CN116327772A - SMO抑制剂Sonidegib对管腔型乳腺癌骨转移的靶向治疗方法 - Google Patents

SMO抑制剂Sonidegib对管腔型乳腺癌骨转移的靶向治疗方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了SMO抑制剂Sonidegib对管腔型乳腺癌骨转移的靶向治疗方法。具体地，本发明提供了SMO抑制剂Sonidegib治疗管腔型乳腺癌骨转移的新用途。本发明通过实验发现，SMO的靶向抑制剂Sonidegib能够降低骨转移灶周围成骨细胞的分化，能够有效地抑制乳腺癌细胞骨转移，为临床乳腺癌骨转移患者提供了新的治疗手段。

Description

SMO抑制剂Sonidegib对管腔型乳腺癌骨转移的靶向治疗方法
技术领域
本发明涉及医药生物领域。具体地说，本发明涉及SMO抑制剂Sonidegib对管腔型乳腺癌骨转移的靶向治疗用途。
背景技术
乳腺癌是全球最常见的女性肿瘤，发生远端转移是造成乳腺癌患者死亡的主要原因。乳腺癌的主要转移位点包括骨、肺、脑、肝，其中骨是最常见的转移靶器官，70％以上的晚期乳腺癌患者会发生骨转移，骨转移同时也是造成患者死亡的一个主要原因。临床上的一个重要现象是不同亚型乳腺癌的转移具有明显的器官倾向性。乳腺癌可分为管腔型(luminal)、HER2阳性以及三阴性等不同的亚型。其中，管腔型为主要亚型，占全部乳腺癌的70％左右。管腔型乳腺癌虽然一般预后较好，到肺、肝、脑等器官的转移复发的风险比其他亚型较低，但是发生骨转移的风险却比其他亚型都要高。骨转移主要发生在管腔型(luminal)亚型乳腺癌中，但这其中的原因并不清晰，给临床骨转移靶向治疗带来了阻碍。可以说骨转移是目前管腔型乳腺癌治疗的一个最主要的问题。
目前乳腺癌骨转移的治疗方案主要是针对破骨细胞的活性抑制，常用的药物为双磷酸盐和狄诺塞麦。但临床数据显示这些治疗手段只能缓解骨转移的进程，并不能有效提高患者的总生存期，而且之前对这些药物的研发主要是在三阴性乳腺癌的细胞动物模型中开展的，因此急需开发针对管腔型乳腺癌骨转移的全新疗法，为临床治疗提供依据。
因此，本领域需要开发一种有效治疗管腔型乳腺癌骨转移的方法。
发明内容
本发明的目的就是提供一种有效治疗管腔型乳腺癌骨转移的方法。
在本发明的第一方面，提供了一种SMO抑制剂的用途，用于制备组合物或制剂，所述组合物或制剂用于预防和/或治疗癌症转移。
在另一优选例中，所述的SMO抑制剂为小分子化合物。
在另一优选例中，所述的SMO抑制剂为Sonidegib或其药学上可接受的盐。
在另一优选例中，所述的癌症为Hedgehog信号通路相关蛋白过表达的癌症。
在另一优选例中，所述的Hedgehog信号通路相关蛋白包括：SCUBE2、Hedgehog配体、SMO、或其组合。
在另一优选例中，所述的过表达指Hedgehog信号通路相关蛋白的表达量(F1)为生理情况下表达量(F0)之比(即F1/F0)≥2，优选地≥3，更优选地≥5。
在另一优选例中，所述的Hedgehog配体为特异性结合受体PTCH1的配体。
在另一优选例中，所述的Hedgehog配体包括：SHH、IHH和DHH。
在另一优选例中，所述的癌症为乳腺癌。
在另一优选例中，所述的乳腺癌选自下组：管腔型乳腺癌、HER2阳性乳腺癌、三阴性乳腺癌、或其组合。
在另一优选例中，所述的乳腺癌为管腔型乳腺癌。
在另一优选例中，所述的乳腺癌转移选自下组：乳腺癌的骨转移、乳腺癌的肺转移、乳腺癌的肝转移、乳腺癌的脑转移、乳腺癌的淋巴转移、或其组合。
在另一优选例中，所述的乳腺癌转移为乳腺癌的骨转移。
在另一优选例中，所述的转移为Hedgehog信号介导的转移。
在另一优选例中，所述的组合物或制剂用于预防和/或治疗Hedgehog信号介导的管腔型乳腺癌骨转移。
在另一优选例中，所述的组合物或制剂用于制备以下一种或多种用途的药物：
(i)抑制癌症转移灶周围的细胞成骨分化；
(ii)抑制乳腺癌骨转移细胞的免疫逃逸；
(iii)抑制乳腺癌细胞的骨转移；
(iv)延长乳腺癌患者生存期。
在另一优选例中，所述的癌症细胞为乳腺癌细胞。
在另一优选例中，所述的乳腺癌细胞为MCF7细胞。
在另一优选例中，所述的免疫逃逸为Hedgehog信号介导的免疫逃逸。
在另一优选例中，所述的制剂为口服制剂或非口服制剂。
在另一优选例中，所述的制剂选自下组：注射剂、吸入剂、酊剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、片剂、丸剂、悬浮剂、乳剂、含片、或滴丸。
在另一优选例中，所述制剂的给药方式为口服或注射。
在另一优选例中，所述的制剂还包括其他预防和/或治疗乳腺癌转移的药物。
在另一优选例中，所述制剂施用的对象为人或非人哺乳动物(如啮齿类动物)。
在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含：
(A1)治疗有效量的第一活性成分，所述第一活性成分为SMO抑制剂；
(A2)治疗有效量的第二活性成分，所述第二活性成分选自：
(Z1)用于预防和/或治疗癌症的成分；
(Z2)用于预防和/或治疗癌症转移的成分；或
(Z3)Z1和Z2的组合；
(B)药学上可接受的载体或赋形剂。
在另一优选例中，所述的第一活性成分和第二活性成分是不同的。
在另一优选例中，所述的SMO抑制剂为Sonidegib或其药学上可接受的盐。
在另一优选例中，所述的癌症为乳腺癌。
在另一优选例中，所述用于预防和/或治疗癌症的成分包括：抗雌激素药物、靶向治疗剂、或化疗剂。
在另一优选例中，所述抗雌激素药物包括：他莫昔芬、卵巢功能抑制剂、芳香化酶抑制剂或其组合。
在另一优选例中，所述化疗剂包括：蒽环类(阿霉素、表阿霉素、柔红霉素和阿克拉霉)、紫杉类药物(紫杉醇、紫杉醇脂质体、白蛋白紫杉醇和多西他赛)或其组合。
在另一优选例中，所述的靶向治疗剂包括：曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、或其组合。
在另一优选例中，所述的靶向治疗剂还包括SCUBE2中和抗体、Hedgehog配体中和抗体、其他Hedgehog信号抑制剂、或其组合。
在另一优选例中，所述的Hedgehog配体中和抗体为SHH中和抗体。
在另一优选例中，所述的乳腺癌为管腔型乳腺癌。
在另一优选例中，所述的乳腺癌转移为乳腺癌的骨转移。
在另一优选例中，所述第一活性成分占药物总重量的质量百分含量为0.1-99％。
在本发明的第三方面，提供了一种如本发明第二方面所述的药物组合物的用途，所述药物组合物用于制备：
(a)预防和/或治疗乳腺癌的药物；
(b)预防和/或治疗乳腺癌转移的药物。
在本发明的第四方面，提供了一种体外非治疗性的抑制间充质干细胞(MSC)成骨分化的方法，包括步骤：
在SMO抑制剂存在的条件下，培养间充质干细胞，从而抑制所述间充质干细胞的成骨分化。
在另一优选例中，所述的SMO抑制剂为Sonidegib或其药学上可接受的盐。
在另一优选例中，所述的MSC成骨分化是由过表达Hedgehog信号通路相关蛋白的癌细胞诱导的。
在另一优选例中，所述步骤中，在SMO抑制剂存在的条件下，共同培养过表达Hedgehog信号通路相关蛋白的癌细胞和间充质干细胞，从而抑制所述间充质干细胞的成骨分化。
在另一优选例中，所述的癌细胞为乳腺癌细胞。
在本发明的第五方面，提供了一种治疗和/或预防乳腺癌骨转移的方法，包括步骤：
给有需要的对象施用治疗有效量的SMO抑制剂或含SMO抑制剂的药物组合物，从而治疗和/或预防乳腺癌骨转移。
在另一优选例中，所述的治疗和/或预防选自下组：
(i)抑制乳腺癌转移灶周围的细胞成骨分化；
(ii)抑制乳腺癌骨转移细胞的免疫逃逸；
(iii)抑制乳腺癌细胞的骨转移；
(iv)上述i～iii的任意组合。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1(a)显示了不同亚型乳腺癌病人原位肿瘤中SCUBE2的表达水平。
图1(b)显示了高SCUBE2组与低SCUBE2组病人的无骨转生存率。
图1(c)显示了不同转移组乳腺癌病人血清中SCUBE2含量。
图1(d)显示了髂动脉注射SCUBE2敲低与对照组乳腺癌细胞后小鼠的骨转移光信号。
图1(e)显示了SCUBE2敲低与对照组乳腺癌细胞诱导成骨分化能力，图中展示的是茜素红染色的成骨细胞钙化区域，右图为成骨染色面积统计。
图1(f)显示了髂动脉注射Scube2过表达与对照组乳腺癌细胞后小鼠的后肢骨转移光信号。
图1(g)显示了Scube2过表达与对照组乳腺癌细胞诱导成骨分化能力，图中展示的是茜素红染色的成骨细胞钙化区域，右图为成骨染色面积统计。
图1(h)显示了髂动脉注射SCUBE2敲低或Scube2过表达乳腺癌细胞后取小鼠腿骨切片，免疫荧光染色展示肿瘤细胞周围ALP阳性成骨细胞分布。右图为统计成骨细胞占肿瘤周围微环境细胞百分比。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；NS，无显著差异。
图2(a)显示了SCUBE2敲低或过表达组与对照组乳腺癌细胞条件培养液中SHH的含量。
图2(b)显示了SCUBE2敲低或过表达组与对照组乳腺癌细胞条件培养液诱导MSC中Hh报告基因激活情况。
图2(c)显示了Scube2过表达组与对照组乳腺癌细胞条件培养液诱导SMO敲低的MSC向成骨分化水平，图中展示的是茜素红染色的成骨细胞钙化区域，右图为成骨染色面积统计。
图2(d)显示了髂动脉注射混合SMO敲低MSC的Scube2过表达与对照组乳腺癌细胞后小鼠的后肢骨转移光信号。
图2(e)显示了取小鼠腿骨进行切片，免疫荧光染色展示肿瘤细胞周围ALP阳性成骨细胞分布。右图为统计成骨细胞占肿瘤周围微环境细胞百分比。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；NS，无显著差异。
图3显示了Sonidegib治疗对骨转移的抑制作用。
图3(a)显示了Sonidegib处理对MSC中Hedgehog信号下游靶基因表达的影响。
图3(b)显示了Sonidegib处理对成骨分化的影响。
图3(c-d)显示了脂肪垫原位注射小鼠乳腺癌细胞系后形成的肿瘤大小(c)和后肢腿骨生物发光信号强度(d)及Sonidegib处理的影响。
图3(e-f)显示了左心室注射小鼠乳腺癌细胞系后骨转移生物发光强度(e)和小鼠总存活率(f)及Sonidegib处理的影响。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；NS，无显著差异。
图4显示了SCUBE2作用模型。(1)管腔型乳腺癌细胞高表达SCUBE2蛋白，促进肿瘤细胞释放黏附在细胞膜上的SHH蛋白。(2)乳腺癌细胞释放的SHH激活成骨前体细胞Hedgehog信号通路，促进成骨分化。(3)Hedgehog信号激活的成骨细胞释放COL1与免疫细胞表面受体LAIR1结合，抑制免疫细胞激活。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现了SMO抑制剂Sonidegib在治疗管腔型乳腺癌骨转移中的新用途。本发明人通过实验发现，SMO的靶向抑制剂Sonidegib意外地能够降低骨转移灶周围成骨细胞的分化，抑制骨转移的发生。同时，Sonidegib阻断Hedgehog信号激活，不仅能够抑制乳腺癌骨转移，还具有减轻免疫逃逸，加强免疫细胞对骨转移瘤杀伤效果的作用。在此基础上，完成了本发明。
实验证明，Sonidegib能够抑制细胞的成骨分化，有效地抑制乳腺癌细胞骨转移。并具有减轻骨转移瘤的免疫逃逸的作用，为临床乳腺癌骨转移患者提供了新的治疗手段。
术语
除非另有定义,否则本文中所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域普通技术人员普遍理解的含义相同。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“含有”可互换使用，不仅包括封闭式定义，还包括半封闭、和开放式的定义。换言之，所述术语包括了“由……构成”、“基本上由……构成”。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”的成分是指适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。
如本文所用，术语“治疗有效量”，是指对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。本领域的普通技术人员应该理解，所述的“治疗有效量”可随着药物组合物的形式、给药途径、所用药物的辅料、疾病的严重程度以及与其他药物联合用药等情况的不同而有所不同。
Hedgehog信号
Hedgehog信号最初在果蝇中被研究发现，是一个在胚胎发育、组织稳态和肿瘤发生中发挥重要作用并且高度保守的信号通路。经典Hedgehog信号通路的激活依赖于相应配体和受体的相互作用。在Hedgehog配体(包含SHH，IHH和DHH)缺失的情况下，Hedgehog配体对应的受体PTCH1通过抑制SMO的活性，抑制Hedgehog信号的激活。一旦Hedgehog配体与PTCH1发生结合，SMO的抑制便得到解除，从而传递激活信号给下游转录因子GLI，Hedgehog整体信号被激活，并进一步在肿瘤的发生发展中起到重要作用。Hedgehog信号激活的成骨细胞能够释放COL1，与免疫细胞表面受体LAIR1结合，抑制免疫细胞激活，从而抑制免疫细胞对肿瘤的杀伤，实现乳腺癌骨转移的免疫逃逸，促进骨转移的发生。
在本发明中，以管腔型乳腺癌为例检验了Hedgehog信号通路的一种激活途径。本发明的实验表明Hedgehog信号通路受到管腔型乳腺癌细胞表达的SCUBE2蛋白的调控。管腔型乳腺癌细胞高表达SCUBE2蛋白，促进肿瘤细胞释放黏附在细胞膜上的Hedgehog配体(SHH蛋白)。乳腺癌细胞释放的SHH通过结合对应受体PTCH1，解除对SMO的抑制，传递激活信号给下游转录因子GLI，从而激活成骨前体细胞的Hedgehog信号通路，促进成骨分化。
在SCUBE2蛋白和Hedgehog配体分泌量异常升高的肿瘤中，最终均通过SMO传递信号激活Hedgehog信号通路，促进成骨分化。因此，本发明发现SMO抑制剂能够用于预防和/或抑制SCUBE2蛋白和Hedgehog配体分泌量异常升高引起的肿瘤转移。
SMO抑制剂
SMO蛋白指七跨膜转导蛋白Smoothened，是Hedgehog通路的重要信号传导蛋白。在本发明的实施方式中，SMO蛋白优选地为人SMO蛋白，其Uniprot ID为Q99835。
如本文所用，术语“SMO抑制剂”指能够直接或间接地使SMO蛋白活性减弱的任意抑制剂。例如通过结合SMO蛋白，抑制SMO蛋白对下游转录因子GLI的激活。
在本发明中，所述的SMO抑制剂优选为Sonidegib及其药学上可接受的盐。
Sonidegib是是一种有效，选择性的SMO拮抗剂。其分子式为C26H26F3N3O3，CAS号为956697-53-3。目前SMO抑制剂Sonidegib已被FDA批准用于基底细胞瘤的临床治疗中。但目前使用Sonidegib针对肿瘤转移，特别是在管腔型乳腺癌骨转移治疗方面的应用还是空白。
本发明首次意外地发现，SMO的靶向抑制剂Sonidegib能够降低骨转移灶周围成骨细胞的分化，抑制骨转移的发生。同时，Sonidegib阻断Hedgehog信号激活，不仅能够抑制乳腺癌骨转移，还具有减轻免疫逃逸，加强免疫细胞对骨转移细胞杀伤效果的作用。因此，本发明发现Sonidegib可应用于制备抑制乳腺癌骨转移的药物。
癌症骨转移
如本文所用，“骨转移”是指某些非骨组织原发的恶性肿瘤经血液循环转移至骨组织，从而引发骨折、疼痛以及其他致死性并发症的疾病。骨转移主要出现在乳腺癌患者中。
在本发明的一个优选实施方式中，SMO抑制剂被用于制备治疗乳腺癌骨转移的药物。本发明所述的乳腺癌包括不同亚型的乳腺癌，如管腔型(luminal)乳腺癌、HER2阳性乳腺癌以及三阴性乳腺癌。其中，骨转移主要发生在管腔型(luminal)亚型乳腺癌中。乳腺癌主要通过促进间充质干细胞(MSC)向成骨细胞分化实现骨转移。
优选地，所述的骨转移为Hedgehog信号介导的骨转移。
本发明发现了乳腺癌骨转移的机制之一，该机制模型如图4所示。具体地，本发明首次发现了：
(1)管腔型乳腺癌细胞高表达SCUBE2，促进肿瘤细胞释放SHH到胞外，解释了在管腔型乳腺癌患者血清中检测到高SCUBE2水平的原因，暗示SCUBE2作为乳腺癌骨转移检测的新靶点；
(2)受到乳腺癌细胞释放的SHH激活后的成骨前体细胞(如MSC细胞)进行成骨分化，帮助乳腺癌细胞在骨微环境的生存；
(3)Hedgehog信号激活的成骨细胞释放COL1，与免疫细胞表面抑制性受体LAIR1结合，抑制免疫激活，使得肿瘤细胞逃避免疫杀伤，减少肿瘤细胞凋亡。
药物组合物
本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含：
(A1)治疗有效量的第一活性成分，所述第一活性成分为SMO抑制剂；
(A2)治疗有效量的第二活性成分，所述第二活性成分选自：
(Z1)用于预防和/或治疗癌症的成分；
(Z2)用于预防和/或治疗癌症转移的成分；或
(Z3)Z1和Z2的组合；
(B)药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明所提供的药物组合物优选含有重量比为0.1-99wt％的第一活性成份，其余部分为第二活性成分、药学可接受的载体、稀释液或溶液或盐溶液。
本发明的第一活性成分可以直接应用与治疗或预防癌症转移。此外，也可以与其他治疗剂，即第二活性成分联用。
所述的第二活性成分可以是任何能够预防和/或治疗癌症或癌症转移的药物成分，包括但不限于化疗剂、内分泌治疗剂、靶向治疗剂等。
需要的时候，在本发明药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。
本发明所提供的化合物和药物组合物可以是多种形式，如片剂、注射剂、胶囊、粉剂、糖浆、溶液状、悬浮液和气雾剂等，并可以存在于适宜的固体或液体的载体或稀释液中和适宜的用于注射或滴注的消毒器具中。
本发明的药物组合物的各种剂型可按照药学领域的常规制备方法制备。其制剂配方的单位计量中通常包含0.05-1000mg本发明的活性化合物，优选地，制剂配方的单位计量中包含1mg-500mg本发明的活性化合物。
本发明的药物组合物可对哺乳动物临床使用，包括人和动物，可以通过口、鼻、皮肤、肺或者胃肠道等的给药途径。最优选为口服。最优选日剂量为0.01-400mg/kg体重，一次性服用，或0.01-200mg/kg体重分次服用。不管用何种服用方法，个人的最佳剂量应依据具体的治疗而定。通常情况下是从小剂量开始，逐渐增加剂量一直到找到最适合的剂量。
本发明的药物或抑制剂可通过各种不同方式施用，例如可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹导入机体。
典型地，本发明活性成分或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等。
给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括O/W型、W/O型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。
本发明活性成分可以被制成普通制剂、也可以制成缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。
为了将本发明活性成分被制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；润湿剂可以是水、乙醇、异丙醇等；黏合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。
还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。
为了将给药单元制成胶囊剂，可以将有效成分本发明活性成分与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将有效成分先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备本发明片剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备本发明的胶囊剂。
为将本发明活性成分制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二醇或它们的混合物作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、PH调剂剂、渗透压调节剂。增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；PH调剂剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。
此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其他添加剂。
本发明的活性成分或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。
在本发明的一个优选的实施方式中，SMO抑制剂可以与SCUBE2中和抗体、Hedgehog配体中和抗体、或其他Hedgehog信号抑制剂联用，加强抗肿瘤骨转移的效果。
当本发明的活性成分与其他治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整它的剂量。
本发明的主要优点包括：
(1)首次发现了管腔型乳腺癌细胞高表达的SCUBE2蛋白能够促进肿瘤细胞释放SHH到胞外，并影响乳腺癌的骨转移，因而首次提出了SCUBE2可作为乳腺癌骨转移预测的新检测靶点。
(2)首次发现了乳腺癌细胞释放的SHH能够激活成骨前体细胞进行成骨分化，帮助乳腺癌细胞在骨微环境的生存。
(3)首次发现了Hedgehog信号激活的成骨细胞能够释放COL1，与免疫细胞表面抑制性受体LAIR1结合，抑制免疫激活，使得肿瘤细胞逃避免疫杀伤，减少肿瘤细胞凋亡。
(4)首次发现了使用SMO抑制剂Sonidegib可以有效缓解乳腺癌骨转移的进程。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1 SCUBE2与管腔型乳腺癌骨转移的关系
在本实施例中，通过分析临床测序数据发现，与其他几个亚型相比，管腔型乳腺癌患者表达高水平的SCUBE2(图1a)。骨转移生存分析发现高表达SCUBE2组的病人无骨转移生存率显著低于低表达SCUBE2组，骨转移发生率明显增加(图1b)。收集病人血清进行酶联免疫吸附测定(ELISA)发现，骨转移组乳腺癌患者的血清SCUBE2蛋白水平显著高于无转移的对照组(图1c)。
本实施例的结果说明，SCUBE2与管腔型乳腺癌骨转移有着密切的联系。
实施例2 SCUBE2在乳腺癌骨转移中的作用
成骨细胞作为骨微环境的一个重要组分，常在骨转移中发挥重要作用。本实施例中检测了SCUBE2对成骨细胞分化的影响，及其在乳腺癌骨转移中的作用。
首先在具有荧光素酶标记的乳腺癌细胞系MCF7中敲低SCUBE2，然后将细胞通过髂动脉注射入免疫缺陷小鼠，通过荧光素酶底物的注射观察与转移负荷相应的光信号。另外，在荧光素酶标记的小鼠细胞系Py8119中过表达Scube2，通过髂动脉注射入免疫正常小鼠中，观察过表达的SCUBE2对乳腺癌转移的影响。
结果：如图1所示，图中pLKO.1、pLVX、DMEM均为对照组。肿瘤细胞的光信号显示，敲低SCUBE2可以显著抑制乳腺癌的骨转移(图1d)。并且敲低SCUBE2显著抑制了乳腺癌细胞诱导间充质干细胞(MSC)向成骨细胞分化的能力(图1e)。过表达的Scube2可以显著增强乳腺癌的骨转移(图1f)，同时肿瘤细胞体外诱导MSC成骨分化能力明显增强(图1g)。并且，小鼠腿骨切片中肿瘤细胞周围ALP阳性成骨细胞的聚集程度随着SCUBE2的表达变化发生改变，SCUBE2高表达组肿瘤细胞周围成骨细胞占比明显增高(图1h)。
本实施例说明，SCUBE2通过调控成骨微环境促进骨转移的发生。
实施例3 SCUBE2对于Hedgehog信号通路的影响
3.1 SCUBE2对SHH释放的影响
SCUBE2是Hedgehog信号通路中的关键蛋白，参与剪切释放黏附在细胞膜上的Hedgehog信号通路配体，并维持其在细胞外的溶解性，激活靶细胞中的Hedgehog信号。我们的机制研究发现SCUBE2可以促进肿瘤细胞释放Hedgehog信号通路配体SHH，提高细胞外SHH含量。
本实施例中，通过敲低或过表达SCUBE2，并检测培养液中SHH含量，来检测SCUBE2对于SHH释放的影响。
结果：相比于对照pLKO.1组，敲低SCUBE2后乳腺癌细胞MCF7释放到培养液上清中的SHH含量明显下降，而相比于对照pLVX组，过表达SCUBE2后乳腺癌细胞MCF7释放到培养液上清中的SHH含量显著增多(图2a)。
3.2 SCUBE2对Hedgehog信号激活的影响
SHH与其受体PTCH1结合后，能够解除对SMO活性的抑制，从而传递激活信号给下游转录因子GLI，因此，本实施例中利用GLI报告系统的激活检测SCUBE2对于Hedgehog信号的激活的影响。
结果：相比于空白对照DMEM，对照pLKO.1组的MCF7细胞上清可以显著激活GLI报告系统，而敲低SCUBE2后MCF7细胞上清对GLI系统的激活受到了明显抑制。同样地，相比较于对照pLVX组MDA-MB-231乳腺癌细胞上清，过表达SCUBE2后对GLI系统的激活显著增强(图2b)。
本实施例说明，SCUBE2能够影响乳腺癌细胞释放SHH到胞外，并进一步影响了周围细胞Hedgehog信号的激活。
实施例4在MSC中敲低SMO对乳腺癌骨转移的影响
Hedgehog信号通路在促进成骨细胞分化中有重要作用，成骨细胞作为骨微环境细胞对骨转移细胞的存活、定植和生长具有重要意义。
在本实施例中，检测了在MSC中，敲低Hedgehog信号通路关键因子SMO对于MSC向成骨细胞分化的影响，并将敲低SMO的MSC细胞与过表达Scube2的肿瘤细胞混合后注射小鼠，观察小鼠乳腺癌骨转移的情况，并通过小鼠腿骨的免疫荧光染色观察骨转移灶周围成骨细胞的比例。
结果：在MSC中敲低SMO可以抑制MSC向成骨细胞的分化进程(图2c)。并且，通过敲低SMO抑制Hedgehog信号通路后，可以抑制乳腺癌骨转移的形成(图2d)，同时明显降低骨转移灶周围成骨细胞的分布比例(图2e)。
本实施例说明，在MSC中敲低SMO能够有效抑制乳腺癌骨转移。
实施例5 Sonidegib对MSC细胞成骨分化的影响
在本实施例中，使用SMO的特异抑制剂Sonidegib处理MSC，并检测MSC中Hedgehog信号下游靶基因Runx2、Osterix、Alpl、Cd1a1、Gli1、Ptch1的表达。并通过碱性磷酸酶活检测MSC成骨分化的情况。
结果：Sonidegib可以显著抑制MSC中Hedgehog信号通路的激活(图3a)，并且Sonidegib处理组中碱性磷酸酶活显著低于对照组，证明Sonidegib可以抑制MSC向成骨分化过程(图3b)。
实施例6 Sonidegib对小鼠体内乳腺癌转移的影响
在小鼠体内使用SMO抑制剂Sonidegib，并测量脂肪垫原位注射小鼠乳腺癌细胞系后形成的肿瘤大小，检测Sonidegib是否能够显著降低乳腺癌细胞从原位向骨组织转移。
结果：药物处理对原位瘤的生长影响不大(图3c)。但Sonidegib治疗组小鼠骨生物发光信号显著降低(图3d)。在左心室注射骨转移模型中，Sonidegib的治疗也能明显抑制骨转移信号(图3e)，并且延长了小鼠的总生存期(图3f)。
本实施例证明，Sonidegib明显抑制了肿瘤细胞的骨转移并延长了小鼠总生存期。但Sonidegib对原位瘤大小无显著影响。
讨论
综上所述，本发明首次发现，针对微环境细胞Hedgehog信号中关键因子SMO的靶向抑制剂(例如Sonidegib)能够有效降低乳腺癌骨转移灶周围成骨细胞的分化，抑制乳腺癌骨转移的发生。
Hedgehog信号通路在肿瘤的发生发展，尤其是肿瘤的骨转移中起着重要作用，靶向Hedgehog的治疗手段有例如Hedgehog配体抑制剂、Hedgehog转导因子SMO抑制剂和Hedgehog转录因子GLI抑制剂。
通过本发明的实施例，验证了Hedgehog信号的一个重要激活途径和Hedgehog信号对乳腺癌骨转移的影响。具体地，发现了管腔型乳腺癌细胞通过高表达SCUBE2，促进细胞膜上的SHH蛋白释放，SHH蛋白通过结合其对应受体PTCH1，解除PTCH1对SMO蛋白活性的抑制，从而释放激活信号给下游转录因子GLI，进而激活成骨细胞中的Hedgehog信号，除了导致肿瘤骨转移。
另外，由于成骨细胞被Hedgehog信号激活后能够释放COL1，与免疫细胞表面免疫抑制受体LAIR1结合，抑制免疫细胞激活，从而抑制免疫细胞对肿瘤的杀伤，实现乳腺癌骨转移的免疫逃逸。因此，本发明通过Sonidegib阻断Hedgehog信号激活，不仅能够抑制乳腺癌骨转移，并且进一步地具有减轻免疫逃逸的效果，为临床乳腺癌骨转移患者提供了新的治疗手段。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种SMO抑制剂的用途，其特征在于，用于制备组合物或制剂，所述组合物或制剂用于预防和/或治疗癌症转移。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的SMO抑制剂为Sonidegib或其药学上可接受的盐。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的癌症为Hedgehog信号通路相关蛋白过表达的癌症。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的癌症为乳腺癌。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的癌症转移选自下组：乳腺癌的骨转移、乳腺癌的肺转移、乳腺癌的肝转移、乳腺癌的脑转移、乳腺癌的淋巴转移、或其组合。
6.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含：
(A1)治疗有效量的第一活性成分，所述第一活性成分为SMO抑制剂；
(A2)治疗有效量的第二活性成分，所述第二活性成分选自：
(Z1)用于预防和/或治疗癌症的成分；
(Z2)用于预防和/或治疗癌症转移的成分；或
(Z3)Z1和Z2的组合；
(B)药学上可接受的载体或赋形剂。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述的SMO抑制剂为Sonidegib或其药学上可接受的盐。
8.一种如权利要求6所述的药物组合物的用途，其特征在于，所述药物组合物用于制备：
(a)预防和/或治疗乳腺癌的药物；
(b)预防和/或治疗乳腺癌转移的药物。
9.一种体外非治疗性的抑制间充质干细胞(MSC)成骨分化的方法，包括步骤：
在SMO抑制剂存在的条件下培养间充质干细胞，从而抑制所述间充质干细胞的成骨分化。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的SMO抑制剂为Sonidegib或其药学上可接受的盐。
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US20160008369A1 (en) * 2013-02-25 2016-01-14 Celine Decaudin Oral formulation and suspension of an oncology drug

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