglin(CD 105)을 자성나노 입자와 세포투과성 펩타이드의 복합체가 레이블(label)된 모델세포에 대하여 반응시킨 결과, 양성 대조군(positive control)에 대해서 형광 정도를 수치화한 결과가 각기 유사하게 관찰되었다. 이는 제조된 세포투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자의 복합체가 모델세포인 hMSC(human Mesenchymal Stem cell) 고유의 특성에 영향을 주지 않는 것을 보여 주는 결과이며, 본 발명에 따른 세포투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자의 복합체는 세포 영상용으로 사용시 세포독성이 없음을 간접적으로 알 수 있었다.
5-2: 세포투과성
펩타이드와
형광표지 자성나노입자 복합체의
중간엽
줄기세포 고유 특성에 미치는 영향의 가시화
상기 세포투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자의 복합체가 중간엽 줄기세포의 고유 특성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 챔버 슬라이드(4-well chamber slide)에 hMSC(human Mesenchymal Stem cell)를 5×103개씩 분주한 다음, 세포의 안정화를 위하여 일반 배지에서 20시간 동안 배양(overnight incubation)하였다. 여기에, 우태혈청(FBS, Fetal Bovine Serum)을 포함하지 않은 DMEM 배지에서 제조한 자성나노입자와 세포투과성 펩타이드 복합체 36㎍/㎖를 각 웰(well)에 주입한 다음, 30분, 1시간, 4시간 후에 인산완충용액(PBS)으로 세척시켜, 10% NBF(neutral buffered formalin)으로 고정시키고, 핵(Hoechst 33342, blue)을 염색한 후에 1차 항체인 Endoglin(CD 105) 및 STRO-1을 1:25의 비율로 0.5% 송아지혈청 -알부민(BSA)을 넣은 인산 완충용액(PBS)에 혼합한 다음, 4℃에서 20시간 동안 (overnight) 흔들어 반응시켰다. 반응시킨 상기 용액에 0.5% 송아지혈청-알부민(BSA)을 넣은 인산 완충용액(PBS)으로 세척 다음, 2차 항체를 1:50의 비율로 0.5% 송아지혈청-알부민(BSA)을 넣은 인산 완충용액(PBS)에 혼합한 후에, 상온에서 1시간 흔들어 반응시켰다. 반응시킨 상기 용액을 인산 완충용액(PBS)으로 세척시킨 다음, 마운팅(mounting)하여 공초점 주사형광 현미경(Confocal scanning microscope)으로 결과를 관찰하였다.
그 결과, 도 8b에 나타난 바와 같이, 형광염료(FITC, green)가 결합된 hMSC(human Mesenchymal Stem cell) 마커, STRO-1 및 Endoglin(CD 105)을 자성나노입자와 세포투과성 펩타이드의 복합체가 레이블(label)된 모델세포에 대하여 반응시킨 후, 양성 대조군(positive control)에 대해서 형광 정도를 수치화한 결과가 각기 유사하게 관찰되었다. 이는 제조된 형광표지 자성나노입자와 세포투과성의 펩타이드 복합체가 모델세포인 hMSC(human Mesenchymal Stem cell) 고유의 특성에 영향을 주지 않는 것을 확인함에 따라, 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자의 복합체는 세포 영상용으로 사용시 세포독성이 없음을 간접적으로 알 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따 라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 형광표지 자성나노입자-세포 투과성 펩타이드 복합체의 제조방법을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 형광표지 자성나노입자-세포 투과성 펩타이드 복합체, 자성나노입자 및 아미노기가 함유된 자성나노입자가 물에 분산된 정도를 측정한 투과전자현미경(transmission electron microscope, TEM) 사진으로, (a) 및 (d)는 물에 분산된 자성나노입자를 250,000배율 및 500,000배율로 관찰한 사진이고, (b) 및 (e)는 물에 분산된 아미노기가 함유된 자성나노입자를 250,000배율 및 500,000배율로 관찰한 사진이며, (c) 및 (f)는 물에 분산된 형광표지 자성나노입자-세포 투과성 펩타이드 복합체를 250,000배율 및 500,000배율로 관찰한 이미지이다.
도 3은 본 발명에 따른 형광표지 자성나노입자-세포 투과성 펩타이드 복합체의 농도에 따른 세포내 투과능을 측정한 공초점 주사전자 현미경(confocal scanning microscope) 사진으로, (a)는 형광표지 자성나노입자-세포 투과성 펩타이드 복합체가 0㎍인 경우이고, (b)는 형광표지 자성나노입자-세포 투과성 펩타이드 복합체가 36㎍인 경우이며, (c)는 형광표지 자성나노입자-세포 투과성 펩타이드 복합체가 108㎍인 경우이다.
도 4는 본 발명에 따른 형광표지 자성나노입자-세포 투과성 펩타이드 복합체의 농도에 따른 세포내 투과능을 측정한 광학 현미경(Optical microscope) 사진으로, (a)는 형광표지 자성나노입자-세포투과성 펩타이드 복합체가 0㎍인 경우이고, (b)는 형광표지 자성나노입자-세포투과성 펩타이드 복합체가 36㎍인 경우이며, (c)는 형광표지 자성나노입자-세포투과성 펩타이드 복합체가 108㎍인 경우이다.
도 5는 본 발명에 따른 형광표지 자성나노입자-세포투과성 펩타이드 복합체의 농도에 따른 세포내 투과능을 유체세포 측정법을 이용하여 측정한 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따른 형광표지 자성나노입자-세포 투과성 펩타이드 복합체의 농도에 따른 골아세포의 분화과정을 측정한 공초점 주사형광 현미경(confocal scanning microscope) 사진으로, (a)는 형광표지 자성나노입자-세포투과성 펩타이드 복합체가 0㎍인 경우이고, (b)는 형광표지 자성나노입자-세포투과성 펩타이드 복합체가 36㎍인 경우이며, (c)는 형광표지 자성나노입자-세포투과성 펩타이드 복합체가 108㎍인 경우이다.
도 7은 본 발명에 따른 형광표지 자성나노입자-세포 투과성 펩타이드 복합체의 농도에 따른 지방세포 분화과정을 측정한 광학 현미경(Optical microscope) 사진으로, (a)는 형광표지 자성나노입자-세포투과성 펩타이드 복합체가 0㎍인 경우이고, (b)는 형광표지 자성나노입자-세포투과성 펩타이드 복합체가 36㎍인 경우이며, (c)는 형광표지 자성나노입자-세포투과성 펩타이드 복합체가 108㎍인 경우이다.
도 8은 본 발명에 따른 형광표지 자성나노입자-세포 투과성 펩타이드 복합체가 중간엽 줄기세포에 미치는 영향을 측정한 것으로, (a)는 중간엽 줄기세포에 대한 형광표지 항원인 STRO-1 및 CD105가 결합된 모델세포를 유체세포측정법에 의해 측정된 그래프이고, (b)는 중간엽 줄기세포에 대한 형광표지 항원인 STRO-1이 결합된 모델세포를 공초점 주사형광 현미경으로 측정한 사진이다.
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nanoparticulates and use thereof
<130> P07-B208
<160> 3
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> LMWP(low molecular weight protamine)
<400> 1
Val Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> TAT(TAT from protein transduction domain of HIV protein)
<400> 2
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> penetratin
<400> 3
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1 5 10 15
Claims (12)
- 다음 단계를 포함하는 세포투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자의 복합체를 제조하는 방법:(a) 자성나노입자의 표면을 아미노기로 개질시켜 아미노기를 함유하는 자성나노입자를 제조하는 단계;(b) 상기 제조된 아미노기를 함유하는 자성나노입자에 형광물질을 혼합하여 형광표지 자성나노입자를 제조하는 단계; 및(c) 상기 제조된 형광표지 자성나노입자에 저분자형 프로타민(LMWP, 서열번호 1 : VSRRRRRRGGRRRR) 및 페너트라틴(penetratin, 서열번호 3 : RQIKIWFQNRRMKWKK)으로 구성된 군에서 선택되는 세포투과성 펩타이드를 결합시켜 세포투과성 펩타이드와 자성나노입자의 복합체(직경:10nm~35nm)를 제조하는 단계.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 자성나노입자는 페릭 암모늄 사이트레이트(ferric ammonium citrate, FAC), 산화철(ferrum oxide), 초상자성 산화철 입자(SPIO), 당질-덱스트란 코팅된 산화철 나노입자(carboxy-dextran coated iron oxide nanoparticle), 미세초상자성 산화철 입자(USPIO), 단일크리스탈린 산화철 나노입자(MION; monocrystalline iron oxide nanoparticles), 다크리스탈린 산화철 나노입자(PION; polycrystalline iron oxide nanoparticles) 및 구강자성입자(OMP; oral magnetic particles)로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 결합은 가교제를 통해 이루어지는 것을 특 징으로 하는 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 가교제는 1,4-비스-말레이미도부탄(1,4-bis-maleimidobutane, BMB), 1,11-비스-말레이미도테트라에틸렌글리콜(1,11-bis-maleimidotetraethyleneglycol, BM[PEO]4), 1-에틸-3-[3-디메틸 아미노프로필] 카보디이미드 하이드로클로라이드(1-ethyl-3-[3-dimethyl aminopropyl] carbodiimide hydrochloride, EDC), 숙시이미딜-4-[N-말레이미도메틸시클로헥산-1-카복시-[6-아미도카프로에이트]](succinimidyl-4-[N-maleimidomethylcyclohexane-1-carboxy-[6-amidocaproate]], SMCC) 및 그의 설폰화염(sulfo-SMCC), 숙시이미딜 6-[3-(2-피리딜디티오)-로피오나미도] 헥사노에이트](succimidyl 6-[3-(2-pyridyldithio)-ropionamido] hexanoate, SPDP) 및 그의 설폰화염(sulfo-SPDP), m-말레이미도벤조일-N-하이드로시숙시이미드 에스터(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester, MBS) 및 그의 설폰화염(sulfo-MBS), 숙시이미딜[4-(p-말레이미도페닐) 부틸레이트](succimidyl[4-(p-maleimidophenyl) butyrate], SMPB) 및 그의 설폰화염(sulfo-SMPB)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 형광물질은 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate, FITC) 또는 테트라메틸로다민 이소티오시아네이 트(tetramethylrhodamine isothiocyanate, TRITC), 알렉사플루오르(Alexa Fluor), 로다민 레드-X(Rhodamine Red-X), 텍사스 레드(texas red), 테트라메틸로드아민(tetramethylrhodamine), 캐스캐이드 블루(cascade blue), DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole), 쿠마린(coumarine), 루시퍼 옐로우(lucifer yellow) 및 단실아마이드(dansylaminde)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 표면 개질은 암모늄 하이드록사이드(ammonium hydroxide), 에탄올(ethanol), 아미노프로필 트리메틸실란(aminopropyl trimethylsilane, APTMS), N-(3-디메틸프로필)-N-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드(N-(3-dimethylpropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC), N-하이드록시술포숙신이미드(N-hydroxysulfosuccinimide, sulfo-NHS) 및 N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide, NHS)로 구성된 군에서 선택되는 것으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 제조된 아미노기를 함유하는 자성나노입자를 소디움 사이트레이트(sodium citrate)로 투석하여 pH를 중성으로 조절하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제10항의 방법 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조되고, 형광표지 자성나노입자에 세포투과성 펩타이드가 결합되어 있는, 직경이 10nm ~ 35nm인 복합체.
- 제11항의 형광표지 자성나노입자에 세포투과성 펩타이드가 결합되어 있는 복합체를 함유하는 세포 영상용 조성물.
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