KR101208587B1 - 하이드록시클로로퀸을 포함하는 항암 치료를 위한 국소 투여용 주사제 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 하이드록시클로로퀸(hydroxychloroquine)을 포함하는 항암 치료를 위한 국소 투여용 주사제 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 항암제 조성물은 in vitro에서 MTT assay를 통한 sarcoma 180에 대한 IC₅₀ 값이 시스플라틴에 비하여 10배 정도 낮은 값을 보여 우수한 세포독성 효과를 가지며, 또한 in vivo에서도 sarcoma 80에 의해 유발된 고형암에 대하여 용량 의존적 효과를 나타낼 뿐 아니라, sarcoma 80에 의해 유발된 복수암에 대하여 수명 연장 효과가 있다.

하이드록시클로로퀸, 항암제, 국소투여용, 주사제.

Description

하이드록시클로로퀸을 포함하는 항암 치료를 위한 국소 투여용 주사제 조성물{ANTICANCER COMPOSITION FOR LOCAL INJECTION COMPRISING HYDROXYCHLOROQUINE}

본 발명은 하이드록시클로로퀸(hydroxychloroquine)을 포함하는 항암제 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 하이드록시클로르퀸을 주성분으로 하는 국소 투여용 주사제 조성물로서 암세포에 직접 주사하여 항암효과를 얻는 제제에 관한 것이다.

종양은 세포가 무한히 증식해 정상적인 세포의 기능을 방해하는 질병으로, 병리조직학적 임상학적 판단 기준에 따라 악성 종양과 양성 종양으로 분리하며 흔히 말하는 암은 악성 종양에 속한다.

암은 국내 사망원인 1위를 차지하고 있으며 세계적으로도 사망원인의 우위를 차지하고 있다. 암은 그 발생원인이나 치료방법이 아직까지 명확하게 밝혀지지 않고 있으며, 현재까지 개발된 치료제는 임상적으로 사용할 때 치명적인 부작용, 내성 발현, 임파구 및 골수파괴 등의 문제점을 나타내고 있다. 따라서, 정상세포에는 활성을 나타내지 않고 암세포에만 세포독성을 갖는 새로운 항암제의 개발이 시급한 실정이다.

현재 인체 내에서 발생하는 암은 약 270여 종으로 이를 연구하기 위한 세포주로는 육종(Sarcoma-180), 흑색종(melanoma), 선종(adenoma), 선암(adeno-carcinoma), 에를리히 복수종양(Ehrlich ascites tumor) 및 워커 암(Walker carcinoma) 등이 보고되어 있다. 이 중 Sarcoma-180은 백색 웅성 마우스의 액와암에서 유래한 육종화된 종양으로, 복수암으로 계대하여 보존시켜 고형과 복수형으로 서로 용이하게 이행할 수 있고 이식 시에는 종간 특이성이 없는 것으로 알려져 있다.

한편, 하이드록시클로로퀸(hydroxychloroquine)은 현재 류마티스 관절염, 원판성 및 전신홍반 루푸스, 광과민성 피부질환의 치료제, 그리고 말라리아의 치료와 예방에 사용되고 있으며, 최근에는 신손상 억제 및 안전신경교종의 연구 등이 보고되었다.

대한민국 특허등록 제10-0390332호에서는 항말라리아제로서 흔히 사용되는 하이드록시클로로퀸, 클로로퀸, 프리마퀸 등을 항암제인 독소루비신, 시스플라틴 등과 병용 투여하는 것에 의해 항암제의 최소 유효농도(IC₅₀)를 낮추고 항암제에 의한 암세포의 약제 내성을 억제할 수 있는 항암제 복합 조성물을 개시하고 있다. 여기에서는 하이드록시클로로퀸 등의 항말라리아제가 항암제의 내성을 억제하여 항암 효과를 상승시키기 위한 보조제로서 사용되고 있으며, 경구, 비경구 등 항암제의 투여 경로에 따른 전신적 투여에 의하여 효과를 나타낸다.

즉, 현재까지 하이드록시클로로퀸이 항암제의 주성분으로 사용된 예는 알려진 바가 없으며, 다만 Biochemical Pharmacology. vol. 68, pp. 1729-1738(2004년 공개)에 하이드록시클로로퀸이 유방암 세포주인 MCF-7의 세포분화를 유도하여 암세포의 증식을 억제한다는 내용과 Oncogene. vol. 22, pp. 3927-3936(2003년 공개)와 British Journal of Haematology. vol. 112, pp. 344-352(2001년 공개)에 하이드록시클로로퀸이 백혈병 암세포주에서 세포자멸사(apoptosis)를 유도하여 암세포의 성장을 억제하는 효과가 있다는 내용이 알려져 있으나, 하이드록시클로로퀸을 항암제의 주성분으로 제제화하여 사용된 사례는 밝혀진 바가 없었다.

본 발명은 하이드록시클로로퀸을 국소 투여용 항암제로 사용하기 위한 것으로, 특히 정상세포에는 활성을 나타내지 않고 암세포에만 세포독성을 갖는 항암제 조성물을 암세포에 직접 주사 또는 주입하기 위한 국소 투여용 항암제 조성물을 제공하기 위한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는 하이드록시클로로퀸(hydroxychloroquine) 또는 이의 염을 포함하는 항암 치료를 위한 국소 투여용 주사제 조성물을 제공한다.

본 발명의 항암제 조성물은 암세포에 직접 주사 또는 주입할 수 있으며, 리도카인과 같은 국소마취제 및/또는 리보플라빈과 같은 항산화제를 추가로 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명은 하이드록시클로로퀸을 주성분으로 하는 조성물을 암세포에 직접 주사 또는 주입하는 국소 투여에 의해 항암 효과를 발휘하도록 한 것이다. 하이드록시클로로퀸을 함유하는 국소 투여용 조성물을 환부에 직접 투여하여 국소 조직을 경화시킴으로써 대사를 차단하게 된다. 암세포는 정상 세포에 비해서 대사가 신속하게 이루어지므로, 하이드록시클로로퀸에 의해 대사가 차단되면 조직이 불활성화되고 결과적으로 조직의 괴사가 일어나게 되는 것이다.

본 발명의 조성물에서 하이드록시클로로퀸의 함량은 5～25 %(w/v)인 것이 바 람직하고, 20～25 %(w/v)가 더욱 바람직하다. 하이드록시클로로퀸이 함량이 5 %(w/v) 보다 낮으면 치료 효과를 기대하기 어렵고, 25 %(w/v) 보다 높으면 암세포 주변 정상 조직의 괴사가 함께 일어나게 된다는 부작용이 있어 바람직하지 않다.

본 발명에 따른 국소 투여용 주사제 조성물에서 국소마취제는 암세포에 주사로 직접 투여시 통증 제거 목적으로 사용되며, 바람직하게는 리도카인을 1～2 %(w/v)의 농도로 사용한다. 또한, 항산화제는 제제 안정성을 위해 배합되며, 바람직하게는 리보플라빈을 0.1～0.5 %(w/v)의 농도로 사용한다.

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본 발명에 따른 항암 치료를 위한 국소 투여용 주사제 조성물은 통상의 주사제 제조방법에 따라 제조할 수 있다.

본 발명의 항암 치료를 위한 국소 투여용 주사제 조성물은, 바람직하게는 암세포에 직접 주사 또는 주입하는데, 환자의 상태에 따라 3～4일 간격으로 수 주간 반복 투여할 수 있으며, 암세포의 크기와 진행 상태에 따라 1～2일 간격을 두고 반복투여 함으로써 암세포의 증식을 억제하고 세포대사를 억제하여 빠른 시일에 암세포를 경화 불활성화 시킬 수 있을 것으로 사료된다.

본 발명에 따른 하이드록시클로로퀸을 포함하는 국소 투여용 주사제 조성물 은 in vitro에서 MTT assay를 통한 sarcoma 180에 대한 IC₅₀ 값이 시스플라틴에 비하여 10배 정도 낮은 값을 보여 우수한 세포독성 효과를 가지며, 또한 in vivo에서도 sarcoma 80에 의해 유발된 고형암에 대하여 용량 의존적 효과를 나타낼 뿐 아니라, sarcoma 80에 의해 유발된 복수암에 대하여 수명 연장 효과가 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실험 방법

(1) 투여 약물

실험에 사용하는 본 발명의 항암제 조성물은 암세포에 직접 주사 또는 주입하는 국소 투여용 제제로 제조하였다. 구체적으로, 주사용 생리식염수에 하이드록시클로로퀸을 20 %(w/v) 농도로 첨가하고 용해 보조제로 20% 에탄올을 조제용량의 10~20 %로 가하여 수욕상에서 가온 용해한 후, 리도카인을 2 %(w/v), 리보플라빈을 0,1 %(w/v) 농도로 첨가하여 제조하였다.

양성 대조약으로 사용한 시스플라틴(cisplatin)은 sigma co(USA)에서 구입하여 사용하였다.

(2) 암세포주

본 실시예에서 사용한 암세포주는 Sarcoma 180(KCLB 4066)으로 한국세포주은행에서 분양 받은 것이다.

세포주에 대한 세포배양 배지로는 10% fetal bovine serum(FBS)이 첨가된 RPMI 1640 배지를 사용하였으며, 여기에 스트렙토마이신(100 ㎕/㎖)과 페니실린(100 ㎕/㎖)을 첨가하였다.

Sarcoma 180 세포주의 배양은 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 48시간 계대배양하여 실험에 사용하였다.

동물 실험을 위해서, Sarcoma 180 세포주를 ICR 마우스 복강 내에 2×10⁷ cells/㎖ 농도로 주입하고 약 2주 후 얻어진 복수를 채취하여 2000 rpm에서 원심 분리한 침전액을 2회 반복하여 세척한 후 0.4% 트립신 블루로 염색하여 2×10⁷ cells/㎖이 되도록 제조하였다.

(3) 실험동물

생후 5주령의 ICR계 실험용 마우스를 구입하여 일 주일 동안 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 동물의 사육조건은 실내온도 22±2℃, 상대습도 50%로 유지하며 12시간 주기로 낮과 밤을 조절하여 조명을 실시하였다.

효과시험예 1. Sarcoma 180에서의 세포독성 측정

본 발명의 조성물이 세포독성에 미치는 영향을 평가하기 위해서 MTT assay를 이용하였다. MTT assay는 세포의 생존율을 측정하기 위한 실험실 시험법으로써 표준 비색분석법(standard colorimetric assay)이라고 할 수 있다. 세포의 증식과 살아있는 세포를 정확하게 측정할 수 있는 기법인 MTT assay는 생명과학 분야, 특히 종양 생물학에서 필수적인 기법중의 하나이다. 새로운 항암제 개발을 위한 효능 검 색이나 기존에 개발된 항암제의 감수성을 알아보기 위하여 동물실험 등 생체에 적용하기 이전에, 생체외에서 약물이 종양세포의 성장을 억제하는 것을 객관적으로 증명하는 과정이 선행되어야 한다.

1×10⁵ cells/㎖로 희석된 sarcoma 180 세포주를 96-웰 플레이트의 각 플레이트에 첨가하고 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ incubator에서 균주를 배양하였다. 24시간 배양 후 본 발명 조성물의 농도를 1.0 ㎕에서 0 ㎕까지 총 8가지 농도로 희석하여 각 웰에 첨가하고 시스플라틴도 동일한 방법으로 희석하여 웰에 첨가하였다.

이후 다시 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간 동안 배양하고 2㎎/㎖ MTT 시약 50 ㎕를 가한 후 37℃ 배양기에서 4시간 동안 방치하였다.

원심분리기를 이용하여 상등액을 제거하고 DMSO 200 ㎕씩을 각 웰에 가해 MTT 염색침전물을 녹인 후 ELISA 판독기로 540 ㎚ 파장에서 OD₅₄₀ 값을 측정하였다.

50% 억제농도(IC₅₀)는 생존율이 50%가 되도록 하는 약물의 농도로 정의하였으며 IC₅₀ 값을 항암효과의 지표로 사용하였다.

도 1은 MTT assay에 의한 sarcoma 180 세포주의 성장에 미치는 본 발명 조성물의 효과를 대조약물과 비교하여 보여주는 그래프이다.

도 1에서 보듯이, 2×10⁷ cell/㎖ 농도로 sarcoma 180 세포주 부유액을 접종 후 대조 약물인 시스플라틴과의 항암력을 비교한 결과, 시스플라틴의 IC₅₀ 값은 0.1 ㎍/㎖에서 나타났으며, 본 발명 조성물의 IC₅₀ 값은 0.01 ㎕ 이하에서 나타난 것을 확인하였다.

즉, 본 발명 조성물은 in vitro에서 MTT assay를 통한 sarcoma 180에 대한 IC₅₀ 값이 시스플라틴에 비하여 10배 정도 낮은 값을 보이므로, 우수한 세포독성 효과를 갖는 것으로 판단된다.

효과시험예 2. 암세포 분화 억제 효과

ICR 마우스에서 본 발명 조성물의 항암력을 관찰하기 위하여 Sarcoma 180을 접종한 후, Sarcoma 180의 분화에 미치는 영향을 평가하였다.

사육 시설에 적응한 동물을 다음 표 1에 따라 총 6개군(G1～G6)으로 나누어, 각 군당 12마리의 동물을 배정하여 사용하였다. 다음 표 1은 실험군 설정 및 투약 농도를 나타낸 것이다.

그룹		투여량	동물수(마리)
G1	N(정상군)	0	12
G2	C(대조군)	0	12
G3	L(저용량군)	16.6 ㎕/체중kg	12
G4	M(중간 용량군)	83.3 ㎕/체중kg	12
G5	H(고용량군)	166.6 ㎕/체중kg	12
G6	cis(시스플라틴)	20 mg/㎡	12

2×10⁷ cell/㎖ 농도로 제조한 sarcoma 180 세포 부유액을 정상군을 제외한 모든 군의 한쪽 서혜부에 피하주사로 이식하여 고형암을 유발시켰다. 본 발명 조성물을 각각 저용량(16.6 ㎕/체중㎏), 중간 용량(83.3 ㎕/체중㎏), 고용량(166.6 ㎕/체중㎏)으로 설정하여, 복수암을 유발한 직후부터 3일 간격으로 6주간 투약하면서 암세포주의 착상 및 분화에 미치는 영향을 평가하고, 시스플라틴과 비교하였다.

항암 지표로는 실험 종료일 부검을 통해 sarcoma 180이 안정적으로 성장한 동물의 개체수를 측정하고 동일한 실험을 2회 실시하여 평균값을 정하였다.

도 2는 ICR 마우스에서 sarcoma 180 세포주의 분화에 미치는 본 발명 조성물의 효과를 대조약물과 비교하여 보여주는 그래프이다. 여기에서, L은 본 발명 조성물의 저용량, M은 중간 용량, H는 고용량을 표시하며, cis는 시스플라틴, N과 C는 각각 정상군과 대조군을 나타낸다.

도 2에서 보듯이, 시험 종료 후 부검을 통하여 서혜부의 암세포 유무를 확인한 결과, 본 발명 조성물의 저용량군은 9.5마리, 중간 용량군 및 고용량군은 각각 7.5 마리에서 종양이 발견되었으며, 대조약물인 시스플라틴에서는 4.5마리에서 종양세포가 관찰되었다.

즉, 본 발명에 따른 조성물은 암세포 분화에 대한 억제 효과가 대조군에 비해서는 다소 증가하였지만 시스플라틴과 동등 이상의 효과를 얻지 못하였다. 이와 같이, 본 발명 조성물이 in vivo와 in vitro에서의 유효성이 서로 다른 이유는, 하이드록시클로로퀸이 상온에서 불용성인 점으로 인한 약물의 제한적 확산거리의 영향 때문으로 추정된다.

효과시험예 3. 고형암에 대한 항암 효과

ICR 마우스에서 본 발명 조성물의 항암력 관찰을 위하여 sarcoma 180을 접종하여 고형암을 유발한 후 sarcoma 180의 사멸에 미치는 영향을 평가하였다.

사육 시설에 적응한 동물을 다음 표 2에 따라 총 4개군(G1～G4)으로 나누어, 각 군당 10마리의 동물을 배정하여 사용하였다. 다음 표 2은 실험군 설정 및 투약 농도를 나타낸 것이다.

그룹		투여량	동물수(마리)
G1	대조군	0	10
G2	저용량군	83 ㎕/체중kg	10
G3	중간 용량군	166 ㎕/체중kg	10
G4	고용량군	415 ㎕/체중kg	10

2×10⁷ cell/㎖ 농도로 제조한 sarcoma 180 세포 부유액을 모든 군의 한쪽 서혜부에 피하주사로 이식하여 고형암을 유발시켰다. 본 발명 조성물을 각각 표 2의 농도로 설정하여, 암세포주를 이식하고 1주 후부터 주 2회 3일 간격으로 6주간 투약하면서 고형암의 유발 정도를 관찰하였다.

항암 지표로는 실험 종료일 부검을 통한 육안적 관찰과 종양의 평균 무게를 측정하였다.

도 3은 ICR 마우스에서 sarcoma 180 세포주 고형암의 성장에 미치는 본 발명 조성물의 효과를 보여주는 그래프이다. 여기에서, G1은 대조군, G2는 본 발명 조성물(20%)을 83 ㎕/체중kg, G3는 166 ㎕/체중kg, 그리고 G4는 415 ㎕/체중kg의 양으로 투여한 경우이다.

실험 결과, 약물 투여를 하지 않은 대조군의 경우 평균 종양 세포의 무게는 4.81±1.69 g인 반면, 본 발명 조성물(20%) 투여군에서 G2 군의 경우는 4.16±1.68 g, G3 군은 3.92±1.00 g, G4 군은 3.31±0.72 g으로 용량 의존적으로 고형암의 무게가 감소하는 것을 알 수 있다.

효과시험예 4. 복수암에 대한 항암 효과 관찰

Sarcoma 180 세포주 이식에 의해 복수암이 유발된 마우스에서 본 발명 조성물의 항암 효과 및 수명 연장에 미치는 영향을 평가하였다.

사육 시설에 적응한 동물을 다음 표 3에 따라 총 3개군(G1～G3)으로 나누어, 각 군당 10마리의 동물을 배정하여 사용하였다. 다음 표 3은 실험군 설정 및 투약 농도를 나타낸 것이다.

그룹		투여량	동물수(마리)
G1	대조군	0	10
G2	중간 용량군	166 ㎕/체중kg	10
G3	고용량군	830 ㎕/체중kg	10

2×10⁷ cell/㎖ 농도로 제조한 sarcoma 180 세포 부유액을 모든 군의 복강내에 접종하여 복수암을 유발시켰다. 본 발명 조성물을 각각 표 3의 농도로 설정하여, 복수암 유발 후부터 3일 간격으로 6주간 투약하면서 사망 동물 추이를 관찰하고, 시스플라틴과 비교하였다.

도 4는 ICR 마우스에서 sarcoma 180 세포주 복수암 유발 후 본 발명 조성물의 수명 연장에 미치는 효과를 보여주는 그래프이다. 여기에서, G1은 대조군, G2는 본 발명 조성물(20%)을 166 ㎕/체중kg, G3는 830 ㎕/체중kg의 양으로 투여한 경우이다.

실험 종료일인 42일까지 복수암에 의한 사망률을 살펴보면, 대조군의 경우 시험 개시 후 9일째부터 폐사되는 동물이 나타나기 시작하였고, 21일째에는 반 정도가 폐사하였으며 42일째 1마리가 살아남았으나, 이는 복수암이 유발되지 않았거나 유발 정도가 미비한 동물로 판단된다. G2 군에서는 대조군보다는 조금 늦게 13일째 폐사 동물이 나타나기 시작하였고 26일째에 반이 폐사하였으나 시험 종료일에 3마리가 생존하였다. 반면 G3 군에서는 약물 투여 개시일에 모든 동물이 사망하였다. 즉, 본 발명 조성물은 복수암에 대한 수명 연장에 기여하는 것으로 나타났다.

도 1은 MTT assay에 의한 sarcoma 180 세포주의 성장에 미치는 본 발명 조성물의 효과를 대조약물과 비교하여 보여주는 그래프이다.

도 2는 ICR 마우스에서 sarcoma 180 세포주의 분화에 미치는 본 발명 조성물의 효과를 대조약물과 비교하여 보여주는 그래프이다.

도 3은 ICR 마우스에서 sarcoma 180 세포주 고형암의 성장에 미치는 본 발명 조성물의 효과를 보여주는 그래프이다.

도 4는 ICR 마우스에서 sarcoma 180 세포주 복수암 유발 후 본 발명 조성물의 수명 연장에 미치는 효과를 보여주는 그래프이다

Claims (7)

1. 생리식염수에 하이드록시클로로퀸20～25%(w/v)를 첨가하여 수욕 상에서 가온 용해한 후 국소마취제 리도카인 1～2%(w/v)와 항산화제 리보플라빈 0.1～0.5%(w/v)를 혼합하여 암세포에 직접 주사 또는 주입하는 것을 특징으로 하는 항암 치료를 위한 국소 투여용 주사제 조성물.
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