CN116437919B - 用组织蛋白酶c抑制剂治疗转移的方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了用包含有效量的组织蛋白酶C(CTSC)抑制剂的药物组合物治疗癌症转移的方法。在一些实施方式中，所述CTSC抑制剂是式(I)化合物或其药学上可接受的盐：

Description

用组织蛋白酶C抑制剂治疗转移的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年9月11日提交的中国专利申请第CN202010955820.1号的权益，该申请的内容以全文引用的方式并入本文。
技术领域
本发明涉及肿瘤医学领域，并且更具体地涉及组织蛋白酶C抑制剂在治疗肿瘤如原发性肿瘤或转移中的应用。
背景技术
在许多肿瘤中，转移是导致患者死亡的主要因素，并且90％的肿瘤患者死亡是由转移导致的。肺是乳腺癌的转移最常见的靶器官，并且也是人体气体交换的场所。肺转移的发生对肿瘤患者是致命的威胁。
乳腺癌是国内外发病率和死亡率最高的女性肿瘤。在目前治疗作用最差的三阴性乳腺癌亚型中，肺转移是治疗失败和患者死亡的主要原因。肿瘤细胞对微环境的调节在肿瘤细胞的转移形成的每个步骤中起重要作用。大量研究表明，肿瘤细胞分泌的细胞外蛋白，包括蛋白酶、细胞因子、生长因子、细胞外基质蛋白等，在癌细胞调节肿瘤微环境的过程中起关键作用。
蛋白酶作为一类重要的肿瘤微环境调节分子，参与一系列与肿瘤细胞转移密切相关的过程。因此，对肿瘤相关分泌蛋白，特别是具有蛋白酶活性的分泌因子如何调节转移的研究具有重要的生物学意义和临床应用价值。
组织蛋白酶C(CTSC)也称为二肽基肽酶1(DPP1)，于1984年被Gutman和Fruton发现。CTSC位于染色体11q14.1-q14.3处，是一种重要的常见蛋白酶。然而，关于CTSC在肿瘤转移中发挥的相关作用的报道却很少。
因此，迫切需要研究蛋白酶对肿瘤转移的影响，特别是CTSC对肿瘤转移的影响，并在此基础上开发抑制肿瘤转移的新型药物制剂，从而延长肿瘤患者的存活时间并改善其存活质量。
发明内容
在一个方面，本公开涉及CTSC抑制剂治疗或抑制癌症转移或治疗原发性癌症的应用。在一个实施方式中，癌症是乳腺癌。在一个实施方式中，转移是乳腺癌的肺转移、乳腺癌的肝转移、乳腺癌的骨转移或肺癌的骨转移。在另外的实施方式中，转移是乳腺癌的肺转移。在另一实施方式中，转移是肺癌的转移。
在另一方面，提供了一种用于治疗需要治疗的患者体内的癌症转移的方法。该方法包含在治疗期内向需要治疗的患者施用包含CTSC抑制剂的药物组合物，其中治疗抑制、减缓或逆转转移的进程。
在另一方面，提供了一种用于治疗需要治疗的患者体内的原发性癌症的方法。该方法包含在治疗期内向需要治疗的患者施用包含CTSC抑制剂的药物组合物，其中治疗抑制、减缓或逆转原发性癌症的进程。
在一个实施方式中，CTSC抑制剂是brensocatib(以前称为AZD7986)或其药学上可接受的盐：
在又一实施方式中，CTSC抑制剂是本文表1中列出的抑制剂中的一个。
在本文提供的方法的一个实施方式中，方法包含在治疗期内向患者施用药物组合物，该药物组合物包含有效量的式(I)化合物或其药学上可接受的盐：
其中，
R1是
R2是氢、F、Cl、Br、OSO2C1-3烷基或C1-3烷基；
R3是氢、F、Cl、Br、CN、CF3、SO2C1-3烷基、CONH2或SO2NR4R5，
其中R4和R5与它们所附接的氮原子一起形成氮杂环丁烷、吡咯烷或哌啶环；
X是O、S或CF2；
Y是O或S；
Q是CH或N；
R6是C1-3烷基，其中C1-3烷基任选地被1、2或3个F取代并且任选地被选自OH、OC1-3烷基、N(C1-3烷基)2、环丙基或四氢吡喃的一个取代基取代；并且
R7是氢、F、Cl或CH3，其中治疗抑制、减缓或逆转原发性癌症或转移的进程。
在方法的一个实施方式中，药物组合物包含式(I)化合物，其中R1是 在另外的实施方式中，R1是/>X是O、S或CF2；R6是C1-3烷基，其中C1-3烷基任选地被1、2或3个F取代；并且R7是氢、F、Cl或CH3。在还另外的实施方式中，R7是氢。
在一个实施方式中，药物组合物包含有效量的brensocatib。
在本文提供的用于治疗癌症转移的方法的一个实施方式中，转移是乳腺癌的转移。在另外的实施方式中，乳腺癌的转移是乳腺癌的肺转移、乳腺癌的肝转移、乳腺癌的骨转移或乳腺癌的脑转移。在还另外的实施方式中，乳腺癌的转移是乳腺癌的肺转移。在一个实施方式中，乳腺癌是腔内乳腺癌、人表皮生长因子受体2(HER2)阳性乳腺癌或三阴性乳腺癌。
在本文提供的原发性癌症的治疗的一个实施方式中，原发性癌症是肺癌、肝癌或乳腺癌。在另外的实施方式中，原发性癌症是乳腺癌。在另外的实施方式中，乳腺癌是腔内乳腺癌、人表皮生长因子受体2(HER2)阳性乳腺癌或三阴性乳腺癌。在另一实施方式中，原发性癌症是肝癌。在又一实施方式中，原发性癌症是肺癌。在另外的实施方式中，肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)。在另一实施方式中，肺癌是小细胞肺癌。
在本文提供的用于治疗癌症转移的方法的另一实施方式中，转移是肺癌的骨转移、胰腺癌的肝转移或胃癌的肝转移。在本文提供的用于治疗癌症转移的方法的又一实施方式中，转移是乳腺癌的肺转移、乳腺癌的肝转移、乳腺癌的骨转移、乳腺癌的脑转移、肺癌的骨转移、胰腺癌的肝转移、结肠癌的肝转移或胃癌的肝转移。在还一实施方式中，转移是肺癌的转移。在一个实施方式中，转移是胰腺癌或胃癌的转移。在又一实施方式中，转移是骨癌、肝癌、胃癌或结肠直肠癌的转移。
在本文提供的方法的一个实施方式中，药物组合物口服施用。在另外的实施方式中，在治疗期期间每天施用一次。
根据本文提供的方法的一些实施方式，治疗期为约6个月至约36个月。在另外的实施方式中，治疗期在约6个月与约24个月之间。在另外的实施方式中，治疗期在约6个月与约18个月之间。在还另外的实施方式中，治疗期在约6个月与约12个月之间。在另一实施方式中，治疗期在约12个月与约36个月之间。在还一实施方式中，治疗期在约18个月与约36个月之间。
在本文提供的用于治疗原发性癌症或癌症转移的方法的一个实施方式中，与治疗期之前的原发性癌症(原发性肿瘤)或转移的体积相比，在治疗期期间或治疗期之后原发性癌症(原发性肿瘤)或转移的体积减小。在另外的实施方式中，与治疗期之前的体积相比，在治疗期期间或治疗期之后体积减小约5％至约25％，或约25％至约50％或约50％至约75％。
在本文提供的用于治疗原发性癌症或癌症转移的方法的一些实施方式中，治疗涉及与治疗期之前患者体内的循环中性粒细胞细胞外陷阱(NET)的数量相比，或与具有相同原发性癌症或转移但未施用药物组合物的第二患者体内的循环NET的数量相比，在治疗期期间或治疗期之后减少患者体内的循环NET。在另外的实施方式中，与治疗期之前的循环NET的数量相比，循环NET的数量减少至少50％。
在本文提供的用于治疗癌症转移的方法的又一实施方式中，方法包括与治疗期之前的原发性癌症(原发性肿瘤)或转移中的NET的数量相比，在治疗期期间或治疗期之后减少原发性癌症(原发性肿瘤)转移中的NET。在另外的实施方式中，与治疗期之前的NET的数量相比，原发性癌症(原发性肿瘤)或转移中的NET的数量减少至少50％。
在本文提供的用于治疗原发性癌症或癌症转移的方法的一些实施方式中，治疗涉及与治疗期之前的中性粒细胞迁移相比，或与具有相同原发性癌症或转移但未施用药物组合物的第二患者体内的中性粒细胞迁移相比，在治疗期期间或治疗期之后减少原发性癌症或转移中的中性粒细胞迁移。在另外的实施方式中，中性粒细胞迁移减少约25％至约75％、约25％至约50％或至少约25％。
附图说明
图1将乳腺癌的临床样本中的CTSC蛋白表达与肺转移相关联。图1A示出了成对原发性肿瘤和肺转移中相对CTSC蛋白水平的免疫荧光(IF)图像，并且图1B绘制了通过IF确定的7名乳腺癌患者的成对原发性肿瘤和肺转移病灶的样本中的相对CTSC蛋白水平，其中绘图的标度为100μm。图1C比较了在由乳腺癌患者的原发性肿瘤(74例)和肺转移病灶(29例)组成的103个肿瘤样本中的CTSC蛋白表达水平。图1D比较了有或无肺转移的乳腺癌患者的血清CTSC水平。图1E比较了具有低血清CTSC水平和高血清CTSC水平的无肺转移的乳腺癌患者的存活率。图1F示出了当按照低CTSC组织水平和高CTSC组织水平分组时乳腺癌患者的存活曲线分析。
图2证明CTSC过表达促进乳腺癌的肺转移。图2A示出了通过蛋白印迹对SCP28细胞中CTSC过表达的mRNA和蛋白水平验证。图1B至D示出了小鼠尾静脉注射过表达CTSC的SCP28细胞后肺的荧光信号(B)、小鼠尾静脉注射过表达CTSC的SCP28细胞后肺表面转移性结节的数量(C)，以及注射过表达CTSC的SCP28细胞的小鼠与注射SCP28细胞的对照组小鼠(每组n＝10)相比的存活分析(D)。
图3指示CTSC敲除抑制乳腺癌的肺转移。图3A示出了通过蛋白印迹对LM2-4175细胞中CTSC敲除的mRNA和蛋白水平验证。图3B至D示出了小鼠尾静脉注射CTSC减少的LM2-4175细胞后肺的荧光信号(B)、小鼠尾静脉注射CTSC减少的LM2-4175后肺表面转移性结节的数量(C)，以及注射CTSC减少的LM2-4175的小鼠与注射LM2-4175细胞的对照组小鼠(每组n＝10)相比的存活分析(D)。
图4绘示了CTSC表达促进免疫完整小鼠体内乳腺癌的肺转移。图4A示出了通过蛋白印迹对4T07细胞中CTSC过表达和4T1细胞中CTSC减少的mRNA和蛋白水平验证。图4B示出了小鼠尾静脉注射过表达CTSC的4T07细胞后，或乳腺脂肪垫注射CTSC减少的4T1细胞后肺的荧光信号。图4C示出了注射过表达CTSC的4T07细胞的小鼠与注射对照4T07细胞的小鼠(每组n＝10)的表面转移性结节的数量。图4D至E示出了注射CTSC减少4T1细胞的小鼠与注射4T1对照细胞的小鼠(每组n＝10)的肿瘤体积的变化(D)和肺转移性结节的数量的变化(E)。
图5证明CTSC参与肺中乳腺癌细胞的早期转移性定殖。图5A示出了与SCP28对照细胞相比，注射过表达CTSC的SCP28细胞的小鼠体内肺转移的生物发光成像(BLI)结果，表明CTSC过表达的小鼠体内肺病变移植增加。图5B示出了注射过表达CTSC的SCP28细胞的小鼠体内癌细胞的接种随时间增加，如通过肺切片的免疫荧光染色所检测的。图5C示出了小鼠体内CTSC过表达的细胞比小鼠体内对照细胞更具增殖性。另一方面，图5D示出了注射CTSC敲除的LM2细胞的小鼠的肺中转移形成减少，而图5E至F示出了小鼠体内CTSC减少的细胞的癌细胞接种(E)和增殖(F)的减少。图5G通过Ki67染色在注射CTSC敲除的LM2细胞后六周直观地比较小鼠体内的肺转移。
图6证实了肺转移中的中性粒细胞募集受CTSC表达水平的影响。图6A提供了流式细胞术结果，以百分比的形式定量了注射具有过表达的CTSC的SCP28细胞的小鼠和注射具有减少的CTSC的LM2细胞的小鼠体内的肺转移的CD45+免疫细胞中CD11b+Ly6G+中性粒细胞的量。图6B提供了类似处理小鼠组的肺实质中CD45+免疫细胞中CD11b+Ly6G+中性粒细胞的可比流式细胞术结果。图6C示出了在注射CTSC过表达的SCP28细胞的小鼠体内，CD11b+Ly6G+中性粒细胞在癌细胞附近的群聚增加，并且在注射具有减少的CTSC的LM2细胞的小鼠体内，群聚减少。图6D将CD11b+Ly6G+中性粒细胞聚集与EdU+示踪的接种的肿瘤细胞增殖相关联，并且图6E至G示出了在注射具有过表达的CTSC的SCP28细胞之前用Ly6G清除抗体处理小鼠引起中性粒细胞聚集(E)、增殖(F)和肺结节形成(G)减少。
图7证明CTSC对中性粒细胞的募集经由PR3-IL-1b-NF-kB途径调节而增强。图7A至B示出了CTSC的过表达或减少对受控培养基中的中性粒细胞募集的影响。图7B的图像示出了IL-6、CCL2、CCL3、G-CSF和TNFR1中的每一者在用过表达CTSC的4T07癌细胞预处理的中性粒细胞中上调。图7C的蛋白印迹图像示出，在一组六种中性粒细胞来源的丝氨酸蛋白酶中，仅PR3在中性粒细胞的细胞质膜上表达。图7D示出了用过表达CTSC的SCP28癌细胞的CM培养的人中性粒细胞的PR3活性在用PR3的抑制剂(西维来司他(Silvelestat))处理后降低。图7E至G示出了西维来司他减少了用过表达CTSC的4T07细胞的条件培养基预处理的鼠中性粒细胞的迁移(E)，并且降低了过表达CTSC的SCP28癌细胞周围的中性粒细胞聚集(F至G)。图7H示出了西维来司他降低了用具有CTSC的SCP28癌细胞的条件培养基预处理的中性粒细胞的IL-1b水平，而NF-KB抑制剂(BAY 11-7082)则没有。如图7I至J所示，当用IL-1b阻断抗体处理移植有过表达CTSC的AT3癌细胞的小鼠时，与IgG处理相比，肺转移(I)和肺表面结节形成(J)减少。
图8表明肿瘤CTSC募集中性粒细胞以诱导NET增生。图8A的IF结果示出，在过表达CTSC的SCP28癌细胞的条件培养基中培养的中性粒细胞形成广泛的NET。收获的小鼠的肺的IF结果示出，在经处理的小鼠体内，在接近过表达CTSC的癌细胞(SCP28)的位置处发生显著的NET形成，而在具有减少的CTSC表达的癌细胞(LM2)附近几乎没有NET形成(图8B)。图8C比较了用添加和不添加西维来司他的4T07癌细胞的条件培养基预处理的鼠中性粒细胞中的ROS水平。图8D示出了用4T1条件培养基和/或添加了rhPR3的重组人活性PR3预处理的鼠中性粒细胞中p38磷酸化增加，而与CTSC表达水平无关。ROS产生在用过表达CTSC的4T07细胞预处理的鼠中性粒细胞中增加，而添加p38抑制剂(SB203580)逆转了该作用(图8E)。用西维来司他(以抑制PR3)或DNase I(以消化NET)处理在4T07或4T1条件培养基中培养的鼠中性粒细胞阻断了CTSC诱导的NET形成(图8F)，并且在注射过表达CTSC的SCP28细胞的小鼠体内观察到相同的作用(这些细胞进一步用西维来司他或DNase I处理)(图8G)。图8H示出了rmTSP-1不能阻断在中性粒细胞培养基中培养的4T07癌细胞的球状体生长，而进一步添加α-IL6和/或DNase I确实不同程度地抑制了球状体生长。
图9将乳腺癌的肺转移的临床样本中的CTSC表达与中性粒细胞浸润和NET形成相关联。图9A证明肺转移样本中的CTSC表达、NET的数量和中性粒细胞浸润高于原发性肿瘤样本。图9B示出了CTSC表达水平与原发性肿瘤和肺转移中的NET形成和中性粒细胞浸润强烈相关。图9C示出了肺转移性肿瘤中的循环NET水平高于非转移性肿瘤，并且图9D示出了当一起考虑原发性肿瘤和肺转移时，血清学CTSC表达水平与血清中的循环NET水平强烈相关。图9E示出了在三种不同的临床乳腺癌亚型中观察到更高水平的CTSC、NET增生和中性粒细胞迁移。
图10示出了CTSC抑制剂brensocatib抑制乳腺癌的肺转移。图10A示出了通过在小鼠体内注射CTSC减少的4T1细胞七天后施用brensocatib后观察肿瘤细胞生长而获得的肿瘤体积对时间的关系。图10B至E示出了在向已注射4T1细胞的小鼠施用brensocatib后，brensocatib治疗抑制肺转移性结节的形成(B)，减少体重损失(C)，增加存活率(D)，并且减少肺病灶中的中性粒细胞浸润(E)。图10F示出了在用4T1的CM(CM)或brensocatib预处理的中性粒细胞的培养基中培养的4T1乳腺癌细胞的肿瘤球形成。在原位注射过表达CTSC的AT3癌细胞并且然后用brensocatib处理的小鼠体内观察到类似的作用(图10G至J)。brensocatib治疗还引起IL-1b的循环水平降低(图10K)。
图11绘示了brensocatib抑制各种转移性癌细胞的中性粒细胞募集、NET增生诱导和肿瘤球形成的能力。图11A示出了弱(MDA-MB-231，简称231)、中等(SP16)和强(SP16L)肝转移性乳腺癌细胞中的CTSC表达水平。图11B示出了弱或强骨转移性乳腺癌细胞中的CTSC表达水平。图11C示出了弱或强骨转移性肺癌细胞中的CTSC表达水平。图11D示出了在向肺转移性乳腺癌细胞LM2-4175施用brensocatib后，通过用NET分子标记物(髓过氧化物酶(MPO)；瓜氨酸化组蛋白H3(Ci-H3))进行免疫荧光染色观察到的在癌细胞条件培养基刺激下中性粒细胞中NET的形成。图11E示出了在用SCP2条件培养基(CM)或brensocatib(Bren)预处理的中性粒细胞的培养基中培养的骨转移性SCP2乳腺癌细胞的肿瘤球形成。图11F示出了在向不同的肝转移性乳腺癌细胞施用brensocatib后，通过免疫荧光染色观察到的在癌细胞条件培养基刺激下中性粒细胞中NET的形成。图11G分析了在向不同的肝转移性乳腺癌细胞施用brensocatib后，癌细胞条件培养基中的中性粒细胞募集。图11H示出了在用SCP16的CM(CM)或brensocatib预处理的中性粒细胞的培养基中培养的肝转移性(SCP16)乳腺癌细胞的肿瘤球形成。图11I示出了在向不同的骨转移性肺癌细胞施用brensocatib后，通过免疫荧光染色观察到的在癌细胞条件培养基刺激下中性粒细胞中NET的形成。图11J分析了在向不同的骨转移性肺癌细胞施用brensocatib后，癌细胞条件培养基中的中性粒细胞募集。图11K至P示出了在用癌细胞的CM(CM)或brensocatib(Bren)预处理的中性粒细胞的培养基中培养的结肠癌细胞SW480(K)、肺癌细胞A549(L)、胃癌细胞AGS(M)、肝细胞癌细胞HUH7(N)和胰腺癌细胞KP4(O)的肿瘤球形成。
图12绘示了brensocatib抑制肝原发性肿瘤和转移的能力。图12A至B示出了CTSC抑制剂brensocatib抑制肝癌细胞HUH7的原发性肿瘤生长(A)和肝表面结节的形成(B)。图12C示出了CTSC抑制剂brensocatib抑制胰腺癌细胞KP4的肝转移。
具体实施方式
本公开部分地基于以下发现：CTSC促进乳腺癌的转移。此外，本公开证明，通过调节转移性微环境中的中性粒细胞浸润和/或NET的形成，CTSC促进乳腺癌细胞上的肺转移和肝转移的发生，这促使能够鉴定用于治疗肿瘤转移的CTSC的药物抑制剂。不希望受理论束缚，通过抑制CTSC、中性粒细胞浸润和NET的形成，CTSC抑制剂调节癌症的肿瘤微环境以减缓、减少或抑制其它器官中的转移。
据此，在本发明的一个方面，提供了一种用于治疗需要治疗的患者体内的癌症转移的方法。该方法包含向患者施用包含有效量的CTSC抑制剂的药物组合物。治疗抑制、减缓或逆转转移的进程，例如，减小转移性生长的大小。
在本发明的另一方面，提供了一种用于治疗需要治疗的患者体内的原发性癌症的方法。该方法包含向患者施用包含有效量的CTSC抑制剂的药物组合物。治疗抑制、减缓或逆转原发性癌症的进程，例如，减小原发性肿瘤生长的大小。
如本文所用，“癌症”是指由异常细胞生长导致的任何恶性和/或侵袭性生长或肿瘤。癌症包括以形成它们的细胞类型命名的实体瘤、血癌、骨髓癌或淋巴系统癌。实体瘤的实例包括肉瘤和癌。癌症还包括起源于身体特定部位处的原发性癌症、已经从其开始的位置扩散到身体其它部分的转移性癌症、原发性癌症缓解后的复发，以及第二原发性癌症，该第二原发性癌症是具有既往癌症病史的人体内的新原发性癌症，其与前者为不同类型的癌症。如本文所用，“原发性癌症”或“原发性肿瘤”是指受试者或患者体内的原始或第一癌症或肿瘤。
如本文所用，术语“转移”是指在位于距癌症的原发性部位一定距离处的不同或继发部位处的恶性生长，其中转移包括来自原发性生长的癌细胞。例如，“肺转移”是指起源于别处(即，来自原发性癌症)的肺中的继发性癌症/肿瘤。“癌症的转移”和“癌症转移”在本文中可互换使用，并且是指在距原发性癌症部位一定距离处的继发性癌症生长。
如本文所用，术语“表达”包括mRNA从基因或基因部分的产生，包括由RNA或基因或基因部分编码的蛋白的产生，并且包括与表达相关的检测物质的出现。例如，cDNA，结合配体(例如，抗体)与基因或其它寡核苷酸、蛋白或蛋白片段的结合，以及结合配体的显色部分均落入术语“表达”的范围内。因此，在免疫印迹(例如，蛋白印迹)上印迹密度的增加也落入基于生物分子的术语“表达”的范围内。
如本文所用，术语“有效量”是指以必要或足够的剂量和时间段有效实现所需治疗或预防结果的量。
如本文所用，术语“治疗”意指降低患者经历疾病的症状(例如，肿瘤生长和/或转移，或由免疫细胞的数量和/或活性介导的其它作用等)的频率。该术语包括施用本发明的化合物或药剂以预防或延迟疾病的症状、并发症或生物化学指标的发作、缓解症状或阻止或抑制疾病、病状或病症的进一步发展。治疗可以是预防性的(以预防或延迟疾病的发作，或预防其临床或亚临床症状的表现)或治疗性抑制或缓解疾病表现后的症状。
如本文所用，术语“患者”是指人或动物受试者。在优选的实施方式中，患者是人。
除非另有说明，否则术语“药学上可接受的”用于将部分(例如，盐、剂型或赋形剂)表征为适于根据合理的医学判断使用。通常，药学上可接受的部分具有超过该部分可能具有的任何有害作用的一种或多种益处。有害作用可以包括例如过度毒性、刺激、过敏响应，以及其它问题和并发症。
如本文所用，“C1-3”意指具有1、2或3个碳原子的碳基团。
除非另有说明，否则术语“烷基”包括直链和支链烷基，并且可以是经取代或未经取代的。“烷基”包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、戊基。
当在两个或更多个项目的列表中使用时，术语“和/或”意指所列出的项目中的任一个可以单独使用或与所列出的项目中的任一个或多个组合使用。例如，表达“A和/或B”旨在意指A和B中的一者或两者，即，单独的A、单独的B，或组合的A和B。表达“A、B和/或C”旨在意指单独的A、单独的B、单独的C、组合的A和B、组合的A和C、组合的B和C，或组合的A、B和C。
如本文所用，单数和单数形式的术语例如“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物，除非内容另外清楚地指明。
在提供值的范围的情况下，应当理解，在范围的上限与下限之间的每个中间值以及在所陈述范围内的任何其它陈述值或中间值均涵盖在本公开内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且也涵盖在本公开内，但受所陈述范围内的任何具体排除的限制。在所陈述范围包括限制中的一个或两个的情况下，排除那些包括的限制中的一个或两个的范围也包括在本公开中。每当使用短语“包含”时，也设想了如“基本上由…组成”和“由…组成”的变型。
本文提供了用于治疗原发性癌症或癌症转移的方法，其部分地包含向需要治疗的患者施用包含有效量的CTSC抑制剂的药物组合物。治疗抑制、减缓或逆转原发性癌症或转移的进程，例如，减小原发性肿瘤或转移性生长的大小。CTSC，也称为二肽基肽酶1(DPP1)，是一种蛋白酶，并且其遗传序列位于染色体11q14.1-q14.3处。
据报道，CTSC对于免疫细胞中表达的丝氨酸活化很重要。例如，CTSC可以活化中性粒细胞中的中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)、蛋白酶3(PR3)、组织蛋白酶G(CTSG)和中性粒细胞丝氨酸蛋白酶4(NSP4)、肥大细胞中的糜蛋白酶和类胰蛋白酶αII/βII/γ，以及淋巴细胞中的颗粒酶A/B。
以CTSC活化中性粒细胞的NE、PR3、CTSG和NSP4为例，溶酶体或高尔基体定位的CTSC通过去除N末端处的两个氨基酸活化中性粒细胞的NE、PR3和CTSG三种丝氨酸蛋白酶，从而起到调节炎症反应的作用。在中性粒细胞成熟过程的早期阶段，即，形态学上的成髓细胞和前髓细胞阶段，NSP以酶原的形式瞬时表达，并且在高尔基体转运过程期间或在初级颗粒(嗜苯胺蓝颗粒)内，包括在中性粒细胞丝氨酸蛋白酶(NE、PR3、CTSG和NSP4)的酶原的N-末端处的阻断其自身酶活性的二肽被CTSC切割，并且然后以活性形式储存在初级颗粒中。然而，还有文献报道PR3在细胞膜上以失活状态组成型表达。
虽然CTSC对中性粒细胞具有正常免疫功能起重要作用，但CTSC在转移性癌症中的作用尚未完全阐明。在本公开中已经发现，通过改善病灶部位处的中性粒细胞浸润和通过增加NET的数量，CTSC改善肿瘤微环境并促进乳腺癌的肺转移。照此，本发明的一个方面涉及一种用于治疗需要治疗的患者体内的癌症转移的方法，该方法包含向患者施用包含有效量的CTSC抑制剂的药物组合物。治疗抑制、减缓或逆转转移的进程。
在一个实施方式中，CTSC抑制剂是下表1或表2中列出的CTSC抑制剂中的一个。
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用于本文提供的方法的其它CTSC抑制剂已经公开于以下各项中：美国专利第8,889,708、8,987,249和9,073,869号以及国际专利申请公开案第WO 2012/119941、WO 2015/032945、WO 2015/032943和WO 2015/032942号，这些文件中的每一者的内容通过引用并入本文。适用于本文所述的方法的其它CTSC抑制剂已经公开于以下各项中：美国专利第8,999,975；9,440,960；9,713,606；9,856,228；9,879,026；RE47,636E；10,238,633号；Bondebjerg等人“人二肽基肽酶I(hDPPI)的新型氨基脲来源的抑制剂(Novelsemicarbazide-derived inhibitors of human dipeptidyl peptidase I(hDPPI))”《生物有机化学与医药化学(Bioorg Med Chem.)》13:4008-4424(2005)；和Bondebjerg等人“二肽基腈作为人二肽基肽酶1抑制剂(Dipeptidyl Nitriles as Human DipeptidylPeptidase 1Inhibitors)”《生物有机化学与医药化学通讯(Bioorg Med Chem Lett.)》16:3614-3617(2006)，这些文件中的每一者的内容以全文引用的方式并入本文。
在本文提供的用于治疗原发性癌症或癌症转移的方法的一些实施方式中，方法包含在治疗期内向需要治疗的患者施用药物组合物，该药物组合物包含有效量的式(I)化合物或其药学上可接受的盐：
其中，
R1是
R2是氢、F、Cl、Br、OSO2C1-3烷基或C1-3烷基；
R3是氢、F、Cl、Br、CN、CF3、SO2C1-3烷基、CONH2或SO2NR4R5，
其中R4和R5与它们所附接的氮原子一起形成氮杂环丁烷、吡咯烷或哌啶环；
X是O、S或CF2；
Y是O或S；
Q是CH或N；
R6是C1-3烷基，其中C1-3烷基任选地被1、2或3个F取代并且任选地被选自OH、OC1-3烷基、N(C1-3烷基)2、环丙基或四氢吡喃的一个取代基取代；并且
R7是氢、F、Cl或CH3，
其中治疗抑制、减缓或逆转原发性癌症的进程或抑制、减缓或逆转转移的进程。
在另外的实施方式中，方法是治疗癌症转移的方法。
在一个实施方式中，向患者施用包含有效量的式(I)化合物的药物组合物，其中，R1是R2是氢、F、Cl、Br、OSO2C1-3烷基或C1-3烷基；R3是氢、F、Cl、Br、CN、CF3、SO2C1-3烷基、CONH2或SO2NR4R5，其中R4和R5与它们所附接的氮原子一起形成氮杂环丁烷、吡咯烷或哌啶环。在另外的实施方式中，R2是氢、F、Cl或C1-3烷基；并且R3是氢、F、Cl、CN或SO2C1-3烷基。在另外的实施方式中，R3是氢、F或CN。
在另一实施方式中，向患者施用包含有效量的式(I)化合物的药物组合物，其中，R1是 X是O、S或CF2；Y是O或S；Q是CH或N；R6是C1-3烷基，其中C1-3烷基任选地被1、2或3个F取代并且任选地被OH、OC1-3烷基、N(C1-3烷基)2、环丙基或四氢吡喃取代；并且R7是氢、F、Cl或CH3。在另外的实施方式中，R1是/>
在另一实施方式中，向患者施用包含有效量的式(I)化合物的药物组合物，其中，R1是X是O、S或CF2；Y是O或S；R6是C1-3烷基，其任选地被1、2或3个F取代并且任选地被OH、OC1-3烷基、N(C1-3烷基)2、环丙基或四氢吡喃取代；并且R7是氢、F、Cl或CH3。在另外的实施方式中，R1是/>
在一些实施方式中，向患者施用包含有效量的式(I)化合物的药物组合物，其中，R1是X是O、S或CF2；R6是C1-3烷基，其中C1-3烷基任选地被1、2或3个F取代；并且R7是氢、F、Cl或CH3。
在又一实施方式中，向患者施用包含有效量的式(I)化合物的药物组合物，其中，R1是X是O；R6是C1-3烷基，其中C1-3烷基任选地被1、2或3个F取代；并且R7是氢。在另外的实施方式中，R6是C1-3烷基，即，甲基、乙基或丙基。在再另外的实施方式中，R6是甲基。
在还一实施方式中，向患者施用包含有效量的式(I)化合物的药物组合物，其中R2是氢、F、Cl、Br、OSO2C1-3烷基或C1-3烷基。在另外的实施方式中，R2是氢、F、Cl或C1-3烷基。在再另外的实施方式中，R2是氢、F或C1-3烷基。
在本文提供的方法的一个实施方式中，向患者施用包含有效量的式(I)化合物的药物组合物，其中R3是氢、F、Cl、Br、CN、CF3、SO2C1-3烷基CONH2或SO2NR4R5，其中R4和R5与它们所附接的氮原子一起形成氮杂环丁烷、吡咯烷或哌啶环。在另外的实施方式中，R3是氢、F、Cl、CN或SO2C1-3烷基。在再另外的实施方式中，R3是氢、F或CN。
在本文提供的用于治疗原发性癌症或癌症转移的方法的一个实施方式中，向患者施用包含有效量的式(I)化合物的药物组合物，其中R6是C1-3烷基，并且C1-3烷基任选地被1、2或3个F取代并且任选地被选自OH、OC1-3烷基、N(C1-3烷基)2、环丙基或四氢吡喃的一个取代基取代。在另外的实施方式中，R6是C1-3烷基，其中C1-3烷基任选地被1、2或3个F取代。在再另外的实施方式中，R6是甲基或乙基。在再另外的实施方式中，R6是甲基。
在还一实施方式中，R7是氢、F、Cl或CH3。在另外的实施方式中，R7是氢。
在一个实施方式中，向患者施用的药物组合物包含有效量的(2S)-N-{(1S)-1-氰基-2-[4-(3-甲基-2-氧代-2,3-二氢-1,3-苯并恶唑-5-基)苯基]乙基}-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺(brensocatib)：或其药学上可接受的盐。在另外的实施方式中，式(I)化合物是brensocatib。在另外的实施方式中，方法是用于治疗癌症转移的方法。在另外的实施方式中，向需要治疗原发性癌症的患者施用包含有效量的brensocatib的药物组合物。
在一些实施方式中，向患者施用的化合物是以下式(I)的化合物中的一种：
(2S)-N-[(1S)-1-氰基-2-(4'-氰基联苯-4-基)乙基]-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺，
(2S)-N-{(1S)-1-氰基-2-[4-(3-甲基-2-氧代-2,3-二氢-1,3-苯并恶唑-5-基)苯基]乙基}-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺，
(2S)-N-{(1S)-1-氰基-2-[4-(3,7-二甲基-2-氧代-2,3-二氢-1,3-苯并恶唑-5-基)苯基]乙基}-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺，
甲磺酸4'-[(2S)-2-氰基-2-{[(2S)-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-基羰基]氨基}乙基]联苯-3-基酯，
(2S)-N-{(1S)-1-氰基-2-[4-(3-甲基-1,2-苯并恶唑-5-基)苯基]乙基}-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺，
(2S)-N-{(1S)-1-氰基-2-[4'-(三氟甲基)联苯-4-基]乙基}-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺，
(2S)-N-[(1S)-1-氰基-2-(3'4'-二氟联苯基-4-基)乙基]-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺，
(2S)-N-{(1S)-1-氰基-2-[4(6-氰基吡啶-3-基)苯基]乙基}-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺，
(2S)-N-{(1S)-1-氰基-2-[4-(4-甲基-3-氧代-3,4-二氢-2H-1,4-苯并噻嗪-6-基)苯基]乙基}-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺，
(2S)-N-{(1S)-1-氰基-2-[4-(3-乙基-7-甲基-2-氧代-2,3-二氢-1,3-苯并恶唑-5-基)苯基]乙基}-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺，
(2S)-N-[(1S)-1-氰基-2-{4-[3-(2-羟基-2-甲基丙基)-2-氧代-2,3-二氢-1,3-苯并恶唑-5-基]苯基}乙基]-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺，
(2S)-N-[(1S)-1-氰基-2-{4-[3-(2,2-二氟乙基)-7-氟-2-氧代-2,3-二氢-1,3-苯并恶唑-5-基]苯基}乙基]-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺，
(2S)-N-[(1S)-1-氰基-2-(4-{3-[2-(二甲基氨基)乙基]-2-氧代-2,3-二氢-1,3-苯并恶唑-5-基}苯基)乙基]-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺，
(2S)-N-{(1S)-1-氰基-2-[4-(3,3-二氟-1-甲基-2-氧代-2,3-二氢-1H-吲哚-6-基)苯基]乙基}-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺，
(2S)-N-{(1S)-1-氰基-2-[4-(7-氟-3-甲基-2-氧代-2,3-二氢-1,3-苯并恶唑-5-基)苯基]乙基}-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺，
(2S)-N-{(1S)-1-氰基-2-[4-(3-乙基-2-氧代-2,3-二氢-1,3-苯并恶唑-5-基)苯基]乙基}-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺，
(2S)-N-[(1S)-1-氰基-2-{4-[3-(环丙基甲基)-2-氧代-2,3-二氢-1,3-苯并恶唑-5-基]苯基}乙基]-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺，
(2S)-N-[(1S)-1-氰基-2-{4-[3-(2-甲氧基乙基)-2-氧代-2,3-二氢-1,3-苯并噻唑-5-基]苯基}乙基]-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺，
(2S)-N-[(1S)-1-氰基-2-{4-[2-氧代-3-(丙-2-基)-2,3-二氢-1,3-苯并恶唑-5-基]苯基}乙基]-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺，
(2S)-N-{(1S)-1-氰基-2-[4-(4-甲基-3-氧代-3,4-二氢-2H-1,4-苯并恶嗪-6-基)苯基]乙基}-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺，
(2S)-N-[(1S)-1-氰基-2-{4-[3-(2-甲氧基乙基)-2-氧代-2,3-二氢-1,3-苯并恶唑-5-基]苯基}乙基]-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺，
(2S)-N-{(1S)-1-氰基-2-[4-(5-氰基噻吩-2-基)苯基]乙基}-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺，
(2S)-N-[(1S)-2-(4'-氨基甲酰基-3'-氟联苯-4-基)-1-氰乙基]-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺，
(2S)-N-{(1S)-1-氰基-2-[4-(1-甲基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-7-基)苯基]乙基}-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺，
(2S)-N-[(1S)-1-氰基-2-{4-[2-氧代-3-(四氢-2H-吡喃-4-基甲基)-2,3-二氢-1,3-苯并恶唑-5-基]苯基}乙基]-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺，
(2S)-N-{(1S)-2-[4-(7-氯-3-甲基-2-氧代-2,3-二氢-1,3-苯并恶唑-5-基)苯基]-1-氰乙基}-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺，
(2S)-N-[(1S)-1-氰基-2-{4-[3-(2,2-二氟乙基)-2-氧代-2,3-二氢-1,3-苯并恶唑-5-基]苯基}乙基]-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺，
(2S)-N-[(1S)-1-氰基-2-{4-[2-氧代-3-(2,2,2-三氟乙基)-2,3-二氢-1,3-苯并恶唑-5-基]苯基}乙基]-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺，
(2S)-N-{(1S)-1-氰基-2-[4-(3-甲基-2-氧代-2,3-二氢-1,3-苯并噻唑-5-基)苯基]乙基}-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺，
(2S)-N-{(1S)-1-氰基-2-[4'-(甲基磺酰基)联苯-4-基]乙基}-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺，
(2S)-N-{(1S)-2-[4'-(氮杂环丁烷-1-基磺酰基)联苯-4-基]-1-氰乙基}-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺，
(2S)-N-[(1S)-1-氰基-2-(4'-氟联苯基-4-基)乙基]-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺，
(2S)-N-{(1S)-2-[4-(1,3-苯并噻唑-5-基)苯基]-1-氰乙基}-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺，或
(2S)-N-[(1S)-1-氰基-2-(4'-氰基联苯-4-基)乙基]-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺，
或前述化合物中的一种的药学上可接受的盐。
在本文提供的方法的一个实施方式中，向患者施用的药物组合物包含有效量的brensocatib：在一些实施方式中，brensocatib为如美国专利第9,522,894号中所公开的多晶型形式A，该专利的公开内容以全文引用的方式并入本文用于所有目的。在一些实施方式中，brensocatib通过使用CuKα辐射测量的具有在约12.2±0.2(°2-θ)处的峰的X-射线粉末衍射图表征。在一些实施方式中，brensocatib通过使用CuKα辐射测量的具有在约20.6±0.2(°2-θ)处的峰的X-射线粉末衍射图表征。在一些实施方式中，brensocatib通过使用CuKα辐射测量的具有在约12.2±0.2和约20.6±0.2(°2-θ)处的峰的X-射线粉末衍射图表征。在一些实施方式中，brensocatib通过使用CuKα辐射测量的具有在约12.2±0.2、约14.3±0.2、约16.2±0.2、约19.1±0.2和约20.6±0.2(°2-θ)处的峰的X-射线粉末衍射图表征。
本领域技术人员将认识到，本公开的化合物可以以已知的方式以各种方法制备。例如，在一个实施方式中，式(I)的化合物根据美国专利第9,522,894号中列出的方法制备，该专利以全文引用的方式并入本文用于所有目的。
本文所述的CTSC抑制剂，例如式(I)的化合物，可以作为药学上可接受的盐存在于药物组合物中。
不希望受理论束缚，本文所述的CTSC抑制剂(例如式(I)化合物)的药学上可接受的盐由于其化学或物理特性中的一种或多种(如在不同温度和湿度下的稳定性，或在H2O、油或其它溶剂中的所需溶解度)而可能是有利的。在一些情况下，盐可以用于帮助CTSC抑制剂的分离或纯化。
当CTSC抑制剂是足够酸性时，药学上可接受的盐包括但不限于碱金属盐(例如，Na或K)、碱土金属盐(例如，Ca或Mg)，或有机胺盐。当CTSC抑制剂是足够碱性时，药学上可接受的盐包括但不限于无机或有机酸加成盐。在一个实施方式中，药学上可接受的盐是氯化物盐、马来酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、甲磺酸盐、酒石酸盐、溴化物盐、硝酸盐、磷酸盐、乙酸盐或葡萄糖酸盐。
在一些实施方式中，根据带电官能团的数量和阳离子或阴离子的化合价，可以存在多于一种的阳离子或阴离子。
对于适用于本文的合适的盐和药学上可接受的盐的综述，可以参见Berge等人《药物科学杂志(J.Pharm.Sci.)》1977,66,1-19或《药用盐手册：特性、选择和使用(Handbookof Pharmaceutical Salts:Properties,selection and use)》,P.H.Stahl,P.G.Vermuth,IUPAC,Wiley-VCH出版社,2002，其以全文引用的方式并入本文用于所有目的。
本文所述的CTSC抑制剂可以形成其盐和共晶形式的混合物。因此，应当理解，本文提供的方法可以使用CTSC抑制剂(例如式(I)的化合物)的此类盐/共晶混合物。
盐和共晶可以使用熟知的技术表征，例如X-射线粉末衍射、单晶X-射线衍射(例如用于评价质子位置、键长或键角)、固态NMR(用于评价例如C、N或P化学位移)或光谱技术(用于测量例如OH、NH或COOH信号和由氢键产生的IR峰位移)。
还应当理解，CTSC抑制剂可以以溶剂化形式存在，例如水合物，包括式(I)化合物或本文所述的另一种CTSC抑制剂的药学上可接受的盐的溶剂化物。
本文所述的某些CTSC抑制剂还可以含有键(例如，碳-碳键、碳-氮键如酰胺键)，其中键旋转被限制为围绕该特定键，例如，由环键或双键的存在引起的限制。因此，应当理解，本公开涵盖所有此类异构体。此外，CTSC抑制剂可以含有多种互变异构形式。立体异构体可以使用常规技术分离，例如色谱法或分级结晶，或者立体异构体可以通过立体选择性合成而制成。
在一个实施方式中，药物组合物包含有效量的同位素示踪的(或“放射性示踪的”)CTSC抑制剂，例如式(I)化合物。此类衍生物是CTSC抑制剂的衍生物，其中一个或多个原子被原子质量或质量数不同于自然界中通常发现的原子质量或质量数的原子替代。可以掺入的放射性核素的实例包括2H(也写为“D”，代表氘)。因此，在一个实施方式中，CTSC抑制剂是本文所述的抑制剂中的一个，其中一个或多个氢原子被一个或多个氘原子替代；并且氘代化合物用于本文提供的方法中的一种。
在另一实施方式中，CTSC抑制剂以前药的形式施用，前药在人或动物体内分解以得到本文所述的CTSC抑制剂中的一个。前药的实例包括式(I)的化合物的体内可水解的酯。
含有羧基或羟基的CTSC抑制剂化合物的体内可水解的(或可裂解的)酯是例如在人或动物体内水解以产生母体酸或醇的药学上可接受的酯。对于酯前药衍生物的实例，可以参见：《当前药物代谢(Curr.Drug.Metab.)》2003,4,461，其以全文引用的方式并入本文用于所有目的。各种其它形式的前药是本领域已知的，并且可以用于本文提供的方法中。对于前药的实例，可以参见：《自然药物发现综述(Nature Reviews Drug Discovery)》2008,7,255，其公开内容以全文引用的方式并入本文用于所有目的。
施用的剂量将根据使用的CTSC抑制剂和施用模式而变化。施用的剂量将随使用的CTSC抑制剂和施用模式而变化。例如，在一个实施方式中，CTSC抑制剂的日剂量可以在0.05微克/千克体重(μg/kg)至100微克/千克体重(μg/kg)的范围内。在另一实施方式中，如果CTSC抑制剂口服施用，则本发明的方法中使用的化合物的日剂量可以在0.01微克/千克体重(μg/kg)至100毫克/千克体重(mg/kg)的范围内。
在一个实施方式中，CTSC抑制剂的日剂量为约5mg至约70mg、约10mg至约60mg，或约10mg至约40mg。在另外的实施方式中，CTSC抑制剂是式(I)化合物或其药学上可接受的盐。在还另外的实施方式中，化合物是brensocatib。在另一实施方式中，CTSC抑制剂的日剂量为约10mg、约25mg、约40mg或约65mg。在另外的实施方式中，CTSC抑制剂是式(I)化合物或其药学上可接受的盐。在还另外的实施方式中，化合物是brensocatib。
在一个实施方式中，CTSC抑制剂以口服剂型施用。在一个实施方式中，CTSC抑制剂的口服剂量为约5mg至约70mg、约10mg至约60mg，或约10mg至约40mg。在另外的实施方式中，CTSC抑制剂是式(I)化合物或其药学上可接受的盐。在还另外的实施方式中，化合物是brensocatib。在另一实施方式中，CTSC抑制剂的口服剂量为约10mg、约25mg、约40mg或约65mg。在另外的实施方式中，CTSC抑制剂是式(I)化合物或其药学上可接受的盐。在还另外的实施方式中，化合物是brensocatib。
在本文提供的方法中，向需要治疗原发性癌症或癌症转移的患者施用包含有效量的CTSC抑制剂的药物组合物。
在一个实施方式中，药物组合物为固体剂型。用于口服施用的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或媒介物)如柠檬酸钠或磷酸二钙混合，或与以下成分混合：(a)填充剂或增容剂，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)结合剂，如羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯树胶；(c)保湿剂，如甘油；(d)崩解剂，如琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、海藻酸、一些复合硅酸盐和碳酸钠；(e)缓慢溶剂，如石蜡；(f)吸收促进剂，如季胺化合物；(g)润湿剂，如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，如高岭土；和(i)润滑剂，如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂的剂型也可以含有缓冲剂。
在一个实施方式中，药物组合物为片剂形式。在另外的实施方式中，片剂形式的药物组合物还包含片剂包衣。
固体剂型如片剂、糖丸剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可以使用包衣和壳如肠溶包衣和本领域已知的其它材料制备。它们可以含有遮光剂，并且此外，此类组合物中的活性化合物或化合物可以以延迟的方式在消化道的一部分中释放。可以使用的包埋组分的实例是聚合物材料和蜡质材料。如果需要，活性化合物也可以与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊剂。
用于口服施用的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂或酊剂。除了活性化合物之外，液体剂型还可以含有本领域常规使用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺，以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚芽油、橄榄油、蓖麻油、芝麻油，或这些物质的混合物。
用于口服应用的液体制剂可以是糖浆剂、溶液剂或混悬剂的形式。溶液例如可以含有本发明的方法中使用的化合物，余量为糖以及乙醇、水、甘油和丙二醇的混合物。任选地，此类液体制剂可以含有着色剂、调味剂、糖精和/或羧甲基纤维素作为增稠剂。此外，当制作用于口服使用的制剂时，可以使用本领域技术人员已知的其它赋形剂。
除了这些惰性稀释剂之外，组合物还可以含有佐剂，如润湿剂、乳化剂、悬浮剂、甜味剂、调味剂和香料。
除了活性化合物之外，悬浮液还可以含有悬浮剂，如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇、脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、甲醇铝、琼脂或这些物质的混合物。
用于肠胃外注射的组合物可以包括生理学上可接受的无菌水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳液，以及用于再溶解成无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。合适的水性和非水性媒介物、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其合适的混合物。
在一个实施方式中，本文提供的方法中使用的药物组合物包含有效量的CTSC抑制剂和药学上可接受的载体、佐剂或稀释剂。“药学上可接受的载体、佐剂或稀释剂”是指一种或多种相容的固体或液体填充剂或凝胶物质，其适用于人体并且必须具有足够的纯度和足够低的毒性。本文中的“相容的”是指组合物中的所有成分可以彼此混合并且可以与根据本公开的化合物混合，同时化合物的药效不会显著降低。药学上可接受的载体、佐剂或稀释剂的一些实例包括纤维素及其衍生物(例如，羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠和乙酸纤维素)、明胶、滑石、固体润滑剂(例如，硬脂酸和硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(例如，大豆油、芝麻油、花生油和橄榄油)、多元醇(例如，丙二醇、甘油、甘露醇和山梨糖醇)、乳化剂(例如，Tween)、润湿剂(例如，十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
对于口服施用，CTSC抑制剂可以与一种或多种药学上可接受的佐剂、稀释剂或载体混合，例如乳糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇；淀粉，例如马铃薯淀粉、玉米淀粉或支链淀粉；纤维素衍生物；粘合剂，例如明胶或聚乙烯吡咯烷酮；崩解剂，例如纤维素衍生物，和/或润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸钙、聚乙二醇、蜡、石蜡等，并且然后压制成片剂。如果需要包衣片剂，则可以用溶解或分散在水或易挥发有机溶剂中的合适聚合物对如上所述制备的片芯进行包衣。替代地，片剂可以用浓缩糖溶液包衣，浓缩糖溶液可以含有例如阿拉伯树胶、明胶、滑石和二氧化钛。
在一个口服施用实施方式中，口服剂型是膜包衣的口服片剂。在另外的实施方式中，剂型是在体外测试条件下具有快速溶解特点的速释剂型。
对于软明胶胶囊剂的制备，本发明的方法中使用的化合物可以与例如植物油或聚乙二醇混合。硬明胶胶囊剂可以含有使用药物赋形剂(如上述用于片剂的赋形剂)的化合物颗粒。而且，本发明的方法中使用的化合物的液体或半固体制剂可以填充到硬明胶胶囊剂中。
在一个实施方式中，组合物是口服崩解片(ODT)。ODT与传统片剂的不同之处在于它们被设计成在舌头上溶解而不是整个吞咽。
在一个实施方式中，组合物是口服薄膜或口服崩解膜(ODF)。当置于舌头上时，此类制剂经由与唾液的相互作用而水合，并从剂型中释放活性化合物。在一个实施方式中，ODF含有成膜聚合物，如羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、短梗霉聚糖、羧甲基纤维素(CMC)、果胶、淀粉、聚乙酸乙烯酯(PVA)或海藻酸钠。
在本文提供的用于治疗原发性癌症或癌症转移的方法的一个实施方式中，药物组合物是国际申请公开案第WO 2019/166626号中描述的组合物中的一种，该申请的公开内容以全文引用的方式并入本文用于所有目的。
在一个实施方式中，药学上可接受的载体、佐剂或稀释剂是无菌盐水。在本公开的其它方面，药学上可接受的载体、佐剂或稀释剂是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
用于根据施用路径选择和制备合适的药物制剂的常规程序描述于例如《药物—剂型设计的科学(Pharmaceuticals-The Science of Dosage Form Designs)》M.E.Aulton,丘吉尔利文斯敦(Churchill Livingstone),第二版,2002中，其以全文引用的方式并入本文用于所有目的。
在本文提供的方法中，在治疗期内施用药物组合物。在一个实施方式中，治疗期为至少一(1)个月、至少三(3)个月、至少六(6)个月、至少十二(12)个月、至少十八(18)个月、至少二十四(24)个月、至少三十(30)个月或至少三十六(36)个月。
在一个实施方式中，治疗期为约六(6)个月至约三十六(36)个月。在另外的实施方式中，治疗期为约六个月至约三十(30)个月。在另外的实施方式中，治疗期为约六个月至约二十四(24)个月。在还另外的实施方式中，治疗期为约六(6)个月至约十八(18)个月。在又另外的实施方式中，治疗期为约六(6)个月至约十二(12)个月。
在另一实施方式中，治疗期为约十二(12)个月至约三十六(36)个月。在另外的实施方式中，治疗期为约十二(12)个月至约三十(30)个月。在另外的实施方式中，治疗期为约十二(12)个月至约二十四(24)个月。在还另外的实施方式中，治疗期为约十二(12)个月至约十八(18)个月。
在一个实施方式中，在治疗期期间，药物组合物每天施用一次。在另外的实施方式中，药物组合物是口服组合物。在另外的实施方式中，药物组合物在每天大约相同的时间施用，例如在早餐之前。
在另一实施方式中，在治疗期期间，药物组合物每天施用两次。在又一实施方式中，在治疗期期间，每周1×、每隔一天、每三天、每周2×、每周3×、每周4×或每周5×施用药物组合物。
在本发明的一些实施方式中，在整个治疗期期间每天一次向有需要的患者施用药物组合物。在另一实施方式中，在整个治疗期期间每天两次向有需要的患者施用药物组合物。在另一实施方式中，在整个治疗期期间每天三次向有需要的患者施用药物组合物。在又一实施方式中，在整个治疗期期间每隔一天向有需要的患者施用药物组合物。在又一实施方式中，在整个治疗期期间每三天向有需要的患者施用药物组合物。
在本发明的方法的一些实施方式中，治疗期为至少1个月、至少6周、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少1年、至少13个月、至少14个月、至少15个月、至少16个月、至少17个月、至少18个月、至少19个月、至少20个月、至少21个月、至少22个月、至少23个月或至少2年的持续时间。
本发明部分地涉及用于治疗原发性癌症和/或癌症转移的方法，其包含在治疗期内向需要治疗的患者施用包含有效量的CTSC抑制剂(例如，式(I)化合物或其药学上可接受的盐)的药物组合物。在一个实施方式中，CTSC抑制剂是brensocatib。在一个实施方式中，CTSC抑制剂是表1中列出的化合物中的一种或其药学上可接受的盐。根据本发明的方法，治疗抑制、减缓或逆转原发性癌症和/或转移的进程。
在一个实施方式中，方法是用于治疗原发性癌症的方法。在另外的实施方式中，原发性癌症是肝癌。在另一实施方式中，原发性癌症是乳腺癌。在另外的实施方式中，乳腺癌是腔内乳腺癌、人表皮生长因子受体2(HER2)阳性乳腺癌或三阴性乳腺癌。在又一实施方式中，原发性癌症是肺癌。在一个实施方式中，肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)。在另一实施方式中，肺癌是小细胞肺癌。
在一个实施方式中，方法是用于治疗癌症转移的方法。在另外的实施方式中，转移是乳腺癌的转移。在另外的实施方式中，乳腺癌是腔内乳腺癌、人表皮生长因子受体2(HER2)阳性乳腺癌或三阴性乳腺癌。
在一个实施方式中，如上所述，本文提供的方法是用于治疗乳腺癌的转移的方法。在另外的实施方式中，乳腺癌的转移是乳腺癌的肺转移、乳腺癌的肝转移、乳腺癌的骨转移或乳腺癌的脑转移。在还另外的实施方式中，乳腺癌的转移是乳腺癌的肺转移。
在本文提供的用于治疗癌症转移的方法的另一实施方式中，转移是肺癌的转移。在一个实施方式中，肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)。在另一实施方式中，肺癌是小细胞肺癌。
在本文提供的用于治疗癌症转移的方法的又一实施方式中，转移是肺癌的骨转移、胰腺癌的肝转移或胃癌的肝转移。在本文提供的用于治疗癌症转移的方法的又一实施方式中，转移是乳腺癌的肺转移、乳腺癌的肝转移、乳腺癌的骨转移、乳腺癌的脑转移、肺癌的骨转移、胰腺癌的肝转移或胃癌的肝转移。
在本文提供的用于治疗癌症转移的方法的一个实施方式中，转移是胰腺癌或胃癌的转移。在另外的实施方式中，转移是胰腺癌的转移。在另一实施方式中，转移是胃癌的转移。
在又一实施方式中，转移是骨癌、肝癌、胃癌或结肠直肠癌的转移。
在方法的一个实施方式中，治疗还包含减轻由原发性癌症引起的患者的体重损失。在另一实施方式中，治疗还包含减轻由肿瘤转移引起的患者的体重损失。
在用于治疗原发性癌症或癌症转移的方法的一个实施方式中，治疗还包含降低患者体内CTSC的血清学水平。在一个实施方式中，原发性肿瘤或转移在治疗期之前包含升高的CTSC蛋白的血清学水平。在一个实施方式中，在治疗期期间或治疗期之后，治疗包含与治疗期之前患者的CTSC蛋白的血清学水平相比，使患者的CTSC蛋白的血清学水平降低至少约10％。在另外的实施方式中，治疗包含与治疗期之前患者的CTSC蛋白的血清学水平相比，使患者的CTSC蛋白的血清学水平降低至少约20％。在又另外的实施方式中，治疗包含与治疗期之前患者的CTSC蛋白的血清学水平相比，使患者的CTSC蛋白的血清学水平降低至少约30％。在还另外的实施方式中，治疗包含与治疗期之前患者的CTSC蛋白的血清学水平相比，患者的CTSC蛋白的血清学水平降低至少约40％。在又另外的实施方式中，治疗包含与治疗期之前患者的CTSC蛋白的血清学水平相比，使患者的CTSC蛋白的血清学水平降低至少约50％。在另一实施方式中，治疗包含与治疗期之前患者的CTSC蛋白的血清学水平相比，使患者的CTSC蛋白的血清学水平降低至少约60％。在还一实施方式中，治疗包含与治疗期之前患者的CTSC蛋白的血清学水平相比，使患者的CTSC蛋白的血清学水平降低至少约70％。在又一实施方式中，治疗包含与治疗期之前患者的CTSC蛋白的血清学水平相比，使患者的CTSC蛋白的血清学水平降低至少约80％。
在用于治疗原发性癌症或转移的方法的一个实施方式中，与治疗期之前患者的CTSC蛋白的血清学水平相比，患者的CTSC蛋白的血清学水平降低约10％至约80％。在另外的实施方式中，与治疗期之前患者的CTSC蛋白的血清学水平相比，患者的CTSC蛋白的血清学水平降低约10％至约70％。在还另外的实施方式中，与治疗期之前患者的CTSC蛋白的血清学水平相比，患者的CTSC蛋白的血清学水平降低约10％至约60％。在又另外的实施方式中，与治疗期之前患者的CTSC蛋白的血清学水平相比，患者的CTSC蛋白的血清学水平降低约10％至约50％。在还另外的实施方式中，与治疗期之前患者的CTSC蛋白的血清学水平相比，患者的CTSC蛋白的血清学水平降低约10％至约40％。
在另一实施方式中，与治疗期之前患者的CTSC蛋白的血清学水平相比，患者的CTSC蛋白的血清学水平降低约40％至约80％。在另外的实施方式中，与治疗期之前患者的CTSC蛋白的血清学水平相比，患者的CTSC蛋白的血清学水平降低约50％至约80％。在还另外的实施方式中，与治疗期之前患者的CTSC蛋白的血清学水平相比，患者的CTSC蛋白的血清学水平降低约60％至约80％。
在本文提供的治疗方法的一个实施方式中，方法还包含与治疗期之前的中性粒细胞细胞外陷阱(NET)的数量相比，在治疗期期间或治疗期之后减少患者体内的NET。在另外的实施方式中，方法包含与治疗期之前的转移中的NET的数量相比，在治疗期期间或治疗期之后减少转移中的NET。在另一实施方式中，方法包含与治疗期之前的原发性癌症中的NET的数量相比，在治疗期期间或治疗期之后减少原发性癌症中的NET。在一个实施方式中，方法包含与治疗期之前的循环NET的数量相比，在治疗期期间或治疗期之后减少患者体内的循环NET。
在本文提供的方法的一个实施方式中，与治疗期之前的NET的数量相比，在治疗期期间或治疗期之后NET(例如，循环的或在转移的一个或多个部位处的)的数量减少至少约10％。在另外的实施方式中，与治疗期之前的NET的数量相比，NET的数量减少至少约20％。在又另外的实施方式中，与治疗期之前的NET的数量相比，NET的数量减少至少约30％。在还另外的实施方式中，与治疗期之前的NET的数量相比，NET的数量减少至少约40％。在又另外的实施方式中，与治疗期之前的NET的数量相比，NET的数量减少至少约50％。在另一实施方式中，与治疗期之前的NET的数量相比，NET的数量减少至少约60％。在还一实施方式中，与治疗期之前的NET的数量相比，NET的数量减少至少约70％。在又一实施方式中，与治疗期之前的NET的数量相比，NET的数量减少至少约80％。
在本文提供的方法的一个实施方式中，与治疗期之前的NET的数量相比，在治疗期期间或治疗期之后NET(例如，循环的，或存在于原发性肿瘤中或肿瘤转移中的)的数量减少约10％至约80％。在另外的实施方式中，与治疗期之前的NET的数量相比，NET的数量减少约10％至约70％。在还另外的实施方式中，与治疗期之前的NET的数量相比，NET的数量减少约10％至约60％。在又另外的实施方式中，与治疗期之前的NET的数量相比，NET的数量减少约10％至约50％。在还另外的实施方式中，与治疗期之前的NET的数量相比，NET的数量减少约10％至约40％。
在本文提供的治疗方法的另一实施方式中，与治疗期之前的NET的数量相比，NET的数量减少约40％至约80％。在另外的实施方式中，与治疗期之前的NET的数量相比，NET的数量减少约50％至约80％。在还另外的实施方式中，与治疗期之前的NET的数量相比，NET的数量减少约60％至约80％。
在一个实施方式中，通过免疫荧光染色检测NET。
在本文提供的转移治疗方法的另一实施方式中，方法还包含与治疗期之前的中性粒细胞迁移相比，或与未用药物组合物治疗的转移患者相比，在治疗期期间或治疗期之后减少转移中的中性粒细胞迁移。在另外的实施方式中，与治疗期之前的转移中的中性粒细胞迁移相比，在治疗期期间或治疗期之后中性粒细胞迁移减少至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％。在一个实施方式中，通过免疫荧光染色测量中性粒细胞迁移。
在本文提供的原发性癌症治疗方法的另一实施方式中，方法还包含与治疗期之前的中性粒细胞迁移相比，或与未用药物组合物治疗的原发性癌症患者相比，在治疗期期间或治疗期之后减少转移中的中性粒细胞迁移。在另外的实施方式中，与治疗期之前的原发性癌症中的中性粒细胞迁移相比，在治疗期期间或治疗期之后中性粒细胞迁移减少至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％。在一个实施方式中，通过免疫荧光染色测量中性粒细胞迁移。
在本文提供的方法的一个实施方式中，与治疗期之前的中性粒细胞迁移相比，或与未施用药物组合物的患者体内的中性粒细胞迁移相比，在治疗期期间或治疗期之后中性粒细胞迁移减少约10％至约80％。在另外的实施方式中，与治疗期之前的中性粒细胞迁移相比，或与未施用药物组合物的患者体内的中性粒细胞迁移相比，在治疗期期间或治疗期之后中性粒细胞迁移减少约10％至约70％。在还另外的实施方式中，与治疗期之前的中性粒细胞迁移相比，或与未施用药物组合物的患者体内的中性粒细胞迁移相比，在治疗期期间或治疗期之后中性粒细胞迁移减少约10％至约60％。在又另外的实施方式中，与治疗期之前的中性粒细胞迁移相比，或与未施用药物组合物的患者体内的中性粒细胞迁移相比，在治疗期期间或治疗期之后中性粒细胞迁移减少约10％至约50％。在还另外的实施方式中，与治疗期之前的中性粒细胞迁移相比，或与未施用药物组合物的患者体内的中性粒细胞迁移相比，在治疗期期间或治疗期之后中性粒细胞迁移减少约10％至约40％。
本文提供了用于治疗原发性癌症或癌症转移的方法，其部分地包含向需要治疗的患者施用CTSC抑制剂，例如式(I)化合物(例如，brensocatib)。治疗抑制、减缓或逆转原发性癌症或转移的进程。
在一个实施方式中，方法还包含与治疗期之前的白介素1β(IL-1β)水平相比，或与未施用药物组合物的患者相比，在治疗期期间或治疗期之后降低患者体内的IL-1β水平。在一个实施方式中，与治疗期之前患者体内的IL-1β水平相比，或与未施用药物组合物的患者相比，在治疗期期间或治疗期之后患者体内的IL-1β水平降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％。在另一实施方式中，方法包含与治疗期之前患者体内的IL-1β水平相比，或与未施用药物组合物的患者相比，在治疗期期间或治疗期之后将患者体内的IL-1β水平降低约5％至约25％、约25％至约50％、约50％至约75％、约25％至约75％，或约5％至约75％。
在一个实施方式中，降低IL-1β水平包含降低原发性癌症的部位或转移的部位处的IL-1β水平。在一个实施方式中，降低IL-1β水平包含降低循环IL-1β水平。
在一个实施方式中，本发明的方法还包含降低趋化因子的循环水平。在另外的实施方式中，趋化因子是白介素6(IL-6)、C-C基序趋化因子配体3(CCL3)或RELA(p65)。在本文提供的转移治疗方法的一个实施方式中，方法还包含与治疗期之前的趋化因子的水平相比，在治疗期期间或治疗期之后降低趋化因子的水平。在一个实施方式中，与治疗期之前患者体内的趋化因子水平相比，或与未施用药物组合物的患者相比，在治疗期期间或治疗期之后患者体内的趋化因子水平降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％。在另一实施方式中，方法包含与治疗期之前患者体内的趋化因子水平相比，或与未施用药物组合物的患者相比，在治疗期期间或治疗期之后将患者体内的趋化因子水平降低约5％至约25％、约25％至约50％、约50％至约75％、约25％至约75％，或约5％至约75％。
在本文提供的转移治疗方法的一个实施方式中，与治疗期之前的原发性癌症或转移的体积相比，在治疗期期间或治疗期之后患者体内的原发性癌症或转移的体积减小。在一个实施方式中，体积的减小为约5％至约75％。在另外的实施方式中，与治疗期之前的肿瘤体积相比，在治疗期期间或治疗期之后肿瘤体积(原发性肿瘤或继发性肿瘤)的减小为约25％至约50％或约50％至约75％。在另一实施方式中，与治疗期之前的肿瘤体积相比，在治疗期期间或治疗期之后肿瘤体积的减小为至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％，或至少约95％。
在本文提供的用于原发性癌症的方法的一个实施方式中，原发性癌症的进程消退。在另外的实施方式中，原发性癌症的消退发生在治疗期期间或治疗期之后。例如，在一个实施方式中，在治疗期开始之后约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月或约1年检测到转移消退。
在本文提供的用于治疗转移的方法的一个实施方式中，转移的进程消退。在另外的实施方式中，转移的消退发生在治疗期期间或治疗期之后。例如，在一个实施方式中，在治疗期开始之后约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月或约1年检测到转移消退。
在一个实施方式中，本文提供的方法还包含改善患者的存活率。在一个实施方式中，存活率相对于未施用药物组合物的患者(即，原发性癌症患者或转移患者)的存活率增加。在一个实施方式中，接受本文提供的方法中的一种的患者的存活率相对于未施用药物组合物的转移患者的存活率平均增加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个月。
在又一实施方式中，方法包含与治疗期之前的肿瘤球大小相比，在治疗期期间或治疗期之后减小原发性癌症或转移中的肿瘤球大小。在另外的实施方式中，与治疗期之前的肿瘤球大小相比，在治疗期期间或治疗期之后肿瘤球大小减小至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％，或至少约90％。在一些实施方式中，通过成像测量肿瘤球大小。
示例性实施方式
实施方式1.一种组织蛋白酶C抑制剂或包含组织蛋白酶C抑制剂的组合物用于治疗或抑制有需要的患者体内的原发性肿瘤或转移的应用。
实施方式2.根据实施方式1所述的应用，其中所述组织蛋白酶C抑制剂是式(I)化合物或其药学上可接受的盐：
其中：
R1是
R2选自由以下组成的组：H、F、Cl、Br、OSO2(C1-3)烷基和(C1-3)烷基；
R3是氢、F、Cl、Br、CN、CF3、SO2C1-3烷基、CONH2或SO2NR4R5，其中R4和R5与它们所附接的氮原子一起形成氮杂环丁烷、吡咯烷或哌啶环；
X是O、S或CF2；
Y是O或S；
Q是CH或N；
R6是(C1-3)烷基，其中所述(C1-3)烷基任选地被一个、两个或三个氟原子取代，并且其中所述(C1-3)烷基任选地被选自OH、O(C1-3)烷基、N[(C1-3)烷基]2、环丙基或四氢吡喃基的取代基取代；并且
R7是H、F、Cl或CH3。
实施方式3.根据实施方式1所述的应用，其中所述组织蛋白酶C抑制剂是brensocatib。
实施方式4.根据实施方式1所述的应用，其中所述组织蛋白酶C抑制剂是表1中列出的抑制剂或其药学上可接受的盐。
实施方式5.根据实施方式1至4中任一项所述的应用，其用于治疗或抑制原发性肿瘤。
实施方式6.根据实施方式1至4中任一项所述的应用，其用于治疗或抑制转移。
实施方式7.根据实施方式6所述的应用，其中所述转移是乳腺癌的肺转移、乳腺癌的肝转移、乳腺癌的骨转移、乳腺癌的脑转移、肺癌的骨转移、胰腺癌的肝转移和胃癌的肝转移。
实施方式8.根据实施方式6所述的应用，其中所述转移是乳腺癌的肺转移、乳腺癌的肝转移、乳腺癌的骨转移或肺癌的骨转移。
实施方式9.根据实施方式6所述的应用，其中肿瘤转移是乳腺癌的转移。
实施方式10.根据实施方式9所述的应用，其中所述乳腺癌是腔内乳腺癌、人表皮生长因子受体2(HER2)阳性乳腺癌或三阴性乳腺癌。
实施方式11.根据实施方式6所述的应用，其中所述转移是肺癌的转移。
实施方式12.根据实施方式11所述的应用，其中所述肺癌是非小细胞肺癌或小细胞肺癌。
实施方式13.根据实施方式5所述的应用，其中所述原发性癌症是肺癌。
实施方式14.根据实施方式5所述的应用，其中所述原发性癌症是肝癌。
实施方式15.根据实施方式5所述的应用，其中所述原发性癌症是乳腺癌。
实施方式16.根据实施方式1至15中任一项所述的应用，其中所述抑制剂或所述组合物口服施用。
实施方式17.根据实施方式1至15中任一项所述的应用，其中所述抑制剂或所述组合物非口服施用。
实施方式18.根据实施方式1至17中任一项所述的应用，其中所述患者具有升高的组织蛋白酶C(CTSC)蛋白的血清学水平，并且所述治疗或抑制包含将所述升高的CTSC蛋白的血清学水平降低至少约25％。
实施方式19.根据实施方式1至17中任一项所述的应用，其中所述患者具有升高的组织蛋白酶C(CTSC)蛋白的血清学水平，并且所述治疗或抑制包含将所述升高的CTSC蛋白的血清学水平降低约25％至约75％。
实施方式20.一种治疗有需要的患者体内的癌症转移的方法，其包含：
在治疗期内向需要治疗的所述患者施用包含有效量的CTSC抑制剂的药物组合物，其中所述治疗抑制、减缓或逆转所述患者体内的肿瘤转移的进程。
实施方式21.一种治疗有需要的患者体内的原发性癌症的方法，其包含在治疗期内向需要治疗的所述患者施用包含有效量的CTSC抑制剂的药物组合物，其中所述治疗抑制、减缓或逆转所述患者体内的所述原发性癌症的进程。
实施方式22.根据实施方式20或21所述的方法，其中所述CTSC抑制剂是以下化合物中的一种。
/>
其中所述治疗抑制、减缓或逆转所述患者体内的所述原发性癌症的所述进程。
实施方式23.根据实施方式20或21所述的方法，其中所述CTSC抑制剂是具有式(I)结构的化合物或其药学上可接受的盐：
其中：
R1是
R2是H、F、Cl、Br、OSO2(C1-3)烷基或(C1-3)烷基；
R3是氢、F、Cl、Br、CN、CF3、SO2C1-3烷基、CONH2或SO2NR4R5，其中R4和R5与它们所附接的氮原子一起形成氮杂环丁烷、吡咯烷或哌啶环；
X是O、S或CF2；
Y是O或S；
Q是CH或N；
R6是(C1-3)烷基，其中所述(C1-3)烷基任选地被一个、两个或三个氟原子取代，并且其中所述(C1-3)烷基任选地被选自OH、O(C1-3)烷基、N[(C1-3)烷基]2、环丙基或四氢吡喃基的取代基取代；并且
R7是H、F、Cl或CH3。
R7是H、F、Cl或CH3。
实施方式24.根据实施方式23所述的方法，其中，
R1是
X是O、S或CF2；
Y是O或S；
Q是CH或N；
R6是C1-3烷基，其中所述C1-3烷基任选地被1、2或3个F取代并且任选地被选自由以下组成的组的一个取代基取代：OH、OC1-3烷基、N(C1-3烷基)2、环丙基和四氢吡喃；并且
R7是氢、F、Cl或CH3。
实施方式25.根据实施方式23或24所述的方法，其中，
R1是
X是O、S或CF2；
Y是O或S；
R6是C1-3烷基，其中所述C1-3烷基任选地被1、2或3个F取代并且任选地被选自由以下组成的组的一个取代基取代：OH、OC1-3烷基、N(C1-3烷基)2、环丙基和四氢吡喃；并且
R7是氢、F、Cl或CH3。
实施方式26.根据实施方式23至25中任一项所述的方法，其中R1是
实施方式27.根据实施方式26所述的方法，其中X是O；R6是C1-3烷基；并且R7是氢。
实施方式28.根据实施方式23所述的方法，其中，
R1是
X是O；
R6是C1-3烷基，其中所述C1-3烷基任选地被1、2或3个F取代；并且
R7是氢。
实施方式29.根据实施方式23所述的方法，其中，
R1是
X是O；
R6是C1-3烷基；并且
R7是氢。
实施方式30.根据实施方式26所述的方法，其中X是O、S和CF2；R6是(C1-3)烷基，其中所述(C1-3)烷基任选地被一个、两个或三个氟原子取代；并且R7是H。
实施方式31.根据实施方式23所述的方法，其中所述式(I)化合物是brensocatib或其药学上可接受的盐。
实施方式32.根据实施方式23所述的方法，其中所述式(I)化合物是brensocatib。
实施方式33.根据实施方式23所述的方法，其中所述式(I)化合物是
(2S)-N-[(1S)-1-氰基-2-(4'-氰基联苯-4-基)乙基]-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺；
(2S)-N-{(1S)-1-氰基-2-[4-(3-甲基-2-氧代-2,3-二氢-1,3-苯并恶唑-5-基)苯基]乙基}-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺；
(2S)-N-{(1S)-1-氰基-2-[4-(3,7-二甲基-2-氧代-2,3-二氢-1,3-苯并恶唑-5-基)苯基]乙基}-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺；
甲磺酸4'-[(2S)-2-氰基-2-{[(2S)-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-基羰基]氨基}乙基]联苯-3-基酯；
(2S)-N-{(1S)-1-氰基-2-[4-(3-甲基-1,2-苯并恶唑-5-基)苯基]乙基}-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺；
(2S)-N-{(1S)-1-氰基-2-[4'-(三氟甲基)联苯-4-基]乙基}-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺；
(2S)-N-[(1S)-1-氰基-2-(3'4'-二氟联苯基-4-基)乙基]-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺；
(2S)-N-{(1S)-1-氰基-2-[4(6-氰基吡啶-3-基)苯基]乙基}-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺；
(2S)-N-{(1S)-1-氰基-2-[4-(4-甲基-3-氧代-3,4-二氢-2H-1,4-苯并噻嗪-6-基)苯基]乙基}-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺；
(2S)-N-{(1S)-1-氰基-2-[4-(3-乙基-7-甲基-2-氧代-2,3-二氢-1,3-苯并恶唑-5-基)苯基]乙基}-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺；
(2S)-N-[(1S)-1-氰基-2-{4-[3-(2-羟基-2-甲基丙基)-2-氧代-2,3-二氢-1,3-苯并恶唑-5-基]苯基}乙基]-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺；
(2S)-N-[(1S)-1-氰基-2-{4-[3-(2,2-二氟乙基)-7-氟-2-氧代-2,3-二氢-1,3-苯并恶唑-5-基]苯基}乙基]-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺；
(2S)-N-[(1S)-1-氰基-2-(4-{3-[2-(二甲基氨基)乙基]-2-氧代-2,3-二氢-1,3-苯并恶唑-5-基}苯基)乙基]-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺；
(2S)-N-{(1S)-1-氰基-2-[4-(3,3-二氟-1-甲基-2-氧代-2,3-二氢-1H-吲哚-6-基)苯基]乙基}-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺；
(2S)-N-{(1S)-1-氰基-2-[4-(7-氟-3-甲基-2-氧代-2,3-二氢-1,3-苯并恶唑-5-基)苯基]乙基}-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺；
(2S)-N-{(1S)-1-氰基-2-[4-(3-乙基-2-氧代-2,3-二氢-1,3-苯并恶唑-5-基)苯基]乙基}-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺；
(2S)-N-[(1S)-1-氰基-2-{4-[3-(环丙基甲基)-2-氧代-2,3-二氢-1,3-苯并恶唑-5-基]苯基}乙基]-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺；
(2S)-N-[(1S)-1-氰基-2-{4-[3-(2-甲氧基乙基)-2-氧代-2,3-二氢-1,3-苯并噻唑-5-基]苯基}乙基]-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺；
(2S)-N-[(1S)-1-氰基-2-{4-[2-氧代-3-(丙-2-基)-2,3-二氢-1,3-苯并恶唑-5-基]苯基}乙基]-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺；
(2S)-N-{(1S)-1-氰基-2-[4-(4-甲基-3-氧代-3,4-二氢-2H-1,4-苯并恶嗪-6-基)苯基]乙基}-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺；
(2S)-N-[(1S)-1-氰基-2-{4-[3-(2-甲氧基乙基)-2-氧代-2,3-二氢-1,3-苯并恶唑-5-基]苯基}乙基]-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺；
(2S)-N-{(1S)-1-氰基-2-[4-(5-氰基噻吩-2-基)苯基]乙基}-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺；
(2S)-N-[(1S)-2-(4'-氨基甲酰基-3'-氟联苯-4-基)-1-氰乙基]-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺；
(2S)-N-{(1S)-1-氰基-2-[4-(1-甲基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-7-基)苯基]乙基}-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺；
(2S)-N-[(1S)-1-氰基-2-{4-[2-氧代-3-(四氢-2H-吡喃-4-基甲基)-2,3-二氢-1,3-苯并恶唑-5-基]苯基}乙基]-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺；
(2S)-N-{(1S)-2-[4-(7-氯-3-甲基-2-氧代-2,3-二氢-1,3-苯并恶唑-5-基)苯基]-1-氰乙基}-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺；
(2S)-N-[(1S)-1-氰基-2-{4-[3-(2,2-二氟乙基)-2-氧代-2,3-二氢-1,3-苯并恶唑-5-基]苯基}乙基]-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺；
(2S)-N-[(1S)-1-氰基-2-{4-[2-氧代-3-(2,2,2-三氟乙基)-2,3-二氢-1,3-苯并恶唑-5-基]苯基}乙基]-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺；
(2S)-N-{(1S)-1-氰基-2-[4-(3-甲基-2-氧代-2,3-二氢-1,3-苯并噻唑-5-基)苯基]乙基}-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺；
(2S)-N-{(1S)-1-氰基-2-[4'-(甲基磺酰基)联苯-4-基]乙基}-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺；
(2S)-N-{(1S)-2-[4'-(氮杂环丁烷-1-基磺酰基)联苯-4-基]-1-氰乙基}-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺；
(2S)-N-[(1S)-1-氰基-2-(4'-氟联苯基-4-基)乙基]-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺；
(2S)-N-{(1S)-2-[4-(1,3-苯并噻唑-5-基)苯基]-1-氰乙基}-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺；
(2S)-N-[(1S)-1-氰基-2-(4'-氰基联苯-4-基)乙基]-1,4-氧杂氮杂环庚烷-2-甲酰胺；或
其药学上可接受的盐。
实施方式34.根据实施方式20至33中任一项所述的方法，其中所述药物组合物的所述施用是通过口服施用。
实施方式35.根据实施方式20至33中任一项所述的方法，其中所述药物组合物的所述施用是通过肠胃外施用。
实施方式36.根据实施方式20至33中任一项所述的方法，其中所述药物组合物的所述施用是通过静脉内施用。
实施方式37.根据实施方式20至33中任一项所述的方法，其中所述药物组合物的所述施用是通过输注。
实施方式38.根据实施方式20至33中任一项所述的方法，其中所述药物组合物是片剂形式。
实施方式39.根据实施方式20至34中任一项所述的方法，其中所述药物组合物还包含片剂包衣。
实施方式40.根据实施方式20至39中任一项所述的方法，其中所述式(I)化合物以约5毫克(mg)至约70mg存在于所述药物组合物中。
实施方式41.根据实施方式20至39中任一项所述的方法，其中所述式(I)化合物以约10毫克(mg)至约60mg存在于所述药物组合物中。
实施方式42.根据实施方式20至39中任一项所述的方法，其中所述式(I)化合物以约10毫克(mg)至约40mg存在于所述药物组合物中。
实施方式43.根据实施方式20至39中任一项所述的方法，其中所述式(I)化合物以约10毫克(mg)存在于所述药物组合物中。
实施方式44.根据实施方式20至39中任一项所述的方法，其中所述式(I)化合物以约25毫克(mg)存在于所述药物组合物中。
实施方式45.根据实施方式20至39中任一项所述的方法，其中所述式(I)化合物以约40毫克(mg)存在于所述药物组合物中。
实施方式46.根据实施方式20至39中任一项所述的方法，其中所述式(I)化合物以约60毫克(mg)存在于所述药物组合物中。
实施方式47.根据实施方式20至46中任一项所述的方法，其中所述施用在整个所述治疗期期间每天进行一次。
实施方式48.根据实施方式20至46中任一项所述的方法，其中所述施用在整个所述治疗期期间每天进行两次。
实施方式49.根据实施方式20至46中任一项所述的方法，其中所述施用在整个所述治疗期期间每隔一天进行一次。
实施方式50.根据实施方式20至46中任一项所述的方法，其中所述施用在整个所述治疗期期间每三天进行一次。
实施方式51.根据实施方式20至50中任一项所述的方法，其中所述治疗期为至少一个月。
实施方式52.根据实施方式20至50中任一项所述的方法，其中所述治疗期为至少两个月。
实施方式53.根据实施方式20至50中任一项所述的方法，其中所述治疗期为至少三个月。
实施方式54.根据实施方式20至50中任一项所述的方法，其中所述治疗期为至少六个月。
实施方式55.根据实施方式20至50中任一项所述的方法，其中所述治疗期为约六个月至约24个月。
实施方式56.根据实施方式55所述的方法，其中所述治疗期为约六个月至约18个月。
实施方式57.根据实施方式55所述的方法，其中所述治疗期为约六个月至约12个月。
实施方式58.根据实施方式55所述的方法，其中所述治疗期为约12个月至约24个月。
实施方式59.根据实施方式55所述的方法，其中所述治疗期为约12个月至约18个月。
实施方式60.根据实施方式20至59中任一项所述的方法，其中所述患者在所述治疗期之前呈现出升高的组织蛋白酶C(CTSC)蛋白的血清学水平。
实施方式61.根据实施方式60所述的方法，其中所述升高的CTSC蛋白的血清学水平在所述治疗期期间或之后降低至少约25％。
实施方式62.根据实施方式60所述的方法，其中所述升高的CTSC蛋白的血清学水平在所述治疗期期间或之后降低至少约50％。
实施方式63.根据实施方式60所述的方法，其中所述升高的CTSC蛋白的血清学水平在所述治疗期期间或之后降低至少约75％。
实施方式64.根据实施方式60所述的方法，其中所述升高的CTSC蛋白的血清学水平在所述治疗期期间或之后降低约25％至约75％。
实施方式65.根据实施方式20至64中任一项所述的方法，其中所述患者是人。
实施方式66.根据实施方式20和22至65中任一项所述的方法，其中所述患者在所述治疗期之后或在所述治疗期期间经历所述转移的消退。
实施方式67.根据实施方式21至65中任一项所述的方法，其中所述患者在所述治疗期之后或在所述治疗期期间经历所述原发性癌症的消退。
实施方式68.根据实施方式66或67所述的方法，其中所述消退发生在进入所述治疗期约两个月或约三个月时。
实施方式69.根据实施方式66或67所述的方法，其中所述消退发生在进入所述治疗期约六个月时。
实施方式69.根据实施方式20、22至66和68至69中任一项所述的方法，其中所述转移是乳腺癌的转移。
实施方式70.根据实施方式69所述的方法，其中乳腺癌的所述转移是乳腺癌的肺转移、乳腺癌的肝转移、乳腺癌的骨转移或乳腺癌的脑转移。
实施方式71.根据实施方式70所述的方法，其中乳腺癌的所述转移是乳腺癌的肺转移。
实施方式72.根据实施方式69至71中任一项所述的方法，其中所述乳腺癌是腔内乳腺癌、人表皮生长因子受体2(HER2)阳性乳腺癌或三阴性乳腺癌。
实施方式73.根据实施方式20、22至66和68至69中任一项所述的方法，其中所述转移是肺癌的骨转移、胰腺癌的肝转移或胃癌的肝转移。
实施方式74.根据实施方式20、22至66和68至69中任一项所述的方法，其中所述转移是乳腺癌的肺转移、乳腺癌的肝转移、乳腺癌的骨转移、乳腺癌的脑转移、肺癌的骨转移、结肠癌的肝转移、胰腺癌的肝转移或胃癌的肝转移。
实施方式75.根据实施方式20、22至66和68至69中任一项所述的方法，其中所述转移是肺癌的转移。
实施方式76.根据实施方式75所述的方法，其中所述肺癌是非小细胞肺癌。
实施方式77.根据实施方式75所述的方法，其中所述肺癌是小细胞肺癌。
实施方式78.根据实施方式20、22至66和68至69中任一项所述的方法，其中所述转移是胰腺癌或胃癌的转移。
实施方式79.根据实施方式20、22至66和68至69中任一项所述的方法，其中所述转移是骨癌、肝癌、胃癌、结肠癌、直肠癌或结肠直肠癌的转移。
实施方式80.根据实施方式21至65和67至69中任一项所述的方法，其中所述原发性癌症是肺癌。
实施方式81.根据实施方式21至65和67至69中任一项所述的方法，其中所述原发性癌症是乳腺癌。
实施方式82.根据实施方式21至65和67至69中任一项所述的方法，其中所述原发性癌症是肝癌。
实施方式83.根据实施方式80所述的方法，其中所述肺癌是小细胞肺癌。
实施方式84.根据实施方式80所述的方法，其中所述肺癌是非小细胞肺癌。
实施方式85.根据实施方式81所述的方法，其中所述乳腺癌是腔内乳腺癌、人表皮生长因子受体2(HER2)阳性乳腺癌或三阴性乳腺癌。
实施方式86.根据实施方式20至85中任一项所述的方法，其中治疗还包含与所述治疗期之前所述患者的白介素1β(IL-1β)的循环水平相比，在所述治疗期期间或所述治疗期之后降低所述患者体内的IL-1β的所述循环水平。
实施方式88.根据实施方式20、22至66、68至79和86中任一项所述的方法，其中与所述治疗期之前所述转移的体积相比，在所述治疗期期间或所述治疗期之后所述转移的所述体积减小约5％至约25％。
实施方式89.根据实施方式20、22、24至66、68至79和86中任一项所述的方法，其中与所述治疗期之前所述转移的体积相比，在所述治疗期期间或所述治疗期之后所述转移的所述体积减小约25％至约50％。
实施方式90.根据实施方式20、22、24至66、68至79和86中任一项所述的方法，其中与所述治疗期之前所述转移的体积相比，在所述治疗期期间或所述治疗期之后所述转移的所述体积减小约50％至约75％。
实施方式91.根据实施方式21至65、67至69和80至86中任一项所述的方法，其中与所述治疗期之前所述原发性癌症的体积相比，在所述治疗期期间或所述治疗期之后所述原发性癌症的所述体积减小约5％至约25％。
实施方式92.根据实施方式21至65、67至69和80至86中任一项所述的方法，其中与所述治疗期之前所述原发性癌症的体积相比，在所述治疗期期间或所述治疗期之后所述原发性癌症的所述体积减小约25％至约50％。
实施方式93.根据实施方式21至65、67至69和80至86中任一项所述的方法，其中与所述治疗期之前所述原发性癌症的体积相比，在所述治疗期期间或所述治疗期之后所述原发性癌症的所述体积减小约50％至约75％。
实施方式94.根据实施方式20至93中任一项所述的方法，其中所述患者的存活率相对于未施用所述药物组合物的患者的存活率有所增加。
实施方式95.根据实施方式20至94中任一项所述的方法，其中所述治疗还包含与所述治疗期之前所述患者体内的循环中性粒细胞细胞外陷阱(NET)的数量相比，在所述治疗期期间或所述治疗期之后减少所述患者体内的循环NET。
实施方式96.根据实施方式20至95中任一项所述的方法，其中所述治疗还包含与所述治疗期之前所述转移中的中性粒细胞迁移相比，在所述治疗期期间或所述治疗期之后减少所述中性粒细胞迁移。
实施方式97.根据实施方式96所述的方法，其中减少中性粒细胞迁移包含与未施用所述药物组合物的第二患者体内的中性粒细胞迁移相比，将所述中性粒细胞迁移减少约25％至约75％。
实施方式98.根据实施方式96所述的方法，其中减少中性粒细胞迁移包含与未施用所述药物组合物的第二患者体内的中性粒细胞迁移相比，将所述中性粒细胞迁移减少约25％至约50％。
实施方式99.根据实施方式96所述的方法，其中减少中性粒细胞迁移包含与未施用所述药物组合物的第二患者体内的中性粒细胞迁移相比，将所述中性粒细胞迁移减少至少约25％。
实施方式100.根据实施方式96所述的方法，其中减少中性粒细胞迁移包含与未施用所述药物组合物的第二患者体内的中性粒细胞迁移相比，将所述中性粒细胞迁移减少至少约50％。
实施方式101.根据实施方式96至100中任一项所述的方法，其中通过免疫荧光染色测量所述中性粒细胞迁移。
实施方式102.根据实施方式20至101中任一项所述的方法，其中所述治疗还包含与所述治疗期之前所述患者体内的中性粒细胞细胞外陷阱(NET)的数量相比，在所述治疗期期间或所述治疗期之后减少所述患者体内的NET。
实施方式103.根据实施方式102所述的方法，其中与所述治疗期之前所述转移中的NET的所述数量相比，所述转移中的NET的所述数量减少至少50％。
实施方式104.根据实施方式102或103所述的方法，其中通过免疫荧光染色检测所述NET。
实施方式105.根据实施方式20至104中任一项所述的方法，其中所述治疗还包含降低所述患者体内一种或多种蛋白的表达水平，其中所述一种或多种蛋白是组织蛋白酶C(CTSC)、白介素6(IL-6)、C-C基序趋化因子配体3(CCL3)或RELA(p65)。
实施方式106.根据实施方式20至105中任一项所述的方法，其中所述治疗还包含减小所述原发性癌症或所述转移中的肿瘤球大小。
实施方式107.根据实施方式106所述的方法，其中通过成像测量所述肿瘤球大小。
实施例
通过参考以下实施例进一步阐释本发明。然而，应当注意的是，与上述实施方式相似，实施例是说明性的，并且不应当被解释为以任何方式限制本发明的范围。
材料和方法
除非另有指示，否则以下材料和方法用于实施以下实施例。
寡核苷酸序列和数据
本研究中使用的寡核苷酸序列提供于表S2中。在以前的研究中公开了部分分泌组数据(MDA-MB-231及其亚系)(Zhuang等人“Wnt信号传导抑制剂DKK1对乳腺癌的肺转移和骨转移的不同作用(Differential effects on lung and bone metastasis of breastcancer by Wnt signalling inhibitor DKK1)”《自然细胞生物学(Nat.Cell Biol.)》19:1274-1285(2017))。其余数据(MCF10CA1h对MCF10CA1a；4T1系列)在本研究中提供为Xiao等人的表S3和S4(“组织蛋白酶C通过调控中性粒细胞浸润和中性粒细胞细胞外陷阱形成而促进乳腺癌肺转移(Cathepsin C promotes breast cancer lung metastasis bymodulating neutrophil infiltration and neutrophil extracellular trapformation)”《癌细胞(Cancer Cell)》29:1-15(2021)，其以全文引用的方式并入本文用于所有目的)。本研究中的原始数据已保存在Mendeley数据(Mendeley Data)www(dot)doi(dot)org/10.17632/sb8h3hw84k.1。
细胞系
本研究中生成的细胞系及其亲代细胞系(MDA-MB-231及其亚系，4T1系列，AT3)在具有10％v/v FBS和100μg/ml青霉素/链霉素的DMEM中生长。MCF10系列细胞系在补充有10μg/ml胰岛素、20ng/ml EFG、0.5μg/ml氢化可的松、100μg/ml青霉素/链霉素和20％v/v马血清的DMEM/F12培养基中生长。使用第5至8代的细胞培养物并每周测试支原体污染。
人乳腺癌组织和血液样本
从山东大学齐鲁医院获得具有转移性状态跟踪信息的冷冻的原发性肿瘤标本(腔内肿瘤、HER2+肿瘤、三阴性肿瘤分别为n＝48、30、10)和患者血清(n＝46)，患者知情同意并且得到齐鲁机构审查委员会的批准。在这88个原发性肿瘤标本中，58个也具有总体存活信息。从上海市第一人民医院获得石蜡包埋的原发性肿瘤(腔内肿瘤、HER2+肿瘤、三阴性肿瘤分别为n＝42、12、20)和肺转移(n＝29)，所有受试者均知情同意并且得到医院机构研究伦理委员会的批准。在上海队列的这74个原发性肿瘤中，58个(腔内肿瘤、HER2+肿瘤、三阴性肿瘤分别为30、9、19个)具有转移状态跟踪信息。将具有跟踪信息的样本用于转移(n＝146)和总体存活(n＝58)的Kaplan-Meier分析。从上海交通大学附属第六人民医院和中山医院收集用于中性粒细胞分离的全血样本，并且得到中心的机构审查委员会的豁免批准。
小鼠实验
在所有动物实验中使用6至10周龄的雌性BALB/c和无胸腺小鼠。如前所述执行原位和静脉内注射(Zhuang等人“Wnt信号传导抑制剂DKK1对乳腺癌的肺转移和骨转移的不同作用”《自然细胞生物学》19:1274-1285(2017))。对于EdU示踪测定，向裸鼠静脉内注射2×105个癌细胞，随后在肺收获前24小时腹膜内(i.p.)注射100ng/小鼠的EdU(赛默飞世尔(ThermoFisher)，C10640)。对于中性粒细胞耗尽测定，在癌细胞注射前每3天，小鼠接受2次1A8 Ly6G抗体(BE0075-1，BioXCel)或大鼠IgG对照(I4131,Sigma)的初始i.p.注射(200μg/小鼠)，并且然后在癌细胞注射后每周两次维持注射。对于西维来司他(Sivelestat)或DNase I处理，在癌细胞注射前2小时，向小鼠i.p.注射西维来司他(50mg/kg)或DNase I(5mg/kg)，随后每天注射试剂，持续9天，并且然后每周两次维持注射。对于GSK484处理，在原位注射AT3或4T07细胞后，用GSK484(20mg/kg，从第7天开始每天i.p.注射，持续20天，并且然后每两天维持注射)处理小鼠。对于IL-1b阻断或IL6R/CCR1抑制测定，从第7天开始每两天用5×104AT3原位接种小鼠，并用IgG或IL-1β阻断抗体(每只小鼠100μg)，或IL6R阻断抗体(每只小鼠100μg)和CCR1抑制剂BX471(20mg/kg)的i.p.施用进行处理，直到处死小鼠。对于brensocatib处理，用1×105 4T1细胞原位接种BALB/c小鼠，并用2×105AT3原位接种C57/BL6小鼠。每天两次口服施用媒介物对照(在0.1M柠檬酸盐缓冲液中的0.5％HPMC、0.1％ Tween 80，pH 3)和brensocatib(5mg/kg)，直到处死小鼠。手术去除约1cm3大小的原位肿瘤。在静脉内接种1×105LM2细胞后，每天静脉内施用重组人活性PR3处理(1.5mg/kg)。对于TSP-1降解测定，在癌细胞注射前2小时向小鼠i.p.注射GSK484(20mg/kg)，并且随后每天处理。然后，用50ml预冷的PBS通过右心室灌注肺，直到它们在注射3×106AT3或4T07细胞后72小时被清除血液。用NightOWL II LB983成像系统(伯托(Bert-hold))和IVIS光谱CT(珀金埃尔默(PerkinElmer))获得BLI。所有动物研究均根据实验室动物护理和使用指南进行，并获得上海营养与健康研究所机构动物护理和使用委员会的批准。
蛋白印迹
通过刮刀或胰蛋白酶化收集培养的细胞，并且然后用裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，1％ NP-40去污剂，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％含磷酸酶和蛋白酶抑制剂的SDS)裂解，并将分散的组织在RIPA缓冲液中在冰上匀化15分钟，随后以17,000g离心15分钟。用BCA蛋白测定试剂盒测量蛋白浓度。分别负载10μg、80μg、30μ的蛋白用于膜蛋白、IL-1β加工、p65磷酸化和其它测定，并在8至12％ SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离。对于癌细胞条件培养基(CM)收集，细胞在10cm培养皿中生长至约80％汇合。在37℃下用无血清培养基洗涤三次后，将细胞在37℃下在无血清培养基中孵育24小时。收集CM，以2,000g离心10分钟，通过0.22μm过滤器过滤，在使用前储存在-80℃下。通过TCA沉淀收集CM中的分泌蛋白。简而言之，将25％v/v TCA添加到含磷酸酶和蛋白酶抑制剂的1ml CM中，在4℃下孵育过夜，并且然后在20,000g下离心60分钟，之后弃去上清液，并用1ml预冷的丙酮洗涤沉淀两次，在4℃下再次在20,000g下离心5分钟。用裂解缓冲液裂解干蛋白沉淀，并在12％ SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离。
对肺转移和转移性灶中的间质组分的FACS分析
间质含量分析的程序先前描述于Zhuang等人“Wnt信号传导抑制剂DKK1对乳腺癌的肺转移和骨转移的不同作用”《自然细胞生物学》19:1274-1285(2017))。简而言之，挑取肺转移，切碎，进一步用5mg/ml III型胶原酶(LS004182，Worthington)、0.001％(W/V)DNase I(D-4527，Sigma)和1％(w/w)分散酶(17105-041，英杰(Invitrogen))在37℃下消化1小时。为了分析早期转移性灶中的免疫细胞，用50ml的PBS通过右心室灌注肺，直到它们被清除血液。如上制备肺组织的单细胞悬浮液。然后，用RBC裂解试剂(555899，BDPharmingen)裂解红细胞。将细胞与CD16/CD32抗体(2.4G2，BD生命科学(BD LifeSciences))在4℃下孵育10分钟，以在抗体染色之前阻断FcR。流式细胞术通过Gallious(贝克曼(Beckman))FACS系统执行，并通过FlowJo V10软件定量。
中性粒细胞分离
为了从骨髓中分离中性粒细胞，将8至12周龄BALB/c小鼠的骨髓细胞收获在不含Ca2+/Mg2+的无菌Hank's缓冲盐溶液(HBSS)(14185052，英杰)中，并置于2层Percoll(17089102，通用电气医疗集团(GE Healthcare))梯度上(72％和63.5％，在HBSS中)，随后在25℃下以1,200g离心30分钟。通过流式细胞术分析证实在63.5％至72％级分的界面中富集的中性粒细胞具有>95％的纯度。为了从小鼠的外周血中分离中性粒细胞，经由心脏穿刺收集全血(每只动物1ml)，并悬浮在含有15mM EDTA的HBSS(每只动物2ml)中。离心(400g，10分钟，4℃)后，将白细胞重悬于2ml含2mM EDTA的HBSS中。然后，在没有制动的情况下，将细胞以三层Percoll梯度(78％、69％和52％)离心(1500g，30分钟，室温)。通过流式细胞术分析证实在69％和78％层的界面中富集的中性粒细胞具有>95％的纯度。通过使用Polymorphprep(1114683，Axis-Shield)进行密度梯度分离并在室温下以500g离心30分钟，从健康女性志愿者和乳腺癌患者的外周血中分离人中性粒细胞。通过May-Grunwald-Giemsa染色(40751ES02，翌圣(Yea-sen))确定分离的中性粒细胞的纯度。除非另有说明，否则在含有0.2％ BSA的RPMI 1640培养基中培养中性粒细胞。
体外NET分析
为了评估NET形成，将中性粒细胞(2.5×105个细胞)接种在24孔板中用聚-L-赖氨酸(P4707，Sigma)涂覆的盖玻片上30分钟，然后添加10％癌细胞CM、西维来司他(10μM)、PMA(20nM，Sigma)、Cl-脒(100μM，Selleck)和/或DNase I(1μg/ml)。在37℃下12至16小时后，将中性粒细胞用4％多聚甲醛(PFA)在室温下固定10分钟，用PBS洗涤两次并在0.1％ TritonX-100中渗透5分钟。将细胞在含有5％ BSA的PBS中封闭30分钟，然后在封闭缓冲液中与抗组蛋白H3(1:50，3680，CST)和抗NE(1:100，ab68672，ABCAM)或抗MPO(1:400，AF3667，R&D)和Ci-H3(1:200，ab5103，ABCAM)在4℃下孵育过夜。在PBS中洗涤三次后，将细胞与荧光染料缀合的二次抗体(1:500，英杰)一起孵育1小时，并且然后在封片(Dako，S3023)前用DAPI(罗氏(Roche)，10236276001)复染。用共焦显微镜细胞观察器(蔡司(ZEISS)，德国)执行观察和照相，并用Zen蓝版(Zen blue edition)软件(蔡司，德国)执行图像处理和分析。使用DANA方法执行NET面积定量(Rebernick等人“DNA面积和NET增生分析(DANA)：定量荧光显微镜图像中中性粒细胞细胞外陷阱的高通量方法(DNA area and NETosis analysis(DANA):ahigh-throughput method to quantify neutrophil extracellular traps influorescent microscope images)”《生物程序在线(Biol.Proced.Online)》20:7(2018))。简而言之，将描绘NET形态和Ci-H3或总H3阳性的结构面积计数为NET化细胞面积，并将NET面积百分比分析为NET化细胞面积除以总DNA面积。如前所述分析NET化细胞的百分比(Valk等人“急性髓性白血病中预测有用的基因表达谱(Prognostically useful gene-expression profiles in acute myeloid leukemia)”《新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)》350:1617-1628(2004))。孵育细胞，并同时用细胞可渗透的SYTO红(1μM)和细胞不可渗透的SY-TOX绿(1μM)染色3小时。然后，弃去上清液并在4℃下用4％PFA固定细胞。通过共焦显微镜细胞观察器(蔡司，德国)拍摄图像。将NET化细胞的百分比计数为NET化细胞的数量除以总细胞数。
循环NET的检测
为了分析循环NET，使用先前描述的捕获ELISA方法(Kessenbrock等人“自身免疫性小血管炎中的中性粒细胞(Netting neutro-phils in autoimmune small-vesselvasculitis)”《自然·医学(Nat.Med.)》15:623-625(2009)；Teijeira等人“由肿瘤产生的CXCR1和CXCR2趋化因子受体激动剂诱导干扰免疫细胞毒性的中性粒细胞细胞外陷阱(CXCR1 and CXCR2 chemokine receptor agonists produced by tumors induceneutrophil extracellular traps that interfere with immune cytotoxicity)”《免疫(Immunity)》52:856-871e858(2020))稍作修改来测定人血清中的MPO-DNA复合物或鼠血清中的NE-DNA复合物。为了分析人血清学MPO-DNA，在4℃下用5μg/ml抗MPO(0400-0002，伯乐(Bio-Rad))捕获抗体涂覆96孔MaxiSorp ELISA板(44-2404，赛默飞世尔)过夜。在PBS中洗涤三次后，在室温下用PBS中的5％ BSA封闭孔45分钟。然后，将50μl患者血清与过氧化物酶示踪的抗DNA单克隆抗体(细胞死亡检测ELISA试剂盒(罗氏，11774425001)的组分2)一起添加并在室温下孵育2小时，并将板用洗涤缓冲液(PBS中的1％ BSA、0.05％ Tween-20)洗涤三次。为了分析小鼠血清学NET，根据制造商的说明书，使用小鼠NE ELISA试剂盒(ab252356，ABCAM)结合上述过氧化物酶示踪的抗DNA单克隆抗体捕获NE-DNA复合物。PBS洗涤三次后，添加过氧化物酶底物(罗氏，11774425001)。在37℃下孵育1小时后，在405nm处测量信号。
双室中性粒细胞迁移测定
双室迁移测定的程序先前已有描述(Zhuang等人“Wnt信号传导抑制剂DKK1对乳腺癌的肺转移和骨转移的不同作用”《自然细胞生物学》19:1274-1285(2017))。简而言之，将RPMI 1640中的5×105个新鲜分离的中性粒细胞添加到上室(363096，BD)中，并将RPMI1640和癌细胞CM的1:1混合物或来自在癌细胞CM中培养的中性粒细胞的培养基作为化学引诱物添加到下室中。3小时后对下室中迁移的细胞计数。
中性粒细胞质膜蛋白的分离
按照先前报道的方案纯化HL-60来源的中性粒细胞的质膜蛋白(Suski等人“从大鼠肝脏中分离质膜相关联的膜(Isolation of plasma membrane-associated membranesfrom rat liver)”《自然·实验手册(Nat.Protoc.)》9:312-322(2014)；Zhang等人“中性粒细胞膜包被的纳米颗粒抑制滑膜炎症并缓解炎性关节炎中的关节损伤(Neutrophilmembrane-coated nanoparticles inhibit synovial inflammation and alleviatejoint damage in inflammatory arthritis)”《自然·纳米技术(Nat.Nanotechnol)》13:1182-1190(2018))。将由HL-60细胞诱导的中性粒细胞在分化培养基(IMDM，10％ FBS，1.25％ DMSO)中培养8天。为了收获膜蛋白，将冷冻细胞解冻并以1×108细胞/ml的密度悬浮于含有蛋白酶抑制剂混合物(539134，默克(Merck))或半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64d(HY-100229，MCE)的低渗裂解缓冲液(225mM D-甘露醇，30mM pH 7.5Tris-HCl，0.2mM EGTA，75mM蔗糖)中。将细胞在冰冷的杜恩斯(Dounce)匀浆器中匀浆(20次)，并且然后在4℃下以20,000g离心20分钟，之后弃去沉淀，并将上清液在4℃下以100,000g再次离心30分钟。上清液是细胞溶质级分。将含有质膜蛋白的沉淀在低渗裂解缓冲液中洗涤一次。如前所述用Pierce细胞表面蛋白分离试剂盒(赛默飞世尔科技(Thermo Scientific)，89881)从人外周血来源的中性粒细胞中分离质膜蛋白(Tei-jeira等人“由肿瘤产生的CXCR1和CXCR2趋化因子受体激动剂诱导干扰免疫细胞毒性的中性粒细胞细胞外陷阱”《免疫》52:856-871e858(2020))。简而言之，用赛默飞世尔科技EZ-Link Sulfo-NHS-SS-生物素对细胞进行示踪，该生物素是一种非细胞可渗透的和硫醇可裂解的胺反应性生物素化试剂。然后，通过用Pierce IP裂解缓冲液(25mM Tris-HCl pH 7.4，150mM NaCl，1mM EDTA，1％ NP-40和5％甘油)裂解并使用五次1秒脉冲在冰上进行超声处理而获得全细胞裂解物。生物素化的细胞膜蛋白通过中性抗生物素蛋白-琼脂糖树脂纯化，并通过与含有5mM二硫苏糖醇的Pierce IP裂解缓冲液孵育而释放。
酶活性测定
酶活性测定的程序如先前所报道地进行(Korkmaz等人“中性粒细胞蛋白酶3和二肽基肽酶I(组织蛋白酶C)作为多血管炎肉芽肿病(韦格纳肉芽肿病)的药理学靶标(Neutrophil proteinase 3and dipeptidyl peptidase I(cathepsin C)aspharmacological targets in granulomatosis with polyangiitis(Wegenergranulomatosis))”《免疫病理学研讨会(Semin.Immunopathol.)》35:411-421(2008))。通过检测细胞悬浮液或游离酶对PR3特异性底物(Abz)-VADnorVADRQ-(EDDnp)或NE特异性底物(Abz)-APEEIMRRQ-(EDDnp)的水解速率来定量PR3或NE酶活性。为了分析膜结合PR3活性，将中性粒细胞在癌细胞CM或非条件培养基中培养，并用DMSO或各种抑制剂(包括西维来司他(10μM)、阿维司他(Alvelestat)(10μM)和CTSGi(20μM))在37℃下处理30至45分钟。然后，将细胞悬浮在具有15μM的PR3特异性底物的活性缓冲液(5×106个细胞/ml，PBS，4mM EGTA，pH 7.4)中，并且通过测量在λex＝320nm和λem＝420nm处的荧光来跟踪水解动力学。为了活化分离的质膜级分中的PR3，根据制造商的说明书活化重组人CTSC(1071-CY，R&D)。然后，将质膜蛋白稀释至250μg/ml，并与活化缓冲液(25mM MES，50mM NaCl，5mM DTT，pH 6.0)中的活性人CTSC一起孵育1小时。通过记录在λex＝320nm和λem＝420nm处的荧光，在具有15μM特异性底物的测定缓冲液(50mM Tris，750mM NaCl，pH 7.4)中测量游离PR3和NE的活性。
细胞因子抗体阵列
根据制造商的说明书，通过使用小鼠细胞因子抗体阵列(ab133994，ABCAM)在与来自4T07细胞的CM一起培养的中性粒细胞的培养基中检测细胞因子。简而言之，将膜用封闭缓冲液封闭45分钟，然后与1ml的含有蛋白酶抑制剂混合物(539134，默克)的样本在4℃下孵育过夜。生物素缀合的抗体和HRP-链霉亲和素孵育后，执行化学发光检测。包括在阵列中的细胞因子列于Xiao等人的表S5(“组织蛋白酶C通过调控中性粒细胞浸润和中性粒细胞细胞外陷阱形成而促进乳腺癌肺转移”《癌细胞》29:1-15(2021))。
ELISA
根据制造商的说明书，使用ELISA试剂盒测定细胞培养上清液或血清中的人IL-1β(88-7621-88，赛默飞世尔)、小鼠IL-1β(432604，Biolegend)、小鼠IL6(88-7064-88，赛默飞世尔)、小鼠CCL3(88-56013-88，赛默飞世尔)的水平。简而言之，在4℃下在包被缓冲液(15mM的Na2CO3，35mM的NaHCO3，pH 9.6)中用捕获抗体包被96孔MaxiSorpTM ELISA板(44-2404，赛默飞世尔)过夜。在PBS中洗涤三次后，在室温下用PBS中的5％ BSA封闭孔45分钟。然后，将100μl的细胞培养上清液或血清和标准样本添加到孔中并在室温下孵育2小时，并将板用洗涤缓冲液(PBS中的1％ BSA、0.05％Tween-20)洗涤三次。接下来，将在2.5％ BSA中的生物素缀合的检测抗体添加到孔中并在室温下孵育2小时。在用洗涤缓冲液洗涤三次后，将HRP-链霉亲和素在室温下孵育45分钟。然后，使用TMB溶液检测信号并在450nm处读取信号。
免疫荧光(IF)染色
对于鼠肺组织，用50ml的PBS通过右心室灌注肺，直到它们被清除血液。然后，将组织用预冷的PBS冲洗并在4℃下在4％ PFA中在振荡器上固定2小时，用PBS中的30％蔗糖脱水过夜，在4℃下包埋在OCT(樱花(Sakura)，4583)中1小时，随后在-80℃下冷冻。将组织切片至10μm厚，并用PBS洗涤两次，在0.2％ Triton X-100中渗透15分钟，在含有5％ BSA的PBS中封闭45分钟。对于EdU染色，使用CLICK PLUS EdU647成像试剂盒(赛默飞世尔，C10640)。
三维球状体培养
3D球状体培养测定的程序先前已有报道(Taylor等人“赖氨酰氧化酶有助于乳腺癌细胞中转化生长因子β信号传导的机械转导介导的调节(Lysyl oxidase contributesto mechanotransduction-mediated regulation of transforming growth factor-betasignaling in breast cancer cells)”《肿瘤形成(Neoplasia)》13:406-418(2011))。简而言之，将4T07细胞(每孔200个)在48孔板中在球状体培养基中的100％生长因子减少的基质胶(Matrigel)(356231，BD)垫上培养(球状体培养基为1％ FBS DMEM和来自在癌细胞CM中培养的中性粒细胞的培养基的1:1混合物，50％基质胶补充有50μg/ml mTSP-1(7859-TH-050))。在完成凝胶化之后，将具有10μg/ml mTSP-1(7859-TH-050)的250μl的培养基(1％FBS DMEM和来自在癌细胞CM中培养的中性粒细胞的培养基的1:1混合物)添加到每个孔中，并且每三天更换培养基。在第7至10天，分析球状体的数量。
活性氧物质(ROS)分析
为了测量ROS水平，将中性粒细胞在癌细胞CM或非条件培养基中培养，并用DMSO或各种抑制剂(包括西维来司他(10μM)、BAY11-7082(10μM)和SB203580(10μM))在37℃下处理1小时。然后收获细胞并重悬于测定缓冲液(PBS，4mM EGTA，pH 7.4，含有10μM CM-H2DCFDA，英杰)中，在37℃下在黑暗中孵育15分钟，用预冷的PBS洗涤，随后在30分钟内进行FACS分析。
临床分析
将所有福尔马林固定的人乳腺癌组织包埋在石蜡中，并将样本切片至6μm厚。将石蜡包埋的切片脱蜡并再水合。通过柠檬酸盐溶液(pH 6.0)或Tris-EDTA(pH 9.0)在95℃下进行抗原修复。然后，用PBS洗涤切片两次，在0.2％ Triton X-100中渗透15分钟，在含有5％ BSA的PBS中封闭45分钟。接下来，如上所述执行IF染色。CTSC、Ci-H3和MPO的相对染色强度通过DAPI染色强度的标准化来计算。每个样本的IF水平被评分为阴性、低、中或高。将样本分类为CTSC高或低表达组，所有染色的原发性肿瘤的中值染色强度作为Kaplan-Meier存活分析的截止值。根据制造商的说明书，在血液预处理后，用CTSC ELISA试剂盒(ELH-组织蛋白酶C，RayBiotech)分析血清样本。
统计分析
使用GraphPad Prism 7.0(美国拉荷亚GraphPad软件公司(GraphPad Software,La Jolla,USA))执行数据分析。数据呈现和统计分析在图例中描述。p值<0.05被认为具有统计学显著性。体外实验独立地重复多次，结果类似，如图例所指示。
实施例1：在具有高肺转移可能性的乳腺癌细胞中的CTSC表达
从乳腺癌患者获得74个原发性病灶和29个肺转移性病灶。这些病灶包括来自7名乳腺癌患者的成对原发性肿瘤和肺转移。通过免疫荧光染色分析样本的CTSC蛋白表达水平，如图1A至C所示。
为了验证CTSC在临床上与乳腺癌中的肺转移相关联，用酶联免疫吸附测定(ELISA)测量乳腺癌患者的血清中的CTSC的水平。然后根据肿瘤样本中CTSC蛋白的表达水平将患者分为两组，第一组对应于高CTSC表达，并且第二组对应于低CTSC表达。最后，使用Kaplan-Meier存活分析比较两组患者的预后(无转移存活和总存活)。
通过免疫荧光(IF)染色对CTSC蛋白表达水平的分析示出，与来自乳腺癌患者的原发性肿瘤相比，肺转移中CTSC蛋白水平显著上调(图1A)。根据图1A的免疫荧光图像，通过标准化为4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色来计算成对原发性肿瘤和肺转移中的相对CTSC蛋白水平(图1B)。如图1B所示，与成对原发性肿瘤相比，肺转移中CTSC表达升高。此外，如图1C所示，当将所有103个肿瘤样本一起考虑时，在超过一半的原发性肿瘤中存在低CTSC表达或没有CTSC表达，而通常，CTSC在肺转移中高表达。
较高的血清学CTSC浓度与乳腺癌患者体内肺转移的复发相关(图1D)。如图1D所示，与没有转移的复发的乳腺癌患者相比，经历肺转移的复发的乳腺癌患者在血清中具有显著更高的CTSC水平。此类升高的血清CTSC水平被示出为对应于较短的无转移存活时间和总体患者存活时间(图1E至F)。如图1E所示，根据Kaplan-Meier分析，血清中具有高CTSC表达水平的患者的无肺转移存活期显著短于具有低CTSC血清表达的患者。此外，如图1F所示，根据Kaplan-Meier分析，高CTSC表达组中的患者比低CTSC表达组中的患者具有显著更短的总体存活期。
在图1A至F中提供的数据证明CTSC分泌水平与乳腺癌患者体内肺转移的可能性具有显著正相关，这指示CTSC可以用作标记物基因以预测乳腺癌患者体内肺转移的风险。
实施例2：CTSC过表达对乳腺癌的肺转移的影响
为了验证CTSC在功能上促进乳腺癌的肺转移，CTSC在SCP28(MDA-MB-231的亚系)中过表达，其显示中值内源性CTSC水平和低肺转移可能性。为了测定CTSC过表达对肺转移的后果，经由尾静脉注射将荧光素酶标记的SCP28对照细胞或过表达CTSC的荧光素酶标记的SCP28细胞引入小鼠。执进行体内成像以经由荧光素酶信号的定量检测肺转移的程度。
经由尾静脉注射将荧光素酶标记的SCP28对照细胞(1)或过表达CTSC的荧光素酶标记的SCP28细胞(2)引入小鼠。评估两组小鼠(即，注射对照细胞的小鼠或注射过表达CTSC的细胞的小鼠)的肺组织的荧光素酶信号，确定两组的肺表面转移性结节的数量，并且计算两组的总体存活率以确定CTSC过表达对肺转移的后果。结果示出于图2A至D中。
图2A的左嵌图证实，与对照SCP28细胞(“pMSCV组”)相比，CTSC过表达的SCP28细胞中的CTSC mRNA水平更高。图2A的右嵌图描绘了蛋白印迹图像，其示出与对照组相比，CTSC过表达的组中CTSC蛋白水平确实上调。“CM”是条件培养基。
如图2B的左嵌图所图示，与对照小鼠相比，注射过表达CTSC的SCP28细胞的小鼠表现出显著更多的肺转移，如CTSC过表达组中在整个5周时间段内生物发光的较高总体水平所指示。如图2B的右嵌图所示，在注射后35天，与注射对照SCP28细胞的小鼠相比，移植有过表达CTSC的SCP28细胞的小鼠表现出显著更多的肺转移。
如图2C的左嵌图所图示，与注射对照SCP28细胞的小鼠相比，移植有过表达CTSC的SCP28细胞的小鼠的肺具有更大的肺表面转移性结节的平均数量。图2C的中心嵌图示出了注射对照SCP28细胞的小鼠和注射过表达CTSC的SCP28细胞的小鼠的全肺图像。观察到注射过表达CTSC的SCP28细胞的小鼠的整个肺含有更大量的可见的肺表面转移性结节。图2B的右嵌图比较了来自注射对照SCP28细胞的小鼠和注射过表达CTSC的SCP28细胞的小鼠的HE染色的肺组织。观察到注射过表达CTSC的SCP28细胞的小鼠的肺组织中的结节密度显著高于注射SCP28对照细胞的小鼠的肺组织中的结节密度。
存活率受CTSC过表达影响。与注射对照SCP28细胞的组相比，注射过表达CTSC的SCP28细胞的小鼠的存活率显著降低(图2D)。
在图2A至D中提供的数据证明CTSC的过表达可以在功能上促进乳腺癌细胞的肺转移，如通过小鼠尾静脉注射所测定的。
实施例3：CTSC敲除对乳腺癌的肺转移的影响
为了评估CTSC损失对乳腺癌细胞的肺转移的功能影响，使用LM2-4175(具有已知高肺转移可能性的MDA-MB-231亚系)。如实施例2中那样评估在小鼠尾静脉注射对照荧光素酶标记的LM2-4175或具有降低的CTSC水平的荧光素酶标记的LM2-4175(shCTSC#1和shCTSCC#2)后的肺转移。计算注射对照荧光素酶标记的LM2-4175的小鼠和注射荧光素酶标记的CTSC减少的LM2-4175的小鼠的肺组织的荧光信号和肺表面转移性结节的数量以及它们各自的存活率。结果示出于图3A至D中。
图3A的左嵌图证实，与对照LM2-4175细胞(“pSuper”组)相比，携带靶向CTSC的shRNA的LM2-4175细胞(“shCTSC#1”和“shCTSC#2”)中的CTSC mRNA水平更低。图3A的右嵌图描绘了蛋白印迹图像，其证实了与对照LM2-4175细胞(“pSuper”组)相比，LM2-4175细胞(“shCTSC#1”和“shCTSC#2”)中CTSC的shRNA敲除后CTSC蛋白的减少。“CM”是条件培养基。
在用CTSC减少的LM2-4175细胞尾静脉注射小鼠后，肺转移和肺表面转移性结节形成减少(分别为图3B和3C)，并且与注射LM2-4175对照细胞的小鼠相比，无转移存活增加(图3D)。
在图3A至D中提供的数据证明CTSC敲除可以在延长存活期中减弱乳腺癌细胞的肺转移，如通过小鼠尾静脉注射所测定的。
实施例4：CTSC表达对免疫完整小鼠体内乳腺癌的肺转移的影响
为了验证CTSC表达对乳腺癌的肺转移的影响，检查小鼠的免疫系统对肺转移的影响。使用具有完好无损的免疫系统的BALB/c小鼠模型，并进行两种类型的实验。
在第一种类型的实验中，将均用荧光素酶标记的4T07对照细胞系和具有过表达的CTSC的4T07小鼠乳腺癌细胞系注射到免疫感受态BALB/c小鼠的尾静脉中，以生成对照和CTSC过表达的小鼠组。然后，获得两组小鼠的肺组织的荧光信号和肺表面转移性结节的数量。结果示出于图4B至C中。
在第二种类型的实验中，将4T1对照细胞系和具有减少的CTSC的4T1细胞系注射到免疫感受态BALB/c小鼠的乳腺脂肪垫中，以生成对照和CTSC敲除小鼠组。然后，获得两组小鼠的肿瘤生长体积和肺结节的数量。结果示出于图4D至E中。
图4A的左嵌图证实，与对照细胞系相比，4T07细胞中的CTSC mRNA水平更高。图4A的中心嵌图证实，与对照细胞(“pVLX”组)相比，CTSC敲除的4T1细胞(“shCTSC#1”和“shCTSC#2”)中CTSC mRNA水平更低。图4A的右嵌图描绘了蛋白印迹图像，其示出与对应对照组相比，CTSC过表达的细胞中CTSC蛋白水平上调，并且两个CTSC敲除组中CTSC蛋白水平下调。“CM”是条件培养基。
图4B示出，用具有过表达的CTSC的4T07细胞静脉内注射免疫完整小鼠后，向肺的肿瘤转移上调，从而指示CTSC过表达显著促进肺中肿瘤细胞的生长，并且该作用不受BALB/c小鼠的完好无损的感受态免疫系统影响。
图4C示出，用具有过表达的CTSC的4T07细胞静脉内注射免疫感受态小鼠后，CTSC过表达的组中小鼠体内肺结节的数量显著高于空白对照组。这指示CTSC过表达显著增加了小鼠体内肺表面转移性病灶的数量，并且该促进作用不受BALB/c小鼠的完好无损的感受态免疫系统影响。
另一方面，在免疫感受态小鼠体内原位注射CTSC敲除的4T1细胞后，与对照组相比，CTSC敲除组中的肿瘤体积和肿瘤生长速率均更低(图4D)。此外，在免疫感受态小鼠体内，CTSC减少不影响4T1细胞在移植部位处的原地生长，但与对照组相比显著减少肺表面转移性结节的形成(图4E)。
总之，在图2A至4E中提供的数据确认了CTSC促进免疫缺陷和免疫感受态小鼠体内乳腺癌细胞的肺转移。
实施例5：CTSC在肺转移期间促进乳腺癌细胞的早期接种和持续增殖。
CTSC在乳腺癌细胞在肺中的早期转移性定殖中起作用。注射具有过表达的CTSC的SCP28的小鼠的生物发光成像(BLI)示出于注射后的第一周期间有显著的肺转移(图5A)。同时，如BLI信号降低所证明的，在注射后的整个第一周，注射未过表达CTSC的对照细胞(pMSCV)的小鼠体内肺转移下降或保持稳定。
如图5B所示，用CTSC过表达的SCP28细胞处理的小鼠的肺切片的免疫荧光染色表明，在注射后24小时、48小时和72小时，过表达CTSC的癌细胞在肺实质中的接种增加。在肺收获之前24小时，通过5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EdU)示踪来评估在移植有过表达CTSC的SCP28细胞的小鼠的肺中接种的癌细胞的增殖。如图5C所示，在注射后24小时、48小时和72小时的时间点进行肺接种后，CTSC过表达的细胞比对照细胞更具增殖性。
CTSC的减少被示出为对肺中乳腺癌细胞的早期转移性定殖具有相反的作用。与注射对照细胞的小鼠相比，注射CTSC敲除的LM2细胞的小鼠的BLI在注射后整个第一周示出肺转移显著减少(图5D)。
如图5E所示，用CTSC敲除的LM2处理的小鼠的肺切片的免疫荧光染色表明，在注射后72小时肺实质中GFP+癌细胞的接种减少。如图5F的右嵌图所示，Edu示踪指示，与注射后72小时的对照细胞相比，更少接种的CTSC过表达的细胞增殖。
CTSC减少还被示出为抑制晚期转移中癌细胞的转移性生长。如图5G所示，与注射对照细胞的小鼠的肺相比，注射后6周注射CTSC敲除的细胞的小鼠的肺的Ki67染色表明肺转移减少。
在图5A至G中提供的数据证明在转移的接种阶段期间，CTSC表达水平影响肿瘤细胞的增殖。
实施例6：CTSC促进肺转移中的中性粒细胞的募集
CTSC在调节肺转移中的中性粒细胞募集中起作用。在注射后7周，通过流式细胞术确定经处理的小鼠体内肺转移的CD45+免疫细胞中CD11b+Ly6G+中性粒细胞的百分比。如图6A的左嵌图所示，与对照细胞相比，具有过表达的CTSC的SCP28细胞含有更大百分比的CD11b+Ly6G+中性粒细胞。相反，如图6A的中心嵌图所示，相对于对照细胞，具有减少的CTSC的LM2细胞含有更小百分比的CD11b+Ly6G+中性粒细胞。图6A的最右嵌图呈现了流式细胞术分析，其指示与对照细胞(3.8％)相比，过表达CTSC的细胞具有更高百分比的中性粒细胞(11.7％)，在两个图表中均圈出。
在注射后72小时，还通过流式细胞术确定了经处理的小鼠体内肺实质中的CD45+免疫细胞中CD11b+Ly6G+中性粒细胞的百分比。如图6B的左嵌图所示，与对照细胞相比，具有过表达的CTSC的SCP28细胞含有更大百分比的CD11b+Ly6G+中性粒细胞。如图6B的右嵌图所示，相对于对照细胞，具有减少的CTSC的LM2细胞含有更小百分比的CD11b+Ly6G+中性粒细胞。
小鼠肺组织的免疫染色示出，与对照pMSCV细胞相比，在注射了CTSC过表达的SCP28细胞的小鼠体内，CD11b+Ly6G+中性粒细胞群聚在癌细胞更附近的位置(图6C，左嵌图)。与对照细胞相比，在注射具有减少的CTSC的LM2细胞的小鼠体内观察到CD11b+Ly6G+中性粒细胞与癌细胞的更少聚集(图6C)。
图6D示出了EdU+示踪的接种的肿瘤细胞的增殖与它们周围的CD11b+Ly6G+中性粒细胞的聚集之间的相关性。
与用IgG预处理相比，当在注射SCP28癌细胞之前用Ly6G清除抗体处理耗尽受试小鼠体内的中性粒细胞时，癌细胞的早期接种和增殖丧失(图6E)。EdU+示踪的肿瘤细胞的早期接种和增殖也是如此(图6F)。此外，相对于用IgG预处理的SCP28小鼠，用α-Ly6G预处理的SCP28小鼠在注射后8周时肺表面转移性结节的形成被抑制(图6G)。
在图6A至G中提供的数据证明肺转移中的CTSC过表达促进中性粒细胞募集增加。
实施例7：CTSC通过调节PR3-IL-1β-NF-κB轴增强中性粒细胞的募集
研究了CTSC对中性粒细胞募集的机制。在条件培养基(CM)中，CTSC过表达(4T07细胞)和CTSC减少(4T1细胞)两者对于癌细胞对中性粒细胞的募集均没有影响(图7A)。然而，当用含有4T07 CTSC的癌细胞条件培养基预处理中性粒细胞时，相对于没有CTSC过表达的对照4T07条件培养基，中性粒细胞培养基能够吸引更多的中性粒细胞(图7A，左嵌图)。
对用CTSC过表达的4T07预处理的中性粒细胞培养基的细胞因子阵列分析表明，孵育12小时后，与用对照4T07预处理相比，趋化因子白介素-6(IL-6)、C-C基序趋化因子配体2和3(CCL2和CCL3)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和可溶性肿瘤坏死因子受体I(TNFRI)均上调(图7B)。如图7B所示，IL-6和CCL3的上调最为明显。
图7C描绘了在HL-60来源的中性粒细胞的各种细胞级分中中性粒细胞来源的丝氨酸蛋白酶、PR3、NE和CTSG的表达水平，所有这些酶都是CTSC的已知底物。本实验中使用的级分标记物是Na/K ATPase、GRP78和β-肌动蛋白。如图7C所示，仅PR3在HL-60来源的中性粒细胞的细胞质膜上表达，这指示CTSC可以直接调节中性粒细胞细胞表面上的膜结合PR3。
然后检查用过表达CTSC的SCP28癌细胞的条件培养基培养的人中性粒细胞的膜结合PR3活性(图7D)。如图7D所示，用CTSGi(一种CTSG抑制剂)或阿维司他(一种NE抑制剂)处理对由CTSC过表达引起的上调的PR3活性没有影响。然而，用西维来司他(一种PR3抑制剂)处理显著降低了上调的PR3活性。
如图7E的左嵌图所示，在用西维来司他处理后，由用4T07(CTSC过表达)癌细胞的条件培养基预处理的中性粒细胞的培养基募集的鼠中性粒细胞的迁移显著减少。
通过肺组织的免疫染色来定量在注射CTSC过表达的SCP28后72小时小鼠的肺中GFP+癌细胞周围的髓过氧化物酶阳性中性粒细胞的数量。虽然癌细胞周围的中性粒细胞聚集相对于对照增加，但是用西维来司他进一步处理降低了中性粒细胞聚集的量(图7F)。这些作用被示出为在注射后持续7周(图7G)。在图7D至G中提供的数据表明CTSC通过PR3调节中性粒细胞，而不是CTSG或NE。
图7H示出了用有和没有CTSC过表达的SCP28癌细胞的条件培养基与西维来司他、阿维司他、CTSGi或BAY 11-7082(一种NF-KB抑制剂)组合预处理的人中性粒细胞的IL-1β分泌。在四种抑制剂中，仅PR3抑制剂西维来司他降低了用CTSC过表达的SCP28癌细胞的条件培养基预处理的中性粒细胞的IL-1β水平(CTSC+，Silvestat+)。用BAY11-7082处理不降低IL-1β水平，表明在中性粒细胞中CTSC对IL-1β的调节不依赖于炎性体途径。
IL-1β在CTSC介导的肺转移中的作用通过在经历过表达CTSC的AT3癌细胞的原位移植的小鼠体内的实验而得到进一步验证。如肺BLI数据所证明的，相对于用IgG处理的小鼠，用IL-1β-阻断抗体进一步处理此类小鼠减少了移植后34天的肺转移(图7I)。与用IgG进一步处理的小鼠相比，用α-IL-1β进一步处理减少了移植了过表达CTSC的AT3癌细胞的小鼠的肺中的肺表面结节的数量(图7J)。
在图7A至J中提供的数据指示CTSC通过活化中性粒细胞PR3和促进通过PR3-IL-1β-NF-κB途径的信号传导来增强中性粒细胞募集。
实施例8：肿瘤中的CTSC诱导中性粒细胞形成支持转移的NET
研究了募集到转移性灶的中性粒细胞的转移调节机制。在CTSC过表达的SCP28癌细胞的条件培养基中培养的中性粒细胞的免疫荧光染色在肺中形成广泛的细胞外陷阱(NET)结构，其数量类似于用12-肉豆蔻酸-13-乙酸佛波酯(PMA)诱导的那些(图8A)。相反，在CTSC敲除的LM2癌细胞的条件培养基中培养的中性粒细胞表现出减少的NET形成。
当在注射后24小时、48小时和72小时进行收获时，对收获的肺的IF分析示出与对照相比，过表达CTSC的附近GFP+SCP28癌细胞中的NET增加，而在肺中CTSC敲除的LM2癌细胞中观察到相反的作用(图8B)。
已知中性粒细胞释放活性氧物质(ROS)会诱导NET形成。参见kolackzkowska等人“肝脏脉管系统中的活体成像表明的NET形成和降解的分子机制(Molecular Mechanismsof NET formation and degradation revealed by intravital imaging in the livervasculature)”《自然·通讯(Nat.Commum.)》6,6673(2015)。对用4T07癌细胞的条件培养基预处理的鼠中性粒细胞的ROS分析示出由CTSC过表达引起的ROS产生增加，而当CTSC过表达时添加西维来司他阻断了ROS产生(图8C)。
如图8D所示，用4T1条件培养基和/或重组人活性PR3预处理的鼠中性粒细胞在rhPR3的存在下示出p38磷酸化增加，而与4T1细胞中CTSC是否敲除无关。然而，通过添加IL-1β-阻断抗体阻断了这种作用。
对用4T07条件培养基预处理的鼠中性粒细胞的ROS分析示出CTSC过表达引起ROS产生增加(图8E)。添加NF-KB抑制剂BAY 11-7082对ROS水平没有影响，表明NF-KB信号传导不参与中性粒细胞的ROS产生。另一方面，添加p38抑制剂SB203580显著降低ROS水平，指示p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径参与中性粒细胞ROS产生和NET增生。
如图8F所示，如NET覆盖的低百分比面积所证明的，用西维来司他(以抑制PR3)或DNase I(以消化NET)处理在4T07或4T1条件培养基中培养的鼠中性粒细胞阻断了CTSC诱导NET形成的能力。此外，如图8G中提供的BLI结果所证明的，已经注射过表达CTSC的SCP28细胞的小鼠体内的肺转移通过在注射后用西维来司他或DNase I进一步处理长达8周而被抑制。
添加重组鼠TSP-1(rmTSP-1)(一种转移抑制性ECM蛋白)不能阻断在用PMA预处理的中性粒细胞培养基中培养的4T07癌细胞的球状体生长(图8H)。类似地，在过表达CTSC的4T07条件培养基中，添加rmTSP-1不阻断球状体生长。然而，在每种情况下，用DNase I进一步处理减少但不消除球状体生长。
当将rmTSP-1和IL6阻断抗体添加到过表达CTSC的4T07条件培养基中时，球状体生长被抑制(图8I，左嵌图)。添加DNase I进一步抑制球状体生长(图8I，左嵌图)。α-IL6、DNase I及其组合对球状体形成的抑制作用可以在图8I提供的图像中看到。
从整体上看，在图8A至I中提供的数据证明CTSC通过活化p38和增加中性粒细胞中的ROS而诱导肿瘤中的NET增生，并且所得NET支持肿瘤细胞中的转移性生长。
实施例9：对人乳腺肿瘤样本的中性粒细胞浸润和NET的分析
研究了NET形成与人乳腺癌的肺转移的临床相关性。
对一组74个人原发性乳腺肿瘤和一组29个肺转移的IF分析示出，相对于原发性肿瘤样本，肺转移样本中的CTSC的表达、NET的形成和中性粒细胞浸润显著更高(图9A)。此外，CTSC表达水平与原发性肿瘤和肺转移中的NET形成(图9B，左嵌图)和中性粒细胞浸润(图9B，右嵌图)强烈相关。
图9C示出了肺转移性肿瘤中的循环NET水平高于非转移性肿瘤，并且图9D示出了当一起考虑原发性肿瘤和肺转移两者时，血清学CTSC表达水平与血清中的循环NET水平强烈相关。
在对三种不同乳腺癌亚型的IF分析中也观察到较高水平的CTSC表达、NET形成和中性粒细胞迁移(图9E)。
在图9A至E中提供的数据示出于临床样本中，CTSC表达与乳腺癌的肺转移中的中性粒细胞浸润和NET形成相关。
实施例10：CTSC抑制剂brensocatib抑制乳腺癌在肺中的转移
研究了CTSC抑制剂治疗乳腺癌的肺转移的应用。brensocatib(也称为AZD7986或INS1007)是一种用于治疗非囊性纤维化支气管扩张的CTSC特异性抑制剂，并且目前已进入II期临床试验。参见Doyle等人“第二代可逆共价DPP1抑制剂的发现带来基于氧氮杂烷酰胺乙腈的临床候选物(AZD7986)(Discovery of second generation reversible covalentDPP1 inhibitors leading to an oxazepane amidoacetonitrile based clinicalcandidate(AZD7986))”《药物化学杂志(J.Med.Chem.)》59:9457-9472(2016)。在经由脂肪垫注射引入4T1细胞后7天向小鼠施用brensocatib。还提供了媒介物对照组。肿瘤体积随时间的变化、形成的肺结节的数量、小鼠体重随时间的变化和小鼠存活率的图形数据以及病灶中NET的数量的统计图示出于图10A至E中。CTSC抑制剂brensocatib还抑制NET促进的4T1细胞的肿瘤球形成(图10F)。
与4T1 CTSC减少的表型一致，brensocatib施用组与未经处理的对照组之间原地肿瘤体积相对于时间的变化一致，指示brensocatib的施用不影响原发性肿瘤生长(图10A)。
与未经处理的小鼠相比，用brensocatib处理的小鼠表现出显著减少的肺结节形成，指示brensocatib施用可以抑制肺表面上的肿瘤细胞形成转移性病灶(图10B)。
用brensocatib处理的小鼠的体重降低低于未经处理的小鼠，指示brensocatib施用可以减轻由肺转移引起的体重损失(图10C)。
与未经处理的小鼠相比，用brensocatib处理显著改善小鼠的存活率，指示brensocatib施用显著延长小鼠的存活期(图10D)。
图10E示出相对于未经处理的小鼠，用brensocatib处理的小鼠的肺病灶中的中性粒细胞浸润减少，指示brensocatib施用显著抑制肺转移性病灶中的中性粒细胞浸润和NET的形成。
图10F示出与未经处理的对照组相比，在用4T1的CM预处理的中性粒细胞的培养基中培养的4T1乳腺癌细胞的肿瘤球形成被brensocatib抑制，指示CTSC抑制剂brensocatib抑制NET促进的乳腺癌细胞的肿瘤球形成。
在原位注射过表达CTSC的AT3癌细胞后，用brensocatib处理小鼠时观察到类似的作用。由brensocatib处理引起的肺病变、循环NET、中性粒细胞迁移和肺转移性结节形成的减少示出于图10G至I中。而且，在经brensocatib处理的小鼠体内观察到存活率的显著增加和IL-1β的循环水平的降低(图10J至K)。
以上提供的所有数据均支持CTSC作为用于临床治疗乳腺癌的肺转移的可能的新靶标。在机理上，CTSC通过在病灶部位处的中性粒细胞浸润增加和NET的数量增加而促进乳腺癌的肺转移，从而引发肿瘤微环境以促进乳腺癌的肺转移。然而，CTSC抑制剂brensocatib有效抑制病灶部位处的中性粒细胞浸润并减少NET的形成，从而抑制小鼠体内乳腺癌的肺转移。
实施例11：CTSC抑制剂brensocatib抑制各种类型的转移性癌细胞进行的中性粒细胞募集、NET的形成和肿瘤球形成
鉴于CTSC上调对肿瘤转移中的中性粒细胞募集和NET的形成的促进作用，以及CTSC抑制剂(brensocatib)对中性粒细胞功能的有益作用，考虑在其它肿瘤转移疾病(包括乳腺癌向肝和骨的转移，以及肺癌向骨的转移)中使用CTSC抑制剂。
检查具有向各种靶器官的不同转移能力的肿瘤细胞(包括乳腺癌向肝、骨的转移和肺癌向骨的转移)中的CTSC蛋白分泌水平。通常，CTSC表达水平在高转移性肿瘤细胞中增加。用这些细胞的条件培养基(分泌物)(有或没有brensocatib)处理来自骨髓的中性粒细胞。然后用Transwell可渗透细胞培养室评估肿瘤分泌物吸引中性粒细胞的能力，并通过NET分子标记物(MPO和瓜氨酸化组蛋白H3)的免疫荧光染色分析NET的形成。来自该研究的数据示出于图11A至J中。
由于brensocatib处理，经药物处理的肿瘤细胞分泌物吸引(募集)中性粒细胞和诱导NET的形成的能力显著减弱。实际上，在用brensocatib处理的许多转移性肿瘤细胞类型中，CTSC蛋白表达(图11A至C)、NET的形成(图11D、F、I)和中性粒细胞募集(图11G、J)显著减少。
由于brensocatib处理，经药物处理的中性粒细胞在体外促进骨转移性和肝转移性乳腺癌细胞的肿瘤细胞生长的能力显著减弱。将中性粒细胞与来自经过或未经过brensocatib处理的癌细胞的条件培养基一起培养以活化NET增生，并且然后将中性粒细胞培养基用于骨转移性和肝转移性乳腺癌细胞的肿瘤球形成，以分析中性粒细胞培养基促进肿瘤细胞生长的作用。骨转移性乳腺癌细胞SCP2的数据示出于图11E中，并且肝转移性乳腺癌细胞SCP16的数据示出于图11H中。
在图11A至J中提供的数据表明CTSC抑制剂brensocatib可以减少乳腺癌的肺转移以外(如乳腺癌的肝转移、乳腺癌的骨转移和肺癌的骨转移)的疾病的早期转移性病灶中的中性粒细胞浸润、NET的形成和肿瘤细胞生长。
实施例12：CTSC抑制剂brensocatib减少各种类型的体外癌症中的NET促进的肿瘤球形成
为了测试brensocatib在不同的体外癌症类型中的治疗作用，研究了brensocatib抑制NET促进的肿瘤球形成的能力。将中性粒细胞与来自经过或未经过brensocatib处理的结肠癌、肝癌、肺癌、胃癌和胰腺癌的肿瘤细胞的条件培养基一起培养以活化NET增生，并且然后将中性粒细胞培养基用于这些癌细胞的肿瘤球形成，以分析中性粒细胞培养基促进肿瘤细胞生长的作用。然后通过成像确定每个样本中肿瘤球的量。brensocatib抑制这些癌症类型的体外肿瘤生长的作用示出于图11K至O中。
实施例13：CTSC抑制剂brensocatib减少体内肝脏中的原发性肿瘤生长和转移
通过脾注射将肝脏和胰腺肿瘤细胞注射到裸鼠中进行一系列小鼠异种移植研究。然后用brensocatib处理小鼠，并且观察肝脏中肿瘤的生长。可以看出，brensocatib处理显著抑制了肝脏中肝癌细胞HUH7的肿瘤生长(图12A、B)，以及肝脏中胰腺癌细胞KP4的转移性生长(图12C)。
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虽然已经参考特定实施例描述了本公开，但是本领域技术人员应当理解，在不脱离本公开的范围的情况下，可以进行各种改变并且可以用等同物取代其元素。此外，可以进行许多修改以采用特定的情况、材料、物质组成、工艺、一个或多个工艺步骤，以符合所描述的发明的客观精神和范围。所有此类修改均旨在落入所附权利要求的范围内。
因此，本公开不限于作为设想用于实施本公开的最佳模式而公开的特定实施例，而是本公开将包括落入所附权利要求的范围和精神内的所有实施例。
本文引用的专利、专利申请、专利申请公开案、期刊文章和方案以全文引用的方式并入本文用于所有目的。

Claims (18)

1.一种组织蛋白酶C抑制剂或包含组织蛋白酶C抑制剂的组合物用于制备治疗或抑制原发性癌症的药物中的用途；
其中，所述药物被施用于具有以下特征的癌症患者，从而抑制原发性癌症处的中性粒细胞细胞外陷阱(NET)的形成：组织蛋白酶C血清水平升高以及原发性癌症处的中性粒细胞细胞外陷阱(NET)的数量增加；
并且，所述原发性癌症为结肠癌、肺癌、胃癌或胰腺癌；
所述组织蛋白酶C抑制剂是或其药学上可接受的盐。
2.一种组织蛋白酶C抑制剂或包含组织蛋白酶C抑制剂的组合物用于制备治疗或抑制癌症转移的药物中的用途；
其中，所述药物被施用于具有以下特征的癌症患者：组织蛋白酶C血清水平升高，以及转移处的中性粒细胞细胞外陷阱(NET)的数量增加；
所述组织蛋白酶C抑制剂或包含组织蛋白酶C抑制剂的组合物通过抑制中性粒细胞向转移处迁移以及转移处的NET的形成来抑制转移灶的形成；
并且，所述癌症转移为乳腺癌的肺转移、乳腺癌的肝转移、乳腺癌的骨转移、肺癌的骨转移或胰腺癌的肝转移；
所述组织蛋白酶C抑制剂是 或其药学上可接受的盐。
3.根据权利要求2所述的用途，其中所述组织蛋白酶C抑制剂是或其药学上可接受的盐。
4.根据权利要求2或3所述的用途，其中所述癌症转移是乳腺癌的肺转移、乳腺癌的肝转移、乳腺癌的骨转移或肺癌的骨转移。
5.根据权利要求2或3所述的用途，其中所述癌症转移是肺癌的骨转移。
6.根据权利要求5所述的用途，其中所述肺癌是小细胞肺癌。
7.根据权利要求5所述的用途，其中所述肺癌是非小细胞肺癌。
8.根据权利要求2或3所述的用途，其中所述癌症转移是乳腺癌的肺转移、乳腺癌的肝转移或乳腺癌的骨转移。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述乳腺癌是三阴性乳腺癌。
10.根据权利要求8所述的用途，其中乳腺癌的所述转移是乳腺癌的肺转移。
11.根据权利要求2或3所述的用途，其中所述癌症转移是胰腺癌的肝转移。
12.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中施用包含口服施用。
13.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中施用包含肠胃外施用。
14.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中施用包含静脉内施用。
15.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述患者的存活率相对于未施用所述药物的癌症患者的存活率有所增加。
16.根据权利要求1所述的用途，其中所述治疗还包含与所述治疗期之前所述患者体内所述原发性癌症处的中性粒细胞细胞外陷阱(NET)的数量相比，在所述治疗期期间或所述治疗期之后减少所述患者体内所述原发性癌症处的NET。
17.根据权利要求2或3所述的用途，其中所述治疗还包含与所述治疗期之前所述患者体内所述转移处的中性粒细胞细胞外陷阱(NET)的数量相比，在所述治疗期期间或所述治疗期之后减少所述患者体内所述转移处的NET。
18.根据权利要求2或3所述的用途，其中所述治疗还包含与所述治疗期之前所述转移中的中性粒细胞迁移相比，在所述治疗期期间或所述治疗期之后减少所述转移中的中性粒细胞迁移。
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