TW201321008A - 牛蒡子苷元用以製備肝癌藥物之用途及促肝癌細胞凋亡之醫藥組合物 - Google Patents

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Tzou-Chi Huang
Mei-Li Wu
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Univ Nat Pingtung Sci & Tech
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Abstract

一種牛蒡子苷元用以製備肝癌藥物之用途，該牛蒡子苷元係具有促進肝癌細胞發生細胞凋亡及細胞毒殺作用；以及，一種促肝癌細胞凋亡之醫藥組合物，係包含：牛蒡子苷元，作為抑制肝癌細胞增生之活性成分；以及至少一種醫藥可接受之藥物佐劑或藥物載劑，使牛蒡子苷元成型為該醫藥組合物。

Description

牛蒡子苷元用以製備肝癌藥物之用途及促肝癌細胞凋亡之醫藥組合物
本發明係關於一種牛蒡子苷元之用途，特別是一種關於牛蒡子苷元用以製備肝癌藥物之用途，及一種包含牛蒡子苷元之醫藥組合物。
請參照第1圖所示，係牛蒡子苷元(Arctigenin)之化學結構，其IUPAC命名為3R,4R(-4-[(3,4-dimethoxyphenyl)methyl]-3-[(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)methyl]-2-tetrahydrofuranone，分子式為C21H24O6，係牛蒡(Burdock)種子中的主要成分之一，通常可以從牛蒡子(Bardanae fructus)、水母雪蓮(Saussurea medusa)、牛蒡(Arctium lappa L.)、日本榧樹(T. nucifera)或槭葉牽牛(Ipomea cairica)等植物(Cho et al.,2004)或其他菊科植物(Asteraceae)中萃取得到，屬於二芐基丁內酯木脂素(dibenzylbutyrolactone lignan)類化合物。
許多研究針對牛蒡子苷元之生物活性進行探討，證實牛蒡子苷元可能具有抗氧化、抗發炎、抗菌或抗腫瘤等作用(Cho et al.,2004)、抑制A型流行性感冒病毒複製之作用(Hatashi et al.,2010)、抑制細胞經由LPS誘導產生的IL-6(廖芳甫，2008年)、抑制血小板凝集作用(楊宗餘，2006年)、降血壓及血管舒張作用(丘俐倩，2005年)；此外，根據Awale et al.於2006年研究顯示，牛蒡子苷元可能具有抑制胰線癌細胞增生的作用，然而，目前尚未有研究資料指出牛蒡子苷元具有抑制肝癌之作用。
肝癌(Liver cancer)，係國人死於惡性腫瘤中的首位，引起肝癌的主要危險因子包括經由肝炎病毒感染及肝硬化，通常係慢性肝炎導致肝硬化，最終演變成肝癌。
目前治療肝癌的方法係根據肝癌患者的腫瘤位置、大小及分布範圍來選擇，一般而言，可分為根治性的治療方法包括腫瘤切除法、酒精注射法、電燒法或微波凝固法，以及緩解性的治療方法，例如放射線治療法、化學治療法及標靶治療法。
最有效的治療方法仍係以根治性的治療方法為主，將癌細胞切除，避免癌細胞擴散至其他器官，並且配合緩解性的治療方法，以達到更佳的腫瘤抑制效果。
在緩解性的治療方法中，放射線治療法係以X光或高能量射線照射肝癌細胞聚集的部位，不僅可以殺死肝癌患者的肝癌細胞，也殺死了肝組織附近的正常細胞，因此，放射線治療法對於肝癌患者的身體負擔極大，也會產生使肝癌患者不適的副作用(例如：頭痛、疲倦、噁心、嘔吐、掉髮或照射部位的皮膚產生紅、乾、搔癢或壓痛感等症狀)，而降低肝癌患者的生活品質。
而化學治療法係以抗癌藥物殺死肝癌患者體內的肝癌細胞，以緩解肝癌細胞之擴散，延長肝癌患者的生存時間，化療藥物係針對會快速複製，無法調控增生速度的細胞進行抑制，特別係指抑制該等細胞的DNA複製機制；然而，由於人體的造血細胞、腸黏膜細胞、毛髮細胞及生殖細胞等亦屬於快速複製的細胞，該等細胞也會受到化療藥物的影響，使肝癌患者進行化學治療的過程中，會發生噁心、嘔吐、腹痛、腹瀉、貧血、掉髮或生殖系統受到破壞等副作用，使肝癌患者的生活品質低落而不願意持續進行治療。
另外，近幾年發展出標靶治療法的藥物可分成三大類：第一類標靶藥物係用以抑制血管新生(Anti-angiogenesis)的癌思停(Bevacizumab)、蕾莎瓦(Sorafenib)及沙利竇邁(Thalidomide)；第二類標靶藥物係用以阻斷癌細胞訊息傳遞路徑的艾瑞莎(Iressa)、得舒緩(Tarceva)、基利克(Glivec)及紓癌特(Sunitinib)；第三類標靶藥物係針對細胞表面抗原莫須瘤(MabThera)及賀癌平(Herceptin)。
然而，該等標靶藥物所費不貲，並非所有肝癌患者皆能夠負擔該等標靶藥物之費用，並且根據臨床試驗資料顯示，並非所有的標靶藥物皆對肝癌細胞具有療效；此外，標靶藥物的專一性雖高，卻仍可能會有副作用，例如：手腳皮膚敏感性增加、腫脹或乾裂起泡等反應，及皮疹、高血壓、腹瀉、無力倦怠甚至出血現象等，對於腫瘤細胞而言，在使用標靶藥物一段時間後，癌細胞可能會產生抗藥性而無法繼續使用。
本發明之主要目的係提供一種牛蒡子苷元用以製備肝癌藥物之用途，特別係藉由牛蒡子苷元作為肝癌細胞抑制劑以抑制核轉錄因子及核轉錄蛋白之活化，使癌細胞發生細胞凋亡(Apoptosis)，進而抑制肝癌細胞之增生現象。
本發明之次一目的係提供一種牛蒡子苷元用以製備肝癌藥物之用途，特別係藉由牛蒡子苷元有效抑制肝癌細胞中乙二醛酶(Glyoxalase I)基因的表現，使肝癌細胞中的糖解副產物-丙酮醛(Methylglyoxal，簡稱MG)之累積，對肝癌細胞造成毒性作用而使肝癌細胞死亡。
本發明之又一目的係提供一種促進肝癌細胞凋亡之醫藥組合物，特別係將牛蒡子苷元應用於製備抑制肝癌細胞增生之醫藥組合物。
為達到前述發明目的，本發明所運用之技術手段包含有：一種牛蒡子苷元用以製備肝癌藥物之用途，牛蒡子苷元係具有促進肝癌細胞發生細胞凋亡及細胞毒殺作用。
本發明之牛蒡子苷元用以製備肝癌藥物之用途中，牛蒡子苷元係抑制肝癌細胞之核轉錄因子之轉位現象。
本發明之牛蒡子苷元用以製備肝癌藥物之用途中，該核轉錄因子為NF-κB(Nuclear factor κ-light-chain-enhancer of activated B cells)。
本發明之牛蒡子苷元用以製備肝癌藥物之用途中，牛蒡子苷元係抑制肝癌細胞之核轉錄蛋白之磷酸化或轉位現象。
本發明之牛蒡子苷元用以製備肝癌藥物之用途中，該核轉錄蛋白為STAT3(Signal tranducers and activators of transcription 3)。
本發明之牛蒡子苷元用以製備肝癌藥物之用途中，牛蒡子苷元係抑制肝癌細胞之乙二醛酶(Glyoxalase I)基因表現，降低該肝癌細胞內之乙二醛酶表現量。
一種促肝癌細胞凋亡之醫藥組合物，係包含：牛蒡子苷元，作為抑制肝癌細胞增生之活性成分；以及至少一種醫藥可接受之藥物佐劑或藥物載劑，使牛蒡子苷元成型為該醫藥組合物。
本發明之促肝癌細胞凋亡之醫藥組合物中，該醫藥組合物係錠劑、膠囊、粉劑、粒劑或液劑。
為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：本發明係提供一種牛蒡子苷元用以製備肝癌藥物之用途，請參照第1圖所示，係本發明牛蒡子苷元之化學結構，牛蒡子苷元係能夠專一性地抑制肝癌細胞之核轉錄因子(Nuclear factor κ-light-chain-enhancer of activated B cells，簡稱NF-κB)及核轉錄蛋白3(Signal tranducers and activators of transcription 3，簡稱STAT3)，促使肝癌細胞發生細胞凋亡(Apoptosis)；此外，本發明之牛蒡子苷元亦能夠抑制肝癌細胞中乙二醛酶(Glyoxalase I)基因表現，使肝癌細胞於糖解作用中所產生之細胞毒素-丙酮醛(Methylglyoxal，簡稱MG)無法被清除，肝癌細胞因毒性累積於細胞內，產生細胞毒殺作用而死亡，因此，本發明之牛蒡子苷元能夠有效抑制癌細胞之擴散，係可應用於製備抑制肝癌細胞增生之醫藥組合物，以改善肝癌之治療現況。
本發明之牛蒡子苷元係可由各種人工合成方式獲得，或者由天然植物(如牛蒡及其種子、水母雪蓮、日本榧樹、槭葉牽牛或其他菊科植物等)中萃取而得，再且，牛蒡子苷元為一種天然化合物，因此，長期服用牛蒡子苷元對人體所造成之肝腎毒性較低，且不會對人體產生副作用；本實施例之牛蒡子苷元係購自美國ChromaDex公司，並選擇但不限定以二甲基亞碸(Dimethyl sulfoxide，簡稱DMSO)作為溶劑。
為證實本發明之牛蒡子苷元具有抑制肝癌細胞增生之作用，將本發明之牛蒡子苷元與一肝癌細胞株共同培養一段時間，再分別進行以下各試驗：(A)肝癌細胞之存活率、(B)肝癌細胞之凋亡現象、(C)肝癌細胞中核轉錄因子(NF-κB)之抑制、(D)肝癌細胞中核轉錄蛋白3(STAT3)之抑制及(E)肝癌細胞中乙二醛酶基因之抑制等分析試驗，紀錄該肝癌細胞株之細胞生理變化。
本實施例係選用人類肝癌細胞株HepG2(購自台灣新竹食品工業科學研究所，編號為BCRC 60027)進行上述試驗；本實施例將該肝癌細胞株培養於一適當培養基中進行繼代培養，待該肝癌細胞數量增殖至培養容器之七或八成滿，取一緩衝液，將增殖培養之肝癌細胞由該培養容器之器壁沖刷至該緩衝液中，以方便進行該肝癌細胞株之細胞計數，以及後續細胞存活率、細胞凋亡現象、細胞內核轉錄因子或核轉錄蛋白之活性抑制以及細胞內乙二醛酶基因抑制之分析。
更詳言之，本實施例係選擇但不限定將該肝癌細胞於含有10%胎牛血清蛋白(Fetal bovine serum，簡稱FBS)及1%抗生素(Penicillin/Streptomycin,Biowest)之DMEM培養基(Dulcbecco’s modified Eagle medium)中增殖培養，其培養條件為5%二氧化碳氣體、溫度為37℃，待該肝癌細胞長至培養容器之七或八成滿，以一商用EDTA緩衝液(Ethylene diamine tetra-acetic acid,MERCK)重複沖洗該培養容器，以便將貼壁生長的肝癌細胞沖刷至該EDTA緩衝液，並進行細胞計數；本實施例所使用之DMEM培養基配方如第1表所示。
(A)肝癌細胞之存活率
為證實本發明牛蒡子苷元確實能抑制肝癌細胞之增生現象，本實施例係以MTT細胞活性染色法(MTT assay)測定細胞活性，證實本發明牛蒡子苷元確實具有細胞毒殺作用而能夠抑制肝癌細胞之增生。更詳言之，MTT細胞活性染色法係利用活細胞粒線體中所含有之琥珀酸去氫酶(Dehydrogenase)可代謝溶於肝癌細胞培養液中的黃色MTT(3-(4,5-cimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)化合物，將MTT化合物中的tetrazolium轉為一藍色產物formazan，該formazan會堆積在細胞中，另以一DMSO溶液將formazan溶解，測量該DMSO溶液於波長570nm處之吸光值，代表各組細胞之存活率，當活細胞數越多，則570nm之吸光值越高。
請參照第2表所示，本實施例係將12組肝癌細胞(各組均含有4x105cells/ml之HepG2)分別與0、5、10、15、20及25微莫耳濃度(μM)之牛蒡子苷元共同培養12或48小時，各組之培養條件請參照第2表所示(第A1-0至A1-5組之作用時間為12小時，第A2-0至A2-5組之作用時間為48小時)，進行MTT細胞活性染色法之試驗，確認各組肝癌細胞之存活率。
本實施例中，無論係作用時間為12小時或48小時之試驗組別來看，分別以第A1-0組及第A2-0組所測得之吸光值為基準(該組肝癌細胞存活率定義為100%)，其餘組別之細胞存活率分別隨牛蒡子苷元濃度增加而下降，特別係第A1-4組、第A2-4組、第A1-5組及第A2-5組之細胞存活率皆為40%以下，証實該肝癌細胞之細胞存活率係與牛蒡子苷元之作用濃度及作用時間呈現負相關。
此外，本實施例另取6組肝癌細胞(各組均含有4x105cells/ml之HepG2)與濃度為25μM之牛蒡子苷元共同培養0、1、3、6、12及24小時後(各組分別為第A3-0至A3-5組)，進行MTT細胞活性染色法之試驗，確認各組肝癌細胞之存活率。
請參照第2圖所示，係以第A3-0組作為基準，其他組別之細胞存活率分別為76%、70%、41%、35%及20%，且由第2圖可知，以濃度為25μM之牛蒡子苷元與肝癌細胞共同培養，各組別之細胞存活率確實係隨牛蒡子苷元之作用時間越長而下降。
由本試驗之MTT細胞活性染色法顯示，當添加牛蒡子苷元之濃度增加，該肝癌細胞之存活率會隨之下降，顯示牛蒡子苷元對於肝癌細胞的抑制作用係呈現一正向趨勢；此外，選用濃度為10~25μM之劑量可有效地抑制肝癌細胞之細胞活性，造成肝癌細胞之死亡。由此證實，本發明之牛蒡子苷元確實具有細胞毒殺作用，進而抑制肝癌細胞增生現象。
(B)肝癌細胞之凋亡現象
為證實癌細胞之存活率下降係與細胞凋亡(Apoptosis)或細胞的增生作用停滯(Rest)相關，本實施例係以流式細胞儀進行肝癌細胞之細胞週期測定，並以共軛焦螢光顯微鏡觀察肝癌細胞之細胞核型態。
「肝癌細胞之細胞週期測定」
當細胞發生凋亡時，凋亡細胞之染色體數目低於2N之時稱作次G1期(Sub-G1)，本實施例係藉由一螢光染劑-碘化丙碇(Propidum iodine，簡稱PI)標定細胞之核酸，並以一流式細胞儀(FACScan laser flow cytometer analysis system；Becton Dickenson)讀取該螢光染劑受雷射光激發之特定波長(488 nm)圖譜，當該次G1期之波峰大於10%者，即代表該肝癌細胞係停留於次G1期，本實施例係以肝癌細胞停留於次G1期百分比代表該組肝癌細胞之細胞凋亡率。
請參照第3表所示，係本實施例針對肝癌細胞對於牛蒡子苷元之濃度依賴性進行細胞週期分析。
本實施例係將6組肝癌細胞(各組均含有4x105cells/ml之HepG2)分別與0、5、10、15、20及25μM之牛蒡子苷元共同培養12小時(第B1-0至B1-5組)；另取6組肝癌細胞(各組均含有4x105cells/ml之HepG2)分別與0、5、10、15、20及25μM之牛蒡子苷元共同培養24小時(第B2-0至B2-5組)，其中，第B1-0組及第B2-0組為未添加牛蒡子苷元之對照組，而第B1-1至B1-5組及第B2-1至B2-5組為不同作用時間之實驗組，觀察各組之細胞週期。
請參照第3表所示，係本實施例各組別肝癌細胞之細胞凋亡率，其中，不論作用時間為12小時或24小時，各組肝癌細胞與5μM之牛蒡子苷元共同培養後，其細胞凋亡率皆大於10%，且該肝癌細胞之細胞凋亡率係隨牛蒡子苷元之濃度增加而遞增，此外，肝癌細胞之細胞凋亡率亦隨牛蒡子苷元的作用時間增加而遞增。
由上述可知，本發明之牛蒡子苷元能夠使肝癌細胞停留於次G1期，使肝癌細胞發生細胞凋亡，以致該肝癌細胞無法生長、增生或擴散。
「肝癌細胞之細胞核型態變化」
當細胞發生凋亡時，肝癌細胞的細胞核形態會發生變化，例如：細胞皺縮、細胞核發生斷裂、DNA片段化，最後會形成凋亡小體(Higuchi,2003)。
本實施例係取6組肝癌細胞(各組均含有4x105cells/ml之HepG2)分別與0、5、10、15、20及25μM之牛蒡子苷元共同培養24小時，再以DAPI染劑(4’,6-diamidino-2-phenylindole,InvitrogenTW)對肝癌細胞之細胞核進行染色，以波長為358nm之光源激發，而發散波長為461nm之光源，並以共軛焦螢光顯微鏡(Leica TCS SP2 confocal microscope)觀察該肝癌細胞之細胞核型態。
請參照附件一之第(a)至(f)圖，係利用DAPI對各組肝癌細胞之細胞核進行染色，觀察各組肝癌細胞的細胞核型態。其中，第(a)圖係未與牛蒡子苷元共同培養者，其細胞核保持完整的型態，並未發生皺縮的現象，而第(b)至(f)圖係分別與5、10、15、20及25μM牛蒡子苷元共同培養1小時之組別，各組肝癌細胞之細胞核發生皺縮，且形成數個凋亡小體(如第(d)至(f)圖箭頭所指之處)，且該肝癌細胞之凋亡現象確實隨著牛蒡子苷元之濃度增加而被抑制。
由肝癌細胞停留於次G1期及肝癌細胞之細胞核發生皺縮現象可知，本發明之牛蒡子苷元能夠使肝癌細胞發生細胞凋亡，以致該肝癌細胞無法生長及增生。
(C)肝癌細胞中核轉錄因子(NF-κB)之抑制
為證實肝癌細胞發生細胞凋亡係由於添加本發明之牛蒡子苷元相關，本實施例係以共軛焦螢光顯微鏡(Leica TCS SP2 confocal microscope)觀察與調控致癌基因轉錄相關的調控因子-NFκB(Nuclear factor κ-light-chain-enhancer of activated B cells)於肝癌細胞中分布的情形，其中NFκB以螢光標定追蹤，當NFκB活化會發生轉位現象而進入細胞核中，使細胞發生增生作用，因此可利用NFκB做為標定癌細胞增生之現象。
本實施例係將7組肝癌細胞(各組均含有4x105cells/ml之HepG2)分別以第4表所示之條件進行培養，其中，第C1及C2組係不與牛蒡子苷元共同培養，而第C3及C4組係分別與5及25μM之牛蒡子苷元共同培養6小時，且第C2至C4組係加入10 ng/ml之TNF-α以刺激各組肝癌細胞之NFκB發生轉位現象，再以一級抗體(Anti-NFκB p65 mouse monoclonal antibody,Santa Cruz Biotechnology,USA)標定NFκB，另以二級抗體(Goat anti-mouse IgG conjugated Fluorescein PE,Santa Cruz Biotechnology,USA)增強該一級抗體之訊號，再以DAPI染劑對細胞核染色，藉此觀察各組肝癌細胞之NFκB之轉位現象。
請參照附件二之第(a)至(g)圖，係利用免疫染色的方式標定NFκB在肝癌細胞中之分布情況，同時以DAPI染劑標定各組肝癌細胞之細胞核位置，進一步將標定NFκB及細胞核之照片重疊在一起，觀察各組肝癌細胞的細胞核及細胞質中NFκB的分布情形。其中，第(a)圖之未與牛蒡子苷元共同培養且未以TNF-α刺激之組別，其NFκB並未發生轉位現象，第(b)圖係僅以TNF-α刺激之組別，其NFκB確實發生轉位現象，第(c)及(d)圖係分別與5及25μM牛蒡子苷元共同培養6小時，再以TNF-α刺激之組別，各組肝癌細胞NFκB的轉位現象確實隨著牛蒡子苷元之濃度增加而被抑制。
由此可知，將肝癌細胞添加本發明之牛蒡子苷元培養6小時，以螢光標定肝癌細胞之NFκB，未添加牛蒡子苷元之組別(第(a)圖)，其細胞核中存在有NFκB(即代表NFκB發生轉位現象)，而相較於添加本發明之牛蒡子苷元之組別(第(c)至(d)圖)，NFκB無法進入肝癌細胞之細胞核中，使得肝癌細胞無法進行細胞增生。由此可證實本發明之牛蒡子苷元可使肝癌細胞中調控細胞增生之轉錄因子(NFκB)無法進入癌細胞的細胞核中，使癌細胞無法進行細胞增生。
(D)肝癌細胞中核轉錄蛋白3(STAT3)之抑制
為證實肝癌細胞發生細胞凋亡係由於添加本發明之牛蒡子苷元相關，本實施例係以共軛焦螢光顯微鏡(Leica TCS SP2 confocal microscope)觀察與調控致癌基因轉錄相關的調控蛋白-STAT3(Signal tranducers and activators of transcription 3)以及活化的STAT3(即磷酸化之STAT3，簡稱pSTAT3)於肝癌細胞中的含量及其分布的情形，其中STAT3及pSTAT3皆以螢光標定追蹤，當STAT3活化時，STAT3於細胞質內含量會增加，且磷酸化的STAT3會發生轉位現象而進入細胞核中，pSTAT3於細胞核中的含量亦增加，顯示該肝癌細胞發生增生作用，因此可利用STAT3及pSTAT3做為標定癌細胞增生之現象。
本實施例係將6組肝癌細胞(各組均含有4x105cells/ml之HepG2)，分別以第5表所示之培養時間進行培養，其中，第D1-2、D1-4至D1-6組再以10ng/ml之IL-6刺激該STAT3轉位至各組肝癌細胞之細胞核中，並對該6組肝癌細胞進行三重染色：(1)以抗STAT3之單株一級抗體(STAT3 anti-mouse monoclonal IgG,Santa Cruz Biotechnology,USA)標定STAT3，另以二級抗體(Goat anti-mouse IgG conjugated Fluorescein PE,Santa Cruz Biotechnology,USA)增強該抗STAT3一級抗體之訊號；(2)以抗pSTAT3之單株一級抗體標定活化的STAT3(即磷酸化的STAT3)，另以Alexa 488 goat anti-rabbit IgG(InvitrogenTW)增強該抗pSTAT3一級抗體之訊號；(3)以DAPI(4’,6-diamidino-2-phenylindole,InvitrogenTW)對細胞核染色，藉此得以同步觀察各組肝癌細胞之STAT3之轉位現象、各組肝癌細胞所含有磷酸化STAT3及其細胞核位置。
請參照附件三之第(a)至(d)圖，係利用免疫染色的方式標定STAT3及pSTAT3在肝癌細胞中之分布情況，進一步推定各組肝癌細胞的細胞狀態。由附件三之第(a)圖可知，在無IL-6刺激及未添加牛蒡子苷元之條件下，第D1-1組肝癌細胞之STAT3含量較其他組別少，且第D1-1組肝癌細胞並未表現pSTAT3；由第(b)圖可知，以IL-6刺激後，第D1-2組肝癌細胞之STAT3含量較第D1-1組多，且第D1-2組肝癌細胞表現大量pSTAT3，並進入到細胞核中；由第(c)圖可知，僅加入牛蒡子苷元之組別，其並未表現pSTAT3，因此，牛蒡子苷元不會對肝癌細胞產生不正常之增生；由第(d)及(f)圖可知，分別添加5、15及25μM之牛蒡子苷元培養6小時後，再加入IL-6刺激各組肝癌細胞，其STAT3於細胞質內的含量雖較第D1-1組有所增加，然而，藉由牛蒡子苷元而能夠抑制STAT3被磷酸化，使細胞核內pSTAT3之含量較第D1-2組為低，表示牛蒡子苷元能抑制pSTAT3之轉位現象，且該轉位現象係隨著牛蒡子苷元之作用濃度增加而被抑制。
本實施例除了觀察STAT3之轉位現象，請參照第6表所示，本實施例另取6組肝癌細胞，分別與不同濃度之牛蒡子苷元共同培養，並以IL-6刺激該肝癌細胞之STAT3活化，使STAT3磷酸化後發生轉位現象，再以西方墨點法定量各組肝癌細胞中的STAT3及磷酸化的STAT3(即pSTAT3)，確認各組肝癌細胞中pSTAT3之活化結果(請參照第3a及3b圖)。
更詳言之，本實施例係自如第6表所示之組別中分別取出適量肝癌細胞，以一定比例(較佳係1:10)稀釋於一商用蛋白質抽取溶劑(Lysis buffer；Sigma)，進行均質處理，造成各組細胞溶解、破裂，以獲得細胞內的蛋白質；再由一商用蛋白質定量套組(Protein Assay Kit；Invitrogen)分析由第D2-1至D2-6組細胞所抽取的蛋白質總量，取等量蛋白質，利用抗STAT3 mouse monoclonal IgG(Santa Cruz Biotechnology,USA)、抗pSTAT3rabbit monoclonal IgG抗體(Cell signaling,USA)及抗actin mouse monoclonal抗體(Millipore,USA)進行西方墨點法分析。
請參照第6表、第3a及3b圖所示，其中，第D2-1及D2-2組係未加入IL-6刺激肝癌細胞發生轉位現象，該第D2-1及D2-2組之STAT3及pSTAT3含量皆低；第D2-3組係僅添加IL-6刺激肝癌細胞發生轉位現象；而第D2-4至D2-6組中，相較於第D2-3組，其STAT3及pSTAT3含量係隨牛蒡子苷元濃度增加而遞減；由此可知，將肝癌細胞添加本發明之牛蒡子苷元培養6至12小時，以螢光標定肝癌細胞之STAT3及pSTAT3後，本發明之牛蒡子苷元不僅能夠抑制肝癌細胞本身持續活化STAT3之現象，也能夠抑制由IL-6誘導肝癌細胞STAT3活化之現象，使STAT3無法被磷酸化，而無法轉位進入肝癌細胞之細胞核中，使得肝癌細胞無法進行細胞增生。
由此可證實，本發明之牛蒡子苷元可使肝癌細胞中調控細胞增生之轉錄蛋白(STAT3)無法進入癌細胞的細胞核中，使癌細胞無法進行細胞增生。
(E)肝癌細胞中乙二醛酶基因之抑制
肝癌細胞為了能夠獲得能量以便大量增生，肝癌細胞的增生過程中會產生糖解作用的代謝副產物-丙酮醛(Methylglyoxal，簡稱MG)，肝癌細胞必須產生較正常細胞為多的乙二醛酶(Glyoxalase I，簡稱GLO-1)，以分解MG，避免肝癌細胞內累積過多毒性而死亡。
為證實添加本發明之牛蒡子苷元可使肝癌細胞中乙二醛酶基因之表現被抑制，以西方墨點法偵測該肝癌細胞中乙二醛酶基因之表現量。更詳言之，請參照第7表所示，係本實施例以不同濃度之牛蒡子苷元之不同培養時間之組別，測量各組之GLO-1表現量。
第7表：各組肝癌細胞之培養條件及其GLO-1表現量
本實施例係將12組肝癌細胞(各組均含有一定細胞數量之肝癌細胞，如1x105cells/ml)分別與0、10、20、30、40及50μM之牛蒡子苷元共同培養12或24小時，進行西方墨點法之試驗，確認各組肝癌細胞中GLO-1之表現量，其中，以第E1組之GLO-1表現量作為基準(定義為100%)，比較其他組別之GLO-1表現量的增減。
更詳言之，本實施例係自上述第E1至E6組中分別取出適量肝癌細胞，以一定比例(較佳係1:10)稀釋於一商用蛋白質抽取溶劑(Lysis buffer；Sigma)，進行均質處理，造成各組細胞溶解、破裂，以獲得細胞內的蛋白質；再由一商用蛋白質定量套組(Protein Assay Kit；Invitrogen)分析由第E1至E6組細胞所抽取的蛋白質總量，取等量蛋白質，利用抗乙二醛酶多株抗體(Glyoxalase-I rabbit polyclonal IgG antibody,Santa Cruz Biotechnology,USA)進行西方墨點法分析。
請參照第4a及4b圖西方墨點法之蛋白質染色結果所示，本實施例係以肝癌細胞中正常表現之β-actin的表現量為定量標準，分別比較各組肝癌細胞中GLO-1的表現情況；由第4a及4b圖結果可知，各組肝癌細胞的GLO-1表現量係隨著本發明牛蒡子苷元之作用時間增加而遞減，且不同牛蒡子苷元濃度之組別，其GLO-1表現量亦隨著牛蒡子苷元之作用濃度增加而遞減。由此可證實，本發明之牛蒡子苷元係可以抑制人類肝癌細胞中GLO-1的表現，而較高劑量(如15至25μM)之牛蒡子苷元，或者較長之牛蒡子苷元作用時間(24小時)者，以較低劑量(如5至25μM)之牛蒡子苷元即可呈現較佳之抑制效果。
由此可知，本發明之牛蒡子苷元係藉由直接抑制肝癌細胞中乙二醛酶基因的表現，使肝癌細胞內GLO-1之表現量下降而無法有效清除細胞中的MG，致使該肝癌細胞發生細胞毒殺作用，造成肝癌細胞死亡。
承上所述，本發明之牛蒡子苷元係可以阻斷肝癌細胞中核轉錄因子-NFκB及核轉錄蛋白-STAT3的轉位現象，中斷該肝癌細胞之細胞增生作用，並且直接抑制人類肝癌細胞之乙二醛酶基因表現，使肝癌細胞無法有效排除由糖解作用所產生的毒素MG，使大量毒素堆積於癌細胞內，影響其細胞活性，最後引發癌細胞自發性的死亡，進而抑制癌細胞的增生與擴散；據此，本發明之牛蒡子苷元確實具有抑制肝癌細胞核轉錄因子及核轉錄蛋白之活化，以及肝癌細胞之乙二醛酶基因表現之功能，可應用於開發促進肝癌細胞凋亡之抑制劑，係可應用於製備抑制肝癌細胞增生之醫藥組合物，具有提升臨床醫療品質之功效。
本發明之牛蒡子苷元係可以做為一藥物活性成分(Active substrate)，以各種方式單獨，或者結合至少一種醫藥可接受之藥物佐劑、藥物載劑、其他副成分、營養成分或他種藥物活性成分，使牛蒡子苷元成型為該醫藥組合物，共同給予各種生物個體，較佳係經由口服方式定期給予各種生物個體一適當劑量，如每天給予1~2次，每次給予5~25微莫耳濃度(μM)/每單位重量公斤(kg)；再者，本發明之牛蒡子苷元可以藉由任何食品加工方法製成各種方便食用之的劑型，如錠劑、膠囊、粉劑、粒劑或滴劑，或者將牛蒡子苷元與其他食品或飲料組合，以符合各種生物個體之使用。
藉此，本發明之牛蒡子苷元用以製備肝癌藥物之用途，特別係藉由牛蒡子苷元作為肝癌細胞抑制劑以抑制核轉錄因子及核轉錄蛋白之活化，使癌細胞發生細胞凋亡(Apoptosis)，具有達到抑制肝癌細胞增生之功效。
本發明之牛蒡子苷元用以製備肝癌藥物之用途，特別係藉由牛蒡子苷元有效抑制肝癌細胞中乙二醛酶基因的表現，使肝癌細胞中乙二醛酶之含量不足以清除肝癌細胞內的毒素，具有使肝癌細胞發生毒殺作用而無法增生或擴散之功效。
本發明促肝癌細胞凋亡之醫藥組合物，係包含有上述之牛蒡子苷元作為活性成分，該牛蒡子苷元可應用於製備抑制肝癌細胞增生之醫藥組合物，使肝癌細胞發生細胞毒殺及細胞凋亡作用，進而抑制肝癌細胞增生，以提升臨床醫療的水準，為本發明之功效。
雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
第1圖：本發明之牛蒡子苷元化學結構示意圖。
第2圖：本實施例之肝癌細胞存活率折線圖。
第3a圖：本實施例不同濃度之牛蒡子苷元對肝癌細胞作用6小時之西方墨點法對STAT3及pSTAT3之染色結果圖。
第3b圖：本實施例不同濃度之牛蒡子苷元對肝癌細胞作用12小時之西方墨點法STAT3及pSTAT3之染色結果圖。
第4a圖：本實施例不同濃度之牛蒡子苷元對肝癌細胞作用12小時之西方墨點法GLO-1之染色結果圖。
第4b圖：本實施例不同濃度之牛蒡子苷元對肝癌細胞作用24小時之西方墨點法GLO-1之染色結果圖。
附件一：本實施例以不同牛蒡子苷元濃度作用於肝癌細胞之細胞核型態的共軛焦螢光顯微鏡照片。
附件二：本實施例以不同牛蒡子苷元濃度作用於肝癌細胞之NFκB轉位現象的共軛焦螢光顯微鏡照片。
附件三：本實施例以不同牛蒡子苷元濃度作用於肝癌細胞之STAT3轉位現象的共軛焦螢光顯微鏡照片。

Claims (8)

  1. 一種牛蒡子苷元用以製備肝癌藥物之用途，該牛蒡子苷元係具有促進肝癌細胞發生細胞凋亡及細胞毒殺作用。
  2. 依申請專利範圍第1項所述之牛蒡子苷元用以製備肝癌藥物之用途，其中，牛蒡子苷元係抑制肝癌細胞之核轉錄因子之轉位現象。
  3. 依申請專利範圍第2項所述之牛蒡子苷元用以製備肝癌藥物之用途，其中，該核轉錄因子為NF-κB(Nuclear factor κ-light-chain-enhancer of activated B cells)。
  4. 依申請專利範圍第1項所述之牛蒡子苷元用以製備肝癌藥物之用途，其中，牛蒡子苷元係抑制肝癌細胞之核轉錄蛋白之磷酸化或轉位現象。
  5. 依申請專利範圍第4項所述之牛蒡子苷元用以製備肝癌藥物之用途，其中，該核轉錄蛋白為STAT3(Signal tranducers and activators of transcription 3)。
  6. 依申請專利範圍第1項所述之牛蒡子苷元用以製備肝癌藥物之用途，其中，牛蒡子苷元係抑制肝癌細胞之乙二醛酶(Glyoxalase I)基因表現，降低該肝癌細胞內之乙二醛酶表現量。
  7. 一種促肝癌細胞凋亡之醫藥組合物，係包含：牛蒡子苷元，作為抑制肝癌細胞增生之活性成分；以及至少一種醫藥可接受之藥物佐劑或藥物載劑，使牛蒡子苷元成型為該醫藥組合物。
  8. 依申請專利範圍第7項所述之促肝癌細胞凋亡之醫藥組合物，其中，該醫藥組合物係錠劑、膠囊、粉劑、粒劑或液劑。
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