JP2018513130A

JP2018513130A - Ｈｓｐ９０阻害ペプチド結合体及びその腫瘍治療における応用

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Publication number: JP2018513130A
Application number: JP2017549252A
Authority: JP
Inventors: 雁勇劉; 楠楊; 萍萍左
Original assignee: 中国医学科学院基礎医学研究所
Priority date: 2015-04-27
Filing date: 2015-10-14
Publication date: 2018-05-24
Anticipated expiration: 2035-10-14
Also published as: KR101858654B1; US20190365911A1; CN104800858B; WO2016173214A1; US10918731B2; JP6462147B2; EP3269393A4; EP3269393A1; EP3269393B1; CN104800858A; KR20170116154A

Abstract

ＨＳＰ９０阻害ペプチドと細胞傷害剤をリンカーで結合して得る結合体及びその腫瘍を予防及び／又は治療する薬物の製造における用途。前記結合体は、標的送達、化学治療およびアポトーシス促進の三つの抗腫瘍効能を有し、薬物の腫瘍殺滅能力を高めるだけでなく、その分薬物の投与量を減少させて、化学療法薬の蓄積による毒性や副作用を大幅に軽減させる。【選択図】なし

Description

本発明は標的抗腫瘍薬に関し、具体的には、熱ショックタンパク質９０阻害ペプチド結合体の腫瘍治療用の標的治療結合体の製造における応用に関する。

悪性腫瘍は人の生命や健康に重大な脅威であり、現在のがん治療効果を改善することは、医療従事者の重要な使命である。臨床上使用されている大部分の化学療法薬は腫瘍標的性が悪く、投与後に優先的に腫瘍の病巣に濃縮されるのではなく、腫瘍に作用する薬物の総量が一般的に全投与量の５−１０％しかない。また、化学療法薬の毒性や副作用により化学療法薬の最適な使用量が制限されて、最終的に化学療法薬が十分に実施できないこと、早期再発及び化学療法抵抗性を引き起こしてしまう。

現在、腫瘍細胞特有の突然変異シグナル経路であるチロシンキナーゼ阻害剤類は臨床使用に成功している。突然変異型患者の場合、このような薬物は、治療効果が高いだけでなく、毒性や副作用が小さい。しかしながら、このような新薬は抗腫瘍スペクトルが狭く、１０−１２ヶ月使用後に薬剤耐性が発生する等の欠点がある。がん原シグナル経路は互いに複数の平行関係があり、多くの場合に、互いを補ったり、交換したりすることができるため、１本の経路をブロックするだけでは癌細胞の生存を危険にさらすほどのものではない。このような欠点を克服するために、これら経路の交点に注目して、複数の経路を遮断して、薬物の作用や効果を向上させて、薬物の抗腫瘍スペクトルと患者それぞれへの適用性を改善する薬物を開発しようとしている。ＨＳＰ９０はそのうちの１種である。

ＨＳＰ９０は真核細胞に幅広く存在している分子シャペロンで、一般的に主に細胞内で新に合成したクライアントタンパク質のペプチド鎖（ＮａｓｃｅｎｔｐｅｐｔｉｄｅｏｆＣｌｉｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ）が正確に折り畳まれて様々な生化学的機能を有する酵素、受容体又はシグナル因子等になるように補助的役割を果たす。化学療法薬の作用下で、腫瘍細胞はＨＳＰ９０の発現を迅速に向上させることを含む保護メカニズムを起動させる。このような保護メカニズムは、腫瘍化学療法からのエスケープ及び薬剤耐性を引き起こす重要な基盤となる。腫瘍細胞のＨＳＰ９０発現レベルは一般的に正常な細胞よりも２−１０倍高く（非特許文献１）、また、細胞膜にも多量のＨＳＰ９０が発現されている（非特許文献２）。公知の数十種類のがん原シグナルタンパク質はＨＳＰ９０のクライアントタンパク質であることから（非特許文献３）、ＨＳＰ９０はがん原シグナルネットワークの重要な交点になり、腫瘍細胞のＨＳＰ９０分子子シャペロンの機能を阻害することによって、複数種のがん原タンパク質の分解を同時に促進することが可能である。同様に、ＨＳＰ９０は細胞のオートファジープロセスを制御することで細胞の薬物応答に関与するため、ＨＳＰ９０を阻害することによって腫瘍の治療効果を改善することも期待できる。

発明人による発明特許（特許文献１、発明名称：腫瘍特異的標的ペプチド及びその応用）に記載のように、ファージディスプレイ技術により、肺癌と特異的に結合可能な標的ペプチド（アミノ酸配列はＬＰＬＴＰＬＰであり、以下、単にＰ７という）をスクリーニングして、該腫瘍特異的標的ペプチドとドセタキセルを封入したバイオポリマー材料のポリ乳酸とを連結し、腫瘍早期診断や治療用の薬剤を製造する。以下、前記標的ペプチドとドセタキセルを封入したポリ乳酸で形成された結合体は標的ペプチドナノ製剤（ＴＮ−ＤＴＸ）とも呼ばれる。

中国特許出願２０１３１０２５８４７６．０号明細書

ＦｅｒｒａｒｉｎｉＭ，ＨｅｌｔａｉＳ，ＺｏｃｃｈｉＭＲ，ＲｕｇａｒｌｉＣ．Ｕｎｕｓｕａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｈｅａｔ−ｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｈｕｍａｎｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓ．ＩｎｔＪＣａｎｃｅｒ１９９２；５１：６１３−９。１６６．Ｂｅｃｋｅｒ，Ｂ．等，ＩｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆＨＳＰ９０ｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｍａｌｉｇｎａｎｔｍｅｌａｎｏｍａｓａｎｄｍｅｌａｎｏｍａｍｅｔａｓｔａｓｅｓ．Ｅｘｐ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２００４；１３：２７−３２。Ｚｈａｏ，Ｒ．等，Ｎａｖｉｇａｔｉｎｇｔｈｅｃｈａｐｅｒｏｎｅｎｅｔｗｏｒｋ：ａｎｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅｍａｐｏｆｐｈｙｓｉｃａｌａｎｄｇｅｎｅｔｉｃｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｍｅｄｉａｔｅｄｂｙｔｈｅＨＳＰ９０ｃｈａｐｅｒｏｎｅ．Ｃｅｌｌ２００５；１２０：７１５−７２７。

出願人は、腫瘍細胞の膜表面タンパク質を抽出して、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ってタンパク質を回収して質量分析同定を行ったところ、アミノ酸配列がＬＰＬＴＰＬＰの標的ペプチド（以下、単に標的ペプチドと呼ばれる）の結合部位タンパク質がＨＳＰ９０である。タンパク質ブロッティング実験により前記標的ペプチドによるＨＳＰ９０発現への影響を研究した結果、標的ペプチドは、腫瘍細胞に用いる場合、ＨＳＰ９０の発現を直接低下できることが明らかになる。従って、該標的ペプチドはＨＳＰ９０阻害ペプチドである。

背景技術に記載のように、ＨＳＰ９０は複数種の腫瘍細胞で高発現されており、細胞の外界温度、薬物や放射線による刺激への抵抗に有利であり、腫瘍再発及び薬剤耐性の過程に対し重要な作用を果たす。出願人は、標的ペプチドとドセタキセルの併用による作用について検討した。

ドセタキセル及び標的ペプチドで処置すると、腫瘍細胞内のオートファジー関連タンパク質Ｂｅｃｌｉｎ１及びＬＣ３のタンパク質発現レベルは変化する。標的ペプチド単独で投与する場合、腫瘍細胞内のオートファジー関連タンパク質Ｂｅｃｌｉｎ１及びＬＣ３のタンパク質発現に影響を及ぼさない。ドセタキセル単独で使用する場合、細胞内のＢｅｃｌｉｎ１の発現レベルは著しく上昇し、同時に、ＬＣ３−Ｉ型はＬＣ３−ＩＩ型へ変換し、それは、細胞内のオートファジーレベルが高くなることを示す。ドセタキセルと標的ペプチドを同時に投入する場合、ドセタキセルだけを使用する場合に比べて、オートファジー関連タンパク質Ｂｅｃｌｉｎ１の発現レベルは著しく低下し、ＬＣ３−Ｉ型からＬＣ３−ＩＩ型への変換はある程度で逆転し、その結果から明らかなように、標的ペプチドはドセタキセルによる腫瘍細胞のオートファジーを著しく抑制できる。

以上から分かるように、前記標的ペプチドは標的作用を有するだけでなく、ドセタキセルと併用することにより腫瘍細胞のオートファジーからアポトーシスへの変換を促進し、さらに腫瘍細胞に対する殺滅作用を高めることができる。以上に基づいて、出願人は前記標的ペプチドとドセタキセルを結合して、標的送達、オートファジー抑制及び腫瘍殺滅の機能を備えた結合体を製造し、以下はＤＴＸ−Ｐ７で示される。

本発明についてインビボ実験を行った結果、一般的な製剤及び該標的ペプチドを用いて製造されたナノ製剤に比べて、前記結合体は、腫瘍の体積を大幅に減少でき、肺腺癌、乳癌、黒色腫等の細胞に対しても顕著な殺滅作用を有する。

本発明は、該ＨＳＰ９０阻害ペプチドの細胞傷害剤結合体の製造における用途を提供する。本発明の前記ＨＳＰ９０阻害ペプチドは、腫瘍細胞を特異的に結合するとともに細胞内のＨＳＰ９０発現を阻害できる。

本発明はさらにＨＳＰ９０阻害ペプチドと細胞傷害剤をリンカーで連結してなる結合体を提供する。好ましくは、前記ＨＳＰ９０阻害ペプチドのアミノ酸配列はＬＰＬＴＰＬＰであり、好ましくは前記ＨＳＰ９０阻害ペプチドのアミノ末端に１−３個のＧ、カルボキシル末端にＳ、ＳＨ又はＳＨＳが連結されている。好ましくは、前記細胞傷害剤はドセタキセル、タキソール及びアドリアマイシンから選ばれる。好ましくは、前記リンカーは一般式−ＣＯ−（ＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎ−ＣＯ−（ただし、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０から選ばれる。）、好ましくは−ＣＯ−ＣＨ_２ＣＨ_２−ＣＯ−である。

本発明で提供する前記ＨＳＰ９０阻害ペプチドは、リンカーにより、エステル化又はアミド化反応を行って、ドセタキセル、タキソールやアドリアマイシン等の細胞傷害剤とともに結合体を製造するものであり、好ましくは、標的ペプチドのアミノ末端がリンカーによりドセタキセルとタキソールの２−ＯＨに連結されて、結合体を製造する。

一方、本発明はさらに、前記ＨＳＰ９０阻害ペプチドのアミノ末端がリンカーによりアドリアマイシンの１０−リキソヘキソピラノシル上の−３−ＮＨ_２に連結されてなる結合体を提供する。

一方、本発明はさらに、前記ＨＳＰ９０阻害ペプチドのアミノ末端がリンカーによりアドリアマイシンの８−ヒドロキシアセチルに連結されて結合体を製造することを提供する。

本発明は、上記本発明の結合体を活性成分とする薬物に関する。本発明の結合体と１種又は複数種の薬学的に許容可能な固体又は液体賦形剤及び／又はアジュバントとを組み合わせて、人又は動物の使用に適するいずれかの剤型に製造する。本発明はさらに、前記結合体の、腫瘍を予防及び／又は治療する薬物の製造における用途に関する。前記腫瘍は、ＨＳＰ９０高発現腫瘍、好ましくは肺癌、肺腺癌、黒色腫、胃癌、乳癌、腎臓癌、肝癌、口腔扁平上皮癌、子宮頸癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、結腸癌及び神経腫瘍、より好ましくは肺腺癌、乳癌及び黒色腫、更に好ましくは肺腺癌である。

本発明の結合体は、単位用量で投与することができ、投与方法として腸内投与又は非腸内投与があり、例えば、経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経鼻投与、口腔粘膜投与、経眼投与、経肺・経気道投与、経皮投与、膣内投与、直腸投与等としてもよい。

投与剤型は、液体剤型、固体剤型又は半固体剤型であってもよい。液体剤型は溶液剤（真溶液とコロイド溶液を含む）、乳剤（ｏ／ｗ型、ｗ／ｏ型及び二重エマルジョンを含む）、懸濁剤、注射剤（水注射剤、粉末注射剤及び輸液剤を含む）、点眼剤、点鼻剤、洗剤や塗り薬等であってもよく、固体剤型は錠剤（通常の錠剤、腸溶性錠剤、バッカル錠、分散性錠剤、チュアブル錠、発泡錠、口腔内崩壊錠を含む）、カプセル剤（ハードカプセル、ソフトカプセル、腸溶性カプセル）、顆粒剤、散剤、ペレット、ドリッピング丸薬、座薬、フィルム剤、パッチ、エアロゾル（乾燥粉末吸入剤）、噴霧剤等であってもよく、半固体剤型は軟膏剤、ゲル剤、パスタ剤等であってもよい。

本発明に係る結合体は、普通の製剤にしてもよく、徐放性製剤、放出制御製剤、標的製剤や各種の微粒子投与システムにしてもよい。

本発明に係る結合体を錠剤にするために、希釈剤、接着剤、湿潤剤、崩壊剤、滑剤、流動促進剤等の本分野で公知の各種の賦形剤を使用することができる。希釈剤は、澱粉、デキストリン、スクロース、グルコース、ラクトース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、微結晶セルロース、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、炭酸カルシウム等としてもよく、湿潤剤は水、エタノール、イソプロパノール等であってもよく、接着剤はデンプンスラリー、デキストリン、シロップ、蜂蜜、グルコース溶液、微結晶セルロース、アラビアゴムスラリー、ゼラチンスラリー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、アクリル酸樹脂、カルボマー、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール等であってもよく、崩壊剤は乾燥デンプン、微結晶セルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、架橋ポリビニルピロリドン、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル、ドデシルスルホン酸ナトリウム等であってもよく、滑剤及び流動促進剤は、タルク粉、シリカ、ステアリン酸塩、酒石酸、液体パラフィン、ポリエチレングリコール等であってもよい。

また、錠剤はコーティング錠、たとえば糖衣コーティング錠、フィルムコーティング錠、腸溶コーティング錠、又は二層錠や多層錠にしてもよい。

投与ユニットをカプセル剤にするために、有効成分として本発明の結合体と希釈剤、流動促進剤とを混合して、混合物をハードカプセル又はソフトカプセルに直接装入してもよい。また、まず、有効成分として本発明の化合物と希釈剤、接着剤、崩壊剤を粒子又はペレットにして、次にハードカプセル又はソフトカプセルに装入してもよい。本発明の化合物の錠剤を製造するための希釈剤、接着剤、湿潤剤、崩壊剤、流動促進剤は本発明の化合物のカプセル剤の製造にも用いられ得る。

本発明に係る結合体を注射剤にするために、水、エタノール、イソプロパノール、プロピレングリコール又はそれらの混合物を溶媒として、本分野で一般的に使用される可溶化剤、助溶剤、ｐＨ調整剤、浸透圧調整剤を適量添加してもよい。可溶化剤又は助溶剤は、ポロキサマー、レシチン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン等であってもよく、ｐＨ調整剤はリン酸塩、酢酸塩、塩酸、水酸化ナトリウム等であってもよく、浸透圧調整剤は塩化ナトリウム、マンニトール、グルコース、リン酸塩、酢酸塩等であってもよい。凍結乾燥粉末注射剤を製造する場合は、さらにマンニトール、グルコース等をサポート剤として添加してもよい。

また、必要に応じて、薬物製剤に着色剤、防腐剤、香料、矯味剤又はほかの添加剤を添加してもよい。

薬用目的を達成させるために、本発明の薬物はいずれかの周知の投与方法により投与できる。

本発明に係る結合体は独立して服用してもよいし、ほかの治療薬又は対症薬と併用してもよい。

本発明に係る結合体の抗腫瘍効果は既に証明されているため、悪性腫瘍の治療に用いられ得る。

本発明は、ＨＳＰ９０阻害ペプチドと、ドセタキセル、タキソールやアドリアマイシン等の細胞傷害剤とを連結することで結合体を製造することを開示しており、薬物の腫瘍殺滅能力を高めるだけでなく、その分、使用量を減少させ、化学療法薬の蓄積による各種の毒性や副作用を軽減でき、応用価値が非常に高い。薬物結合体は、標的送達、化学治療及びアポトーシス促進の三つの抗腫瘍効能を有し、腫瘍治療効果の改善、例えば腫瘍薬剤耐性逆転の分野に幅広く適用できる。

標的ペプチドの結合部位がＨＳＰ９０であることを示す図である。標的ペプチドによるＨＳＰ９０発現、細胞オートファジー及びアポトーシスへの影響を示す図の一つであり、タンパク質ブロッティング実験を示し、標的ペプチドが熱ショックタンパク質９０の発現を効果的に低下でき、且つ一定の濃度依存関係を有することを示す図である。標的ペプチドによるＨＳＰ９０発現、細胞オートファジー及びアポトーシスへの影響を示す図の一つであり、標的ペプチドがドセタキセルによる腫瘍細胞オートファジーを大幅に抑制することを示す図である。標的ペプチドによるＨＳＰ９０発現、細胞オートファジー及びアポトーシスへの影響を示す図の一つであり、標的ペプチドがドセタキセルによる腫瘍細胞オートファジーを大幅に抑制することを示す図である。標的ペプチドによるＨＳＰ９０発現、細胞オートファジー及びアポトーシスへの影響を示す図の一つであり、標的ペプチドがドセタキセルによる腫瘍細胞オートファジーを大幅に抑制することを示す図である。標的ペプチドによるＨＳＰ９０発現、細胞オートファジー及びアポトーシスへの影響を示す図の一つであり、ＡｎｎｅｘｉｎＶ法によるアポトーシス検査であり、標的ペプチドが細胞のアポトーシス発生を促進するとともに、ドセタキセルにより誘導される細胞アポトーシスを促進できることを示す図である。標的ペプチドによるＨＳＰ９０発現、細胞オートファジー及びアポトーシスへの影響を示す図の一つであり、細胞電子顕微鏡像であり、標的ペプチドがドセタキセルにより誘導される細胞アポトーシスを促進できることを示す図である。結合体ＤＴＸ−Ｐ７の質量分析スペクトルを示す図である。各群のヌードマウスの体重変化を示す図である。ＤＴＸ、ＤＴＸ−Ｐ７、ＴＮ−ＤＴＸ治療群のヌードマウスの腫瘍解剖図である。ＤＴＸ、ＤＴＸ−Ｐ７、ＴＮ−ＤＴＸによる腫瘍相対体積への影響を示す図である。以上の各図において、＊はモデル群との比較を示す。＃はＤＴＸとＴＮ−ＤＴＸとの比較を示す。

以下の実施例は本発明の内容をより説明するが、本発明を制限するものではない。本発明の精神及び主旨を脱逸せずに、本発明の方法、ステップ又は条件について行う修正や置換はすべて、本発明の範囲に属する。特に明示しない限り、実施例に使用される技術手段は当業者が公知する一般的な手段である。

（実施例１）標的ペプチド結合部位及びＨＳＰ９０発現への影響

膜タンパク質抽出キットを用いてタンパク質を抽出し、ＳＤＳ−Ｐａｇｅ電気泳動を行って、ゲルを切って目的タンパク質を回収し、制限酵素処理を行って質量分析を実施したところ、図１に示すように、バンドＡは分子量が５３Ｋｄで、熱ショックタンパク質９０ｋＤαを示し、バンドＢは分子量が４８Ｋｄで、熱ショックタンパク質９０ｋＤβを示す。同定した結果、該結合ターゲットはＨＳＰ９０であった（図１）。

（実施例２）標的ペプチドによるＨＳＰ９０発現への影響

（１）ヒト肺腺癌Ａ５４９細胞を用いてパンクレアチン消化処理を行い、８００×ｇを５ｍｉｎ遠心処理し、ＰＢＳで再懸濁させて、細胞をカウントし、密度を１×１０^６／ｍｌに調整した。
（２）６ウェルプレートを１ｍｌ／ウェルで接種して、次に培地２ｍｌを加え、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩培養した。
（３）１ウェルの標的ペプチドごとに培地３００μｌを加えて、最終濃度がそれぞれ１０^−４Ｍになるように希釈し、陰性対照に等体積の培地を加えて、３７℃、５％ＣＯ_２で４８ｈ作用させ、各群について３つのウェルを設置して、独立に実験を３回繰り返した。タンパク質を抽出してタンパク質ブロッティング分析を行った。
結果から明らかなように、標的ペプチドは熱ショックタンパク質９０の発現を効果的に低下させ、且つ一定の濃度依存関係を示す（図２Ａ）。したがって、該標的ペプチドはＨＳＰ９０阻害ペプチドであった。

（実施例３）標的ペプチドによる細胞アポトーシスへの影響

接種細胞を培養して、培地で標的ペプチドを希釈し、対応した濃度を有するドセタキセル溶液を調製した。陰性対照に等量の培地を加えて、標的ペプチド群に１０^−４Ｍの標的ペプチドを加え、ドセタキセル群に１０^−９Ｍを加え、ドセタキセルと標的ペプチドの併用群にそれぞれ１０^−４Ｍの標的ペプチドと１０^−９Ｍのドセタキセルを加えた。３７℃、５％ＣＯ_２で６ｈ作用させた。ＡｎｎｅｘｉｎＶ法によりアポトーシスを検査して、タンパク質を抽出してアポトーシスタンパク質を検出した。

ＡｎｎｅｘｉｎＶ法によるアポトーシス検出結果から明らかなように、標的ペプチドを添加すると、細胞アポトーシスの発生を誘導でき、ドセタキセルと併用すると、更に細胞アポトーシスを誘導できる。

タンパク質ブロッティングの結果から明らかなように、標的ペプチドを添加すると、カスパーゼ−３（Ｃａｓｐａｓｅ−３）がある程度で分裂し、さらに、ドセタキセルと併用する場合は、ドセタキセルだけを使用する場合に比べて、Ｃａｓｐａｓｅ−３の分裂領域はより明らかになる。図２Ｅと図２Ｆは、標的ペプチドが細胞のアポトーシスの発生を促進でき、さらにドセタキセルにより誘導される細胞アポトーシスを促進できることを示す。

（実施例４）標的ペプチドによる細胞オートファジーへの影響

接種細胞を培養して、培地で標的ペプチドを希釈し、対応した濃度を有するドセタキセル溶液を調製した。陰性対照に等量の培地を加え、標的ペプチド群に１０^−４Ｍの標的ペプチドを加え、ドセタキセル群に１０^−９Ｍを加え、ドセタキセルと標的ペプチドの併用群にそれぞれ１０^−４Ｍの標的ペプチド及び１０^−９Ｍのドセタキセルを加えた。３７℃、５％ＣＯ_２で６ｈ作用させた。オートファゴソームを検査し、タンパク質を抽出してオートファジータンパク質を検出した。

図２Ｂ−図２Ｄの結果から明らかなように、ドセタキセル及び標的ペプチドで処理した後、細胞内のオートファジー関連タンパク質Ｂｅｃｌｉｎ１及びＬＣ３のタンパク質の発現レベルは変化し、標的ペプチド単独で投与する場合、細胞内にこれらタンパク質発現レベルは大幅に変化することがなく、ドセタキセルで誘導されると、細胞内にＢｅｃｌｉｎ１の発現レベルは著しく高くなり、同時に、ＬＣ３−Ｉ型はＬＣ３−ＩＩ型へ変換し、オートファジーレベルの上昇を示す。ドセタキセルと標的ペプチドを同時に加えると、ドセタキセル単独で使用する場合に比べて、オートファジー関連タンパク質Ｂｅｃｌｉｎ１の発現レベルは著しく低下し、ＬＣ３−Ｉ型からＬＣ３−ＩＩ型への変換もある程度で逆転した。標的ペプチドはドセタキセルによる腫瘍細胞オートファジーを確実に抑制できることを示す。

（実施例５）ドセタキセル−ＨＳＰ９０阻害ペプチドＰ７結合体（ＤＴＸ−Ｐ７）の製造

＜ＤＴＸ−Ｓｕｃの合成＞

ＤＴＸ１．５ｇと無水コハク酸（Ｓｕｃｃｉｎｉｃａｎｈｙｄｒｉｄｅ、略語Ｓｕｃ）０．５ｇをジクロロメタン２０ｍｌに溶解して、ピリジン０．５ｍｌを加え、常温で１週間撹拌して、反応がほぼ終了した。ジクロロメタンを減圧除去し、残留物に５％クエン酸水溶液を５０ｍｌ加えて、酢酸エチル５０ｍｌで３回抽出し、有機相を混合し、乾燥後に酢酸エチルを減圧除去して、ＤＴＸ−Ｓｕｃ粗製品を得て、粗製品を分取型Ｃ１８カラムを通して精製し、凍結乾燥させて、ＤＴＸ−Ｓｕｃを得て、ＨＰＬＣ分析を行った。クロマトグラフィー製造方法：移動相：アセトニトリル４０−７０％（水６０−３０％）／０−３０ｍｉｎ、流速２０ｍｌ／ｍｉｎ。クロマトグラフィー分析方法：移動相：アセトニトリル０−５０％（水１００−５０％）／０−５０ｍｉｎ、流速１ｍｌ／ｍｉｎ。

＜ＤＴＸ−Ｐ７の合成＞

固相ペプチド合成法によりＰ７を製造した。Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−Ｔｒｔ樹脂（０．５ｍｍｏｌ、樹脂置換度０．６ｍｍｏｌ／ｇ）０．８３ｇに配列に従ってアミノ酸を接続し、ペプチド鎖の構築が終了すると、ＤＴＸ−Ｓｕｃをペプチド鎖のＮ−末端に連結させた。樹脂から分解した結合体粗製品を分取Ｃ１８カラムを通して精製し、ターゲット留分を収集して、凍結乾燥させ、ＤＴＸ−Ｐ７を得て、ＨＰＬＣ分析と質量分析を行った。クロマトグラフィー製造方法：移動相：アセトニトリル４０−７０％（水６０−３０％）／０−３０ｍｉｎ、流速２０ｍｌ／ｍｉｎ。クロマトグラフィー分析方法：移動相：アセトニトリル０−５０％（水１００−５０％）／０−５０ｍｉｎ、流速１ｍｌ／ｍｉｎ。ＤＴＸ−Ｐ７質量分析図は図３に示される。

同一方法によりタキソールヘプタペプチド結合体ＰＴＸ−Ｐ７（化２に示す構造式）、アドリアマイシンＮＨ２ヘプタペプチド結合体（ＤＯＸ−Ｐ７）（化３に示す構造式）及びアドリアマイシンＯＨ位ヘプタペプチド結合体（ＤＯＸ−ＯＨ−Ｐ７）（化４に示す構造式）を製造した。

（実施例６）ヒト非小細胞肺癌のヌードマウス皮下移植モデルの製造

対数成長期にあるヒト非小細胞肺癌Ａ５４９細胞を収集して、１０％ＦＢＳを含有するＦ−１２Ｋ培地１ｍｌを加え、軽くピペッティングして単一細胞懸濁液になるまで均一に混合して、適当に希釈し、細胞をカウントした。Ｍａｔｒｉｇｅｌマトリゲルを氷浴に入れて凍結融解し、予備冷却されたピペットヘッドで細胞懸濁液とＭａｔｒｉｇｅｌマトリゲル（１：３）を所定比率で混合して、細胞濃度を８×１０６／ｍｌに調整し、氷浴で保存して使用に備えた。

ＳＰＦグレードの３−４周齢で約１６ｇのＢＡＬＢ／ｃ（ｎｕ／ｎｕ）雌ヌードマウス３０匹を用いて、実験前に１週間環境に適応させた。モデルを作成する時、まずイオドフォアでヌードマウスの右前肢の腋窩の皮膚を消毒して、１ｍｌの無菌ＢＤ注射器を用いてＡ５４９細胞懸濁液を適量で吸い取り、注射器の針先端部を皮膚と平行にして刺し、細胞懸濁液１００μｌをヌードマウスの右前肢の腋窩の皮下（接種濃度８×１０５／１００μｌ）に接種した。細胞接種終了後、ヌードマウスの状態を観察して、ケージに入れて飼養し続けた。

（実施例７）担癌ヌードマウスへの群別投与

ヌードマウスの生着をリアルタイムに観察して、生着すると、ノギスで測定して、腫瘍の大きさを記録し、腫瘍が形成され且つ体積が１００ｍｍ^３に達すると（腫瘍体積＝長径×短径^２／２）、生理食塩水群（対照）、ドセタキセル群（ＤＴＸ）、ドセタキセル標的ナノ薬物群（ＴＮ−ＤＴＸ）及びドセタキセル−ペプチドＰ７結合物群（ＤＴＸ−Ｐ７）の４群にランダムに分けた。

動物をそれぞれの群に分けて２日目に、腹腔内注射投与方式により、１週間に１回投与するように、計４週間投与した。初回投与日を０日目として、投与日はそれぞれ０日目、７日目、１４日目、２１日目となる。投与量はＤＴＸ濃度で計算すると、１０ｍｇ／ｋｇであった。

１週間にヌードマウスの状況を２回観察して、体重を記録し、ノギスを用いて腫瘍の長径と短径を測定し、下式により腫瘍体積（Ｔｕｍｏｒｖｏｌｕｍｅ、Ｖ）と相対腫瘍体積（Ｒｅｌａｔｉｖｅｔｕｍｏｒｖｏｌｕｍｅ、ＲＴＶ）を算出した。

Ｖ＝１／２×ａ×ｂ^２（長径ａ、短径ｂ）

ＲＴＶ＝Ｖｔ／Ｖ０（初回投与時の腫瘍体積をＶ０、投与してｔ日目の腫瘍体積をＶｔとする）

初回投与５週間後（すなわち２８日目）、ヌードマウスに０．５％のペントバルビタールナトリウム溶液を腹腔内注射して麻酔し（用量５０ｍｇ／ｋｇ）、頚椎脱臼方法で動物を殺して、ヌードマウスの右前肢の腋窩皮下における腫瘍組織を分離し、腫瘍の質量を秤量して記録した。腫瘍群を切り開いて、一部を４％パラホルムアルデヒド溶液に浸漬して４℃で保存し、残りを液体窒素で急冷して−８０℃で凍結保存した。

重量監視結果から明らかなように、各群動物の体重に有意的な差異がなく、各種ＤＴＸ製剤は優れた安全性を有することを示す（図４）。図５は各群の動物の腫瘍成長状況を示し、図６は曲線図で各群の動物の腫瘍成長状況を示す。以上から示すように、ＤＴＸ、ＤＴＸ−Ｐ７、ＴＮ−ＤＴＸのいずれも腫瘍に対してある程度の阻害作用を示す。そのうち、ＤＴＸ−Ｐ７の抗腫瘍作用は最も著しく、対照群に比べて、４日目に相対腫瘍体積は著しく減少し始めた（ｐ＜０．０５）。ＤＴＸ−Ｐ７の効果はＤＴＸより高く、同時に、出願人の早期特許で開示されたナノ標的薬物ＴＮ−ＤＴＸ（ｐ＜０．０１）よりも優れた。以上の結果から明らかなように、ＤＴＸ−Ｐ７の腫瘍抑制効果は、ドセタキセルと標的ペプチドの抑制効果の単なる組み合わせだけでなく、予想以上の抑制効果を有する。本願人に開示されているＴＮ−ＤＴＸに比べても、ＤＴＸ−Ｐ７の抑制効果の差異も大幅に顕著である。それは、細胞傷害剤と前記ＨＳＰ９０阻害ペプチドをリンカーにより接続してなる結合体が、開示されているナノ標的薬物ＴＮ−ＤＴＸに比べて、顕著な阻害腫瘍成長効果を有することを示す。

（実施例８）四種類の結合体による複数種の腫瘍細胞への毒性実験

肺腺癌Ａ５４９、乳癌ＭＣＦ−７Ｓ及び黒色腫細胞Ａ３７５を希釈して３×１０^４／ｍｌの単一細胞懸濁液にし、１ウェル毎に１００μｌを接種するように９６ウェルプレートに接種して、２４ｈ培養後、それぞれ５、２０、８０、３２０ｎＭのＤＴＸ−Ｐ７、タキソールヘプタペプチド結合体（ＰＴＸ−Ｐ７）、アドリアマイシンＮＨ２ヘプタペプチド結合体（ＤＯＸ−Ｐ７）及びアドリアマイシンＯＨ位ヘプタペプチド結合体（ＤＯＸ−ＯＨ−Ｐ７）を加えて４８ｈインキュベートし、１ウェルにＣＣＫ−８溶液１０μｌを加えて、１．５ｈインキュベーション後、４５０ｎｍ波長で吸光度値を測定して、細胞の生存率を統計し、三種類の結合体の半数阻害濃度ＩＣ_５０を計算した。表１（四種類の結合体による各種の腫瘍細胞への殺滅作用（ＩＣ_５０、ｎＭ））から分かるように、四種類の結合体は、複数種の腫瘍細胞に対して優れた殺滅作用を有し、複数種の腫瘍の治療が期待できる。

Claims

結合体であって、
ＨＳＰ９０阻害ペプチドと細胞傷害剤をリンカーで連結して得ることを特徴とする結合体。
前記ＨＳＰ９０阻害ペプチドのアミノ酸配列はＬＰＬＴＰＬＰであり、好ましくは前記ＨＳＰ９０阻害ペプチドのアミノ末端に１−３個のＧが接続され、カルボキシル末端にＳ、ＳＨ又はＳＨＳが接続されている請求項１に記載の結合体。
前記細胞傷害剤はドセタキセル、タキソール及びアドリアマイシンから選ばれる請求項１又は２に記載の結合体。
前記リンカーは、一般式−ＣＯ−（ＣＨ_２ＣＨ_２）ｎ−ＣＯ−（ただし、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０から選ばれる）を有し、
前記リンカーは好ましくは−ＣＯ−ＣＨ_２ＣＨ_２−ＣＯ−である請求項１又は２に記載の結合体。
ＨＳＰ９０阻害ペプチドのアミノ末端は、リンカーによってドセタキセル又はタキソールの２−ＯＨに連結されるか、前記ＨＳＰ９０阻害ペプチドのアミノ末端は、リンカーによってアドリアマイシンの１０−リキソヘキソピラノシル上の−３−ＮＨ２に連結されるか、又は前記ＨＳＰ９０阻害ペプチドのアミノ末端は、リンカーによってアドリアマイシンの８−ヒドロキシアセチルに連結されている接請求項１又は２に記載の結合体。
前記結合体は、下記化１〜化４に示す構造式を有する結合体から選ばれる請求項５に記載の結合体。
請求項１−６のいずれか１項に記載の結合体の、腫瘍を予防及び／又は治療する薬物の製造における使用。
前記腫瘍は、ＨＳＰ９０を高発現させる腫瘍であり、
好ましくは、肺癌、肺腺癌、黒色腫、胃癌、乳癌、腎臓癌、肝癌、口腔扁平上皮癌、子宮頸癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、結腸癌及び神経腫瘍、より好ましくは肺腺癌、乳癌及び黒色腫、更に好ましくは肺腺癌から選ばれる請求項７に記載の使用。
請求項１−６のいずれか１項に記載の結合体及び薬学的に許容可能な賦形剤を含む腫瘍成長を阻害する腫瘍標的製剤。