TWI728551B

TWI728551B - 藥學組合物用於治療與半乳糖凝集素-１活化相關癌症之用途

Info

Publication number: TWI728551B
Application number: TW108141256A
Authority: TW
Inventors: 陳登海; 陳孟堂; 王建元; 黃政博; 陳書語; 林怡秀; 王思嘉; 廖志遠
Original assignee: 三華生物科技股份有限公司
Priority date: 2019-11-13
Filing date: 2019-11-13
Publication date: 2021-05-21
Also published as: TW202118499A

Abstract

在此揭示一種藥學組合物用於製備預防和/或治療患有與半乳糖凝集素-1相關癌症的醫藥品。所述藥學組合物主要由靈芝酸S和靈芝酸T所組成。本揭示內容之藥學組合物施用至個體之前、同時或之後可再施用一抗癌藥物，藉以產生協同抑制癌細胞生長的效果。

Description

藥學組合物用於治療與半乳糖凝集素-1活化相關癌症之用途

本揭示內容是關於一種藥學組合物用於製備治療與半乳糖凝集素-1活化相關癌症醫藥品之用途，所述藥學組合物包含一新穎三萜化合物的組合，即靈芝酸S和靈芝酸T。

半乳糖凝集素-1與癌症進程、侵襲和轉移有關。目前已有相關研究指出半乳糖凝集素-1透過T細胞失能(T cell anergy)的方式參與腫瘤發展，並促進癌細胞免疫逃逸(cancer-immune escape)。另外，半乳糖凝集素-1與腫瘤內皮細胞的粘附和遷移有關；由此可見，半乳糖凝集素-1可作為抗癌治療干預的相關靶點。

本揭示內容之發明人意外的發現特定的靈芝酸能夠抑制由半乳糖凝集素-1活化所媒介的癌症進程和轉移，因此，這些靈芝酸可作為發展治療與半乳糖凝集素-1活化相關癌症醫藥品之候選藥物。

發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。

本揭示內容至少一部分係基於意外發現從靈芝(Ganoderma lucidum)之子實體或菌絲體中所分離出的特定三萜類或靈芝酸能夠抑制與半乳糖凝集素-1活化相關癌細胞之生長。因此，這些化合物能夠作為發展治療和/或預防與半乳糖凝集素-1活化相關癌症之醫藥品。

因此，本揭示內容第一態樣是提供一種藥學組合物之製藥用途，其中所述藥學組合物包含靈芝酸S(ganoderic acid S)和靈芝酸T(ganoderic acid T)，並且是用於製備治療或預防個體中與半乳糖凝集素-1活化相關癌症之醫藥品。

依據本揭示內容之實施方式，所述藥學組合物主要由靈芝酸S和靈芝酸T；以及一藥學上可接受賦型劑所組成。依據本揭示內容之實施方式，所述藥學組合物中的靈芝酸S和靈芝酸T之重量比為約1：1至1：10。在較佳的實施方式中，所述藥學組合物中的靈芝酸S和靈芝酸T的重量比為約1：2。

本揭示內容之第二態樣是提供一種治療或預防個體中與半乳糖凝集素-1活化相關癌症之方法。所述方法包含以下步驟：施用一有效量之藥學組合物，其主要由靈芝酸S和靈芝酸T；以及一藥學上可接受賦型劑所組成。依據本揭示內容之實施方式，所述藥學組合物中的靈芝酸S和靈芝酸T的重量比為約1：1至1：10。在較佳的實施方式中，所述藥學組合物中的靈芝酸S和靈芝酸T的重量比為約1：2。

適用於本方法治療之與半乳糖凝集素-1相關的癌症可以是膠質母細胞瘤(glioblastoma)、甲狀腺癌(thyroid cancer)、腸胃道癌(gastrointestinal cance r)、肝癌(liver cancer)、肺癌(lung cancer)、乳癌(breast cancer)、胰臟癌(pancreatic cancer)、黑色素瘤(melanoma)、前列腺癌(prostate cancer)、卵巢癌(ovarian cancer)、腺癌(adenocarcinoma)、膀胱癌(bladder cancer)和腎癌(kidney cancer)。

在可任選的實施方式中，所述方法更包含於施用本發明藥學組合物之前、之後或同時施用一抗癌藥物至所述個體，以協同抑制癌細胞的生長。

適用於本方法的抗癌藥物的實例包含，但不限於，紫杉醇(paclitaxel)、異丙氧代苯紫杉醇(docetaxel)、喜樹鹼(camptothecin,CPT)、抗癌妥(topotecan,TPT)、治癌妥(irinotecan,CPT-11)、阿黴素(Doxorubicin)、丹阿黴素(daunorubicin)、艾阿黴素(epirubicin)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、順鉑(cis-platin)、碳鉑(碳鉑)、長春花鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)、尹氟醯胺(ifosfamide)、溶肉瘤素(melphalan)、絲裂黴素(mitomycin)、氨基甲基葉酸(methotrexate)、絲羥酮(mitoxantrone)、鬼臼毒素(teniposide)、鬼臼乙叉苷(etoposide)、博萊黴素(bleomycin)、亞葉酸(leucovorin)、星狀素(cytarabine)、放線菌素D(dactinomycin)、鏈尿佐菌素(streptozocin)、考布丁A4磷酸鹽(combretastatin A4-phosphate)、SU5416。在一較佳的實施方式，當併用本發明藥學組合物和抗癌藥物紫杉醇時，能夠達到協同抑制卵巢癌的效果。在其他較佳的實施方式中，當併用本發明藥學組合物和抗癌藥物阿黴素時，能夠達到協同抑制卵巢癌的效果。

在可任選的實施方式中，本發明的方法更包含在對個體施用本發明藥學組合物之前、同時或之後，額外對個體施用其他手術或放射線治療。

在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。

為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：第1圖為依據本發明一實施方式所示本發明TN-GL-01組合物對卵巢癌細胞株ES-2細胞的影響；第2圖為依據本發明一實施方式所示利用西方墨點法分析本發明TN-GL-01組合物對於半乳糖凝集素-1表現的影響；第3圖為依據本發明一實施方式所示TN-GL-01組合物、順鉑和阿黴素分別對於紫杉醇誘導細胞死亡的影響；第4圖為依據本發明一實施方式所示TN-GL-01組合物、順鉑和紫杉醇分別對於阿黴素誘導細胞死亡的影響；第5A圖為依據本發明一實施方式所示之免疫組織化學分析和腫瘤外觀結果之照片；；第5B圖為依據本發明一實施方式所示腫瘤重量之直條圖；第6A圖為依據本發明一實施方式所示CD8-陽性細胞於免疫組織化學分析之結果；第6B圖為依據本發明一實施方式所示之直條圖，其顯示癌組織中人類免疫細胞百分比；第7A圖為依據本發明一實施方式所示之直條圖，其顯示癌組織中紫杉醇的量；以及第7B圖為依據本發明一實施方式所示之直條圖，其顯示第7A圖的腫瘤重量。

為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。

1.定義

除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。

在本文中，「治療(treatment or treating)」一詞包括可導致欲求之藥學和/或生理效果的防止性(即，預防性)、治癒性或緩和性處置。該效果較佳是指醫療上可部分或完全治癒或防止癌細胞的生長。此外，「治療」一詞在此係指基於可部分或完全減輕、延遲發生、抑制進程、減輕嚴重性、和/或減少一種特定疾病、異常和/或醫療狀況之一或多個病徵出現機率之目的，而對受測個體(或患者)，尤指具有一種醫療狀況、一種該醫療狀況之症狀、一種因該醫療狀況而引起的疾病或病症、或是一種會使朝向該醫療狀況發展的先期狀況的個體，施用或施加本揭示內容的藥學組合物。可對尚未出現特定疾病、異常和/或醫療狀況之明顯病徵的個體，和/或僅對該特定疾病、異常和/或醫療狀況產生早期病徵的個體進行治療，以期降低產生該特定疾病、異常和/或醫療狀況相關之病理的風險。在本文中，所述病徵、疾病、異常和/或醫療狀況可以是原位癌或轉移性癌。若能減少一或多個病徵或臨床指標即代表該治療是「有效」的。

「預防(prophylaxis)」在此是指對一種未來事件的防制手段。基於本文中預防癌細胞或因手術或診斷程序進而潛藏地提高了癌細胞轉移的文意，因此可在實施該手術或診斷程序之前、同時或之後，實施本文所述的預防性處置手段。

「一有效量(an effective amount)」一詞意將對於治療癌症的目的，此一用量在經過適當的給藥期間後，能夠達到減少癌細胞數目的欲求效果。

「化合物(compound)」、「組合物(composition)」、「藥劑(agent)」或「醫藥品(medicine or medicament)」等詞在此可交替使用，且都是指當施用於一個體(人類或動物)時，能夠透過局部和/或全身性作用而誘發所欲求的藥學和/或生理反應的一種化合物或組合物。

「施用(administered、administering或、administration)」一詞在此係指直接施用所述的化合物或藥學組合物，或施用活性化合物的前驅藥(prodrug)、衍生物(derivative)、或類似物(analog)等，而可於施用個體體內形成該活性化合物之一相當用量者。

本文中交替使用「個體(subject)」或「患者(patient)」等詞，其係指可接受所述化合物和/或方法治療的動物(包括人類)。「個體」或「患者」在此涵蓋了雄性與雌性兩種性別，除非另有具體說明。因此「個體」或「患者」包含任何哺乳類動物，包括，但不限於，人類、非人類的靈長類，如哺乳動物、狗、貓、馬、羊、豬、牛等，其可因利用所述化合物或藥學組合物進行治療而獲益。適合接受本發明藥學組合物和/或方法治療的動物較佳為人類。一般來說，「患者」一詞及「個體」一詞在本文中可彼此交替使用。

雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已儘可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比(例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者)均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。此外，在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。

2.藥學組合物

本揭示內容至少有一部分是肇因於意外發現單離自靈芝子實體或菌絲體中特定靈芝酸的新穎組合能夠抑制半乳糖凝集素-1表現，導致腫瘤生長受到抑制。因此，本發明所揭示的新穎靈芝酸組合物，特別是靈芝酸S和靈芝酸T的組合，能夠有效作為治療或預防與半乳糖凝集素-1介導之癌症的醫藥品。此外，本發明更意外地發現併用本發明靈芝酸S和靈芝酸T的組合物和抗癌藥物(如，鬼臼乙叉苷、阿黴素和紫杉醇)能夠產生協同抑制腫瘤生長和/或轉移的功效。

因此，本發明第一態樣是提供一種用於治療或預防與半乳糖凝集素-1活化相關癌症的藥學組合物。所述藥學組合物包括三萜化合物，其主要由靈芝酸S和靈芝酸T所組成，以及一種藥學上可接受的佐劑。

原則上，靈芝酸S和靈芝酸T可分別利用Hirotani等人(Phytochemistry(1987)，26(10)，2797-2803)由靈芝(Ganoderma spp)中所分離。此外，亦可利用臺灣發明專利公告號I381844所揭示的步驟由培養Ganoderma lucidum之廢料中分離出靈芝酸S和靈芝酸T，特別是在經採收Ganoderma lucidum後培養基所殘留的菌絲體中分離，且該發明專利所揭示內容引用至本案中。無論原料是來自靈芝子實體或是菌絲體，所用的分離純化方法一般都包括以溶劑(較佳是醇類溶液)，在高於室溫的溫度下進行萃取，接著將萃取物進行管柱層析，其包括但不限於高效率液態層析(HPLC)和逆相液態層析(Reverse Phase Liquid Chromatograpy)等，以及濃縮、乾燥等步驟，直到獲得一種靈芝萃出物的乾燥粉末為止。

依據本揭示內容之實施方式，本發明藥學組合物中靈芝酸S和靈芝酸T的重量比約1：1至1：10，例如、1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9和1：10。在一較佳的實施方式中，所述藥學組合物中的靈芝酸S和靈芝酸T之重量比約1：2。

一般來說，上述本發明三萜化合物(即，靈芝酸S和靈芝酸T組合物)的含量佔整體藥學組合物重量約0.1%至99%(重量%)，例如約佔整體藥學組合物重量的至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%。在某些實施方式中，上述本發明三萜化合物的含量佔整體藥學組合物重量的至少1%(重量%)。在特定實施方式中，上述本發明三萜化合物的含量佔整體藥學組合物重量的至少5%(重量%)。在另一些實施方式中，上述本發明三萜化合物的含量佔整體藥學組合物重量的至少10%(重量%)。在又另一些實施方式中，上述本發明三萜化合物的含量佔整體藥學組合物重量的至少25%(重量%)。

在某些實施方式中，本發明藥學組合物或醫藥品可作為佐劑搭配其他主要癌症療法使用，其中所述癌症療法包含但不限於，外科手術、放射線治療或化學治療。在某些實施方式中，本發明藥學組合物是與化學治療劑或抗癌藥劑併用。

可根據眾所接受的藥學製程來製備上述醫藥品或上述藥學組合物，如Remington’s Pharmaceutical Sciences(17th edition,ed.Alfonoso R.Gennaro,Mack Publishing Company,Easton,Pa(1985))中所述的製程。藥學上可接受的賦型劑係指可和製劑中其他成分相容且與生物體相容者。

本揭示內容知藥學組合物可以任一種合適的途徑施用，舉例而言，經由口服施用(如，膠囊、懸浮液或錠劑)或腸胃外施用。腸胃外施用的方式包括例如肌肉內注射、靜脈注射、皮下注射或腹膜內注射等系統性方式施用。在較佳實施方式中，可經由口服方式(如，透過食物)將本發明化合物投予個體。

若以口服方式施用，可將本發明藥學組合物配方成為內含各種輔劑(如，微晶纖維素(microcrystalline cellulose,MCC)、甲基纖維素(methylcellulose,MC)、檸檬酸鈉、碳酸鈣、磷酸二鈣及甘胺酸)；各種崩解劑(如澱粉、藻酸及特定矽酸鹽)；以及顆粒黏合劑(如，聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、明膠及相思樹膠(acacia))的藥錠。除此外，還可包含諸如硬脂酸鎂、十二烷基硫酸鈉及滑石等的潤滑劑。上述的固態組合物亦可作為填充物填入至明膠膠囊中；與此相關的較佳材料包括乳糖或牛奶中的糖以及高分子量聚乙二醇。當使用方式是口服用懸浮液和/或特效藥液(elixirs)時，可組合活性成分與各種甜味劑或風味劑、著色劑或染料一起配方，需要時還可加入乳化劑和/或懸浮劑，以及諸如水、乙醇、丙二醇、甘油等稀釋劑。

若以腸胃外(parenterally)方式施用，可將本發明醫藥品或藥學組合物配方成為液態的藥學組合物，其可為能以靜脈內注射、肌肉內注射、皮下注射或腹膜內注射等方式施用的無菌溶液或懸浮液。可用來製造上述無菌注射溶液或懸浮液的稀釋劑包括，但不限於，1,3-丁二醇、甘露醇、水、林格氏溶液、等張性氯化鈉溶液。也可使用脂肪酸(如，油酸)及其之甘油酯衍生物，或是天然藥學可接受的油(如，橄欖油或菜籽油)來製造可供注射用的溶液或懸浮液。這類油性溶液或懸浮液中也可包含用來稀釋的醇類或羧甲基纖維素或類似的分散劑。也可使用其他常用的界面活性劑(如，Tweens或Spans系列)或乳化劑，或藥學領域製造配方時常用來增強生物可利用性的藥劑。

當可理解，本發明藥學組合物的劑量會因個體而異，這不僅是因為特定的給藥途徑以及於患者體內所引發之所欲反應等之不同，還可能受到其他因素影響，例如：欲治療症狀的疾病狀態或嚴重程度；患者的年齡、性別或體重、患者的健康狀況；以及欲治療的病理狀態的嚴重程度、患者於同時進行的其他醫療或特殊飲食內容；以及本領域通常知識者可想到的其他因素；而負責照料的醫療人員最終可基於這些因素而判斷出適當的劑量。可調整給藥劑量與形式以提供較佳的治療反應。治療有效量同時也是指組合物所致的毒性或有害的效果不及於其所帶來的治療利益。在較佳的情形中，本發明之組合物於投藥時，應採用適當的劑量並持續一段時間，以減少出現症狀的次數和/或嚴重程度。

3.治療方法

本揭示內容也提供一種治療個體中與半乳糖凝集素-1活化相關癌症的方法。所述方法包含施用一治療有效量之前述任一實施方式所示之藥學組合物至所述個體。

此外，所述方法更包含於施用本發明藥學組合物之前、同時或之後，額外對該患者施用另一種已知可改善癌症治療效果的藥劑。此類藥劑的實例包括，但不限於，抗癌藥、抗血管增生藥物、抗病毒藥物、減輕疼痛藥物、抗貧血藥物、細胞激素、顆粒細胞株刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)、抗嘔吐藥物以及其他類似物。

在某些較佳的實施方式中，本發明的方法更包含施用本發明藥學組合物外，還額外施用一抗癌藥物至所述個體，並且可藉由抑制半乳糖凝集素-1表現，達到協同抑制細胞的功效。適用於本發明方法的抗癌藥物包含但不限於，紫杉醇(paclitaxel)、異丙氧代苯紫杉醇(docetaxel)、喜樹鹼(camptothecin,CPT)、抗癌妥(topotecan,TPT)、治癌妥(irinotecan,CPT-11)、阿黴素(Doxorubicin)、丹阿黴素(daunorubicin)、艾阿黴素(epirubicin)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、順鉑(cis-platin)、碳鉑(碳鉑)、長春花鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)、尹氟醯胺(ifosfamide)、溶肉瘤素(melphalan)、絲裂黴素(mitomycin)、氨基甲基葉酸(methotrexate)、絲羥酮(mitoxantrone)、鬼臼毒素(teniposide)、鬼臼乙叉苷(etoposide)、博萊黴素(bleomycin)、亞葉酸(leucovorin)、星狀素(cytarabine)、放線菌素D(dactinomycin)、鏈尿佐菌素(streptozocin)、考布丁A4磷酸鹽(combretastatin A4-phosphate)、SU5416及其他類似物。抗血管增生藥物實例包括，但不限於，DS 4152、TNP-470、SU6668、內皮生長抑制素(endostatin)、2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol)、癌細胞血管阻斷素(angiostatin)、沙利竇邁(thalidomide)、四硫鉬酸銨(tetrathiomolybdate)、三羧氨基喹啉(linomide)、IL-12及其他類似物。抗病毒藥物實例包括，但不限於，金剛烷胺(amantadine)、金剛乙胺(rimantadine)及其他類似物。減輕疼痛藥物實例包括，但不限於，對乙醯胺基酚(如，對乙醯胺基苯酚)、非固醇類抗發炎藥物(NSAID)(如，水楊酸鹽)及鴉片樣藥物(如，嗎啡及鴉片)。抗貧血藥物實例包括，但不限於，紅血球生長素。

適合本發明方法治療的癌症包括但不限於，膠質母細胞瘤、甲狀腺癌、腸胃道癌、肝癌、肺癌、乳癌、胰臟癌、黑色素瘤、前列腺癌、卵巢癌、腺癌、膀胱癌和腎癌。

在一較佳的實施方式中，是合併施用本發明藥學組合物和紫杉醇至患有卵巢癌的個體。在其他較佳的實施方式中，是合併施用本發明藥學組合物和阿黴素至患有卵巢癌的個體。

在本發明方法中，個體每天施用上述藥學組合物的量約1-120毫克/公斤個體體重，例如，1、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110或毫克/公斤體重/日；較佳是約30-110毫克/公斤體重/日，例如約30、40、50、60、70、80、90、100或110毫克/公斤體重/日；更佳是約80-100毫克/公斤體重/日，例如約80、90或100毫克/公斤體重/日。當可理解，本發明藥學組合物的劑量會因個體而異，這不僅是因為所用的特定給藥途徑，以及組合物於患者體內所引發之所欲反應等因素之不同，還可能受到其他因素影響，例如：欲治療症狀的疾病狀態或嚴重程度；患者的年齡、性別或體重、患者的健康狀況；以及欲治療的病理狀態的嚴重程度、患者於同時進行的其他醫療或特殊飲食內容；以及本領域通常知識者可想到的其他因素；而負責照料的醫療人員最終可基於這些因素而判斷出適當的劑量。可調整給藥劑量與形式以提供較佳的治療反應。治療有效量同時也是指化合物或組合物所致的毒性或有害的效果不及於其所帶來的治療利益。所述劑量可以單一劑量施用，或者採用多劑量施用的方式，如，每日二、三或四個劑量。

在某些實施方式中，所述方法更包含在對該患者施用本發明藥學組合物之後，額外對該患者施用放射線治療。

下文提出多個實驗例來說明本發明的某些態樣，以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明，且不應將這些實驗例視為對本發明範圍的限制。據信習知技藝者在閱讀了此處提出的說明後，可在不需過度解讀的情形下，完整利用並實踐本發明。此處所引用的所有公開文獻，其全文皆視為本說明書的一部分。

實驗例

材料和方法

細胞培育

本研究係使用卵巢癌細胞ES-2和骨髓瘤細胞株ARH-77，將各該細胞株細胞分別培育在經Dulbecco氏改良過之Eagle氏培養基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium,DMEM)中，並添加10%胎牛血清(fetal calf serum,FCS)、100單位(IU)/毫升之盤尼西林、100奈克(ng)/毫升之鏈黴素(Invitrogen,Carlsbad,CA)、2mM L-穀氨酸和非必要胺基酸及丙酮酸鈉，並維持在37℃的潮溼環境下(5% CO2及95%空氣)。平時將細胞培養於10公分直徑培養盤內，當細胞長到八分滿時進行繼代培養。繼代培養方式係先吸去舊的培養液後，以3毫升的磷酸緩衝液(PBS)清洗培養細胞一次，接著，在37℃下以1毫升之胰蛋白酶/EDTA(0.05%/0.025%)溶液處理細胞5分鐘，使細胞脫離培養盤成懸浮狀態；接著，在懸浮細胞中加入2毫升新鮮的培養液，以中和胰蛋白酶的活性。然後，將細胞打散使平均分布於細胞懸浮液中，留下適當比例的細胞數後，接種至培養盤上。將所述培養盤放置培養相中，並依上述步驟培養。

細胞活性分析

將細胞接種在96孔盤中(細胞密度為每孔3,000個細胞)，並依照上述步驟培養。當要測定細胞活性分析時，先以本揭示內容不同濃度的三萜化合物或抗癌藥物處理至少48小時，再進行MTT分析。

MTT分析

添加50微升之MTT儲存液(5毫克之MTT溶於1毫升之無菌PBS)至每一培養孔中。另外，添加50微升之MTT儲存溶液至500微升之培養基中，作為陰性控制組。將培養盤置於37℃，培養4小時。分別從每個樣本中取450微升之分液至新的48孔培養盤，添加100微升之DMSO，利用移液管混合，於37℃下，反應20分鐘，並在570nm波長下測定吸光值。

免疫組織化學染色

利用4%多聚甲醛(paraformaldehyde)固定組織，並以石蠟包埋。ES-2腫瘤組織切片進行抗原修復(antigen retrieval)處理。樣本利用Ku80(C48E7)兔單珠抗體進行培育，接著再以抗兔子HRP次級抗體培育。樣本以DAB(褐色)染色，並以蘇木(藍色)複染。

西方墨點分析

將待測樣本和對照樣本分別注入SDS-PAGE，之後將其轉移至PVDF膜上。加入5%之溶於TBS(包含0.1% Tween-20)的脫脂牛奶反應30分鐘後，加入一級抗體，於4℃作用至隔日；之後加入與辣根過氧化物酶鍵結之二級抗體(Amersham Biosciences,Piscataway)進行反應。利用Pierce ECL西方墨點受質(Thermo Fisher Scientific)及ImageQuant LAS-4000(GE Healthcare)來觀察蛋白表現。

原位卵巢癌動物模型

本試驗使用6週齡之NOD/SCID雄鼠，飼養在無病原菌的環境下，室溫維持於22±3℃，相對濕度保持於50±20%，日夜週期維持12/12小時，並可自由取用飲水及食物。動物飼料使用實驗鼠飼料5001(Laboratory Rodent Diet 5001)(購自PMI® Nutrition International,Inc.,MO,USA)。動物飲水則使用煮沸過之自來水。所有動物實驗操作，皆遵循中華實驗動物學會出版之「實驗動物管理與使用指南」之規範。

腫瘤接種前一天，將小鼠隨機分組，分組後確認各組間體重無統計上顯著差異，然後，將動物右後大腿外側剃毛。試驗開始當天，注射腫瘤細胞於剃毛處皮下，將ES-2卵巢癌細胞(0.1mL生理食鹽水內含1X10⁷個細胞)注射至NOD/SCID小鼠，以產生皮下(s.c.)異種移植(xenograft)腫瘤。

實施例1 本發明藥學組合物之製備及特性

1.1 本發明藥學組合物之製備

在此實施例中，本發明之藥學組合物為「TN-GL-01組合物」，混合靈芝酸T(26毫克)、靈芝酸S(14毫克)和結晶甲基纖維素(crystallized methylcellulose)(60毫克)的乾燥粉末，於攪拌機中混合得到均質混合物。

1.2 TN-GL-01組合抑制卵巢癌細胞之活性

依照「材料與方法」所示MTT分析法評估實施例1.1之TN-GL-01組合物對於卵巢癌細胞(即，ES-2細胞)的影響，結果示於第1圖。

如圖所示，TN-GL-01組合物、靈芝酸S(GAS)、靈芝酸T(GAT)抑制每一細胞株之50%活性(IC₅₀)的濃度分別為30.1微克(μg)/毫升、58.3微克/毫升和24.5微克/毫升，結果顯示實施例1.1之TN-GL-01組合物、靈芝酸S和靈芝酸T對於卵巢癌細胞株ES2皆具有細胞毒性。

1.3 TN-GL-01組合物抑制ES-2細胞之半乳糖凝集素-1之表現

在此實施例中，利用西方墨點法分析評估本發明TN-GL-01組合物對於ERK(extracellular-signal-regulated kinase)路徑中半乳糖凝集素-1(Galectin-1)蛋白質表現量的影響，結果示於第2圖。結果顯示，靈芝酸S(GAS)、靈芝酸T(GAT)和TN-GL-01組合物皆能有效抑制半乳糖凝集素-1之表現。由此可見，本發明TN-GL-01組合物可透過抑制半乳糖凝集素-1發揮其功效。

實施例2 併用TN-GL-01組合物和抗癌藥劑於體外(In vitro)試驗中抑制癌細胞之影響

在此實施例中，評估實施例1.1之TN-GL-01組合物對於化療藥劑(即，鬼臼乙叉苷、阿黴素、順鉑和紫杉醇)在ARH-77細胞毒殺效果的影響，其中碳鉑作為對照藥物。結果摘要於表1至表3，及第3圖和第4圖。

請參見表1，結果顯示TN-GL-01組合物能夠增強鬼臼乙叉苷誘導骨髓瘤ARH-77細胞死亡的效果，且比施用碳鉑更有效(IC₅₀ 156nM vs 238nM，控制組IC₅₀ 415nM)。併用TN-GL-01組合物和阿黴素(IC₅₀ 50nM vs 73nM，相較於控制組IC₅₀ 99nM)也有類似的結果。

為了測定合併使用TN-GL-01和其他三種藥物(即，紫杉醇、阿黴素和順鉑)中任一藥物的影響，計算存活率的預測值(expected value)和實際值(實oberved value)之間的統計差異。若預測值和實際值之間無顯著差異，代表所述功效為「相加作用(additivity)(p>0.05)」。若存活率實際值顯著低於預測值，代表合併使用所產生的功效為「協同作用(p<0.05)」。此外，當存活率之實際值統計上高於存活率之預測值時，則為「拮抗作用」。所述預測值是各別藥物於特定劑量的存活率相乘而得。利用MTT分析測量存活率及該些數值(第3圖和第4圖)。所述結果以平均值±標準差(standard deviation,SD)表示，結果示於表2和表3。

請參見第3圖，其顯示TN-GL-01組合物、順鉑和阿黴素對於紫杉醇誘導細胞死亡的影響。在三種抗癌藥劑(即，TN-GL-01組合物、順鉑和阿黴素)中，TN-GL-01組合物於增強紫杉醇誘導細胞死亡的效果上最佳(第3圖)。令人意外的是實驗結果顯示當合併使用TN-GL-01組合物(20微克/毫升)和紫杉醇(各別濃度：62.5nM和125nM)時，對於ARH-77細胞能夠產生協同抑制的功效(參見表2)。

在阿黴素誘導細胞死亡的實驗結果上，也可觀察到類似的結果，相較於順鉑或紫杉醇，TN-GL-01組合物增強阿黴素誘導細胞死亡的效果最佳(第4圖)。再者，在合併使用TN-GL-01組合物(20微克/毫升)和阿黴素(濃度為500nM)時，對於ARH-77細胞能夠產生協同抑制的效果(表3)，其中當阿黴素濃度未超過200nM時，結果顯示僅有相加或拮抗作用的效果(表3)。

綜合以上結果顯示，除了各抗癌藥劑和本發明組合物本身對於癌細胞的毒性外，合併使用本發明的TN-GL-01組合物和其他化療藥劑(如，紫杉醇和阿黴素)對於癌細胞能夠產生協同抑制的效果。

實施例3 合併使用TN-GL-01組合物和紫杉醇於活體內(In vivo)抑制卵巢癌的影響

在此實施例中，依據「材料和方法」一節所示步驟將卵巢瘤接種於小鼠身上並誘導之。將小鼠隨機分成不同組別，各組別的老鼠分別經由腹腔注射投予實施例1.1之TN-GL-01組合物(300毫克/公斤)、紫杉醇(10毫克/公斤)或合併使用紫杉醇(10毫克/公斤或20毫克/公斤)和TN-GL-01組合物(300毫克/公斤)。將老鼠犧牲，測量基質細胞中半乳糖凝集素-1的表現、細胞組織中紫杉醇的含量，以及試驗動物中CD-8陽性細胞量。結果顯示於第5圖至第7圖。

從外觀上而言，相對於控制組的實驗動物，經實施例1.1之TN-GL-01組合物治療的實驗動物身上切除的卵巢瘤，其生長顯著被抑制，腫瘤重量降低52%(第5A圖和第5B圖)。再者，在以TN-GL-01組合物治療的組別中，基質細胞的半乳糖凝集素-1(Galectin-1)表現量降低，此於實施例1.3的結果一致。再者，相較於控制組，在α-SMA的表現量上，陽性表現α-SMA之基質細胞的數量較低(第5A圖)，結果顯示TN-GL-01組合物能夠改變腫瘤微環境，促進免疫細胞浸潤，與第6A和6B圖所顯示經TN-GL-01組合物處理的卵巢瘤內的免疫細胞(即，CD-8)數量增加結果一致。

此外，實驗結果證實TN-GL-01組合物能夠增強腫瘤組織內化療藥劑(即，紫杉醇)的含量。請參見第7A圖，經TN-GL-01(300毫克/公斤)和紫杉醇(10或20毫克/公斤)處理的腫瘤，其紫杉醇殘留量明顯較高。因此，合併使用TN-GL-01(300毫克/公斤)和紫杉醇(10或20毫克/公斤)的腫瘤，其重量顯著降低(第圖7B).。

綜上所述，本揭示內容結果顯示TN-GL-01組合物適合發展治療癌症的醫藥品或佐劑。

雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。

Claims

一種藥學組合物用於製備醫藥品之用途，其中該醫藥品是用於治療一患有與半乳糖凝集素-1活化相關癌症之個體，且該藥學組合物主要由一靈芝酸S和一靈芝酸T，且不包含靈芝酸P、Q、R、Me和赤靈酸S；以及一藥學上可接受賦型劑所組成，其中該靈芝酸S和該靈芝酸T的重量比為1：1至1：10，且其中該個體施用一紫杉醇(paclitaxel)、異丙氧代苯紫杉醇(docetaxel)、鬼臼乙叉苷(etoposide)或阿黴素(doxorubicin)。
如請求項1所述之用途，其中該藥學組合物中的該靈芝酸S和該靈芝酸T的重量比為約1：2。
如請求項1所述之用途，其中該與半乳糖凝集素-1活化相關癌症是選自於以下所組成之群組：膠質母細胞瘤、甲狀腺癌、腸胃道癌、肝癌、肺癌、乳癌、胰臟癌、黑色素瘤、前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌和腎癌。
如請求項3所述之用途，其中該與半乳糖凝集素-1活化相關癌症是卵巢癌。
如請求項1所述之用途，其中該與半乳糖凝集素-1活化相關癌症是腺癌。
如請求項1所述之用途，其中該抗癌藥物是紫杉醇。
如請求項1所述之用途，其中該抗癌藥物是阿黴素。
如請求項1所述之用途，其中該抗癌藥物是鬼臼乙叉苷。