CN111467500B - 一种低氧双靶向性agt抑制剂偶联物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药物制备领域,尤其涉及一种低氧双靶向性AGT抑制剂偶联物及其制备方法与应用。所述低氧双靶向性AGT抑制剂偶联物包括:经由低氧响应性基团相互偶联的AGT抑制剂和与肿瘤细胞表面过表达的CD44受体特异性结合的亲水性高分子材料。本发明的两亲性的低氧双靶向性AGT抑制剂偶联物可通过自组装形成纳米载体,用于包载抗肿瘤药物并将其靶向性递送至肿瘤区域,在低氧环境中释放药物,从而发挥靶向抗肿瘤作用,同时具有抗耐药性和良好的水溶性。
Description
技术领域
本发明涉及药物制备领域,尤其涉及一种低氧双靶向性AGT抑制剂偶联物及其制备方法与应用。
背景技术
O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(AGT)是一类存在于细胞中的DNA损伤修复蛋白,通过将鸟嘌呤O6位上的烷基基团转移到自身第145位半胱氨酸残基上,进而对受损DNA进行修复。然而,在肿瘤治疗过程中,AGT会修复抗癌烷化剂造成的肿瘤细胞DNA损伤,这种修复作用最终导致肿瘤细胞对抗癌烷化剂产生耐药性,使得化疗效果大大降低。为了克服AGT介导的耐药性,将其AGT抑制剂与抗癌烷化剂联合使用,通过AGT抑制剂消耗肿瘤细胞中过表达的AGT,从而提高肿瘤细胞对抗癌烷化剂的敏感性,增强治疗效果。O6-苄基鸟嘌呤(O6-BG)是第一个进入临床使用的AGT抑制剂,可将其自身的苄基转移到AGT活性中心Cys145残基上生成结构稳定的S-苄基半胱氨酸,从而失活AGT,提高肿瘤细胞对抗癌烷化剂的敏感性。
研究表明,将O6-BG与氯乙基亚硝基脲(CENUs)、替莫唑胺或顺铂等抗癌烷化剂联合用药,能够显著提高抗癌烷化剂对肿瘤细胞的敏感性,改善肿瘤治疗效果。然而,作为AGT抑制剂,O6-BG类化合物的水溶性都较差、活性较低,尤其是这些化合物在抑制肿瘤细胞AGT的同时也会抑制正常细胞的AGT,导致正常细胞对烷化剂的敏感性增强,进而使得化疗药物的毒副作用大大增加。另外,CENUs等抗癌烷化剂本身也存在水溶性差、稳定性差及非靶向性等问题。因此,CENUs等抗癌烷化剂的临床使用受到了很大的限制。
目前虽有研究将O6-BG或其衍生物与CENUs缀合成一个分子,以避免联合用药可能引起的配伍问题,但是这些联合分子仍然没能改善药物的水溶性差、稳定性差等不足。因此,开发理化性质稳定、靶向性强的药物对改善肿瘤治疗现状具有重要意义。
专利文献CN110591076A公开了一种低氧靶向性AGT抑制剂偶联物,包括经由低氧响应基团相互偶联的AGT抑制剂和亲水性高分子材料;但上述偶联物由于仅是单独靶向于低氧环境,所以对于肿瘤组织中的非低氧区域不能发挥靶向作用,尤其是对于处于低氧环境下的非肿瘤组织或细胞可能存在较大的毒副作用。
有鉴于此,特提出本发明。
发明内容
针对现有技术存在的不足,本发明第一目的为提供一种低氧双靶向性AGT抑制剂偶联物。
本发明提供的低氧双靶向性AGT抑制剂偶联物,包括:经由低氧响应性基团相互偶联的AGT抑制剂和与肿瘤细胞表面过表达的CD44受体特异性结合的亲水性高分子材料。
AGT抑制剂能够阻断AGT介导的肿瘤耐药性,将其与低氧响应性基团和亲水性高分子配体结合生成具有两亲性的低氧-CD44受体双靶向性AGT抑制剂偶联物。该偶联物可通过自组装形成纳米材料,用于包载药物并将其靶向递送至肿瘤低氧组织中,从而发挥双靶向抗肿瘤作用,具有良好的抗耐药性、良好的水溶性和生物相容性。
作为优选,所述AGT抑制剂为疏水性。
作为优选,所述低氧响应性基团为偶氮苯衍生物,其在肿瘤低氧区域能发生偶氮键的断裂。
作为优选,所述AGT抑制剂为O6-苄基鸟嘌呤或其衍生物;进一步地,所述AGT抑制剂为O6-(3-取代)苄基鸟嘌呤。
作为优选,所述亲水性高分子材料为透明质酸、O-羧甲基壳聚糖或聚丙烯酸;
本发明中,所述亲水性高分子材料为透明质酸,其能与肿瘤细胞表面过表达的CD44受体特异性结合,且有良好的生物相容性,能进一步提高递送的精准性、增强治疗的靶向性,降低毒副作用。
作为优选,所述偶联物具有通式(I)所示结构:
其中,R为H、CH3、CH2CH2NH2、CH2COOCH2CH3、CH2CONH2中的一种;X为O或NH;n1为1-10的整数;
n2与n3的总和为透明质酸的聚合度,所述透明质酸的分子量为3000~150000Da;
作为上述技术方案的优选,所述透明质酸的分子量为4000~100000Da,该分子量的透明质酸可诱导引发受体介导的细胞内吞作;更优选地,所述透明质酸的分子量为4000Da或5000Da或10000Da或12000Da或100000Da。
此时,所述偶联物包括低氧响应性基团偶氮苯衍生物(AZO)、疏水性O6-BG类似物(BG)和与CD44受体特异性结合的亲水性透明质酸(HA),形成两亲性的低氧和CD44受体双靶向性偶联物HA-AZO-BG。
作为优选,当R为H时,所述偶联物的抗耐药性较好。
进一步优选地,当R为H,X为NH时,所述偶联物的抗耐药性和生物安全性更好。
再进一步优选地,当R为H,X为NH,n1为10时,所述偶联物的抗耐药性、生物安全性和肿瘤靶向性进一步提升。
更进一步优选地,当R为H,X为NH,n1为10,且所述透明质酸的分子量为5000Da时,所述偶联物的低氧和CD44受体双靶向性和抗耐药性更进一步提升。
本发明第二个目的为提供上述偶联物的制备方法,由低氧响应性基团、AGT抑制剂和亲水性高分子材料通过酰胺化反应制得,制备步骤简单,成本低。
作为优选,当所述偶联物具有通式(I)所示结构且R为H时,其制备方法包括以下步骤:
(1)将3-氨基苯甲醇与取代苯反应生成(3-((4-取代苯基)二氮烯基)苯基)甲醇(a);
(2)将2-氨基-6-氯嘌呤与1-甲基吡咯烷反应生成1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基)-1-甲基吡咯烷-1-鎓氯化物(b);
(3)将所述(3-((4-取代苯基)二氮烯基)苯基)甲醇(a)与所述1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基)-1-甲基吡咯烷-1-鎓氯化物(b)反应生成6-((3-((4-取代苯基)二氮烯基)苄基)氧基)-9H-嘌呤-2-胺(c);
(4)将氨基取代正烷基羧酸与透明质酸反应生成烷基化透明质酸(d);
(5)将所述6-((3-((4-取代苯基)二氮烯基)苄基)氧基)-9H-嘌呤-2-胺(c)与所述烷基化透明质酸(d)反应生成偶氮苯类O6-苄基鸟嘌呤-透明质酸偶联物(e)。
上述制备方法的合成线路如下:
进一步地,上述制备方法具体包括以下步骤:
(1)(3-((4-取代苯基)二氮烯基)苯基)甲醇(a)的合成
将3-氨基苯甲醇溶于去离子水中,在冰浴条件下依次加入浓盐酸、亚硝酸钠溶液、取代苯和乙酸钠溶液,搅拌反应,反应结束后萃取,减压旋蒸,经柱色谱纯化,即得(3-((4-取代苯基)二氮烯基)苯基)甲醇(a);
(2)1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基)-1-甲基吡咯烷-1-鎓氯化物(b)的合成
将2-氨基-6-氯嘌呤溶于有机溶剂,加入1-甲基吡咯烷搅拌反应,无原料点后终止反应,静置至完全沉淀,过滤并将收集到的固体洗涤,真空干燥,即得1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基)-1-甲基吡咯烷-1-鎓氯化物(b);
(3)6-((3-((4-取代苯基)二氮烯基)苄基)氧基)-9H-嘌呤-2-胺(c)的合成
将步骤(1)所得(3-((4-取代苯基)二氮烯基)苯基)甲醇溶于有机溶剂中,依次加入催化剂和步骤(2)所得1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基)-1-甲基吡咯烷-1-鎓氯化物(b),惰性气体环境中搅拌反应,反应结束后,萃取,减压旋蒸,经柱色谱纯化,即得6-((3-((4-取代苯基)二氮烯基)苄基)氧基)-9H-嘌呤-2-胺(c);
(4)烷基化透明质酸(d)的合成
将透明质酸溶解于磷酸盐缓冲液(PBS)中,加入催化剂活化,然后加入氨基取代正烷基羧酸,继续搅拌反应,反应结束后,透析,冷冻干燥,即得烷基化透明质酸(d);
(5)偶氮苯类O6-苄基鸟嘌呤-透明质酸偶联物(e)的合成
将步骤(4)所得烷基化透明质酸(d)溶解于去离子水中,加入催化剂活化,然后加入步骤(3)所得6-((3-((4-取代苯基)二氮烯基)苄基)氧基)-9H-嘌呤-2-胺(c)的溶液,继续搅拌反应,反应结束后,透析,冷冻干燥,即得偶氮苯类O6-苄基鸟嘌呤-透明质酸偶联物(e)。
作为上述技术方案的优选,步骤(1)中,3-氨基苯甲醇、浓盐酸、亚硝酸钠和取代苯的投入摩尔比为1:2:1:1,反应温度为0~5℃,反应时间为12h;反应机理为3-氨基苯甲醇在酸性条件下与亚硝酸钠反应生成重氮盐,然后在碱性条件下与取代苯反应生成偶氮苯衍生物;所述酸性条件通过加入浓盐酸实现,所述碱性条件通过加入乙酸钠缓冲溶液实现;所述旋蒸温度为30℃;用柱色谱法对产物进行纯化,优选地柱色谱固定相为硅胶,流动相为二氯甲烷和甲醇,进一步优选二氯甲烷/甲醇(v/v)=50:1~40:1;
步骤(2)中,1-甲基吡咯烷和2-氨基-6-氯嘌呤的投入摩尔比为1:2.5;所述有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺(DMF);反应温度为20-30℃;反应时间为16-20h;所用终止反应试剂为丙酮;
步骤(3)中,所述有机溶剂为DMF;催化剂为叔丁醇钾或氢化钠,进一步优选为氢化钠,同时在反应体系中加入少量4-二甲基氨基吡啶(DMAP)可提高反应产率;步骤(1)中所得产物、步骤(2)中所得产物和氢化钠的投入摩尔比为1:1:3;所述惰性气体为氮气或氩气,进一步优选为氮气;反应时间为4~6h,进一步优选为5h;萃取溶剂为乙酸乙酯和饱和氯化铵溶液;所述旋蒸温度为40℃;柱色谱纯化时所用固定相为硅胶,流动相为二氯甲烷和甲醇,进一步优选二氯甲烷/甲醇(v/v)=50:1~10:1;
步骤(4)中,所述催化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS);透明质酸、EDC、NHS和氨基取代正烷基羧酸的投入摩尔比为1:5:5:10;活化时间为1h;反应时间为24h;反应温度为25℃;透析液为去离子水;透析时间优化为48h;
步骤(5)中,所述催化剂为EDC和NHS;烷基化透明质酸(d)、EDC、NHS和6-((3-((4-取代苯基)二氮烯基)苄基)氧基)-9H-嘌呤-2-胺(c)的投入摩尔比为1:5:5:10;溶解化合物(c)的溶剂为无水乙醇;活化时间为1h;反应时间为24h;反应温度为25℃;透析液为去离子水;透析时间优化为48h。
当偶联物具有通式(I)所示结构且R不为H时,将反应物2-氨基-6-氯嘌呤和氨基取代正烷基羧酸更换为相应的化合物,该制备方法仍然可用。
本发明第三个目的为提供上述偶联物在制备抗肿瘤药物中的应用。
作为优选,所述肿瘤为脑瘤、骨髓瘤、黑色素瘤、肝癌、肺癌、胃癌、白血病、结肠癌、淋巴癌中的一种或多种,优选为脑瘤、黑色素瘤、肝癌、肺癌中的一种或多种。
本发明第四个目的为提供一种抗肿瘤纳米制剂,该纳米制剂由上述偶联物经自组装形成纳米载体包载抗肿瘤烷化剂制得。
所述纳米制剂在纳米颗粒的高渗透长滞留效应以及透明质酸与肿瘤细胞表面CD44受体的特异性结合作用靶向于肿瘤组织,一方面高效完成了抗肿瘤烷化剂的递送任务,另一方面大大降低了由于药物的全身分布而引起的毒副作用,改善了化疗的安全性。在肿瘤低氧环境中,偶氮苯O6-苄基鸟嘌呤-透明质酸偶联物中的偶氮苯结构分解,生成的O6-苄基鸟嘌呤类似物发挥AGT抑制活性,解除了化疗的耐药性;同时,纳米载体降解,所包载的抗肿瘤烷化剂被释放,发挥抗肿瘤作用。另外,该纳米制剂以纳米胶束为载体,提高了抗肿瘤药物的水溶性和稳定性等理化性质。
作为优选,所述抗肿瘤烷化剂为导致DNA烷化损伤的烷化剂;通过使DNA发生烷基化、抑制肿瘤细胞分裂发挥抗肿瘤作用的抗肿瘤药物。
进一步优选为氯乙基亚硝基脲(CENUs)、替莫唑胺、氮烯唑胺中的一种或多种;再进一步优选为氯乙基亚硝基脲(疏水性),如卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)或司莫司汀(Me-CCNU)。
本发明第五个目的为提供上述抗肿瘤纳米制剂的制备方法,包括如下步骤:将所述偶联物和所述抗肿瘤烷化剂溶解于有机溶剂中,用去离子水水合、透析、冻干,即得。
采用溶剂挥发法,利用胶束的两亲性,通过物理作用将难溶于水的药物封装于胶束的疏水内核中。当所述抗肿瘤烷化剂为Me-CCNU时,制备步骤如下:将Me-CCNU溶于有机溶剂中,所述偶联物溶于去离子水中,在搅拌处理下滴加Me-CCNU溶液、搅拌挥干有机溶剂、离心、过滤,将上清液冷冻干燥,即得所述抗肿瘤纳米制剂。
作为上述技术方案的优选,Me-CCNU与偶联物的投入质量比为1:20~1:1,所述有机溶剂为四氢呋喃、甲醇、无水乙醇中的一种或多种,进一步优选为无水乙醇。
本发明的两亲性的低氧双靶向性AGT抑制剂偶联物可通过自组装形成纳米载体,用于包载抗肿瘤药物并将其靶向性递送至肿瘤区域,在低氧环境中释放药物,从而发挥靶向抗肿瘤作用,同时具有抗耐药性和良好的水溶性。
附图说明
图1为本发明实施例5中HA-AZO-BG/Me-CCNU 1的粒径分布和透射电镜形貌图;
图2为本发明实施例6中HA-AZO-BG/Me-CCNU 2的粒径分布和透射电镜形貌图;
图3为本发明实施例7中HA-AZO-BG/Me-CCNU 3的粒径分布和透射电镜形貌图;
图4为本发明实施例8中HA-AZO-BG/Me-CCNU 4的粒径分布和透射电镜形貌图;
图5为实验例1中HA-AZO-BG/Me-CCNU在PBS和含10%血清(FBS)的MEM培养基中的稳定性实验结果;
图6为实验例2中HA-AZO-BG/Me-CCNU的低氧还原敏感性实验结果;
图7为实验例3中HA-AZO-BG对细胞中AGT蛋白的抑制能力实验结果;
图8为实验例4中HA-AZO-BG/Me-CCNU中Me-CCNU的体外释放测试结果;
图9为实验例5中HA-AZO-BG/Me-CCNU的细胞克隆形成实验结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
实施例中所涉及偶联物1、偶联物2、偶联物3和偶联物4的结构如下:
实施例1偶联物1(HA-AZO-BG 1)的制备
(1)(3-((4-氨基苯基)二氮烯基)苯基)甲醇的合成
准确称取3-氨基苯甲醇(1.23g,10mmol)于50mL圆底烧瓶中,加入5mL去离子水使其溶解,冰水浴条件下搅拌,然后滴加1.7mL浓盐酸,再缓慢滴加冷的亚硝酸钠溶液(4mol/L,2.5mL),搅拌反应20min,然后加入(0.91mL,10mmol)苯胺,继续冰浴搅拌15min,再加入乙酸钠溶液(1.8mol/L,10mL),继续冰浴搅拌1h,然后4℃反应12h。反应结束后用二氯甲烷和水萃取,加无水硫酸钠干燥过夜,30℃旋蒸除去溶剂。通过硅胶柱层析法分离纯化,以二氯甲烷和甲醇混合液为洗脱液,采用梯度洗脱(二氯甲烷/甲醇V/V=50:1~40:1),30℃旋蒸除去溶剂,得到黑色固体(3-((4-氨基苯基)二氮烯基)苯基)甲醇(1.86g,8.2mmol),产率82%;
IR(KBr压片)υ/cm-1:3707.9(O-H);3332.6(N-H);2929.3(-CH2-);1604.8(N=N);1526.4(C=C);1113.1(C-O);1099.2(C-N);839.4(=C-H);
1H NMR(400MHz,DMSO)δ:4.55(s,2H,CH2);5.44(s,1H,OH);5.47(s,2H,NH2);7.61-7.99(m,4H,C6H4);6.92-8.25(m,4H,C6H4);
ESI-MS:m/z 228.1131(M+H)+。
(2)1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基)-1-甲基吡咯烷-1-鎓氯化物的合成
称取2-氨基-6-氯嘌呤(2g,11.8mmol)于100mL圆底烧瓶中,加入50mL DMF使其溶解,然后加入1-甲基吡咯烷(3mL,29.5mmol),室温搅拌反应20h后,加入3mL丙酮进行沉淀,过滤收集沉淀,加乙醚洗涤两次得到白色固体1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基)-1-甲基吡咯烷-1-鎓氯化物(1.8g,7.08mmol),产率60%。
IR(KBr压片)υ/cm-1:3447.5(NH);3276.7(NH2);2976.2(C-H);1719.6(C=N);1554.3(C=C);
1H NMR(400MHz,DMSO)δ:2.03(m,2H,CH2);2.23(m,2H,CH2);3.63(s,3H,CH3);3.94(m,2H,CH2N+);4.57(m,2H,CH2N+);7.12(s,2H,NH2);8.30(s,1H,H8);12.98(s,1H,H9);
ESI-MS:m/z 255.1119(M+H)+。
(3)6-((3-((4-氨基苯基)二氮烯基)苄基)氧基)-9H-嘌呤-2-胺的合成
称取所得固体(3-((4-氨基苯基)二氮烯基)苯基)甲醇(227mg,1mmol)于50mL圆底烧瓶中,加入10mL DMF使其溶解,然后依次加入氢化钠(72mg,3mmol)、1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基)-1-甲基吡咯烷-1-鎓氯化物(254mg,1mmol)、DMAP 20mg,氮气保护下25℃搅拌反应5h;加入含100μL冰乙酸的1mL去离子水淬灭;用乙酸乙酯和饱和氯化铵溶液萃取,加入无水硫酸钠干燥过夜,40℃旋蒸除去溶剂,通过硅胶柱层析法分离纯化,以二氯甲烷和甲醇混合液为洗脱液,采用梯度洗脱(二氯甲烷/甲醇V/V=50:1~10:1),30℃旋蒸除去溶剂,得到黄色固体6-((3-((4-氨基苯基)二氮烯基)苄基)氧基)-9H-嘌呤-2-胺(126mg,0.35mmol),产率35%;
IR(KBr压片)υ/cm-1:3332.5(N-H);2926.3(C-H);1706.1(C=N);1605.9(N=N);1524.3(C=C);1250.6(C-O-C);1098.2(C-N);
1H NMR(400MHz,DMSO)δ:5.30(s,2H,CH2);5.52(s,2H,NH2);6.58(s,2H,NH2);6.98(m,2H,CH);7.67-8.05(m,4H,C6H4);8.30(m,2H,CH);8.73(s,1H,CH);13.93(s,1H,NH);
ESI-MS:m/z 361.1522(M+H)+。
(4)6-氨基己酸-透明质酸偶联物的合成
称取透明质酸(~5000Da)200mg,EDC(38mg,0.2mmol)、NHS(23mg,0.2mmol)置于100mL圆底烧瓶中,加入20mL PBS,搅拌至完全溶解,室温反应1h活化,向圆底烧瓶中加入6-氨基己酸(52mg,0.4mmol),继续反应24h,反应结束后,将反应液置于透析袋(MW 3000Da)中,用去离子水透析48h,收集透析后的液体,冷冻干燥即得偶氮苯类6-氨基己酸-透明质酸偶联物(64mg,12.8μmol),产率32%;
IR(KBr压片)υ/cm-1:3420.2(O-H);2927.7(C-H);1152.6(C-O-C);1737.4(COOH);1645.4(CONH);1078.1、1045.2(C-O);
1H NMR(400MHz,DMSO)δ:1.14-2.85(d,14H,CH);1.11-3.57(m,6H,CH2);2.21(t,2H,CH2);3.18(t,2H,CH2);1.11-1.99(s,6H,CH3);3.65-4.32(m,9H,CH);3.99(s,2H,OH);4.59(s,6H,OH);3.57(s,4H,CH2);8.09(s,1H,NH);8.17(s,2H,NH);10.68(s,1H,OH);11.87(s,1H,OH);6.02(s,1H,CH);
(5)偶氮苯类O6-苄基鸟嘌呤-透明质酸偶联物1(HA-AZO-BG 1)的合成
称取6-氨基己酸-透明质酸偶联物200mg,EDC(38mg,0.2mmol)、NHS(23mg,0.2mmol)置于100mL圆底烧瓶中,加入20mL PBS,搅拌至完全溶解,室温反应1h活化,向圆底烧瓶中加入6-((3-((4-氨基苯基)二氮烯基)苄基)氧基)-9H-嘌呤-2-胺(144mg,0.4mmol),继续反应24h,反应结束后,向反应液中加入500mL无水乙醇,4000rpm低温离心10min,将沉淀用去离子水复溶,经0.45μm混合纤维素滤膜过滤,将滤液冷冻干燥即得偶氮苯类O6-苄基鸟嘌呤-透明质酸偶联物1(53mg,10μmol),产率26.7%。
IR(KBr压片)υ/cm-1:3420.2(O-H);3332.5(N-H);2927.7(C-H);1152.6(C-O-C);1737.4(COOH);1706.1(C=N);1645.4(CONH);1605.9(N=N);1524.3(C=C);1098.2(C-N);1065.2(C-O);
1H NMR(400MHz,DMSO)δ:1.14-2.85(d,14H,CH);1.11-3.57(t,14H,CH2);1.11-1.99(s,6H,CH3);3.65-4.32(m,9H,CH);3.99(s,2H,OH);4.59(s,6H,OH);5.19(s,2H,CH2);8.09(s,1H,NH);8.17(s,2H,NH);10.68(s,1H,OH);6.41(s,2H,NH2);7.67-8.05(m,4H,C6H4);6.02-8.57(s,6H,CH);10.38(s,1H,NH);13.93(s,1H,NH)。
实施例2偶联物2(HA-AZO-BG 2)的制备
(1)(3-((4-羟基苯基)二氮烯基)苯基)甲醇的合成
准确称取3-氨基苯甲醇(1.23g,10mmol)于50mL圆底烧瓶中,加入5mL去离子水使其溶解,冰水浴条件下搅拌,然后滴加1.7mL浓盐酸,再缓慢滴加冷的亚硝酸钠溶液(4mol/L,2.5mL),搅拌反应20min,然后加入(0.88mL,10mmol)苯酚,继续冰浴搅拌15min,再加入乙酸钠溶液(1.8mol/L,10mL),继续冰浴搅拌1h,然后4℃反应12h;反应结束后用二氯甲烷和水萃取,加无水硫酸钠干燥过夜,30℃旋蒸除去溶剂。通过硅胶柱层析法分离纯化,以二氯甲烷和甲醇混合液为洗脱液,采用梯度洗脱(二氯甲烷/甲醇V/V=50:1~40:1),30℃旋蒸除去溶剂,得到黑色固体(3-((4-羟基苯基)二氮烯基)苯基)甲醇(1.96g,8.6mmol),产率86%;
IR(KBr压片)υ/cm-1:3703.5(O-H);3612.1(O-H);2926.7(-CH2-);1602.9(N=N);1510.3(C=C);1145.7(C-O);1017.5(C-N);840.2(=C-H);
1H NMR(400MHz,DMSO)δ:4.77(s,2H,CH2);5.40(s,1H,OH);7.03(m,2H,CH);7.89(m,2H,CH);7.66-7.98(m,4H,C6H4);9.50(s,1H,OH);
ESI-MS:m/z 229.0973(M+H)+。
(2)1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基)-1-甲基吡咯烷-1-鎓氯化物的合成
称取2-氨基-6-氯嘌呤(2g,11.8mmol)于100mL圆底烧瓶中,加入50mL DMF使其溶解,然后加入1-甲基吡咯烷(3mL,29.5mmol),室温搅拌反应20h后,加入3mL丙酮进行沉淀,过滤收集沉淀,加乙醚洗涤两次得到白色固体1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基)-1-甲基吡咯烷-1-鎓氯化物(1.8g,7.08mmol),产率60%;
IR(KBr压片)υ/cm-1:3447.5(NH);3276.7(NH2);2976.2(C-H);1719.6(C=N);1554.3(C=C);
1H NMR(400MHz,DMSO)δ:2.03(m,2H,CH2);2.23(m,2H,CH2);3.63(s,3H,CH3);3.94(m,2H,CH2N+);4.57(m,2H,CH2N+);7.12(s,2H,NH2);8.30(s,1H,H8);12.98(s,1H,H9);
ESI-MS:m/z 255.1119(M+H)+。
(3)6-((3-((4-羟基苯基)二氮烯基)苄基)氧基)-9H-嘌呤-2-胺的合成
称取所得固体(3-((4-羟基苯基)二氮烯基)苯基)甲醇(228mg,1mmol)于50mL圆底烧瓶中,加入10mL DMF使其溶解,然后依次加入氢化钠(72mg,3mmol)、1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基)-1-甲基吡咯烷-1-鎓氯化物(254mg,1mmol)、DMAP 20mg,氮气保护下25℃搅拌反应5h。加入含100μL冰乙酸的1mL去离子水淬灭。用乙酸乙酯和饱和氯化铵溶液萃取,加入无水硫酸钠干燥过夜,40℃旋蒸除去溶剂,通过硅胶柱层析法分离纯化,以二氯甲烷和甲醇混合液为洗脱液,采用梯度洗脱(二氯甲烷/甲醇V/V=50:1~10:1),30℃旋蒸除去溶剂,得到黄色固体6-((3-((4-羟基苯基)二氮烯基)苄基)氧基)-9H-嘌呤-2-胺(119mg,0.33mmol),产率33%;
IR(KBr压片)υ/cm-1:3612.1(O-H);3448.5(N-H);2926.3(C-H);1706.1(C=N);1605.9(N=N);1524.3(C=C);1250.6(C-O-C);1098.2(C-N);
1H NMR(400MHz,DMSO)δ:5.37(s,2H,CH2);6.57(s,2H,NH2);7.11(m,2H,CH);7.89(m,2H,CH);7.69-8.02(m,4H,C6H4);8.73(s,1H,CH);9.53(s,1H,OH);13.69(s,1H,NH);
ESI-MS:m/z 362.1362(M+H)+。
(4)6-氨基己酸-透明质酸偶联物的合成
称取透明质酸(~5000Da)200mg,EDC(38mg,0.2mmol)、NHS(23mg,0.2mmol)置于100mL圆底烧瓶中,加入20mL PBS,搅拌至完全溶解,室温反应1h活化,向圆底烧瓶中加入6-氨基己酸(52mg,0.4mmol),继续反应24h,反应结束后,将反应液置于透析袋(MW 3000Da)中,用去离子水透析48h,收集透析后的液体,冷冻干燥即得偶氮苯类6-氨基己酸-透明质酸偶联物(59mg,11μmol),产率29.3%;
IR(KBr压片)υ/cm-1:3420.2(O-H);2927.7(C-H);1152.6(C-O-C);1737.4(COOH);1645.4(CONH);1078.1、1045.2(C-O);
1H NMR(400MHz,DMSO)δ:1.14-2.85(d,14H,CH);1.11-3.57(m,6H,CH2);2.21(t,2H,CH2);3.18(t,2H,CH2);1.11-1.99(s,6H,CH3);3.65-4.32(m,9H,CH);3.99(s,2H,OH);4.59(s,6H,OH);3.57(s,4H,CH2);8.09(s,1H,NH);8.17(s,2H,NH);10.68(s,1H,OH);11.87(s,1H,OH);6.02(s,1H,CH);
(5)偶氮苯类O6-苄基鸟嘌呤-透明质酸偶联物2(HA-AZO-BG 2)的合成
称取6-氨基己酸-透明质酸偶联物200mg,EDC(38mg,0.2mmol)、NHS(23mg,0.2mmol)置于100mL圆底烧瓶中,加入20mL PBS,搅拌至完全溶解,室温反应1h活化,向圆底烧瓶中加入6-((3-((4-羟基苯基)二氮烯基)苄基)氧基)-9H-嘌呤-2-胺(144mg,0.4mmol),继续反应24h,反应结束后,向反应液中加入500mL无水乙醇,4000rpm低温离心10min,将沉淀用去离子水复溶,经0.45μm混合纤维素滤膜过滤,将滤液冷冻干燥即得偶氮苯类O6-苄基鸟嘌呤-透明质酸偶联物2(60mg,12μmol),产率30.4%;
IR(KBr压片)υ/cm-1:3608.8(O-H);2935.1(C-H);1160.5(C-O-C);1759.3(COOH);1710.5(C=N);1729.5(COO);1607.5(N=N);1529.3(C=C);1101.2(C-N);1067.2(C-O);
1H NMR(400MHz,DMSO)δ:1.14-2.85(d,14H,CH);1.11-3.57(t,14H,CH2);1.11-1.99(s,6H,CH3);3.65-4.32(m,9H,CH);3.99(s,2H,OH);4.59(s,6H,OH);5.19(s,2H,CH2);8.09(s,1H,NH);8.17(s,2H,NH);10.68(s,1H,OH);6.41(s,2H,NH2);7.67-8.05(m,4H,C6H4);6.02-8.57(s,6H,CH);13.93(s,1H,NH)。
实施例3偶联物3(HA-AZO-BG 3)的制备
(1)(3-((4-氨基苯基)二氮烯基)苯基)甲醇的合成
准确称取3-氨基苯甲醇(1.23g,10mmol)于50mL圆底烧瓶中,加入5mL去离子水使其溶解,冰水浴条件下搅拌,然后滴加1.7mL浓盐酸,再缓慢滴加冷的亚硝酸钠溶液(4mol/L,2.5mL),搅拌反应20min,然后加入(0.91mL,10mmol)苯胺,继续冰浴搅拌15min,再加入乙酸钠溶液(1.8mol/L,10mL),继续冰浴搅拌1h,然后4℃反应12h。反应结束后用二氯甲烷和水萃取,加无水硫酸钠干燥过夜,30℃旋蒸除去溶剂。通过硅胶柱层析法分离纯化,以二氯甲烷和甲醇混合液为洗脱液,采用梯度洗脱(二氯甲烷/甲醇V/V=50:1~40:1),30℃旋蒸除去溶剂,得到黑色固体(3-((4-氨基苯基)二氮烯基)苯基)甲醇(1.86g,8.2mmol),产率82%;
IR(KBr压片)υ/cm-1:3707.9(O-H);3332.6(N-H);2929.3(-CH2-);1604.8(N=N);1526.4(C=C);1113.1(C-O);1099(C-N);839.4(=C-H);
1H NMR(400MHz,DMSO)δ:4.73(s,2H,CH2);5.44(s,1H,OH);5.47(s,2H,NH2);6.93(m,2H,CH);7.61-7.99(m,4H,C6H4);8.25(m,2H,CH);
ESI-MS:m/z 228.1131(M+H)+。
(2)1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基)-1-甲基吡咯烷-1-鎓氯化物的合成
称取2-氨基-6-氯嘌呤(2g,11.8mmol)于100mL圆底烧瓶中,加入50mL DMF使其溶解,然后加入1-甲基吡咯烷(3mL,29.5mmol),室温搅拌反应20h后,加入3mL丙酮进行沉淀,过滤收集沉淀,加乙醚洗涤两次得到白色固体1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基)-1-甲基吡咯烷-1-鎓氯化物(1.8g,7.08mmol),产率60%;
IR(KBr压片)υ/cm-1:3447.5(NH);3276.7(NH2);2976.2(C-H);1719.6(C=N);1554.3(C=C);
1H NMR(400MHz,DMSO)δ:2.03(m,2H,CH2);2.23(m,2H,CH2);3.63(s,3H,CH3);3.94(m,2H,CH2N+);4.57(m,2H,CH2N+);7.12(s,2H,NH2);8.30(s,1H,H8);12.98(s,1H,H9);
ESI-MS:m/z 255.1119(M+H)+。
(3)6-((3-((4-氨基苯基)二氮烯基)苄基)氧基)-9H-嘌呤-2-胺的合成
称取所得固体(3-((4-氨基苯基)二氮烯基)苯基)甲醇(227mg,1mmol)于50mL圆底烧瓶中,加入10mL DMF使其溶解,然后依次加入氢化钠(72mg,3mmol)、1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基)-1-甲基吡咯烷-1-鎓氯化物(254mg,1mmol)、DMAP 20mg,氮气保护下25℃搅拌反应5h。加入含100μL冰乙酸的1mL去离子水淬灭。用乙酸乙酯和饱和氯化铵溶液萃取,加入无水硫酸钠干燥过夜,40℃旋蒸除去溶剂,通过硅胶柱层析法分离纯化,以二氯甲烷和甲醇混合液为洗脱液,采用梯度洗脱(二氯甲烷/甲醇V/V=50:1~10:1),30℃旋蒸除去溶剂,得到黄色固体6-((3-((4-氨基苯基)二氮烯基)苄基)氧基)-9H-嘌呤-2-胺(126mg,0.35mmol),产率35%;
IR(KBr压片)υ/cm-1:3332.5(N-H);2926.3(C-H);1706.1(C=N);1605.9(N=N);1524.3(C=C);1250.6(C-O-C);1098.2(C-N);
1H NMR(400MHz,DMSO)δ:5.30(s,2H,CH2);5.52(s,2H,NH2);6.58(s,2H,NH2);6.98(m,2H,CH);7.67-8.05(m,4H,C6H4);8.30(m,2H,CH);8.73(s,1H,CH);13.93(s,1H,NH);
ESI-MS:m/z 361.1522(M+H)+。
(4)11-氨基十一酸-透明质酸偶联物的合成
称取透明质酸(~5000Da)200mg,EDC(38mg,0.2mmol)、NHS(23mg,0.2mmol)置于100mL圆底烧瓶中,加入20mL PBS,搅拌至完全溶解,室温反应1h活化,向圆底烧瓶中加入11-氨基十一酸(81mg,0.4mmol),继续反应24h,反应结束后,将反应液置于透析袋(MW3000Da)中,用去离子水透析48h,收集透析后的液体,冷冻干燥即得偶氮苯类11-氨基十一酸-透明质酸偶联物(54mg,11μmol),产率27.1%;
IR(KBr压片)υ/cm-1:3421.2(O-H);2935.4(C-H);1158.6(C-O-C);1735.4(COOH);1650.4(CONH);1078.1、1045.2(C-O);
1H NMR(400MHz,DMSO)δ:1.15-2.87(d,14H,CH);1.09-3.56(m,16H,CH2);2.21(t,2H,CH2);3.18(t,2H,CH2);1.14-1.92(s,6H,CH3);3.51(s,4H,CH2);3.69-4.37(m,9H,CH);3.94(s,2H,OH);4.53(s,6H,OH);8.09(s,1H,NH);8.17(s,2H,NH);10.66(s,1H,OH);11.84(s,1H,OH);6.05(s,1H,CH);
(5)偶氮苯类O6-苄基鸟嘌呤-透明质酸偶联物3(HA-AZO-BG 3)的合成
称取11-氨基十一酸-透明质酸偶联物200mg、EDC(38mg,0.2mmol)、NHS(23mg,0.2mmol)置于100mL圆底烧瓶中,加入20mL PBS,搅拌至完全溶解,室温反应1h活化,向圆底烧瓶中加入6-((3-((4-氨基苯基)二氮烯基)苄基)氧基)-9H-嘌呤-2-胺(144mg,0.4mmol),继续反应24h,反应结束后,向反应液中加入500mL无水乙醇,4000rpm低温离心10min,将沉淀用去离子水复溶,经0.45μm混合纤维素滤膜过滤,将滤液冷冻干燥即得偶氮苯类O6-苄基鸟嘌呤-透明质酸偶联物3(59mg,12μmol),产率29.3%。
IR(KBr压片)υ/cm-1:3426.2(O-H);3333.5(N-H);2929.7(C-H);1157.6(C-O-C);1739.4(COOH);1710.1(C=N);1647.4(CONH);1609.9(N=N);1525.3(C=C);1096.2(C-N);1067.2(C-O);
1H NMR(400MHz,DMSO)δ:1.14-2.85(d,14H,CH);1.11-3.57(t,24H,CH2);1.11-1.99(s,6H,CH3);3.65-4.32(m,9H,CH);3.99(s,2H,OH);4.59(s,6H,OH);5.19(s,2H,CH2);8.09(s,1H,NH);8.17(s,2H,NH);10.68(s,1H,OH);6.41(s,2H,NH2);7.67-8.05(m,4H,C6H4);6.02-8.57(s,6H,CH);10.38(s,1H,NH);13.93(s,1H,NH)。
实施例4偶联物4(HA-AZO-BG 4)的制备
(1)(3-((4-羟基苯基)二氮烯基)苯基)甲醇的合成
准确称取3-氨基苯甲醇(1.23g,10mmol)于50mL圆底烧瓶中,加入5mL去离子水使其溶解,冰水浴条件下搅拌,然后滴加1.7mL浓盐酸,再缓慢滴加冷的亚硝酸钠溶液(4mol/L,2.5mL),搅拌反应20min,然后加入(0.88mL,10mmol)苯酚,继续冰浴搅拌15min,再加入乙酸钠溶液(1.8mol/L,10mL),继续冰浴搅拌1h,然后4℃反应12h。反应结束后用二氯甲烷和水萃取,加无水硫酸钠干燥过夜,30℃旋蒸除去溶剂。通过硅胶柱层析法分离纯化,以二氯甲烷和甲醇混合液为洗脱液,采用梯度洗脱(二氯甲烷/甲醇V/V=50:1~40:1),30℃旋蒸除去溶剂,得到黑色固体(3-((4-羟基苯基)二氮烯基)苯基)甲醇(1.96g,8.6mmol),产率86%;
IR(KBr压片)υ/cm-1:3703.5(OH);3612.1(OH);2926.7(-CH2-);1602.9(N=N);1510.3(C=C);1145.7(C-O);1017.5(C-N);840.2(=C=H);
1H NMR(400MHz,DMSO)δ:4.77(s,2H,CH2);5.40(s,1H,OH);7.03(m,2H,CH);7.89(m,2H,CH);7.66-7.98(m,4H,C6H4);9.50(s,1H,OH);
ESI-MS:m/z 229.0973(M+H)+。
(2)1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基)-1-甲基吡咯烷-1-鎓氯化物的合成
称取2-氨基-6-氯嘌呤(2g,11.8mmol)于100mL圆底烧瓶中,加入50mL DMF使其溶解,然后加入1-甲基吡咯烷(3mL,29.5mmol),室温搅拌反应20h后,加入3mL丙酮进行沉淀,过滤收集沉淀,加乙醚洗涤两次得到白色固体1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基)-1-甲基吡咯烷-1-鎓氯化物(1.8g,7.08mmol),产率60%;
IR(KBr压片)υ/cm-1:3447.5(NH);3276.7(NH2);2976.2(C-H);1719.6(C=N);1554.3(C=C);
1H NMR(400MHz,DMSO)δ:2.03(m,2H,CH2);2.23(m,2H,CH2);3.63(s,3H,CH3);3.94(m,2H,CH2N+);4.57(m,2H,CH2N+);7.12(s,2H,NH2);8.30(s,1H,H8);12.98(s,1H,H9);
ESI-MS:m/z 255.1119(M+H)+。
(3)6-((3-((4-羟基苯基)二氮烯基)苄基)氧基)-9H-嘌呤-2-胺的合成
称取所得固体(3-((4-羟基苯基)二氮烯基)苯基)甲醇(228mg,1mmol)于50mL圆底烧瓶中,加入10mL DMF使其溶解,然后依次加入氢化钠(72mg,3mmol)、1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基)-1-甲基吡咯烷-1-鎓氯化物(254mg,1mmol)、DMAP 20mg,氮气保护下25℃搅拌反应5h。加入含100μL冰乙酸的1mL去离子水淬灭。用乙酸乙酯和饱和氯化铵溶液萃取,加入无水硫酸钠干燥过夜,40℃旋蒸除去溶剂,通过硅胶柱层析法分离纯化,以二氯甲烷和甲醇混合液为洗脱液,采用梯度洗脱(二氯甲烷/甲醇V/V=50:1~10:1),30℃旋蒸除去溶剂,得到黄色固体6-((3-((4-羟基苯基)二氮烯基)苄基)氧基)-9H-嘌呤-2-胺(119mg,0.33mmol),产率33%。
IR(KBr压片)υ/cm-1:3612.1(O-H);3448.5(N-H);2926.3(C-H);1706.1(C=N);1605.9(N=N);1524.3(C=C);1250.6(C-O-C);1098.2(C-N);
1H NMR(400MHz,DMSO)δ:5.37(s,2H,CH2);6.57(s,2H,NH2);7.11(m,2H,CH);7.89(m,2H,CH);7.69-8.02(m,4H,C6H4);8.73(s,1H,CH);9.53(s,1H,OH);13.69(s,1H,NH);
ESI-MS:m/z 362.1362(M+H)+。
(4)11-氨基十一酸-透明质酸偶联物的合成
称取透明质酸(~5000Da)200mg,EDC(38mg,0.2mmol)、NHS(23mg,0.2mmol)置于100mL圆底烧瓶中,加入20mL PBS,搅拌至完全溶解,室温反应1h活化,向圆底烧瓶中加入11-氨基十一酸(81mg,0.4mmol),继续反应24h,反应结束后,将反应液置于透析袋(MW3000Da)中,用去离子水透析48h,收集透析后的液体,冷冻干燥即得偶氮苯类11-氨基十一酸-透明质酸偶联物(68mg,14μmol),产率34.2%。
IR(KBr压片)υ/cm-1:3421.2(O-H);2935.4(C-H);1158.6(C-O-C);1735.4(COOH);1650.4(CONH);1078.1、1045.2(C-O);
1H NMR(400MHz,DMSO)δ:1.15-2.87(d,14H,CH);1.09-3.56(m,16H,CH2);2.21(t,2H,CH2);3.18(t,2H,CH2);1.14-1.92(s,6H,CH3);3.51(s,4H,CH2);3.69-4.37(m,9H,CH);3.94(s,2H,OH);4.53(s,6H,OH);8.09(s,1H,NH);8.17(s,2H,NH);10.66(s,1H,OH);11.84(s,1H,OH);6.05(s,1H,CH);
(5)偶氮苯类O6-苄基鸟嘌呤-透明质酸偶联物4(HA-AZO-BG 4)的合成
称取11-氨基十一酸-透明质酸偶联物200mg,EDC(38mg,0.2mmol)、NHS(23mg,0.2mmol)置于100mL圆底烧瓶中,加入20mL PBS,搅拌至完全溶解,室温反应1h活化,向圆底烧瓶中加入6-((3-((4-羟基苯基)二氮烯基)苄基)氧基)-9H-嘌呤-2-胺(144mg,0.4mmol),继续反应24h,反应结束后,向反应液中加入500mL无水乙醇,4000rpm低温离心10min,将沉淀用去离子水复溶,经0.45μm混合纤维素滤膜过滤,将滤液冷冻干燥即得偶氮苯类O6-苄基鸟嘌呤-透明质酸偶联物4(57mg,11μmol),产率28.5%。
IR(KBr压片)υ/cm-1:3604.8(O-H);2931.1(C-H);1158.5(C-O-C);1756.3(COOH);1714.5(C=N);1727.8(COO);1608.5(N=N);1531.3(C=C);1097.2(C-N);1061.7(C-O);
1H NMR(400MHz,DMSO)δ:1.14-2.85(d,14H,CH);1.11-3.57(t,24H,CH2);1.11-1.99(s,6H,CH3);3.65-4.32(m,9H,CH);3.99(s,2H,OH);4.59(s,6H,OH);5.19(s,2H,CH2);8.09(s,1H,NH);8.17(s,2H,NH);10.68(s,1H,OH);6.41(s,2H,NH2);7.67-8.05(m,4H,C6H4);6.02-8.57(s,6H,CH);13.93(s,1H,NH)。
实施例5抗肿瘤纳米制剂1(HA-AZO-BG/Me-CCNU 1)
称取50mg Me-CCNU溶于2mL无水乙醇中,称取50mg HA-AZO-BG 1溶于2mL去离子水中,向HA-AZO-BG 1溶液中缓慢滴加2mL Me-CCNU溶液,在室温下搅拌24h挥干乙醇。将反应液以4000rpm的转速低温离心10min,上清液经0.45μm混合纤维素滤膜过滤以除去未被封装的Me-CCNU,收集滤液,冷冻干燥即得HA-AZO-BG/Me-CCNU 1。其粒径分布及形貌分析如图1所示。
实施例6抗肿瘤纳米制剂2(HA-AZO-BG/Me-CCNU 2)
称取50mg Me-CCNU溶于2mL无水乙醇中,称取50mg HA-AZO-BG 2溶于2mL去离子水中,向HA-AZO-BG 2溶液中缓慢滴加2mL Me-CCNU溶液,在室温下搅拌24h挥干乙醇,将反应液以4000rpm的转速低温离心10min,上清液经0.45μm混合纤维素滤膜过滤以除去未被封装的Me-CCNU,收集滤液,冷冻干燥即得HA-AZO-BG/Me-CCNU 2。其粒径分布及形貌分析如图2所示。
实施例7抗肿瘤纳米制剂3(HA-AZO-BG/Me-CCNU 3)
称取50mg Me-CCNU溶于2mL无水乙醇中,称取50mg HA-AZO-BG 3溶于2mL去离子水中,向HA-AZO-BG 3溶液中缓慢滴加2mL Me-CCNU溶液,在室温下搅拌24h挥干乙醇,将反应液以4000rpm的转速低温离心10min,上清液经0.45μm混合纤维素滤膜过滤以除去未被封装的Me-CCNU,收集滤液,冷冻干燥即得HA-AZO-BG/Me-CCNU 3。其粒径分布及形貌分析如图3所示。
实施例8抗肿瘤纳米制剂4(HA-AZO-BG/Me-CCNU 4)
称取50mg Me-CCNU溶于2mL无水乙醇中,称取50mg HA-AZO-BG 4,溶于2mL去离子水中,向HA-AZO-BG 4溶液中缓慢滴加2mL Me-CCNU溶液,在室温下搅拌24h挥干乙醇,将反应液以4000rpm的转速低温离心10min,上清液经0.45μm混合纤维素滤膜过滤以除去未被封装的Me-CCNU,收集滤液,冷冻干燥即得HA-AZO-BG/Me-CCNU 4。其粒径分布及形貌分析如图4所示。
实验例1 HA-AZO-BG/Me-CCNU的稳定性测试
取适量实施例5~8中制备的HA-AZO-BG/Me-CCNU,溶于PBS或含10%血清(FBS)的MEM培养基中,在0、6、12、24、36、48h测定四种抗肿瘤纳米制剂的粒径变化,结果如图5所示。
由图5可知,四种抗肿瘤纳米制剂在两种溶剂中的粒径均无明显变化,表明HA-AZO-BG/Me-CCNU具有良好的稳定性。
实验例2 HA-AZO-BG/Me-CCNU的低氧还原敏感性测试
取适量实施例5~8中制备的HA-AZO-BG/Me-CCNU分别溶于PBS中,并向体系中加入大鼠肝微粒体和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH),分别在常氧或低氧条件下37℃振荡孵育,反应结束后测定各抗肿瘤纳米制剂的粒径,结果如图6所示。
由图6可知,在低氧条件下,四种抗肿瘤纳米制剂的粒径均明显增大,说明在低氧条件下偶氮键被大鼠肝微粒体和NADPH还原,导致抗肿瘤纳米制剂载体发生降解,颗粒碎裂;而在常氧条件下,四种抗肿瘤纳米制剂的粒径均无明显变化,说明在常氧条件下偶氮键不会被还原,抗肿瘤纳米制剂载体不能发生裂解,颗粒保持稳定。
该实验结果表明,HA-AZO-BG/Me-CCNU能够在低氧条件下特异性地通过偶氮结构的还原分解而引发纳米载体碎裂并释放药物,而在常氧条件下保持稳定,具有良好的低氧选择性。
实验例3 HA-AZO-BG对细胞中AGT蛋白的抑制能力
选取AGT高表达且易产生耐药性的人脑神经胶质瘤SF763细胞进行Western Blot实验。将SF763细胞用PBS、O6-BG、HA-AZO-BG 1、HA-AZO-BG 2、HA-AZO-BG 3和HA-AZO-BG 4处理,然后将上述各处理组分别在常氧(21%氧气)和低氧(1%氧气)条件下孵育4h,收集细胞沉淀,于冰上裂解,随后离心去除细胞碎片,收集上清于离心管中,至冰上备用。使用二喹啉甲酸(BCA)法测定提取蛋白的浓度,然后取40μg蛋白,加入蛋白上样缓冲液,沸浴后迅速转移至冰上冷却。将所得的蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,然后进行Western Blot,结果如图7所示。
由图7可知,常氧条件下,经四种纳米颗粒处理后,SF763细胞中的AGT水平与对照组相比没有明显差异,表明该纳米颗粒在常氧条件下不会抑制细胞中的AGT活性,这是因为常氧条件下纳米颗粒中的偶氮结构不会分解,无法释放出O6-BG类似物,不能发挥AGT抑制作用。相反地,在低氧条件下,用四种纳米制剂处理后,细胞中的AGT水平显著降低,且低于O6-BG处理组,表明四种纳米制剂在低氧条件下表现出良好的AGT抑制活性,这是因为低氧条件下纳米制剂中的偶氮结构被还原分解,释放出O6-BG类似物,发挥AGT抑制作用。该实验结果表明,该纳米颗粒具有良好的AGT抑制活性和低氧选择性。
实验例4 HA-AZO-BG/Me-CCNU中Me-CCNU的释放测试
将实施例5~8中制备的HA-AZO-BG/Me-CCNU和游离Me-CCNU分别置于透析袋(1000Da)中,将透析袋置于含有大鼠肝微粒体和NADPH的PBS中,在常氧和低氧条件下进行透析。在5、10、20、40、60、90、120、150、180、240、300和360min时取1mL透析袋外的PBS,用高效液相色谱法测定PBS中Me-CCNU的含量,从而得到4种纳米制剂的体外释放情况。如图8A所示,在低氧条件下,Me-CCNU的释放量可达70%以上,这是由于低氧条件可以触发HA-AZO-BG纳米载体中偶氮键的断裂,进而纳米载体降解,Me-CCNU被有效释放。而在常氧条件下(如图8B所示),Me-CCNU的释放量低于20%,这说明在常氧条件下,纳米颗粒保持完整,不会发生碎裂,因此包载的Me-CCNU不能被有效释放出来。该实验结果表明,纳米制剂HA-AZO-BG/Me-CCNU在常氧的血液循环及正常组织中可以保持良好的稳定性,有利于延长药物的血液循环时间;而在低氧的肿瘤组织中,HA-AZO-BG/Me-CCNU能够迅速降解,有效释放出Me-CCNU,从而有效发挥靶向抗肿瘤作用。
实验例5 HA-AZO-BG/Me-CCNU的细胞克隆形成实验
选取人脑神经胶质瘤SF763细胞和SF126细胞进行克隆形成实验,其中SF763细胞高表达AGT、易产生耐药性,SF126细胞低表达AGT、耐药性较低。将生长状态良好的SF763和SF126细胞分别经胰酶消化制成单细胞悬液,用分别含PBS、Me-CCNU、HA-AZO-BG/Me-CCNU1、HA-AZO-BG/Me-CCNU 2、HA-AZO-BG/Me-CCNU 3和HA-AZO-BG/Me-CCNU 4的培养基稀释细胞悬液,接种于六孔板中,500个细胞/孔,每组设置三个平行。然后于37℃、5%CO2条件下培养9天后,进行染色并计数,如图9所示。
结果表明,经Me-CCNU处理后,AGT高表达的SF763细胞的克隆形成率明显高于AGT低表达的SF126细胞,这是由于AGT介导的DNA损伤修复作用导致肿瘤细胞对Me-CCNU产生了耐药性。经纳米制剂HA-AZO-BG/Me-CCNU处理后的各组细胞中,常氧组的克隆形成率明显高于低氧组,且与对照组接近,这是由于常氧条件下纳米制剂载体不会发生降解,因而包裹于其中的Me-CCNU不会被释放,因此常氧条件下四种纳米制剂均不能显著抑制肿瘤细胞;相反地,在低氧条件下,四种纳米制剂载体中的偶氮苯结构均被还原,导致载体发生降解,同时释放出包载于其中的Me-CCNU和具有抗耐药作用的AGT抑制剂O6-BG类似物,从而有效抑制肿瘤细胞的增殖和克隆形成能力。另外,与SF126细胞相比,低氧处理后,纳米制剂对具有耐药性的SF763细胞的抑制作用更为明显。综上,四种纳米制剂在常氧条件下均不会发挥细胞抑制作用,而在低氧条件下对两种细胞均表现出良好的抑制作用。说明本发明所保护的纳米制剂HA-AZO-BG/Me-CCNU具有良好的肿瘤低氧靶向性、抗耐药性和抗肿瘤活性。
实验例6 HA-AZO-BG/Me-CCNU的细胞毒性实验
(1)实验材料
供试化合物:临床常用的抗肿瘤药物Me-CCNU、实施例5~8中制备的HA-AZO-BG/Me-CCNU 1、HA-AZO-BG/Me-CCNU 2、HA-AZO-BG/Me-CCNU 3和HA-AZO-BG/Me-CCNU 4。
细胞系:人脑神经胶质瘤细胞SF763、人脑神经胶质瘤细胞SF126、人肝癌细胞HepG2、人肺癌细胞A549和人黑色素瘤细胞A375。
(2)实验方法
5种细胞均以1000个/孔接种于96孔板,在37℃、5%CO2培养24h后,以浓度为20μM、50μM、100μM、200μM、500μM、800μM、1000μM和2000μM的抗肿瘤纳米制剂HA-AZO-BG/Me-CCNU1、2、3、4和未包封的Me-CCNU进行处理,每组6个复孔,并设置对照组。设置常氧组和低氧组,其中常氧组在21%氧气、低氧组在1%氧气条件下孵育24h。然后每孔加入10μL CCK-8溶液,作用4小时。最后,在450nm波长下检测吸光度值,按以下公式计算细胞存活率,并计算药物的半数抑制率IC50。
肿瘤细胞存活率(%)=(A药物处理组-A空白组)/(A对照组-A空白组)×100%
A药物处理组为具有培养基、肿瘤细胞、药物溶液和CCK-8溶液的孔的吸光度值;
A空白组为具有培养基和CCK-8溶液,但没有肿瘤细胞和药物的孔的吸光度值;
A对照组为具有培养基、肿瘤细胞、CCK-8溶液,但没有药物溶液的孔的吸光度值。
(3)实验结果:见表1。
表1肿瘤细胞的半数抑制率(IC50,μM)
由表1中数据可知,在常氧条件下,纳米药物包载Me-CCNU形成的HA-AZO-BG/Me-CCNU 1、HA-AZO-BG/Me-CCNU 2、HA-AZO-BG/Me-CCNU 3和HA-AZO-BG/Me-CCNU 4的IC50值比游离Me-CCNU显著提高。这是由于纳米载体HA-AZO-BG对Me-CCNU进行了有效的包封且在常氧条件下不能发生裂解,使药物在常氧条件下不能被释放,因此不能发挥肿瘤细胞抑制作用。这使得该制剂在体内未达到肿瘤低氧区域之前,不能释放Me-CCNU,也就不能导致DNA损伤,因而能够有效降低Me-CCNU对正常组织的毒副作用。
而在低氧环境下,HA-AZO-BG/Me-CCNU 1、HA-AZO-BG/Me-CCNU 2、HA-AZO-BG/Me-CCNU 3和HA-AZO-BG/Me-CCNU 4的IC50值比各常氧组和游离Me-CCNU组显著降低。这表明所合成的纳米制剂具有良好的低氧靶向性,纳米制剂中的偶氮键在低氧条件下能够有效地被还原,从而使纳米壳发生裂解,释放出内部包载的Me-CCNU和AGT抑制剂O6-BG或其衍生物。O6-BG衍生物能够有效抑制AGT的活性,阻断了AGT对Me-CCNU造成的DNA烷化损伤的修复,增加了肿瘤细胞对Me-CCNU的敏感性,从而使Me-CCNU能够靶向性地在肿瘤低氧区域充分发挥其抗肿瘤活性。此外,通过HA与肿瘤细胞表面过表达的CD44受体的结合作用,能够增加肿瘤细胞对纳米药物的摄取作用,从而使得纳米药物靶向性的在肿瘤细胞中积累,增强治疗的靶向性,改善治疗效果。
以上实验结果表明,与传统CENUs类抗肿瘤药物相比,本发明所合成的纳米制剂具有良好的低氧靶向性和抗耐药性,能够特异性地在低氧条件下将偶氮苯基团还原,使得纳米壳发生裂解,从而释放出纳米颗粒内部的CENUs和O6-BG或其衍生物,在靶向递送抗肿瘤药物的同时,还靶向抑制了肿瘤内部AGT介导的耐药性,实现了抗癌、抗耐药和靶向递送的“三效合一”。此外,经过纳米载体HA-AZO-BG的包载,CENUs的水溶性和稳定性也得到了显著提高,也有利于抗癌活性的提高。
虽然,上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验,对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (14)
2.根据权利要求1所述的偶联物,其特征在于,所述透明质酸的分子量为4000~100000Da。
3.根据权利要求2所述的偶联物,其特征在于,所述透明质酸的分子量为4000 Da或5000 Da或10000 Da或12000 Da或100000 Da。
4.根据权利要求3所述的偶联物,其特征在于,R为H。
5.根据权利要求4所述的偶联物,其特征在于,R为H,且所述透明质酸的分子量为5000Da。
6.权利要求5所述偶联物的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将3-氨基苯甲醇与取代苯反应生成(3-((4-取代苯基)二氮烯基)苯基)甲醇;
(2)将2-氨基-6-氯嘌呤与1-甲基吡咯烷反应生成1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基)-1-甲基吡咯烷-1-鎓氯化物;
(3)将所述(3-((4-取代苯基)二氮烯基)苯基)甲醇与所述1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基)-1-甲基吡咯烷-1-鎓氯化物反应生成6-((3-((4-取代苯基)二氮烯基)苄基)氧基)-9H-嘌呤-2-胺;
(4)将氨基取代正烷基羧酸与透明质酸反应生成烷基化透明质酸;
(5)将所述6-((3-((4-取代苯基)二氮烯基)苄基)氧基)-9H-嘌呤-2-胺与所述烷基化透明质酸反应生成偶氮苯类O6-苄基鸟嘌呤-透明质酸偶联物。
7.权利要求1~5任一项所述偶联物在制备抗肿瘤药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述肿瘤为脑瘤、骨髓瘤、黑色素瘤、肝癌、肺癌、胃癌、白血病、结肠癌、淋巴癌中的一种或多种。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述肿瘤为脑瘤、黑色素瘤、肝癌、肺癌中的一种或多种。
10.一种抗肿瘤纳米制剂,其特征在于,由权利要求1~5任一项所述偶联物经自组装形成纳米载体包载抗肿瘤烷化剂制得。
11.根据权利要求10所述的抗肿瘤纳米制剂,其特征在于,所述抗肿瘤烷化剂为导致DNA烷化损伤的烷化剂。
12.根据权利要求11所述的抗肿瘤纳米制剂,其特征在于,所述抗肿瘤烷化剂为氯乙基亚硝基脲、替莫唑胺、氮烯唑胺中的一种或多种。
13.根据权利要求12所述的抗肿瘤纳米制剂,其特征在于,所述抗肿瘤烷化剂为氯乙基亚硝基脲中的卡莫司汀、洛莫司汀或司莫司汀。
14.权利要求10-13任一项所述抗肿瘤纳米制剂的制备方法,其特征在于,当所述抗肿瘤烷化剂为司莫司汀时,制备步骤如下:将司莫司汀溶于有机溶剂中,所述偶联物溶于去离子水中,在搅拌处理下滴加司莫司汀溶液、搅拌挥干有机溶剂、离心、过滤,将上清液冷冻干燥,即得所述抗肿瘤纳米制剂。
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