CN103405480B

CN103405480B - 10-羟基喜树碱-丁二酸与腺病毒结合物及制法和用途

Info

Publication number: CN103405480B
Application number: CN201310163392.9A
Authority: CN
Inventors: 徐涛; 陈文铎
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2013-05-03
Filing date: 2013-05-03
Publication date: 2015-11-25
Anticipated expiration: 2033-05-03
Also published as: CN103405480A

Abstract

本发明公开了一种10-羟基喜树碱-丁二酸与腺病毒的结合物，其制备方法为：利用10-羟基喜树碱与丁二酸酐在无水吡啶中通过4-二甲氨基吡啶催化，使10-羟基喜树碱上的羟基与丁二酸酐的羧基反应，生成HCPT-SA；HCPT-SA和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐在N，N-二甲基甲酰胺中通过N-羟基琥珀酰亚胺进行反应，然后加入腺病毒进行暗反应；从而使HCPT-SA上的羧基与腺病毒衣壳蛋白的氨基反应构成10-羟基喜树碱-丁二酸与腺病毒的结合物。上述10-羟基喜树碱-丁二酸与腺病毒的结合物的用途为：在制备用于抗肿瘤的药物中的应用。

Description

10-羟基喜树碱-丁二酸与腺病毒结合物及制法和用途

技术领域

本发明涉及一种10-羟基喜树碱-丁二酸与腺病毒的结合物及其制备方法和其在抗肿瘤方面的应用。

背景技术

喜树碱作为一种天然的生物碱，是美国化学家Wall等1966年首次从中国引种的珙桐科植物喜树(Camptothecaacuminata)树杆中提取得到。但是天然喜树碱水溶性极差，因此早期临床使用喜树碱的水溶性羧酸钠盐。遗憾的是喜树碱制成羧酸钠盐后抗癌活性锐减，活性只有喜树碱本身的10-20％，研究表明内酯环的稳定性是喜树碱保持活性的重要指标。目前，伊立替康，拓扑替康和贝洛替康已经获得批准上市用于临床治疗，这些药物主要是通过修饰A/B环提高药物的水溶性，还有系列的衍生物正处于临床实验，但是该类药物还有诸如呕吐、腹泻、骨髓抑制以及出血性膀胱炎等严重的副作用，后来经过化学修饰的衍生物也具有类似的毒副作用。

为了提高喜树碱的水溶性，降低其毒副作用，其内酯环在体内的保留时间延长及增加生理活性，使抗肿瘤活性得以提高。长期以来人们一直在寻找高效低毒的喜树碱衍生物，研究发现对喜树碱不同位置的修饰可得到不同活性的喜树碱衍生物，喜树碱的内酯环是其抗肿瘤活性的关键部位。E环的结构对抗肿瘤活性非常重要，其改造和修饰也很丰富，主要是围绕20位内酯环和羟基。而天然喜树碱的内酯环是不稳定的，因为20位羟基会与酯羰基形成分子内氢键，加速喜树碱E环内酯环开环。对羟基的改造主要是使其形成酯键，因其空间位阻的作用或基团对电子排布的影响，减弱了分子内氢键的影响，提高酯键的稳定性。

肿瘤病人重复服用喜树碱衍生物能导致产生耐药性，这也影响其有效性。因此，有必要开发喜树碱类药物的前体药物，以克服这些喜树碱类药物缺点。现在已经有许多高分子修饰的喜树碱前体药物的报道，有的已进入临床试验。如聚乙二醇，右旋糖酐，甘氨酸类等，这类化学修饰都能有效的提高喜树碱内酯的稳定性和水溶性，从而增加其抗肿瘤活性，减少毒副作用。更具备缓控释及肿瘤靶向功能。

近期，腺病毒载体(Adenovirusvector，Ad)作为新型纳米材料在生物材料和医药领域快速地发展，主要是因为Ad载体衣壳蛋白有良好的结构特征，适于被改造为‘smart’nanodevices，不仅仅携带目的基因还能作为药物，抗体，多肽和影像造影剂等多种大分子的载体。Ad纳米级的衣壳蛋白表面可作为释药系统，几乎适于携带任何一种治疗药物或是影像造影剂，例如无机分子，生物和放射性化合物，并可以靶向治疗位点。许多研究已证明用配体修饰Ad衣壳蛋白可改变Ad的趋向性，提高靶向性。

腺病毒是一种无被膜的二十面体的病毒，约有50余种血清型，目前的研究比较集中在血清型2和血清型5上。Ad衣壳蛋白上拥有～1800个自由赖氨酸，主要分布在五邻体，六邻体和纤维蛋白上。这些自由的赖氨酸为共价偶联一些大分提供了许多活性位点，如聚合物，多糖，生物素，荧光基团，金属纳米颗粒和量子点等。与用基因工程修饰Ad衣壳蛋白，化学修饰方法更加简单易行，效果显著，不仅可改变Ad载体的趋向性，还可改变其理化性质和代谢动力学如粒径，ζ-电位的改变以及在血液中的清除率。因此，采用化学法修饰Ad，其理化性质和代谢动力学的改变是评价新载体性能的两个重要方面。

有研究发现，将喜树碱类药物与腺病毒载体的混合使用会增加腺病毒对癌细胞的杀伤作用，将羟基喜树与腺病毒介导的HSV-TK基因系统碱混合使用后发现这种方法能增强自杀基因系统对人膀胱癌的杀伤作用，能够良好地诱导人膀胱癌细胞的凋亡杀伤作用。也有研究也发现将复制缺陷型腺病毒介导的bcl-Xs与羟基喜树碱联合使用后会对卵巢癌细胞产生协同作用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种能提高对肿瘤杀伤力的10-羟基喜树碱-丁二酸与腺病毒的结合物及其制备方法和用途。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种10-羟基喜树碱-丁二酸与腺病毒的结合物，该结合物为HCPT-SA-Ad，HCPT是10-羟基喜树碱，SA是丁二酸；Ad是腺病毒；10-羟基喜树碱与丁二酸通过酯键相连接，丁二酸与腺病毒通过酰胺键连接；

所述10-羟基喜树碱的结构式为：

作为本发明的10-羟基喜树碱-丁二酸与腺病毒的结合物的改进：腺病毒为C亚型血清型腺病毒，C亚型血清型腺病毒为Ad₂型血清型腺病毒或者为Ad₅型血清型腺病毒。

作为本发明的10-羟基喜树碱-丁二酸与腺病毒的结合物的进一步改进：

该结合物的结构式为：

备注说明：Ad₂型、Ad₅型是指不同血清型的腺病毒，它们的不同只是在纤毛结构的不同，在宏观来看没什么区别。

作为本发明的10-羟基喜树碱-丁二酸与腺病毒的结合物的进一步改进：10-羟基喜树碱是10位羟基取代。

本发明还同时提供了上述10-羟基喜树碱-丁二酸与腺病毒的结合物的制备方法：

利用10-羟基喜树碱与丁二酸酐在无水吡啶中通过4-二甲氨基吡啶(DMAP)催化，使10-羟基喜树碱上的羟基与丁二酸酐的羧基反应，生成HCPT-SA；HCPT-SA和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDAC)在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中通过N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)进行反应，然后加入腺病毒进行暗反应；从而使HCPT-SA上的羧基与腺病毒衣壳蛋白的氨基反应构成10-羟基喜树碱-丁二酸与腺病毒的结合物。

作为本发明的10-羟基喜树碱-丁二酸与腺病毒的结合物的制备方法的进一步改进，包括以下步骤：

1)、HCPT-SA(10-羟基喜树碱-丁二酸酐)的合成

10-羟基喜树碱溶解于无水吡啶后，加入4-二甲氨基吡啶(DMAP)和丁二酸酐，55～65℃搅拌70～74h；所述10-羟基喜树碱：4-二甲氨基吡啶：丁二酸酐的摩尔比为1:2～2.5:9～11；

反应所得产物经浓缩、纯化处理，得HCPT-SA；

一般而言，每0.247mmol的10-羟基喜树碱配用15～25ml的无水吡啶；

2)、HCPT-SA-AdTRAIL(10-羟基喜树碱-丁二酸-腺病毒)的制备

HCPT-SA溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDAC)在室温(10～25℃)下反应3.5～4.5小时；所述HCPT-SA：N-羟基琥珀酰亚胺：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1:1.5～2:0.9～1.1；

一般而言，每0.027mmolHCPT-SA配用400～600μL的DMF；

在所得的反应后溶液中加入含2×10¹⁰pfu的AdTRAIL的PBS(10mM，pH7.4)溶液，HCPT-SA:AdTRAIL的摩尔比为10⁹:1pmol；于3～5℃搅拌暗反应11～13小时；反应结束后，离心，所得上清液经纯化(SephadexG-25)，得HCPT-SA-AdTRAIL。HCPT-SA-AdTRAIL的结构式如下：

本发明还同时提供了上述10-羟基喜树碱-丁二酸与腺病毒的结合物的用途，为在制备用于抗肿瘤的药物中的应用。

为了提高喜树碱类药物的溶解度和靶向性，增加腺病毒对肿瘤的杀伤作用，本发明中将喜树碱类药物(10-羟基喜树碱)通过丁二酸与腺病毒衣壳蛋白以共价键结合，构成10-羟基喜树碱-丁二酸与腺病毒(HCPT-SA-Ad)的结合物。

本发明的原理是：利用喜树碱类药物分子与丁二酸酐在无水吡啶中通过4-二甲氨基吡啶(DMAP)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDAC)催化，使喜树碱类药物分子上的羟基与丁二酸酐的羧基反应，生成有一个有丁二酸酐裸露羧基的复合物分子喜树碱类药物-丁二酸(HCPT-SA)分子式；将HCPT-SA与腺病毒在EDAC和NHS的催化下反应使HCPT-SA上的羧基与腺病毒衣壳蛋白的氨基反应构成喜树碱类药物-丁二酸-腺病毒结合物。

本发明通过紫外分光光度计在喜树碱类药物的特征吸收峰确定喜树碱类药物与腺病毒的结合数；通过HCPT-SA与Ad的结合物对结肠癌细胞SW480抑制率的测定确定该结合物对肿瘤细胞杀伤作用；其中本发明实施例中所用的腺病毒是复制缺陷性腺病毒AdTRAIL，该腺病毒可以在肿瘤细胞中表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)，从而增强对肿瘤细胞的杀伤效果。

本发明的有益效果是，本发明的结合物与10-羟基喜树碱和天然腺病毒相比较，其杀伤作用明显提高，由于减少了10-羟基喜树碱的用量，因此能降低10-羟基喜树碱对正常细胞的毒副作用。

本发明的HCPT-SA-Ad的实际使用方法和用量为：使用方法为静脉注射，用量1～3mg。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为10-羟基喜树碱、腺病毒(Ad)、10-羟基喜树碱-丁二酸-腺病毒(HCPT-SA-Ad)的MTT法测定结果图。

具体如下：MTT法分别测定10-羟基喜树碱(HCPT)浓度为0.1μg/ml，0.05μg/ml，0.025μg/ml，0.0125μg/ml，0.00625μg/ml；腺病毒(Ad)在m.o.i.值为160，80，40，20，10；HCPT与Ad的混合物中HCPT的浓度为0.1μg/ml，0.05μg/ml，0.025μg/ml，0.0125μg/ml，0.00625μg/ml，Ad的m.o.i.值为160，80，40，20，10；HCPT-SA-Ad在m.o.i.值为160，80，40，20，10；其对应的喜树碱的含量为0.01μg/ml，0.005μg/ml，0.0025μg/ml，0.00125μg/ml，0.000625μg/ml时对结肠癌细胞SW480的抑制率。

结果表明经过喜树碱修饰的腺病毒对结肠癌的杀伤作用明显增加，在相同的杀伤作用下，修饰后的腺病毒所结合的喜树碱约是游离喜树碱的1/10倍，大大减少喜树碱的用量，进而可以预料其副作用也会减少。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施的，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，所涉及的材料不受本说明的方案限制。

实施例1、10-羟基喜树碱-丁二酸酐的合成

10-羟基喜树碱(200mg，0.247mmol)溶解于无水吡啶(20ml)后，加入DMAP(4-二甲氨基吡啶，123.6mg，0.594mmol)和丁二酸酐(1180mg，2.47mmol)，60℃搅拌72h。反应所得产物冷却至室温后用20ml甲苯稀释，然后旋转真空蒸干(条件：0.1Mpa，50℃)，重复一次(即，重复上述用甲苯稀释和旋转真空蒸干)。再加50ml氯仿于旋转瓶，并用20ml2％(质量浓度)稀盐酸和20ml饱和NaCl溶液洗涤有机相，重复一次(即，重复用20ml2％稀盐酸和20ml饱和NaCl溶液洗涤有机相)；有机相用无水MgSO4干燥，抽滤，用旋转蒸发仪浓缩至恒重，得浓缩物(即HCPT-SA的粗提物)0.901g。

硅胶层析柱纯化样品湿法装柱、干法上样；具体为：

1)干法制备样品

在上述所得的HCPT-SA的粗提物中加入2ml甲醇以溶解该粗提物，以1:1质量比的加入柱层析用(100-200目)硅胶(即，硅胶的用量为0.901g)，充分混匀，用旋转蒸发仪蒸干。

2)湿法装柱

称取8g柱层析用(100-200目)硅胶加入一倍体积(约4ml)氯仿搅拌，1.5cm直径的柱子下端先塞有脱脂棉，柱子先加1/3柱体积的氯仿，打开下端阀门，一次装成硅胶，用泵继续加氯仿以压实硅胶。

3)上样

装好的硅胶柱留约0.5cm的氯仿溶液，缓慢加入样品粉末(保持样品表面一直有氯仿)，待样品完全沉降后，继续加入氯仿使溶液层高于硅胶层约5cm，使用流动相梯度甲醇/氯仿(甲醇体积浓度0-5％，100min；甲醇体积浓度5％-7％，50min；甲醇体积浓度7％，50min；甲醇体积浓度7％-8％，50min；流速1ml/min)纯化样品，同时检测流动相在375nm处吸收值的变化，收集每个吸收峰并抽真空干燥样品。用薄层层析法检测各个峰的样品的比移值。

375nm处有吸收值的洗脱液进行收集，用20ml甲醇进行重结晶，得到284mg淡黄色粉末，产率97.7％。该淡黄色粉末为HCPT-SA(10-羟基喜树碱-丁二酸酐)，经核磁共振与质谱检测。

1H-NMR(DMSO-d6)d：0.92(3H,t,J＝7.3Hz,C19-H),2.15(2H,t,J＝7.4Hz,C23-H),2.42(2H,t,J＝7.4Hz,C24-H,),2.50-2.51-(2H,m,C18-H),5.23(2H,s,C5-H),5.41(2H,s,C17-H),7.13(1H,s,C14-H),8.01-8.04(2H,dd,J＝8.1Hz,J＝8.4Hz,C9-H,C12-H),8.44(1H,s,C7-H),12.14(1H,brs,-COOH).

MS:m/z449(M+H)+：564。

实施例2HCPT-SA-AdTRAIL的制备

HCPT-SA(15mg，0.027mmol)溶于DMF(N，N-二甲基甲酰胺，500μL)，加入NHS(N-羟基琥珀酰亚胺，4.6mg，0.05mmol)和EDAC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，4.8mg，0.027mmol)在室温(10～25℃)下反应4小时。将反应后溶液加入到约2mL的含2×10¹⁰pfu的AdTRAIL的PBS(10mM，pH7.4)溶液中(摩尔比为HCPT-SA:AdTRAIL＝10⁹:1pmol)，在4℃下，搅拌暗反应12小时。反应结束后，离心(5000rpm,30min)，取上清液，将上清液经SephadexG-25纯化。纯化的具体内容为：以SephadexG-25凝胶层析，缓冲溶液为PBS(10mM，pH8.0)，流速为1ml/min，用5个柱体积的PBS溶液平衡层析柱后，上样后，继续加入PBS，保持流速为1ml/min，以260nm和375nm波长紫外光检测所得产物，根据凝胶过滤层析的原理去除没有共价偶联的HCPT-SA的分子(去除260nm处没有吸收值的纯化后产物，因为260nm是用来检测腺病毒，375nm检测HCPT)，得到纯化的HCPT-SA-AdTRAIL(10-羟基喜树碱-丁二酸-腺病毒)约2ml。-20℃储存备用。

备注说明：AdTRAIL为Ad₅型血清型腺病毒。

实施例3HCPT与AdTRAIL衣壳蛋白的共价结合分子数的测定

制作HCPT单体的标准吸收曲线，通过计算未反应HCPT回收率方法来确定HCPT与AdTRAIL衣壳蛋白上氨基的共价结合分子数(n＝4)，未结合的HCPT分子数根据回归方程的标准曲线来计算。在以上实验中，用甲醇作为空白。HCPT反应量依据其在375nm的紫外吸收值来计算。依据HCPT在375nm(甲醇溶液)紫外吸收值所建立的标准曲线回归方程：Y(OD)＝112.02X(μg/mL)-1.2959(R²＝0.9994)，其线性范围在0.0018～15.18μg/mL，计算洗脱液中HCPT含量。用最初参加反应HCPT的量减去纯化过柱洗脱液中HCPT含量，得到HCPT与AdTRAIL共价偶联的量，将其转化摩尔数，根据阿伏伽德罗常数(6.02×10²³)转化成与AdTRAIL衣壳蛋白氨基共价偶联的分子数。计算得到HCPT-SA与AdTRAIL共价偶联的分子数是499±25,(n＝5)。

实施例4HCPT-SA-AdTRAIL对结肠癌细胞SW480抑制率的检测

HCPT-SA-AdTRAIL的细胞生存率即MTT实验，选用的靶细胞为SW480。具体的步骤如下，将96孔板的每个孔中加入200μL用DMEM培养基培养的结肠癌细胞SW480(5.0×10³cells/well)，并在37℃，二氧化碳浓度为5％，并加湿空气环境下进行孵育48h后，分别将10-羟基喜树碱(HCPT)、腺病毒(AdTRAIL)、HCPT与AdTRAIL的混合物和10-羟基喜树碱-丁二酸酐-腺病毒加入到96孔板的上述细胞中，其中10-羟基喜树碱(HCPT)浓度为0.1μg/ml，0.05μg/ml，0.025μg/ml，0.0125μg/ml，0.00625μg/ml；腺病毒(AdTRAIL)m.o.i.值为160，80，40，20，10；HCPT与AdTRAIL的混合物，其中HCPT的浓度为0.1μg/ml，0.05μg/ml，0.025μg/ml，0.0125μg/ml，0.00625μg/ml，Ad的m.o.i.值为160，80，40，20，10；10-羟基喜树碱-丁二酸酐-腺病毒(HCPT-SA-AdTRAIL)m.o.i.值为160，80，40，20，10(其对应的喜树碱的含量为0.01μg/ml，0.005μg/ml，0.0025μg/ml，0.00125μg/ml，0.000625μg/ml)。每个m.o.i值和HCPT浓度重复6孔，并设有空白组和对照组。所述空白组为未加入任何药物或病毒处理的细胞，对照组为只加入10-羟基喜树碱(HCPT)或腺病毒(AdTRAIL)处理的细胞，实验组为加入10-羟基喜树碱-丁二酸酐-腺病毒处理的细胞。

感染48小时天后，用PBS,pH7.0小心洗3次，并将所用孔中的培养基用180μL新鲜DMEM和20μL的MTT溶液(5mg/mL)替换，并继续培养4h(培养条件同上述孵育条件)。最后，将所有孔中的培养基倒出，每孔加入150μL的DMSO，并室温下轻轻振摇。每个孔中的溶液在570nm处的吸光值可用酶标仪进行测定。各个组的细胞相对存活率(实验组相对空白组)可通过如下公式进行计算得到：ViableRate(％)＝(ODtreated/ODcontrol)×100％。其中ODtreated表示加入药物或腺病毒的实验组样品吸光值，而ODcontrol表示空白组(未加入药物或腺病毒)的吸光值。结果表明经过喜树碱修饰的腺病毒(即本发明的HCPT-SA-AdTRAIL)对结肠癌细胞的杀伤作用明显增加，在相同的杀伤作用下，修饰后的腺病毒所结合的喜树碱(即本发明的的HCPT-SA-AdTRAIL)的用量是单纯喜树碱用量的1/10倍，从而大大减少了喜树碱的用量，进而可以预料其副作用也会减少。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.10-羟基喜树碱-丁二酸与腺病毒的结合物，其特征是：该结合物的结构式为：