TWI406658B - 使用異硫氰酸酯類來治療癌症之方法及用途 - Google Patents
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Description
本揭示內容是有關於某些小分子的新穎用途,特別是異硫氰酸酯類化合物的新穎用途,其可用來製造能治療癌症的醫藥品或藥學組合物。
在大部分國家,癌症已經成為主要的死亡原因。目前用來治療癌症的標準方法如下:手術切除、化學藥物治療、放射線治療、免疫治療及生物性治療等;在這些方式中,以手術切除及化學藥物治療最常被採用。
治療的首要目標是要在不傷及身體其他部位的情況下,將癌細胞完全移除。但由於癌細胞極易侵犯周圍組織或是透過微遷移而轉移至身體其他遠端部位,致使手術切除癌細胞的應用層面受到限制。「化學藥物治療(Chemotherapy)」顧名思義就是以可摧毀癌細胞的藥物來進行治療。現階段,「化學藥物治療」通常是指使用可快速影響細胞分裂的毒性藥物進行治療。但是,在某些情況下,癌細胞卻會對一或多種這類細胞毒性藥物發展出抗藥性或是變得不敏感,因此,有許多相關研究希望找到能夠成功治療癌症,特別是具有抗藥性或是對抗癌藥物不敏感,的其他有效治療藥物或是手段。另外,部分癌症本身預斷性差、或是缺乏對其專一性較高的化學藥物,例如胰臟癌、非小細胞肺癌(non-small-cell lung carcinoma,NSCLC)或食道癌。
有鑒於此,此領域亟需一種或一類可用來治療上述具有抗藥性或是對目前化學藥物治療不敏感之癌症的有效藥學化合物。
本揭示內容至少部分係基於發現異硫氰酸酯類化合物,特別是自山葵(Wasabia japonica
MATSUM)中分離出來的6-甲基亞磺醯己基異硫氰酸酯(6-methylsulfinylhexyl isothiocyanate,以下稱I7457)和它的衍生物,6-甲基磺醯己基異硫氰酸酯(6-methylsulfonylhexyl isothiocyanate,以下稱I7557),分別具有可透過使至少45%的癌細胞生長停滯在G2
/M週期而達到延緩癌細胞生長的目的。上述這些發現,暗示本發明化合物可作為能治療癌症(包括具抗藥性之癌症)之醫療性藥劑的先導化合物。
因此,本揭示內容第一態樣是提供一種可用來治療一個體之癌症的方法。所述方法包含對該個體施用一治療有效量的I7457或是I7557或是其藥學上可接受的鹽類。適合以本發明化合物進行治療的癌症是選自胰臟癌、慢性骨髓白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)、非小細胞肺癌(non-small-cell lung carcinoma,NSCLC)及食道癌組成的群組中。在一較佳實施方式中,上述CML乃是對伊馬替尼(imatinib,以此為活性成分之抗癌藥物的商品名為基利克膜衣錠)具有抗性的CML癌細胞。上述個體可以是哺乳類動物,較佳是人類。
在某些實施方式中,所述方法更包含在對該個體施用I7457或是I7557之後,再對該癌症施以放射線處理。在一較佳實施方式中,該癌症為胰臟癌。
在某些實施方式中,所述方法更包含在對該個體施用I7457或是I7557的同時、之前或之後,也對該個體施用另一種已知可改善癌症治療效果的藥劑。這類藥劑的實例包括,但不限於,抗癌藥物、抗血管增生藥物、抗病毒藥物、抗生素、減輕疼痛藥物、抗貧血藥物、細胞激素、顆粒細胞株刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)、抗嘔吐藥物以及其他類似物。
因此,本揭示內容第二態樣是提供上述I7457或是I7557的新穎用途,其可用來製造一種可治療癌症的醫藥品或是藥學組合物。所製造出來的醫藥品或是藥學組合物會包括一藥學有效量之I7457或是I7557或是其藥學上可接受的鹽類;以及一藥學上可接受的輔劑。
若以上述藥學組合物總重量為基準,本發明化合物,特別是I7457或是I7557,約占該藥學組合物總重量的0.1%至99%(重量%)。在某些實施方式中,本發明化合物的量至少約為該藥學組合物總重量的1%。在特定實施方式中,本發明化合物的量至少約為該藥學組合物總重量的5%。在其他實施方式中,本發明化合物的量至少約為該藥學組合物總重量的10%。在另外實施方式中,本發明化合物的量至少約為該藥學組合物總重量的25%。
在某些實施方式中,上述本發明之醫藥品或是藥學組合物中更包括另一種已知可改善癌症治療效果的藥劑。這類藥劑的實例包括,但不限於,抗癌藥物、抗血管增生藥物、抗病毒藥物、抗生素、減輕疼痛藥物、抗貧血藥物、細胞激素、G-CSF、抗嘔吐藥物以及其他類似物。
透過以下的詳細說明與附隨之申請專利範圍將可更了解本揭示內容的這些及其他特徵。需知以上的概述及以下的詳細說明僅為例示,用來闡述本揭示內容,而非用以限制本揭示內容之範疇。
所述實施方式與專有名詞是為了闡述發明內容之用,並非用以限制本揭示內容範疇。本揭示內容範疇也涵蓋並未特意揭示於此,但習知技藝人士在閱讀過本揭示內容後可輕易推知的其他實施方式。
本揭示內容至少有一部分是肇因於一種從山葵(Wasabia japonica
MATSUM)中分離出來的異硫氰酸酯類化合物,特別是6-甲基亞磺醯己基異硫氰酸酯(I7457)及其衍生物,6-甲基磺醯己基異硫氰酸酯(I7557),具有抑制癌細胞(特別是,具有抗藥性之癌細胞)生長活性,這樣的發現而發展出來的。因此,可將這兩種異硫氰酸酯類化合物,作為能治療癌症之醫療藥劑的先導化合物。
異硫氰酸酯類化合物乃是包含有可輕易鑑別之異硫氰酸根(-NCS-)基團的化合物。以下即為本案發明人發現具有新穎用途之異硫氰酸酯類化合物的結構式:
6-甲基亞磺醯己基異硫氰酸酯(6-methylsulfinylhexyl isothiocyanate,或稱I7457)
6-甲基磺醯己基異硫氰酸酯(6-methylsulfonylhexyl isothiocyanate,或稱I7557)
可以習知的方法從植物、種子或植物萃出物中分離出本發明之6-甲基亞磺醯己基異硫氰酸酯(或I7457)。含有高量異硫氰酸酯類化合物的植物包括,但不限於,青花菜、芽菜、包心白菜、花椰菜、芥菜子、山葵、白蘿蔔、木瓜籽等。本發明之6-甲基亞磺醯己基異硫氰酸酯化合物較佳是自山葵中分離而得。至於其之衍生物,6-甲基磺醯己基異硫氰酸酯(或I7557),則可向商業實驗室(如,LKT Laboratories,Inc(St. Paul,Minnesota,USA))購買。
因此,本揭示內容提供一種用來治療一個體之癌症的方法。所述方法包括對該個體施用一治療有效量的上述兩種化合物之一或是其藥學上可接受的鹽類。本發明所述兩種化合物可有效地使至少45%的癌細胞生長停滯在G1
/M週期,防止這些癌細胞劑續增生。適合以本發明化合物進行治療的癌症是選自胰臟癌、慢性骨髓白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)、及非小細胞肺癌(non-small-cell lung carcinoma,NSCLC)。較佳是使用本發明所揭示的任一種化合物來治療具有抗藥性的癌細胞。
如所述,抗藥性是指癌細胞的一種狀態,尤指對單一治療性藥劑發展出抗性。舉例來說,癌細胞可能會對諸如敏畢瘤(vinblastine)、敏克瘤(vincristine)和溫諾平(vinorelvine)之類的長春花生物鹼類(vinca alkaloids);諸如阿黴素(Doxorubicin)、丹阿黴素(daunorubicin)及艾達黴素(idarubicin)之類的蒽環黴素(anthracyclines);微管蛋白安定藥物(紫杉醇)或酪胺酸激酶活性抑制劑(如,達沙替尼(dasatinib)、尼祿替尼(nilotinib)和伊馬替尼(imatinib))發展出抗藥性。
在一較佳實施方式中,可透過本發明兩種化合物之任一種進行治療的癌症是CML,特別是對美國藥物管理局核准之基利克膜衣錠(活性成分為伊馬替尼)具有抗性的CML癌細胞。在另一實施例中,可透過本發明兩種化合物之任一種進行治療的癌症是胰臟癌,其預斷性差且對於患有局部晚期胰臟癌或是胰臟癌已轉移的患者來說,平均存活時間分別只有約10個月及6個月。在另一實施例中,可透過本發明兩種化合物之任一種進行治療的癌症是對化學藥物治療不敏感的NSCLC。在另一實例中,所述癌症為目前仍以手術切除為最主要治療手段的食道癌。
在某些實施方式中,可經由口服、肌肉注射或靜脈注射而施用至個體身上之本發明化合物的有效用量約為1-100毫克/公斤個體體重。每天可施用至個體身上之本發明化合物的有效用量約為10、20、30、40、50、60、70、80、90或100毫克/公斤個體體重;較佳是約30-70毫克/公斤個體體重,例如約30、40、50、60、70毫克/公斤個體體重。這些劑量可以單次施用或是分成多次在一天內施用。
在某些實施方式中,所述方法更包含在施用本發明化合物之前,先對該癌症施以放射線預處理。在一實施例中,所述癌症為胰臟癌。
在某些實施方式中,所述方法更包含在施用本發明化合物的同時、之前或之後,對該個體施用另一種已知可改善癌症治療效果的藥物。這類藥物的實例包括,但不限於,抗癌藥物、抗血管增生藥物、抗病毒藥物、抗生素、減輕疼痛藥物、抗貧血藥物(如紅血球生長素)、細胞激素(如,顆粒細胞-巨噬細胞細胞株刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)、G-CSF或抗嘔吐藥物。
抗癌藥物的實例包括,但不限於,紫杉醇(paclitaxel)、異丙氧代苯紫杉醇(docetaxel)、喜樹鹼(camptothecin,CPT)、抗癌妥(topotecan,TPT)、治癌妥(irinotecan,CPT-11)、阿黴素(Doxorubicin)、丹阿黴素(daunorubicin)、艾阿黴素(epirubicin)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、順鉑(cis-platin)、碳鉑(cyclophosphamide)、長春花鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)、尹氟醯胺(ifosfamide)、溶肉瘤素(melphalan)、絲裂黴素(mitomycin)、氨基甲基葉酸(methotrexate)、絲羥酮(mitoxantrone)、鬼臼毒素(teniposide)、鬼臼乙叉苷(etoposide)、博萊黴素(bleomycin)、亞葉酸(leucovorin)、星狀素(cytarabine)、放線菌素D(dactinomycin)、鏈尿佐菌素(streptozocin)、考布丁A4磷酸鹽(combretastatin A4-phosphate)、SU5416及其他類似物。抗血管增生藥物的實例包括,但不限於,DS 4152、TNP-470、SU6668、內皮生長抑制素(endostatin)、2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol)、癌細胞血管阻斷素(angiostatin)、沙利竇邁(thalidomide)、四硫鉬酸銨(tetrathiomolybdate)、三羧氨基喹啉(linomide)、IL-12及其他類似物。抗病毒藥物的實例包括,但不限於,金剛烷胺(amantadine)、金剛乙胺(rimantadine)及其他類似物。減輕疼痛藥物的實例包括,但不限於,對乙醯胺基酚(如,對乙醯胺基苯酚)、非固醇類抗發炎藥物(NSAID)(如,水楊酸鹽)及鴉片樣藥物(如,嗎啡及鴉片)。抗貧血藥物的實例包括,但不限於,紅血球生長素。
本揭示內容也提供一種用來治療癌症的藥學組合物。此藥學組合物包括一治療有效量之上述本發明化合物;以及一藥學上可接受的輔劑。
一般來說,本發明化合物的含量佔整體藥學組合物重量約0.1%至99%(重量%)。在某些實施方式中,本發明化合物的含量佔整體藥學組合物重量的至少1%(重量%)。在特定實施方式中,本發明化合物的含量佔整體藥學組合物重量的至少5%(重量%)。在另一些實施方式中,本發明化合物的含量佔整體藥學組合物重量的至少10%(重量%)。在又另一些實施方式中,本發明化合物的含量佔整體藥學組合物重量的至少25%(重量%)。
在某些實施方式中,本發明醫藥品及藥學組合物中更包含另一種已知可改善癌症治療效果的藥物。這類藥物的實例包括,但不限於,抗癌藥物、抗血管增生藥物、抗病毒藥物、抗生素、減輕疼痛藥物、抗貧血藥物(如紅血球生長素)、細胞激素(如顆粒細胞-巨噬細胞細胞株刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)、G-CSF或抗嘔吐藥物。
可根據眾所接受的藥學製程來製備上述藥劑或藥學組合物,如Remington’s Pharmaceutical Sciences(17th
edition,ed. Alfonoso R. Gennaro,Mack Publishing Company,Easton,Pa(1985))中所述的製程。藥學上可接受的輔劑係指可和製劑中其他成分相容且與生物體相容者。
本發明化合物(即,I7457或是I7557)可經由口服(如,口服用膠囊、懸浮液或藥錠)、或腸胃外(parenterally)等適當方法施用。腸胃外(parenterally)施用方式包括例如肌肉內注射、靜脈注射、皮下注射或腹膜內注射等系統性方式施用。或是,也可透過穿皮膜方式施用,如局部皮膚塗抹或是吸入性(如支氣管內、鼻腔內、口腔內或鼻滴劑等);或是直腸內方式施用。施用時可單獨給藥或併同習知藥學可接受輔劑一起給藥。在較佳實施方式中,可經由口服方式(如,透過食物)將本發明化合物投予個體。
若以口服方式施用,可將本發明化合物配方成為內含各種輔劑(如微晶纖維素、碳酸鈣、磷酸二鈣及甘胺酸);各種崩解劑(如澱粉、藻酸及特定矽酸鹽);以及顆粒黏合劑(如,聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、明膠及相思樹膠(acacia))的藥錠。除此外,還可包含諸如硬脂酸鎂、十二烷基硫酸鈉及滑石等的潤滑劑。此固態配方也可當作填充劑用於明膠膠囊內,與此相關的較佳材料包括乳糖或牛奶中的糖以及高分子量聚乙二醇。當使用方式是口服用懸浮液和/或特效藥液(elixirs)時,可組合活性成分與各種甜味劑或風味劑、著色劑或染料一起配方,需要時還可加入乳化劑和/或懸浮劑,以及諸如水、酒精、丙二醇、甘油等稀釋劑。
若以腸胃外(parenterally)方式施用,可將本發明化合物配方成為液態的藥學組合物,其可為能以靜脈內注射、肌肉內注射、皮下注射或腹膜內注射等方式施用的無菌溶液或懸浮液。可用來製造上述無菌注射溶液或懸浮液的稀釋劑包括,但不限於,1,3-丁二醇、甘露醇、水、林格氏溶液、等張性氯化鈉溶液。也可使用脂肪酸(如,油酸)及其之甘油酯衍生物,或是天然藥學可接受的油(如,橄欖油或菜籽油)來製造可供注射用的溶液或懸浮液。這類油性溶液或懸浮液中也可包含用來稀釋的醇類或羧甲基纖維素或類似的分散劑。也可使用其他常用的界面活性劑(如,Tweens或Spans系列)或乳化劑,或藥學領域製造配方時常用來增強生物可利用性的藥劑。
可將本發明之上述醫藥品或藥學組合物調製成多種可供局部表面給藥(topical application)的劑型。可使用此領域中習知的各種皮膚可接受的惰性輔劑在這類劑型中。適合皮膚表面施用之配方包括液體、乳霜、乳液、乳膏、凝膠、噴劑、氣霧噴劑、皮膚貼片等類似物。常用的惰性輔劑如水、乙醇、聚乙烯吡咯啶、丙二醇、礦物油、硬脂醇及其他可形成膠狀物的材料。所有上述劑型與輔劑皆為藥學領域所熟知。對於本文所述的組合物之效果而言,劑型的選擇並非關鍵。
亦可將本發明之上述醫藥品或藥學組合物製成多種適用於黏膜給藥(mucosal application)的劑型,如經頰(buccal)和/或舌下(sublingual)藥物劑型單元,以遞送藥物穿過口腔黏膜。可使用多種生物可降解且藥學可接受的高分子輔劑,此種輔劑可使得藥學組合物具有可接受的吸附效果以及所欲的藥物釋放模式,且可和經頰和/或舌下藥物劑型單元中所含的欲施用活性成分或其他成分相容。一般來說,上述的高分子輔劑包含親水性聚合物,其可黏附至口腔黏膜的濕潤表面。高分子輔劑的實施例包括但不限於丙烯酸聚合物與共聚物(acrylic acid polymers and copolymers);水解聚乙烯醇(hydrolyzed polyvinylalcohol);聚乙烯氧化物(polyethylene oxides);聚丙烯酸酯(polyacrylates);乙烯聚合物與共聚物(vinyl polymers and copolymers);聚乙烯吡咯啶;葡萄糖(dextran);瓜膠(guar gum);果膠(pectins);澱粉;及纖維素聚合物(cellulosic polymers)。
因此,本發明也提供用來治療哺乳類(特別是人類)之癌症的方法,包括對該個體施用所述內含本發明活性化合物之醫藥品或藥學組合物。這類醫藥品或藥學組合物較佳是以可有效傳送所述組合物中活性化合物的途徑施用至一哺乳類(較佳是人類)身上適當或可產生欲求效果的位置。適當的施用途經可以是例如主動或被動地經口、經鼻、經肺或經皮膜等方式;或是以經腸胃外的方式,如直腸栓劑、皮下注射、靜脈內注射、肌肉內注射、鼻腔內、眼用溶液或軟膏。此外,也可將本發明化合物與其他活性藥劑一同施用。
當可理解,本發明之化合物的劑量會因患者而異,這不僅是因為所用的特定化合物或組合物、給藥途徑、化合物(單獨或連同一或多種藥物)於患者體內所引發之所欲反應等因素之不同,還可能受到其他因素影響,例如:欲治療症狀的疾病狀態或嚴重程度;患者的年齡、性別或體重、患者的健康狀況;以及欲治療的病理狀態的嚴重程度、患者於同時進行的其他醫療或特殊飲食內容;以及本領域通常知識者可想到的其他因素;而負責照料的醫療人員最終可基於這些因素而判斷出適當的劑量。可調整給藥劑量與形式以提供較佳的治療反應。治療有效量同時也是指化合物或組合物所致的毒性或有害的效果不及於其所帶來的治療利益。在較佳的情形中,本發明之化合物或組合物於投藥時,應採用適當的劑量並持續一段時間,以使得症狀的數目和/或嚴重性得以降低。
以下為本說明書中所用特定名詞的說明:
在本文中,「治療(treating或treatment)」一詞意指對癌細胞或一個體施用所述化合物,以使至少45%、50%、55%、60%或65%的癌細胞生長停滯在G2
/M週期而延緩癌細胞生長,藉使腫瘤體積縮小。因此,「治療」一詞在此亦表示殺死癌細胞或誘發癌細胞的細胞凋亡。
「一有效量(an effective amount)」一詞意此一用量在經過適當的給藥時期後,能夠達到治療癌症的所欲治療效果。
「化合物(compounds)」、「組合物(compositions)」、「活性化合物(active compounds)」、「藥劑(agent)」或「醫藥品(medicament)」等詞在此可互相替換,且都是指當施用於一對象(人類或動物)時,能夠透過局部和/或全身性作用而誘發所欲藥學和/或生理反應的一種化合物或組合物。
「施用(administered、administering或、administration)」一詞在此係指直接施用所述的化合物或組合物,或施用活性化合物的前驅藥(prodrug)、衍生物(derivative)、或類似物(analog)等可於對象體內形成該活性化合物之一相當用量者。
在此處「個體(subject)」或「患者(patient)」等詞係指可接受所述化合物和/或方法治療的動物,包括人類。「個體」或「患者」在此涵蓋了雄性與雌性兩種性別,除非另有具體說明。因此「個體」或「患者」包含任何哺乳類動物,較佳為人類,其可因利用所述化合物進行治療而獲益。
以下實施例是用來闡明本揭示內容特定態樣並幫助習知技藝者了解並實施本揭示內容。但本揭示內容範疇並不限於這些實施例中。
細胞培育
在本研究中係使用人類慢性骨髓性白血病(chronic myelogenous leukemia,簡稱CML)細胞株K562R、人類胰臟癌似上皮細胞(epithelial-like)細胞株PANC-1、人類巴氏食道腺癌(Barrett's-associated esophageal adenocarcinoma)細胞株SEG-1,人類食道鱗狀上皮細胞癌株81T/VGH(human esophageal squamous cell carcinoma line 81T/VGH)以及人類食道腺癌株BE-3(human esophageal adenocarcinoma line BE-3)。將每一細胞株的細胞分別培育在經Dulbecco氏改良過之Eagle氏培養基(Dulbecco'
s modified Eagle'
s medium,DMEM)中,並添加10%胎牛血清(fetal calf serum,FCS)、100單位/ml之盤尼西林、100 μg/ml之鏈黴素(Invitrogen,Carlsbad,CA)和2mM L-穀氨酸,並維持在37℃的潮溼環境下(5% CO2
及95%空氣)。
抗藥性CML細胞株之誘導
將CML細胞株K562R培育於持續存有低劑量甲磺酸伊馬替尼(imatinib mesylate,亦稱為STI-571)的環境下,以得到對伊馬替尼具有抗性之細胞株。在操作過程中,在上述DMEM培養基中加入0.2 μM甲磺酸伊馬替尼,將K562R培育於此培養基中,並維持在37℃的潮溼環境下(5% CO2
及95%空氣)。
MTT分析
MTT分析是一種比色分析,其可量測酵素(即,還原酶)在活細胞內將黃色的四唑化合物-溴化3-(4,5-二甲噻唑)-2,5-二苯四銼(3-[4,5-dimethylthiazol]-2,5-diphenyltetrazolium bromide,簡稱MTT)還原成甲(formazane)的活性。只有在細胞存活時,才能進行這種還原作用;因此通常會利用MTT分析來評估細胞存活與增殖的能力。簡言之,使細胞和10或20 μM的試驗化合物(如,I7457 or I7557)接觸48或72小時;之後加入MTT染料(500 μg/ml),並讓還原反應進行4小時;而後加入500 μl的異丙醇以終止還原反應。利用分光光度計測量樣本在570 nm之波長下的吸光度。
細胞週期分析
自培養基中取得經培育之細胞(不論是否經過本發明之化合物(即,I7457 or I7557)預先處理),接著,在4℃下以75%冰冷的酒精處理該些細胞至少經過一夜,使細胞固定。之後,在室溫下以A型RNA酶(RNAase A)處理細胞約30分鐘,離心後將細胞沉澱物重新懸浮在適量的碘化丙啶(propidium iodide,PI)(20 μg/ml)中,然後以流式細胞儀測定出不同週期的細胞並計數其數目。
免疫墨點分析
利用已知的溶解緩衝液使培育後的細胞溶解,並利用布拉德福(Bradford)法來測量蛋白質總量。將萃取出的粗單白(about 50-100 μg)加入至0.15%的十二基硫酸鈉聚丙醯胺凝膠(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel)中,再利用電泳法分離其中的蛋白質。其後將分離後的蛋白質轉印至硝化纖維膜上,並利用含有4%脫脂牛奶的TBST緩衝液(0.8%氯化鈉、0.02%氯化鉀、25 mM Tris-HCl/pH 8.0以及0.1%的Tween-20)來移除非專一結合。將各種抗體(包括p-Plk-1、p-Chk-1、p-Chk-2、p-Cdc2、GAPDH、α-微管蛋白(α-tubulin)、β-微管蛋白(β-tubulin)以及p-組蛋白(p-histone)H3(購自Transduction Laboratories,Lexington,KY,USA))分別溶解於含有2%脫脂牛奶的TRST緩衝液中,並分別和分離後的蛋白帶(protein band)於4℃下培育至少一夜。清洗後,以和辣根過氧化酶形成共軛的二次抗體(horseradish conjugated secondary antibodies)在室溫下培育約30分鐘,而後利用ECL化學冷光試劑(Amersham Pharmacia Biotech,US)偵測蛋白帶並利用X-光將底片曝光,便於以肉眼觀察表現的蛋白帶。
劉氏染色
將細胞轉移到載玻片上並以溶液A(0.5 g的甲基藍(methylene blue)以及1.7 g的伊紅黃(Eosin yellow),皆溶於1,000 ml的甲醇中)覆蓋。45秒後,加入溶液B(1.3 g的天藍染料(azure)、1.4 g的甲基藍、23.38 g的磷酸氫二鈉(Na2
HPO4
)與6.5 g的磷酸二氫鉀(KH2
PO4
),皆溶於1,000 ml的蒸餾水中),其中溶液B與溶液A的添加量為2:1。輕吹溶液表面,以使得兩種溶液混合均勻。將玻片靜置約90秒,而後以流動的水迅速地洗去染料。之後利用顯微鏡來觀察染色細胞的外觀。
放射線處理及形成細胞群落能力分析
在直徑約35毫米的6孔培養盤內植入數目約為100之癌細胞,並加入DMEM培養基(其中添加了10% FCS,以及濃度分別為5或10 μM的測試藥物(即,I7457或I7557)),然後繼續培育約24小時。洗掉藥物,並對細胞施以放射線處理。透過線性加速器(Clinac 1800,Varian Associates,Inc.,Palo Alto,CA,USA)來傳送約6 MeV的電子束能量,並以單次、每分鐘約2.4Gy的速率施加約0、0.5、1、2或4 Gy(Gray)的劑量。每次照射時,以另一同時也被照射的RP-60C游離室(CAPINTEL,Inc.,Ramsey,NY,USA)作為對照組,以確保電子能量達到平衡。輻射照射後,將細胞放回培育室,繼續培育10-14天,然後,以3%的結晶紫進行染色,並計算所形成的細胞群落數目(50細胞為1個細胞群落)。
利用上文「材料與方法」部分所述的步驟進行誘導而得到對伊馬替尼具抗性的人類CML細胞株K562R。分別利用細胞存活(MTT)與細胞週期分析以及免疫墨點分析與劉氏染色法來評估I7457與I7557的抑制生長活性。
第1與2圖分別繪示出I7457與I7557對於抗伊馬替尼CML細胞之細胞存活率的影響。圖中所示的結果顯示I7457與I7557皆可有效減少細胞數目,且此一效果與劑量相關;當使用20 μM的試驗化合物時,可使抗藥性CML細胞的數目至少減少為對照組細胞的65%。
細胞週期分析進一步顯示出有至少60%的CML細胞停滯於G2
/M期,且處於亞G1(sub-G1)群的細胞族群會隨著I7457或I7557劑量增加而增加(參見表1)。
此外,相較於對照組細胞(第3A圖),經過20 μM的I7457(第3B圖)或I7557(第3B圖)處理的CML細胞開始變圓,而使其外觀呈氣球狀,這意味著CML細胞正經歷細胞凋亡與有絲分裂風暴(mitotic catastrophe)。對經藥物處理之CML細胞進行α-與β-微管蛋白之染色分析(資料未顯示)以及免疫墨點分析的結果,也進一步證實了上述的有絲分裂事件。第4圖繪示出利用免疫墨點分析所測定之經藥物處理之CML細胞中β-微管蛋白的含量,由圖中可以看出,與對照組細胞相較之下,利用I7457與I7557治療可分別降低細胞中β-微管蛋白的含量。
藉由測量有絲分裂不活化複合蛋白(mitotic inactivation complex proteins)以及其上游調控蛋白的表現量,進一步探討I7457或I7557-誘發之有絲分裂不活化過程;上述有絲分裂不活化複合蛋白如Cdc2激酶與細胞週期素(cyclin)B1;而上游調控蛋白如Plk-1、Chk-1與Chk-2。試驗結果顯示,與對照組相較之下,在經I7457與I7557治療的CML細胞中都有較高的細胞週期素B1與磷酸化Plk-1表現量(第5與6圖);而在經I7457與I7557治療的CML細胞中則有較低的磷酸化Chk-1、磷酸化Chk-2與磷酸化cdc2激酶表現量(第7、8、9圖)。
本實施例亦探究了另一種關鍵有絲分裂蛋白-磷酸化組蛋白H3的表現量。組蛋白H3只有在細胞進行有絲分裂的過程中才會被磷酸化,因此若細胞停滯在有絲分裂期中,此蛋白的含量會提高。一如預期地,在經I7457與I7557治療的抗藥性CML細胞之中,磷酸化組蛋白H3的表現量遠比對照組細胞來得高(第10圖)。利用已知可干擾有絲分裂細胞中微管形成的有絲分裂抑制劑-諾可唑(nocodazole,用量100 nM)作為陽性對照組。總結來看,本實施例的各項結果顯示在經過I7457與I7557治療的抗藥性CML細胞中,有絲分裂現象受到了抑制。
利用與上述實施例1相似的方法來探究本發明之化合物I7457與I7557對PANC-1細胞的影響,所用的方法包括細胞存活率分析、細胞週期分析、對與細胞週期相關之蛋白的表現進行免疫墨點分析以及外觀分析。
細胞存活率分析的結果顯示,與對照組細胞相較之下,I7457與I7557在20 μM的濃度下能夠有效地將癌細胞的數目減少至少50%(資料未顯示)。細胞週期分析顯示以I7457與I7557治療後僅需24小時,即可使至少50%的細胞停滯於G2
/M期,且處於亞G1群的細胞數目隨著I7457或I7557的劑量提高而增加(參見表2)。至於和細胞週期相關的蛋白質,其表現量與上文針對抗藥性CML細胞所述的表現模式相似(資料未顯示)。
在本實施例中,發明人探究了本發明化合物I7457與I7557,對胰臟癌細胞株Panc-1及BxPc-3接受放射線處理的感受性之影響。
為此,先依據本文「材料與方法」段落中所揭示的步驟,對上述胰臟癌細胞施以放射線處理,然後再繼續培育殘存的癌細胞,並以細胞群落分析(clonogenic assay)來觀察這些細胞後續形成細胞群落的能力。細胞群落分析乃是癌症研究領域中,慣用來測試藥物或放射線處理,對癌細胞本身後續繼續無限制地進行分裂之能力的試驗,其是透過計算這些癌細胞形成群落的數目來估算。每一細胞群落至少必須包含50個細胞。試驗結果示於下表3及4中。
結果顯示,無論是Panc-1或BxPc-3細胞株,本發明揭示的兩種化合物,I7457與I7557,在濃度為10 μM時,均可有效地增強這些癌細胞株對放射線處理的感受力,亦即可增強放射線處理殺死癌細胞的效果。因此,本發明兩化合物,I7457與I7557,具有後續開發成抗癌藥物佐劑的潛力。
利用與上述實施例1相似的方法來探究本發明之化合物I7457與I7557對SEG-1細胞的影響,所用方法包括細胞存活率分析、細胞週期分析、對與細胞週期相關之蛋白的表現進行免疫墨點分析以及外觀分析。
細胞存活率分析的結果顯示,相較於對照組細胞,I7457與I7557在20μM的濃度下能夠有效地減少癌細胞數目至少70%(資料未顯示)。細胞週期分析顯示以I7457與I7557治療後僅需24小時,即可使至少45%的細胞停滯於G2
/M期,且處於亞G1群的細胞數目隨著I7457或I7557的劑量提高而增加(資料未顯示)。至於和細胞週期相關的蛋白質,其表現量與上文針對抗藥性CML細胞所述的表現模式相似(資料未顯示)。
利用與上述實施例1相似的方法,以細胞存活率分析來探究本發明之化合物I7457與I7557對人類食道鱗狀上皮細胞癌株81T/VGH(human esophageal squamous cell carcinoma line 81T/VGH)以及人類食道腺癌株BE-3(human esophageal adenocarcinoma line BE-3)的生長力的影響,結果示於下表5及6中。
對81T/VGH細胞而言,細胞存活率分析結果顯示,經過20μM
之I7457與I7557處理48小時後,相較於對照組細胞,兩化合物均能夠有效地減少癌細胞數目至少50%(表5)。類似的結果也出現在BE-3細胞的細胞存活率分析上,I7457與I7557在約20μM的濃度下,即可有效地抑制約50%的癌細胞生長(表6)。
當可理解上述實施方式與實施例僅為例示,且熟習此技藝者可對齊進行各種修飾。上文提出之說明書、實施例與資料的目的在於使本說明書的結構完備,並作為實作本發明之例示。雖然本揭示內容已以實施方式揭露如上,然其並非用以限定本揭示內容,任何熟習此技藝者,在不脫離本揭示內容之精神和範圍內,當可作各種之更動與潤飾,因此本揭示內容之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
為讓本揭示內容之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂,所附圖式之說明如下:第1圖繪示出依據本發明一實施方式,I7457對於抗伊馬替尼之CML K562R細胞之細胞存活率的影響;第2圖繪示出依據本發明一實施方式,I7557對於抗伊馬替尼之CML K562R細胞之細胞存活率的影響;第3圖以照片呈現出依據本發明一實施方式,經劉氏染色法處理之抗伊馬替尼之CML K562R細胞,其中第3A圖為控制組細胞,第3B圖為經20μM之I7457處理的細胞,且第3C圖為經20μM之I7557處理的細胞;
第4圖分別繪示出依據本發明一實施方式,經I7457與I7557處理之抗伊馬替尼之CML K562R細胞中β-微管蛋白的含量;
第5圖分別繪示出依據本發明一實施方式,經I7457與I7557處理之抗伊馬替尼之CML K562R細胞中細胞週期素B1的含量;
第6圖分別繪示出依據本發明一實施方式,經I7457與I7557處理之抗伊馬替尼之CML K562R細胞中p-Plk-1的含量;
第7圖分別繪示出依據本發明一實施方式,經I7457與I7557處理之抗伊馬替尼之CML K562R細胞中p-Chk-1的含量;
第8圖分別繪示出依據本發明一實施方式,經I7457與I7557處理之抗伊馬替尼之CML K562R細胞中p-Chk-2的含量;
第9圖分別繪示出依據本發明一實施方式,經I7457與I7557處理之抗伊馬替尼之CML K562R細胞中p-Cdc2激酶的含量;以及
第0圖分別繪示出依據本發明一實施方式,經I7457與I7557處理之抗伊馬替尼之CML K562R細胞中磷酸化組蛋白H3的含量。
Claims (16)
- 6-甲基亞磺醯己基異硫氰酸酯(6-methylsulfinylhexyl isothiocyanate)於製造用以治療癌症之醫藥品的用途,上述癌症係選自由胰臟癌、慢性骨髓白血病、非小細胞肺癌及食道癌所組成之群組。
- 如請求項1所述之用途,其中該慢性骨髓白血病對伊馬替尼(imatinib)具抗性。
- 如請求項1所述之用途,其中該癌症為胰臟癌。
- 如請求項3所述之用途,其中該胰臟癌可於後續處理中以放射線進行治療。
- 一種用來延緩活體外多數癌症細胞生長的方法,包含施用一有效量如請求項1所述之6-甲基亞磺醯己基異硫氰酸酯或其藥學上可接受鹽類,其中該癌症為胰臟癌、慢性骨髓白血病、非小細胞肺癌或食道癌。
- 如請求項5所述之方法,其中該慢性骨髓白血病對伊馬替尼(imatinib)具抗性。
- 如請求項5所述之方法,其中該癌症為胰臟癌。
- 如請求項7所述之方法,更包含在施用該有效量如請求項1所述之6-甲基亞磺醯己基異硫氰酸酯或其藥學上可接受鹽類之後,再對該胰臟癌施以放射線處理。
- 6-甲基磺醯己基異硫氰酸酯(6-methylsulfonylhexyl isothiocyanate)於製造用以治療癌症之醫藥品的用途,上述癌症係選自由胰臟癌、慢性骨髓白血病、非小細胞肺癌及食道癌所組成之群組。
- 如請求項9所述之用途,其中該慢性骨髓白血病對伊馬替尼(imatinib)具抗性。
- 如請求項9所述之用途,其中該癌症為胰臟癌。
- 如請求項11所述之用途,其中該胰臟癌可於後續處理中以放射線進行治療。
- 一種用來延緩活體外多數癌症細胞生長的方法,包含施用一有效量如請求項9所述之6-甲基磺醯己基異硫氰酸酯或其藥學上可接受鹽類,其中該癌症為胰臟癌、慢性骨髓白血病、非小細胞肺癌或食道癌。
- 如請求項13所述之方法,其中該慢性骨髓白血病對伊馬替尼(imatinib)具抗性。
- 如請求項13所述之方法,其中該癌症為胰臟癌。
- 如請求項15所述之方法,更包含在施用該有效量如請求項9所述之6-甲基磺醯己基異硫氰酸酯或其藥學上可接受鹽類之後,再對該胰臟癌施以放射線處理。
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Cancer Detection and Prevention., 2005, 29:155-160. Food Sci. Technol. Res., 2003, 9(2):148-151. * |
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