CN103040850A - 蛋氨酸-抗肿瘤复合药物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了蛋氨酸连接物，化合物通式为X-Y-蛋氨酸，其中X为阿霉素、紫杉醇、羟基喜树碱、长春新碱、吉西他滨、利妥昔单抗等。Y为丁二酸酐或乌头酸酐或戊二酸酐或省去，此类型化合物可用于肿瘤的靶向治疗，本发明还公开了制备方法。本发明将蛋氨酸通过丁二酸酐与阿霉素和紫杉醇共价连接，其中蛋氨酸起到肿瘤靶向的作用，丁二酸酐提高抗肿瘤药物水溶性，药物在肿瘤部位蓄积进入肿瘤细胞，有效提高药物浓度，并且降低全身毒副作用。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤靶向治疗领域，具体为构建具有肿瘤靶向的蛋氨酸和抗肿瘤药物的连接物，特别涉及制备多种肿瘤靶向的蛋氨酸-抗肿瘤复合药物。
背景技术
目前常见的抗肿瘤药物具有毒副作用大，非靶向性，药效低等缺陷。在杀死肿瘤细胞的同时对正常细胞也造成较大的伤害。目前，抗肿瘤药物的毒性、水溶性等已成为临床限制给药的主要因素。在此基础上，我们构建改造了蛋氨酸靶向抗肿瘤前药。以期达到靶向性强，毒副作用小，药效高的目的。
肿瘤已成为威胁人类健康的重大疾病，肿瘤具有易迁移，复发性高，难以根治等特性。在肿瘤发展早期进行治疗，可以较好的切除病灶，提高患者生存率。肿瘤的早期诊断及靶向治疗具有重要的作用。蛋氨酸是人体的必需氨基酸，肿瘤的生长和繁殖都依赖蛋氨酸。目前发现蛋氨酸至少有以下四种功能：蛋氨酸参加蛋白的合成。蛋氨酸是谷胱甘肽的前体，因此可以防止细胞被破坏。蛋氨酸是形成聚胺精胺和亚精脒所必需的物质，对细胞分裂起重要的作用。「蛋氨酸为DNA或其它分子甲基化作用提供了甲基团。蛋氨酸依赖是肿瘤细胞的显著特征，在体内通过转运体LAT1和LAT2进入细胞。由于肿瘤细胞代谢旺盛，分裂增殖迅速，蛋氨酸摄取量明显高于正常细胞。利用这一特点，可以将蛋氨酸作为靶点用于修饰抗肿瘤药物及肿瘤诊断试剂。
目前肿瘤靶向给药已经成为肿瘤治疗中的一个重要方面，其中，以代谢为靶向机制，以蛋氨酸为肿瘤靶向物质的抗肿瘤药物还没有报道过。
发明内容
本发明的蛋氨酸-抗肿瘤复合药物，结构式如下X-Y-蛋氨酸(见式III)
其中X为阿霉素、吡柔比星、紫杉醇、多西紫杉醇、奥沙利铂、喜树碱、羟基喜树碱、长春新碱、长春碱、长春瑞宾、长春酰胺、利妥昔单抗或吉西他滨；Y为丁二酸酐、乌头酸酐或戊二酸酐。
阿霉素-蛋氨酸(式I)、紫杉醇-蛋氨酸(式II)
所述的蛋氨酸-抗肿瘤复合药物的制备方法，其特征在于按如下步骤实现：步骤(1)制备丁二酸酐-阿霉素复合物：将阿霉素溶于蒸馏水中，冰浴搅拌，然后将溶于丁二酸酐缓慢滴加到阿霉素水溶液中，冰浴反应0.5-2h，获得丁二酸酐-阿霉素复合物，；
步骤(2)制备丁二酸酐-阿霉素复合物活性酯：将丁二酸酐-阿霉素复合物溶于二甲亚砜中，加入1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，反应4-6h。
步骤(3)制备阿霉素-丁二酸酐-蛋氨酸前体药物：将蛋氨酸份溶于pH8的tris缓冲液，缓慢滴加至步骤(2)所制的阿霉素-丁二酸酐活性酯中，避光搅拌反应12-18h，获得产物。
所述的蛋氨酸-抗肿瘤复合药物的制备方法，特征在于按如下步骤实现：
步骤(1)制备紫杉醇-丁二酸酐复合物：将紫杉醇和丁二酸酐溶于二氯甲烷，加入4-二甲氨基吡啶份，50°搅拌反应，洗涤纯化。
步骤(2)制备紫杉醇-丁二酸酐活性酯：将紫杉醇-丁二酸酐复合物溶于二甲亚砜中，加入1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，反应4-6h。
步骤(3)制备紫杉醇-丁二酸酐-蛋氨酸前体药物是将蛋氨酸溶于pH8的tris缓冲液，缓慢滴加至步骤(5)所制的紫杉醇-丁二酸酐活性酯中，避光搅拌反应12-30h，获得产物。
有益效果：本发明将蛋氨酸通过丁二酸酐与阿霉素和紫杉醇共价连接，其中蛋氨酸起到肿瘤靶向的作用，丁二酸酐提高抗肿瘤药物水溶性，药物在肿瘤部位蓄积进入肿瘤细胞，有效提高药物浓度，并且降低全身毒副作用。
附图说明
图1是MET-DOX的紫外吸收光谱
图2是MET-DOX的荧光吸收光谱
图3是MET-PTX的紫外吸收光谱
图4是MET-DOX的质谱
图5是MET-PTX的质谱
图6是MET-DOX的核磁，A为氢谱，B为碳谱。
图7是MET-PTX的核磁，A为氢谱，B为碳谱。
图8MET-DOX和MET-PTX的肿瘤治疗效果图，其中A为MET-DOX，B为MET-PTX。
具体实施方式
.实施例1：将10mg阿霉素溶于2ml蒸馏水中，冰浴搅拌2min，将7mg丁二酸酐溶于200μL二恶烷，将其缓慢滴加到冰浴阿霉素水溶液中。反应5min后，用1M NaOH水溶液调节反应液的pH值在7～9的范围内，冰浴反应20min，反应结束后，将浑浊液分装在EP管中，10000r/min离心5min进行分离，弃掉上清液，沉淀即为阿霉素-丁二酸酐复合物。将10mg复合物溶于200μl二甲亚砜中，再加入3mg1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐和3mg N-羟基琥珀酰亚胺，室温反应4h。取10mg蛋氨酸溶于pH8的tris缓冲液1ml，缓慢滴加活性酯DMSO液至此水溶液中，避光搅拌反应12-18h。反应液过葡聚糖凝胶G-15，蒸馏水洗脱，最先下来的橘红色组分收集起来，冷冻干燥，过高效液相进一步分离纯化，最终得到终产物阿霉素-丁二酸酐-蛋氨酸(命名为MET-DOX)。质谱鉴定阿霉素-丁二酸酐M+1640.7，阿霉素-丁二酸酐-蛋氨酸M+1773.2。
表2为HMBC，其中√为H与所对应的C相关；
实施例2：将10mg紫杉醇和5mg丁二酸酐用200μl二氯甲烷溶解，此时溶液略呈混浊，用一次性注射器缓慢加入5mg二甲氨基丙胺，溶液变澄清，油浴50°反应48h，其间用TLC跑板监测反应进程。反应结束后，用2倍体积的水洗涤2次，饱和食盐水洗涤2次，无水硫酸镁干燥，最后通过旋蒸除去反应试剂，得到紫杉醇-丁二酸酐复合物。过硅胶柱分离纯化，以跑板比例乙酸乙酯∶石油醚3∶1的比例进行分离，最终得到纯化的复合物。取10mg复合物溶于适当二甲亚砜中，加入3mgl-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐和3mgN-羟基琥珀酰亚胺，反应4-6h，制得紫杉醇-丁二酸酐活性酯，取10mg蛋氨酸溶于pH8的tris缓冲液1ml中，缓慢滴加活性酯DMSO液至此水溶液中，避光搅拌反应20-30h。反应液过葡聚糖凝胶G-15，收集最先下来的组分，冷冻干燥得粗品固体，过高效液相分离纯化，得到最终产物紫杉醇-丁二酸酐-蛋氨酸(命名为MET-PTX)。质谱鉴定紫杉醇-丁二酸酐M+1953.3，紫杉醇-丁二酸酐-蛋氨酸M+11133.8。
.实施例3：将肿瘤细胞MCF-7以5×104/ml接种于96孔培养板，每孔200μl，在37°，5％CO2条件下培养24h，待细胞完全贴壁后，加入不同浓度的MET-DOX和DOX溶液(加入体积控制在10μl以下)，以未处理的空白细胞为对照，设5个复孔，于37℃，5％CO2培养箱孵育。72h后加入20μlMTT(5mg/ml水溶液)，继续孵育4h，弃去培养液，用少量PBS清洗，每孔加入100μl二甲基亚砜(DMSO)，恒温振荡20min，用酶联检测仪测定570nm处的吸光度，计算细胞存活率。
表3各组对肿瘤细胞MCF-7的存活率影响
| 组别 | 细胞存活率(％) |
| 对照组 | 95.6±0.08 |
| 阿霉素 | 57.7±0.06 |
| MET-DOX | 48.4±0.04 |
实施例5：肿瘤细胞MDA-MB-231以5×104/ml接种于96孔培养板，每孔200μl，在37°，5％CO2条件下培养24h，待细胞完全贴壁后，加入不同浓度的MET-PTX和PTX溶液(加入体积控制在10μl以下)，以未处理的空白细胞为对照，设5个复孔，于37℃，5％CO2培养箱孵育。72h后加入20μlMTT(5mg/ml水溶液)，继续孵育4h，弃去培养液，用少量PBS清洗，每孔加入100μl二甲基亚矾(DMSO)，恒温振荡20min，用酶联检测仪测定570nm处的吸光度，计算细胞存活率。各个组的细胞相对存活率(实验组相对空白组)可通过如下公式进行计算得到：Inhibition ratio(％)＝(ODcontrol-ODtreated/ODcontrol)×100％。其中ODtreated表示加入一定浓度的实验组样品吸光值，而ODcontrol表示空白组(未加入样品)的吸光值。
表4各组对肿瘤细胞MDA-MB-231的存活率影响
| 组别 | 细胞存活率(％) |
| 对照组 | 93.7±0.08 |
| 紫杉醇组 | 65.7±0.06 |
| MET-PTX | 51.5±0.08 |
实施例6：取雌性裸鼠18只(4～6周龄，体重18～22g)饲养于SPF级无菌饲养室。取2×106的MCF-7乳腺癌细胞，加入胰蛋白酶和EDTA混和消化液消化，1640培养液吹打、离心制成单细胞悬液，接种于裸鼠的右侧腋部皮下。每只接种0.2ml，接种后继续饲养并1周3次检测肿瘤的生长情况。待肿瘤直径超过0.5cm(7～14天)，致瘤率达100％后用于实验。
将MCF-7肿瘤鼠平均随机分为3组(每组6只裸鼠，尾静脉给药，给药频率为隔天一次，连续五次，具体的实验设计方案如下所示：
A组，DOX单品，剂量为6mg/kg；B组，MET-DOX，8.21mg/kg(相对阿霉素含量6mg/kg)。C组，生理盐水组
当肿瘤均长到200mm3时，隔天尾静脉注射，连续五天，根据公式V＝a×b2/2计算肿瘤体积(a长轴、b短轴)。治疗结束后将小鼠处死，剥下肿瘤称重，在此期间每天对各组裸鼠的体重进行称重。计算肿瘤抑制率和体重减少率。
抑制率(％)＝(对照组瘤重-治疗组瘤重)/对照组瘤重×100％
体重减少率(％)＝给药组平均体重减少量-对照组平均体重减少量/对照组平均体重减少量×100％.
表5各组对荷乳腺癌裸鼠抑制作用的影响(
n＝5)
实施例7：取雌性裸鼠18只(4～6周龄，体重18～22g)饲养于SPF级无菌饲养室。取2×106的MDA-MB-231乳腺癌细胞，加入胰蛋白酶和EDTA混和消化液消化，DMEM培养液吹打离心制成单细胞悬液，接种于裸鼠的右侧腋部皮下。每只接种0.2ml，接种后继续饲养并1周3次检测肿瘤的生长情况。待肿瘤直径超过0.5cm(7～14天)，致瘤率达100％后用于实验。
将MDA-MB-231肿瘤鼠平均随机分为3组(每组6只裸鼠，尾静脉给药，给药频率为隔天一次，连续五次，具体的实验设计方案如下所示：
A组，PTX单品，剂量为15mg/kg；B组，MET-PTX，17mg/kg(相对阿霉素含量15mg/kg)。C组，生理盐水
当肿瘤均长到200mm3时，隔天尾静脉注射，连续五天，根据公式V＝a×b2/2计算肿瘤体积(a长轴、b短轴)。治疗结束后将小鼠处死，剥下肿瘤称重，在此期间每天对各组裸鼠的体重进行称重。计算肿瘤抑制率和体重减少率。
抑制率(％)＝(对照组瘤重-治疗组瘤重)/对照组瘤重×100％
体重减少率(％)＝给药组平均体重减少量-对照组平均体重减少量/对照组平均体重减少量×100％
表6各组对荷乳腺癌裸鼠抑制作用的影响(
n＝5)
Claims (5)
1.蛋氨酸-抗肿瘤复合药物，其结构式如下：
其中X为阿霉素、吡柔比星、紫杉醇、多西紫杉醇、奥沙利铂、喜树碱、羟基喜树碱、长春新碱、长春碱、长春瑞宾、长春酰胺、利妥昔单抗或吉西他滨；Y为丁二酸酐、乌头酸酐或戊二酸酐。
2.根据权利要求1所述的蛋氨酸-抗肿瘤复合药物，其特征在于所述的X为阿霉素；Y为丁二酸酐。
3.根据权利要求1所述的蛋氨酸-抗肿瘤复合药物，其特征在于所述的X为紫杉醇；Y为丁二酸酐。
4.根据权利要求2所述的蛋氨酸-抗肿瘤复合药物的制备方法，其特征在于按如下步骤实现：按质量份数计：
步骤(1)制备丁二酸酐-阿霉素复合物：将阿霉素溶于蒸馏水中，冰浴搅拌，然后将溶于丁二酸酐缓慢滴加到阿霉素水溶液中，冰浴反应0.5-2h，获得丁二酸酐-阿霉素复合物，；
步骤(2)制备丁二酸酐-阿霉素复合物活性酯：将丁二酸酐-阿霉素复合物溶于二甲亚砜中，加入1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，反应4-6h。
步骤(3)制备阿霉素-丁二酸酐-蛋氨酸前体药物：将蛋氨酸份溶于pH8的tris缓冲液，缓慢滴加至步骤(2)所制的阿霉素-丁二酸酐活性酯中，避光搅拌反应12-18h，获得产物。
5.根据权利要求3蛋氨酸-抗肿瘤复合药物的制备方法，特征在于按如下步骤实现：
按质量份数计：
步骤(1)制备紫杉醇-丁二酸酐复合物：将紫杉醇和丁二酸酐溶于二氯甲烷，加入4-二甲氨基吡啶份，50°搅拌反应，洗涤纯化。
步骤(2)制备紫杉醇-丁二酸酐活性酯：将紫杉醇-丁二酸酐复合物溶于二甲亚砜中，加入1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，反应4-6h。
步骤(3)制备紫杉醇-丁二酸酐-蛋氨酸前体药物是将蛋氨酸溶于pH8的tris缓冲液，缓慢滴加至步骤(5)所制的紫杉醇-丁二酸酐活性酯中，避光搅拌反应12-30h，获得产物。
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| CN (1) | CN103040850A (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103405480A (zh) * | 2013-05-03 | 2013-11-27 | 浙江理工大学 | 10-羟基喜树碱-丁二酸与腺病毒结合物及制法和用途 |
| CN104800858A (zh) * | 2015-04-27 | 2015-07-29 | 中国医学科学院基础医学研究所 | Hsp90抑制肽偶联物及其在肿瘤治疗中的应用 |
| CN106893054A (zh) * | 2016-03-29 | 2017-06-27 | 江苏省肿瘤医院 | 一种阳离子聚合物基因载体及其制备方法和应用 |
| CN109675043A (zh) * | 2019-02-28 | 2019-04-26 | 中国药科大学 | 甲硫氨酸在增敏紫杉醇对乳腺癌治疗效果中的应用 |
| CN110423259A (zh) * | 2019-08-13 | 2019-11-08 | 广东工业大学 | 一种喜树碱糖缀合物及其制备方法和应用 |
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 《Molecular Imaging and Biology》 20120503 Didel M. Mahounga等 Synthesis of a Novel L-Methyl-Methionine-ICG-Der-02 Fluorescent Probe for In Vivo Near Infrared Imaging of Tumors 第699-707页 1-5 第14卷, * |
| DIDEL M. MAHOUNGA等: "Synthesis of a Novel L-Methyl-Methionine–ICG-Der-02 Fluorescent Probe for In Vivo Near Infrared Imaging of Tumors", 《MOLECULAR IMAGING AND BIOLOGY》 * |
| HAIYAN CHEN等: "Multifunctional near-infrared-emitting nano-conjugates based on gold clusters for tumor imaging and therapy", 《BIOMATERIALS》 * |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103405480A (zh) * | 2013-05-03 | 2013-11-27 | 浙江理工大学 | 10-羟基喜树碱-丁二酸与腺病毒结合物及制法和用途 |
| CN103405480B (zh) * | 2013-05-03 | 2015-11-25 | 浙江理工大学 | 10-羟基喜树碱-丁二酸与腺病毒结合物及制法和用途 |
| CN104800858A (zh) * | 2015-04-27 | 2015-07-29 | 中国医学科学院基础医学研究所 | Hsp90抑制肽偶联物及其在肿瘤治疗中的应用 |
| CN104800858B (zh) * | 2015-04-27 | 2017-11-21 | 中国医学科学院基础医学研究所 | Hsp90抑制肽偶联物及其在肿瘤治疗中的应用 |
| US10918731B2 (en) | 2015-04-27 | 2021-02-16 | Institute Of Basic Medical Sciences, Chinese Academy Of Medical Sciences | HSP90 inhibitory peptide conjugate and application thereof in treating tumor |
| CN106893054A (zh) * | 2016-03-29 | 2017-06-27 | 江苏省肿瘤医院 | 一种阳离子聚合物基因载体及其制备方法和应用 |
| CN106893054B (zh) * | 2016-03-29 | 2020-07-28 | 江苏省肿瘤医院 | 一种阳离子聚合物基因载体及其制备方法和应用 |
| CN109675043A (zh) * | 2019-02-28 | 2019-04-26 | 中国药科大学 | 甲硫氨酸在增敏紫杉醇对乳腺癌治疗效果中的应用 |
| CN110423259A (zh) * | 2019-08-13 | 2019-11-08 | 广东工业大学 | 一种喜树碱糖缀合物及其制备方法和应用 |
| CN110423259B (zh) * | 2019-08-13 | 2021-01-26 | 广东工业大学 | 一种喜树碱糖缀合物及其制备方法和应用 |
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