CN113813394B - 一种兼有抗耐药性和低氧/酯酶双重响应的多功能纳米载体的制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

一种兼有抗耐药性和低氧/酯酶双重响应的多功能纳米载体的制备方法和应用属于生物医用高分子材料技术领域，本发明的纳米递送系统载体能够通过分子间作用力包载疏水性化疗药物，依靠高渗透长滞留效应聚集在肿瘤部位；以低氧和酯酶高表达为特征的肿瘤微环境可诱导纳米载体上偶氮键以及酯键断裂，释放出具有抑制AGT活性的O6‑(3‑氨基)‑苄基鸟嘌呤和具有抗肿瘤活性的烷化剂，从而提高药物的抗耐药性和抗肿瘤活性。

Description

一种兼有抗耐药性和低氧/酯酶双重响应的多功能纳米载体的制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医用高分子材料技术领域，尤其是一种兼有抗耐药性和低氧/酯酶双重响应的多功能纳米载体制备和应用。
背景技术
DNA烷化剂是最早应用于临床癌症治疗的化疗药物，大多数抗癌烷化剂水溶性差、稳定性差和缺乏靶向性，严重限制其在临床上的应用。此外，肿瘤细胞对化疗药物产生的耐药性是导致化疗效果不理想的主要原因。DNA修复机制中涉及的多种蛋白能够有效修复DNA损伤，降低抗癌烷化剂的细胞毒性，使肿瘤细胞对烷化剂产生耐药性，大大降低了该类药物的化疗效果。O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(AGT)是一类存在于细胞中的DNA损伤修复蛋白，可以将鸟嘌呤O6位上的烷化损伤转移至自身145位半胱氨酸的残基上，修复受损DNA。O6-苄基鸟嘌呤(O6-BG)是最早进入临床的AGT抑制剂，可将其自身的苄基转移到AGT活性中心Cys145残基上，生成结构稳定的S-苄基半胱氨酸，从而失活AGT，提高肿瘤细胞对抗癌烷化剂的敏感性。为了克服AGT导致的耐药性，研究人员将O6-BG与氯乙基亚硝基脲(CENUs)、替莫唑胺和顺铂等联合使用，能够显著提高抗癌烷化剂对肿瘤细胞的敏感性，从而改善肿瘤治疗效果。
由于药物之间溶解度、药代动力学及生物利用度等方面存在的差异，导致联合给药后药物分布不协调，进而影响其治疗效果。现有研究将O6-BG或其衍生物与CENUs缀合成一个分子，以避免联合用药可能引起的配伍问题。但是，AGT抑制剂与CENUs本身缺乏靶向性，AGT抑制剂不仅抑制肿瘤组织中AGT活性，也抑制了正常组织的自我修复能力，此外CENUs在发挥抗癌作用的同时，其较强的全身毒性甚至会导致“二次肿瘤”的伤害，降低化疗效果。因此，迫切需要设计并制备药物靶向输送系统，以发挥抗耐药性和增效减毒的作用。
现有纳米药物载体虽有提高化疗药物稳定性、水溶性和增加血液循环时间等优势，但可能在到达肿瘤部位时提前释放药物，或在到达靶区后不能及时有效释放药物。酯酶是癌细胞内过度表达的酶之一。恶性肿瘤的酯酶活性约为正常组织的2.6-3.7倍，高表达的酯酶在肿瘤迁移、侵袭、存活中起着重要作用。此外，肿瘤内新生血管分布上常表现为分支紊乱，结构异常，不能有效供应血液，导致肿瘤组织普遍存在低氧区域。因此，利用肿瘤微环境特有的理化性质，设计一种兼有抗耐药性和刺激响应型的纳米药物载体，能使药物在肿瘤部位高效释放，从而发挥靶向抗肿瘤作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种兼有抗耐药性和低氧/酯酶双重响应的多功能纳米载体的制备方法。本发明的纳米递送系统载体能够通过分子间作用力包载疏水性化疗药物，依靠高渗透长滞留效应聚集在肿瘤部位；以低氧和酯酶高表达为特征的肿瘤微环境可诱导纳米载体上偶氮键以及酯键断裂，释放出具有抑制AGT活性的O6-(3-氨基)-苄基鸟嘌呤和具有抗肿瘤活性的烷化剂，从而提高药物的抗耐药性和抗肿瘤活性。
所述低氧响应基团为偶氮苯，酯酶响应基团为酯基，其在肿瘤微环境中均可发生断裂。
所述AGT抑制剂为O6-(3-氨基)-苄基鸟嘌呤。
所述亲水性高分子材料为壳聚糖，其基本结构具有多个可修饰的羟基，且有良好的生物相容性，因此能进一步提高递送的精准性，降低毒副作用。
本发明提供“一种兼有抗耐药性和低氧/酯酶双重响应的多功能纳米载体”的制备方法包括的步骤：
1)低氧与酯酶双靶向性AGT抑制剂壳聚糖偶联物CS-COO-AZO-BG的合成方法：
本发明提供低氧与酯酶双靶向性AGT抑制剂壳聚糖偶联物CS-COO-AZO-BG的结构式为：
Figure BDA0003218186240000031
称取(E)-4-((3-((2-氨基-9H-嘌呤-6-基)氧基)甲基)苯基)二氮基)苯甲酸(BZCOH)溶于无水乙醇中，得到浓度为0.25-1mg/mL的BZCOH乙醇溶液；向其中加入4-二甲基氨基吡啶(DMAP)和1,3-二环己基碳二亚胺(DCC)，其中BZCOH、DMAP和DCC的投料摩尔比为1:(1-5):(5-10)，得到混合液A，将混合液A于25-60℃条件下反应4-10h。称取壳聚糖溶于1％的醋酸水溶液中,得到混合液B，按壳聚糖与BZCOH的投入摩尔比为1:5-1:100将混合液B滴加至混合液A中，25-60℃条件下搅拌反应24-72h。然后，将上述反应液置于透析袋中，透析袋截留分子量为3500Da，使用无水乙醇/蒸馏水(v/v)＝3:1-1:1透析，透析时间为12-72h以除去未反应的小分子化合物。将透析液冻干，即得偶联物CS-COO-AZO-BG。
2)一种兼有抗耐药性和低氧/酯酶双重响应的多功能纳米载体CS-COO-AZO-BGNPs的制备：
称取偶联物CS-COO-AZO-BG冻干粉末溶于蒸馏水中得到浓度为5-30mg/mL的偶联物水溶液，冰浴下超声处理5-30min，超声功率设为200-500W。然后，将上述反应液通过混合纤维素滤膜过滤后，真空冷冻干燥12-36h，即得纳米载体CS-COO-AZO-BG NPs。
3)载化疗药物的一种兼有抗耐药性和低氧/酯酶双重响应的多功能抗肿瘤纳米药物CS-COO-AZO-BG/Drug NPs的制备：
将疏水性化疗药物溶于有机溶剂中得到浓度为5-100mg/mL的混合液C，将偶联物CS-COO-AZO-BG冻干粉末溶于蒸馏水中得到浓度为10-35mg/mL的混合液D,将混合液C用注射器均匀地滴加至混合液D中，继续搅拌反应3-10min。然后在冰浴条件下超声处理反应液5-30min，超声功率设为200-400W。接下来，将上述超声后的反应液加至透析袋中，透析袋截留分子量为1000-2000Da，透析液是pH＝7.4的PBS，透析2-6h以除去未包封的药物。最后，将透析袋中的液体冻干，即得包载化疗药物的抗耐药性和低氧/酯酶双重响应的多功能抗肿瘤纳米药物CS-COO-AZO-BG/Drug NPs。
优选地，所述步骤1)中BZCOH乙醇溶液浓度优选为0.3-1mg/mL；混合液A中，BZCOH、DMAP和DCC的投料摩尔比优选为1:(3-5):(5-8)；所述壳聚糖相对分子量优选为10000-50000Da；混合液B中，壳聚糖与BZCOH的投料摩尔比优选为1:20-1:80；透析时间优选为12-36h。
优选地，步骤2)中CS-COO-AZO-BG水溶液浓度优选为10-25mg/mL；超声处理的时间优选为10-28min；超声功率优选为250-400W；真空干燥时间优选为12-24h。
优选地，步骤3)所述的疏水性化疗药物为DNA烷化剂类药物，优选为氯乙基亚硝基脲类抗癌烷化剂；进一步优选为氯乙基亚硝基脲类药物中的卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)和司莫司汀(Me-CCNU)。所述有机溶剂为四氢呋喃、甲醇、无水乙醇中的一种或多种，优选为无水乙醇；混合液C的浓度优选为10-50mg/mL；混合液D的浓度优选为10-30mg/mL；混合液C和混合液D的反应时间优选为3-8min；超声处理时间优选为5-20min，超声功率优选为300-400W；透析时间优选为2-4h。
本发明所述肿瘤为脑瘤、骨髓瘤、黑色素瘤、肝癌、肺癌、胃癌、白血病、结肠癌、淋巴癌中的一种或多种，优选为脑瘤、黑色素瘤、肝癌、肺癌中的一种或多种。
本发明具有的实质性特点：
1)本发明制备功能性纳米载体具有抗耐药性和低氧/酯酶双重响应性。在低氧和酯酶高表达的肿瘤微环境中，载体上偶氮键被还原，释放AGT抑制剂，发挥抗耐药的作用，同时酯基被水解还原，进一步释放纳米核心中所包载的抗肿瘤药物，从而实现药物的靶向递送和可控释放，发挥增效减毒的作用。
2)本发明所用的载体材料具有良好的生物相容性、生物可降解性，能在水溶液中自组装形成粒径均匀和分散度好的球形纳米载体。
3)本发明所设计的功能性纳米载体能够包载疏水性化疗药物，克服了氯乙基亚硝基脲类药物体内不稳定、易被清除以及疏水性药物难容性带来的生物利用度低等缺点。
4)本发明所制备的功能性纳米载体是具有壳核结构的球形纳米颗粒，其平均粒径为100-200nm，在肿瘤组织增强渗透滞留效应(EPR)下，有效地富集在肿瘤部位，通过胞吞进入细胞。
5)本发明制备方法简单，经济成本低廉，具有很广阔的应用前景。
附图说明
附图是用来对本发明的进一步阐述，与下面具体实施方式共同用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。附图中：
图1为本发明的“一种兼有抗耐药性和低氧/酯酶双重响应的多功能纳米载体”的制备路线及在肿瘤组织中药物递送示意图；
图2为本发明实施例1中CS-COO-AZO-BG NPs的粒径分布和透射电镜形貌图；
图3为本发明实施例3中CS-COO-AZO-BG/BCNU NPs的粒径分布和透射电镜形貌图；
图4为本发明实施例5中CS-COO-AZO-BG/CCNU NPs的粒径分布和透射电镜形貌图；
图5为本发明实施例7中CS-COO-AZO-BG/Me-CCNU NPs的粒径分布和透射电镜形貌图；
图6为实验例2中各功能性载药载体在H2O、PBS和含10％血清(FBS)的DMEM培养基中稳定性的实验结果；
图7为实验例3中各功能性载药载体的低氧还原敏感性实验结果(图A、C和E代表常氧且不加酯酶条件下平均粒径分布情况，图B、D和F代表低氧且不加酯酶条件下平均粒径分布情况)；
图8为实验例4中各功能性载药载体的酯酶响应性实验结果(图A、C和E代表常氧且不加羧酸酯酶条件下平均粒径分布情况，图B、D和F代表常氧且加羧酸酯酶条件下平均粒径分布情况)；
图9为实验例5中常氧且不加酯酶条件下各游离药物与功能性纳米载体的药物累计释放曲线；
图10为实验例5中低氧且不加酯酶条件下各游离药物与功能性纳米载体的药物累计释放曲线；
图11为实验例5中常氧且加酯酶条件下各游离药物与功能性纳米载体的药物累计释放曲线；
图12为实验例5中低氧且加酯酶条件下各游离药物与功能性纳米载体的药物累计释放曲线)；
具体实施方式
为了更清楚地阐述本发明，以下申请人将按照本发明技术方案的实施例对本发明作更进一步的详细说明。
实施例1一种兼有抗耐药性和低氧/酯酶双重响应的多功能纳米载体的(CS-COO-AZO-BG NPs)制备：
(1)偶氮苯类O6-苄基鸟嘌呤-壳聚糖偶联物(CS-COO-AZO-BG)的合成
称取BZCOH 1.5g(3.8mmol)溶于4mL无水乙醇中，得到浓度为0.38mg/mL的BZCOH乙醇溶液；向其中加入DMAP 2.21g(17.86mmol)，DCC 4.5g(22mmol)，将该反应液在30℃条件下反应6h。称取300mg壳聚糖(15000Da)溶于5mL 1％醋酸水溶液得到60mg/mL的壳聚糖醋酸水溶液，将壳聚糖醋酸水溶液滴加至反应液中，在30℃条件下继续反应24h。然后，将上述反应液加至透析袋中，透析袋截留分子量为3500Da，使用无水乙醇/蒸馏水(v/v)＝3:1-1:1透析，透析时间为12h，以除去未反应的小分子化合物。将透析液于-80℃预冻12h后，真空冷冻干燥24h即得CS-COO-AZO-BG。
IR(KBr压片)υ/cm-1:3332.5(N-H)；2927.7、1232.7(C-H)；1680.6(C＝N)；1652.1、1563.2(C＝C)；1152.6(C-O-C)；1704.4(C＝O)；1078.1、1045.2(C-O)；
1H NMR(400MHz,DMSO)δ:1.11(d,3H,CH3)；1.7(s,2H,NH2)；1.99(s,3H,CH3)；2.93-5.35(m,10H,CH)；3.41(s,3H,CH3)；3.51(d,2H,CH2)；3.94(s,1H,OH)；4.37(s,2H,OH)；4.49(d,2H,CH2)；5.16(s,2H,CH2)；6.33(s,2H,NH2)；7.58-7.88(m,4H,C6H4)；8.02-8.22(m,4H,C6H4)；8.34(s,1H,NH)；8.57(s,1H,NH)；13.65(s,1H,NH)；
(2)CS-COO-AZO-BG NPs的制备
称取100mg步骤(1)中所制备的CS-COO-AZO-BG冻干粉末于圆底烧瓶中，加入10mL蒸馏水充分溶解，得到浓度为10mg/mL的偶联物水溶液。冰浴条件下，超声处理20min，超声功率设为250W。然后，将上述反应液通过0.45μm混合纤维素滤膜过滤后，真空冷冻干燥滤液24h，即得CS-COO-AZO-BG NPs。
实施例2一种兼有抗耐药性和低氧/酯酶双重响应的多功能纳米载体的(CS-COO-AZO-BG NPs)制备：
(1)CS-COO-AZO-BG的合成
称取BZCOH 1.6g(4.1mmol)溶于4mL无水乙醇中，得到浓度为0.40mg/mL的BZCOH乙醇溶液；向其中加入DMAP 2.35g(18.86mmol)，DCC 5.07g(24.6mmol)，将该反应液在35℃条件下反应8h。称取330mg壳聚糖(27000Da)溶于5mL 1％醋酸水溶液得到66mg/mL的壳聚糖醋酸水溶液，将壳聚糖醋酸水溶液滴加至反应液中，在35℃条件下继续反应36h。然后，将上述反应液加至透析袋中，透析袋截留分子量为3500Da，使用无水乙醇/蒸馏水(v/v)＝3:1-1:1透析，透析时间为12h以除去未反应的小分子化合物。将透析液于-80℃预冻12h后，真空冷冻干燥24h即得CS-COO-AZO-BG。
IR(KBr压片)υ/cm-1:3341.6(N-H)；2928.8、1251.1(C-H)；1699.1(C＝N)；1688.1、1603.2(C＝C)；1149.6(C-O-C)；1712.1(C＝O)；1080.1、1048.1(C-O)；
1H NMR(400MHz,DMSO)δ:1.11(d,3H,CH3)；1.69(s,2H,NH2)；1.89(s,3H,CH3)；2.91-5.37(m,10H,CH)；3.46(s,3H,CH3)；3.51(d,2H,CH2)；3.94(s,1H,OH)；4.37(s,2H,OH)；4.49(d,2H,CH2)；5.16(s,2H,CH2)；6.33(s,2H,NH2)；7.58-7.88(m,4H,C6H4)；8.02-8.22(m,4H,C6H4)；8.36(s,1H,NH)；8.51(s,1H,NH)；13.64(s,1H,NH)；
(2)CS-COO-AZO-BG NPs的制备
称取150mg步骤(1)中所制备的CS-COO-AZO-BG冻干粉末于圆底烧瓶中，加入10mL蒸馏水充分溶解，得到浓度为15mg/mL的偶联物水溶液。冰浴条件下，超声处理25min，超声功率设为300W。然后，将上述反应液通过0.45μm混合纤维素滤膜过滤后，真空冷冻干燥滤液18h，即得CS-COO-AZO-BG NPs。
实施例3载卡莫司汀的一种兼有抗耐药性和低氧/酯酶双重响应的多功能纳米载体的(CS-COO-AZO-BG/BCNU NPs)制备
(1)CS-COO-AZO-BG的合成
称取BZCOH 1.8g(5mmol)溶于4mL无水乙醇中，得到浓度为0.45mg/mL的BZCOH乙醇溶液；向其中加入DMAP 2.83g(23mmol)，DCC 7.83g(38mmol)，将该反应液在45℃条件下反应8h。称取350mg壳聚糖(35000Da)溶于5mL 1％醋酸水溶液得到70mg/mL的壳聚糖醋酸水溶液，将壳聚糖醋酸水溶液滴加至反应液中，在45℃条件下继续反应24h。然后，将上述反应液加至透析袋中，透析袋截留分子量为3500Da，使用无水乙醇/蒸馏水(v/v)＝3:1-1:1透析，透析时间为24h以除去未反应的小分子化合物。将透析液于-80℃预冻12h后，真空冷冻干燥24h即得CS-COO-AZO-BG。
IR(KBr压片)υ/cm-1:3551.1(N-H)；2870.2、1249.4(C-H)；1666.9(C＝N)；1656.1、1573.1(C＝C)；1152(C-O-C)；1709.2(C＝O)；1071.1、1039.3(C-O)；
1H NMR(400MHz,DMSO)δ:1.12(d,3H,CH3)；1.6(s,2H,NH2)；1.89(s,3H,CH3)；2.91-5.35(m,10H,CH)；3.42(s,3H,CH3)；3.52(d,2H,CH2)；3.93(s,1H,OH)；4.35(s,2H,OH)；4.50(d,2H,CH2)；5.13(s,2H,CH2)；6.28(s,2H,NH2)；7.58-7.88(m,4H,C6H4)；8.02-8.22(m,4H,C6H4)；8.13(s,1H,NH)；8.57(s,1H,NH)；13.61(s,1H,NH)；
(2)CS-COO-AZO-BG/BCNU NPs的制备
称取1mg BCNU溶于100μL无水乙醇中得到浓度为10mg/mL的BCNU乙醇溶液，称取20mg CS-COO-AZO-BG溶于2mL去离子水中得到浓度为10mg/mL的偶联物水溶液,将上述BCNU乙醇溶液用注射器均匀地滴加至偶联物水溶液中，继续搅拌反应4min。然后在冰浴条件下超声处理反应液5min，超声功率设为320W。接下来，将上述超声后的反应液加至透析袋中透析袋截留分子量为1000-2000Da，透析液是pH＝7.4的PBS，透析时间为2.5h以除去未包封的药物。最后，将透析袋中液体冻干，即得CS-COO-AZO-BG/BCNU NPs。
实施例4载卡莫司汀的一种兼有抗耐药性和低氧/酯酶双重响应的多功能纳米载体的(CS-COO-AZO-BG/BCNU NPs)制备
(1)CS-COO-AZO-BG的合成
称取BZCOH 2.2g(5.5mmol)溶于4mL无水乙醇中，得到浓度为0.5mg/mL的BZCOH乙醇溶液；向其中加入DMAP 3.49mg(28.6mmol)，DCC7.02g(34mmol)，将该反应液在30℃条件下反应4h。称取350mg壳聚糖(30000Da)溶于5mL 1％醋酸水溶液得到70mg/mL的壳聚糖醋酸水溶液，将壳聚糖醋酸水溶液滴加至反应液中，在30℃条件下继续反应36h。然后，将上述反应液加至透析袋中，透析袋截留分子量为3500Da，使用无水乙醇/蒸馏水(v/v)＝3:1-1:1透析，透析时间为18h以除去未反应的小分子化合物。将透析液于-80℃预冻12h后，真空冷冻干燥24h即得CS-COO-AZO-BG。
IR(KBr压片)υ/cm-1:3341.7(N-H)；2930.5、1261.3(C-H)；1686.9(C＝N)；1672.1、1577.9(C＝C)；1150.0(C-O-C)；1710.9(C＝O)；1075.1、1048.3(C-O)；
1H NMR(400MHz,DMSO)δ:1.23(d,3H,CH3)；1.59(s,2H,NH2)；1.89(s,3H,CH3)；2.93-5.34(m,10H,CH)；3.43(s,3H,CH3)；3.49(d,2H,CH2)；3.89(s,1H,OH)；4.37(s,2H,OH)；4.50(d,2H,CH2)；5.16(s,2H,CH2)；6.27(s,2H,NH2)；7.58-7.88(m,4H,C6H4)；8.02-8.12(m,4H,C6H4)；8.25(s,1H,NH)；8.51(s,1H,NH)；13.59(s,1H,NH)；
(2)CS-COO-AZO-BG/BCNU NPs的制备
称取1.5mg BCNU溶于100μL无水乙醇中得到浓度为15mg/mL的BCNU乙醇溶液，称取20mg CS-COO-AZO-BG溶于2mL去离子水中得到浓度为10mg/mL的偶联物水溶液,将上述BCNU乙醇溶液用注射器均匀地滴加至偶联物水溶液中，继续搅拌反应4min。然后在冰浴条件下超声处理反应液8min，超声功率设为350W。接下来，将上述超声后的反应液加至透析袋中，透析袋截留分子量为1000-2000Da，透析液是pH＝7.4的PBS，透析时间为3h以除去未包封的药物。最后，将透析袋中液体冻干，即得CS-COO-AZO-BG/BCNU NPs。
实施例5载洛莫司汀的一种兼有抗耐药性和低氧/酯酶双重响应的多功能纳米载体的(CS-COO-AZO-BG/CCNU NPs)制备
(1)CS-COO-AZO-BG的合成
称取BZCOH 1.5g(3.8mmol)溶于4mL无水乙醇中，得到浓度为0.375mg/mL的BZCOH乙醇溶液；向其中加入DMAP 1.39g(11.4mmol)，DCC 4.69g(23mmol)，将该反应液在40℃条件下搅拌5h,称取400mg壳聚糖(3700Da)溶于5mL 1％醋酸水溶液中，得到80mg/mL的壳聚糖醋酸水溶液，将壳聚糖醋酸水溶液滴加至反应液中，在35℃条件下继续反应24h，反应结束后，将反应液加至透析袋中(35000Da)，使用无水乙醇/蒸馏水(v/v)＝3:1-1:1透析，透析时间为25h，以除去未反应的小分子化合物。将透析液于-80℃预冻12h后，真空冷冻干燥24h即得CS-COO-AZO-BG。
IR(KBr压片)υ/cm-1:3400.5(N-H)；2887.7、1259.7(C-H)；1690.6(C＝N)；1652.1、1586.0(C＝C)；1173.1(C-O-C)；1714.2(C＝O)；1090.9、1045.1(C-O)；
1H NMR(400MHz,DMSO)δ:1.31(d,3H,CH3)；1.68(s,2H,NH2)；2.01(s,3H,CH3)；2.93-5.35(m,10H,CH)；3.21(s,3H,CH3)；3.51(d,2H,CH2)；3.94(s,1H,OH)；4.37(s,2H,OH)；4.49(d,2H,CH2)；5.16(s,2H,CH2)；6.33(s,2H,NH2)；7.48-7.88(m,4H,C6H4)；8.07-8.32(m,4H,C6H4)；8.34(s,1H,NH)；8.57(s,1H,NH)；13.55(s,1H,NH)；
(2)CS-COO-AZO-BG/CCNU NPs的制备
称取3.5mg CCNU溶于100μL无水乙醇中，得到浓度为35mg/mL的BCNU乙醇溶液，称取50mg CS-COO-AZO-BG溶于2mL去离子水中得到浓度为25mg/mL的偶联物水溶液，将上述CCNU乙醇溶液用注射器均匀地滴加至偶联物水溶液中，继续搅拌反应5min。然后在冰浴条件下超声处理反应液12min，超声功率设为380W。接下来，将上述超声后的反应液加至透析袋中，透析袋截留分子量为1000-2000Da，透析液是pH＝7.4的PBS，透析时间为3.5h以除去未包封的药物。最后，将透析袋中液体冻干，即得CS-COO-AZO-BG/CCNU NPs。
实施例6载洛莫司汀的一种兼有抗耐药性和低氧/酯酶双重响应的多功能纳米载体的(CS-COO-AZO-BG/CCNU NPs)制备
(1)CS-COO-AZO-BG的合成
称取BZCOH 1.25g(3mmol)溶于4mL无水乙醇中，得到浓度为0.31mg/mL的BZCOH乙醇溶液；向其中加入DMAP 1.46g(12mmol)，DCC 4.5g(22mmol)，将该反应液在40℃条件下搅拌6h。称取380mg壳聚糖(45000Da)溶于4mL 1％醋酸水溶液中，得到95mg/mL的壳聚糖醋酸水溶液。将壳聚糖醋酸水溶液滴加至反应液中，在40℃条件下继续反应36h。然后，将上述反应液加至透析袋中，透析袋截留分子量为3500Da，使用无水乙醇/蒸馏水(v/v)＝3:1-1:1透析，透析时间为36h，，以除去未反应的小分子化合物。将透析液于-80℃预冻12h后，真空冷冻干燥24h即得CS-COO-AZO-BG。
IR(KBr压片)υ/cm-1:3530.1(N-H)；2830.9、1239.7(C-H)；1657.6(C＝N)；1652.1、1551.2(C＝C)；1050.6(C-O-C)；1691.1(C＝O)；1079.2、1041.2(C-O)；
1H NMR(400MHz,DMSO)δ:1.21(d,3H,CH3)；1.77(s,2H,NH2)；2.09(s,3H,CH3)；2.93-5.31(m,10H,CH)；3.43(s,3H,CH3)；3.51(d,2H,CH2)；3.74(s,1H,OH)；4.37(s,2H,OH)；4.49(d,2H,CH2)；5.16(s,2H,CH2)；6.30(s,2H,NH2)；7.55-7.92(m,4H,C6H4)；8.42-8.62(m,4H,C6H4)；8.033(s,1H,NH)；8.45(s,1H,NH)；13.75(s,1H,NH)；
(2)CS-COO-AZO-BG/CCNU NPs的制备
称取5mg CCNU溶于100μL无水乙醇中，得到浓度为50mg/mL的CCNU乙醇溶液，称取50mg CS-COO-AZO-BG溶于2mL去离子水中得到浓度为25mg/mL的偶联物水溶液，将上述CCNU乙醇溶液用注射器均匀地滴加至偶联物水溶液中，继续搅拌反应6min。然后，在冰浴条件下超声处理反应液22min，超声功率设为400W。接下来，将上述超声后的反应液加至透析袋中，透析袋截留分子量为1000-2000Da，透析液是pH＝7.4的PBS，透析时间为4h以除去未包封的药物。最后，将透析袋中液体冻干，即得CS-COO-AZO-BG/CCNU NPs。
实施例7载司莫司汀的一种兼有抗耐药性和低氧/酯酶双重响应的多功能纳米载体的(CS-COO-AZO-BG/Me-CCNU NPs)制备
(1)CS-COO-AZO-BG的合成
称取BZCOH 1.7g(4mmol)溶于4mL无水乙醇中，得到浓度为0.43mg/mL的BZCOH乙醇溶液；向其中加入DMAP 2.19g(18mmol)，DCC 6.59g(32mmol)，将该反应液在50℃条件下搅拌5h。称取350mg壳聚糖(42000Da)溶于5mL 1％醋酸水溶液中，得到70mg/mL的壳聚糖醋酸水溶液，将壳聚糖醋酸水溶液滴加至反应液中，在50℃条件下继续反应24h。然后，将上述反应液加至透析袋中，透析袋截留分子量为3500Da，用无水乙醇/蒸馏水(v/v)＝3:1-1:1透析，透析时间为30h，以除去未反应的小分子化合物。将透析液于-80℃预冻12h后，真空冷冻干燥24h即得CS-COO-AZO-BG。
IR(KBr压片)υ/cm-1:3532.2(N-H)；2827.9、1240.7(C-H)；1670.6(C＝N)；1652.1、1555.2(C＝C)；1052.6(C-O-C)；1694.4(C＝O)；1078.1、1045.2(C-O)；
1H NMR(400MHz,DMSO)δ:1.25(d,3H,CH3)；1.8(s,2H,NH2)；2.13(s,3H,CH3)；2.93-5.35(m,10H,CH)；3.41(s,3H,CH3)；3.51(d,2H,CH2)；3.74(s,1H,OH)；4.37(s,2H,OH)；4.49(d,2H,CH2)；5.16(s,2H,CH2)；6.33(s,2H,NH2)；7.58-7.88(m,4H,C6H4)；8.02-8.22(m,4H,C6H4)；8.033(s,1H,NH)；8.35(s,1H,NH)；13.65(s,1H,NH)；
(2)CS-COO-AZO-BG/Me-CCNU NPs的制备
称取2.4mg Me-CCNU溶于100μL无水乙醇中，得到浓度为40mg/mL的Me-CCNU乙醇溶液，称取50mg CS-COO-AZO-BG溶于2mL去离子水中得到浓度为25mg/mL的偶联物水溶液。将上述Me-CCNU无水乙醇溶液用注射器均匀地滴加至偶联物水溶液中，继续搅拌反应4.5min。然后在冰浴条件下超声处理反应液23min，超声功率设为350W。接下来，将上述超声后的反应液加至透析袋中，透析袋截留分子量为1000-2000Da，透析液是pH＝7.4的PBS，透析时间为2h以除去未包封的药物。最后，将透析袋中液体冻干，即得CS-COO-AZO-BG/MeCCNU NPs。
实施例8载司莫司汀的一种兼有抗耐药性和低氧/酯酶双重响应的多功能纳米载体的(CS-COO-AZO-BG/Me-CCNU NPs)制备
(1)CS-COO-AZO-BG的合成
称取BZCOH 1.4g(3.6mmol)溶于4mL无水乙醇中，得到浓度为0.35mg/mL的BZCOH乙醇溶液；向其中加入DMAP 2.19g(18mmol)，DCC 5.18g(25mmol)，将该反应液在45℃条件下搅拌4h。称取280mg壳聚糖(50000Da)溶于4mL 1％醋酸水溶液中，得到70mg/mL的壳聚糖醋酸水溶液。将壳聚糖醋酸水溶液滴加至反应液中，在45℃条件下继续反应45h，然后，将上述反应液加至透析袋中，透析袋截留分子量为3500Da，用无水乙醇/蒸馏水(v/v)＝3:1-1:1透析，透析时间为20h，以除去未反应的小分子化合物。将透析液于-80℃预冻12h后，真空冷冻干燥24h即得CS-COO-AZO-BG。
IR(KBr压片)υ/cm-1:3538.2(N-H)；2817.9、1241.7(C-H)；1670.6(C＝N)；1652.1、1555.2(C＝C)；1061.6(C-O-C)；1694.4(C＝O)；1078.1、1077.2(C-O)；
1H NMR(400MHz,DMSO)δ:1.24(d,3H,CH3)；1.79(s,2H,NH2)；2.13(s,3H,CH3)；2.91-5.36(m,10H,CH)；3.41(s,3H,CH3)；3.49(d,2H,CH2)；3.73(s,1H,OH)；4.37(s,2H,OH)；4.49(d,2H,CH2)；5.16(s,2H,CH2)；6.33(s,2H,NH2)；7.58-7.88(m,4H,C6H4)；8.05-8.25(m,4H,C6H4)；8.033(s,1H,NH)；8.32(s,1H,NH)；13.63(s,1H,NH)；
(2)CS-COO-AZO-BG/Me-CCNU NPs的制备
称取3.3mg Me-CCNU溶于100μL无水乙醇中，得到浓度为33mg/mL的Me-CCNU乙醇溶液，称取60mg CS-COO-AZO-BG溶于2mL去离子水中得到浓度为30mg/mL的偶联物水溶液。将上述Me-CCNU无水乙醇溶液用注射器均匀地滴加至偶联物水溶液中，继续搅拌反应5min。然后在冰浴条件下超声处理反应液15min，超声功率设为300W。接下来，将上述超声后的反应液加至透析袋中，透析袋截留分子量为1000-2000Da，透析液是pH＝7.4的PBS，透析时间为2h以除去未包封的药物。最后，将透析袋中液体冻干，即得CS-COO-AZO-BG/MeCCNU NPs。
实验例1：各载药的功能性纳米载体包封率和载药量的测试
1.实验材料
将上述透析前各载药功能性纳米载体的反应液置于超滤管(3KD)中，1000rpm离心8min，收集滤液，并利用有机溶剂破坏法取适量甲醇滴入反应液中，经0.22μm水膜过滤，高效液相色谱法(HPLC)测定药物含量并计算包封率与载药量。
Figure BDA0003218186240000161
Figure BDA0003218186240000162
2.实验结果：见表1。
表1各载药功能性纳米载体包封率和载药量
Figure BDA0003218186240000163
由表1中数据可知，制备的一种兼有抗耐药性和低氧/酯酶双重响应的多功能纳米载体对各疏水性药物的包封率均在80％以上，载药量均在5％以上，说明该载体可高效包封各疏水性药物，且具有较高载药量。
实验例2：各载药的功能性纳米载体的稳定性测试
取适量实施例3-8中所制备的载药功能性纳米载体冻干粉末，溶于蒸馏水、PBS、或含10％血清(FBS)的DMEM培养基中，在0、12、24、48、72、108h测定三种载药功能性纳米载体的粒径变化，结果如图6所示。由图6可知，三种载药功能性纳米颗粒在各溶剂中的平均粒径均无明显变化，说明该各载药纳米颗粒具有良好的稳定性。
实验例3：各载药的功能性纳米载体的低氧还原敏感性测试
利用Na2S2O4法模拟低氧还原条件，称取5mg实施例3-8中制备的载药的功能性纳米载体冻干粉末分别溶于2mL蒸馏水中，并向体系中加入1μM的Na2S2O4封闭EP管口，于37℃水浴锅中孵育30min，利用马尔文粒度仪检测加入Na2S2O4前后平均粒径的变化情况，结果如图7所示。加入Na2S2O4后，各载药的功能性纳米载体的平均粒径变化明显，平均粒径分布较广，说明在低氧条件下各纳米药物载体偶氮键被还原，导致纳米药物载体发生降解，颗粒碎裂；而在常氧条件下，三种载药的功能性纳米载体的平均粒径均无明显变化，说明在常氧条件下偶氮键不会被还原，各纳米药物载体不能发生裂解，颗粒保持稳定，具有良好的低氧选择性。
实验例4：各载药的功能性纳米载体的酯酶响应性测试
称取5mg实施例3-8中制备的载药的功能性纳米载体冻干粉末分别溶于2mL PBS中，加入30U/mL的羧酸酯酶，于37℃水浴条件下振荡孵育10min。利用马尔文粒度仪检测其平均粒径变化情况，结果如图8所示。在羧酸酯酶模拟的酯酶高表达的肿瘤微环境中，各纳米药物的平均粒径变化明显，与未加入酯酶组相比，加入酯酶后溶液中平均粒径分布变广，溶液中粒径分布不均匀。而在未加入酯酶的纳米药物平均粒径分布较为集中，说明该纳米药物具有良好的酯酶响应性。
实验例5：各载药的功能性纳米载体中药物释放行为测试
将实施例3-8中制备的载药的功能性纳米载体和游离的化疗药物(BCNU、CCNU和Me-CCNU)分别置于再生纤维透析袋(MWCO:1000-2000Da),将透析袋置于含有大鼠肝微粒体、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的PBS工作液中，通过向体系内充入氮气和添加30U/mL的羧酸酯酶模拟低氧和酯酶高表达的肿瘤微环境，分别在以上条件下进行透析。在10、20、40、60、90、120、150、180、240min时取1mL透析袋外的PBS，用高效液相色谱法分别测定溶液中BCNU、CCNU和Me-CCNU的含量，从而得到三种药物的累计释放量。如图9所示，在常氧条件下,各组药物释放量低于20％，这说明在常氧条件下，各纳米颗粒保持完整，不会发生碎裂，因此包载的药物不能被释放出来。而在低氧条件下(如图10)，各药物释放量均明显上升，这是由于低氧条件可以触发CS-COO-AZO-BG载体中的偶氮键的断裂，进而纳米载体降解，纳米核心中的药物被有效释放。如图11所示，与常氧条件下不加羧酸酯酶组(如图9)相比，各纳米药物在添加羧酸酯酶条件下药物累积释放量明显上升，说明羧酸酯酶的加入可以使纳米载体的酯基水解，进而导致载体碎裂，使药物从纳米核心释放出来。与前三组相比，在低氧及添加羧酸酯酶的条件下(如图12)，各纳米药物的药物累积释放量达到最高；低氧及羧酸酯酶条件可分别促进纳米载体上偶氮键及酯基的断裂，使纳米核心的药物充分释放。而各游离的药物无论是在常/低氧、有/无酯酶条件下，其释放行为相似，均表现为快速释放，且释放量可达90％以上。该实验结果表明，CS-COO-AZO-BG NPs在正常组织中可保持良好的稳定性，有利于延长药物的血液循环时间，防止药物的提前释放；而在低氧与酯酶高表达的肿瘤微环境中，CS-COO-AZO-BG NPs能迅速降解，高效释放药物，从而发挥良好的靶向抗肿瘤作用。
实验例6：各载药的功能性纳米载体的细胞毒性实验
1、实验材料
供试化合物：游离的BCNU、CCNU、Me-CCNU、实施例3-8中制备的CS-COO-AZO-BG/BCNU NPs、CS-COO-AZO-BG/CCNU NPs和CS-COO-AZO-BG/Me-CCNU NPs。
细胞系：人脑神经胶质瘤细胞SF763、人脑神经胶质瘤细胞SF126、人脑胶质瘤细胞T98G、大鼠胶质瘤细胞C6、宫颈癌HeLa细胞。
2、实验方法
5种细胞均以1000个/孔接种于96孔板，在37℃、5％CO2培养24h后，以浓度为20μM、50μM、100μM、200μM、500μM、800μM、1000μM和2000μM的各载药的功能性纳米载体和游离的化疗药物进行处理，每组6个复孔，并设置对照组。设置常氧/不加酯酶组、低氧/不加酯酶组、常氧/加酯酶组和低氧/加酯酶组；以向体系内充入氮气及加入50U/mL羧酸酯酶的方式模拟低氧/酯酶高表达的肿瘤微环境。然后每孔加入10μL CCK-8溶液，作用4h。最后，在450nm波长下检测吸光度值，按以下公式计算细胞存活率，并计算药物的半数抑制率IC50。
肿瘤细胞存活率(％)＝(A药物处理组-A空白组)/(A对照组-A空白组)×100％
A药物处理组为具有培养基、肿瘤细胞、药物溶液和CCK-8溶液的孔的吸光度值；
A空白组为具有培养基和CCK-8溶液，但没有肿瘤细胞和药物的孔的吸光度值；
A对照组为具有培养基、肿瘤细胞、CCK-8溶液，但没有药物溶液的孔的吸光度值。
3、实验结果：见表2。
表2肿瘤细胞的半数抑制率(IC50,μM)
Figure BDA0003218186240000191
Figure BDA0003218186240000201
由表2中数据可知，在常氧/不加酯酶条件下，功能性纳米载体包载各化疗药物的IC50值比游离的化疗药物显著提高。这是由于纳米载体CS-COO-AZO-BG NPs对各化疗药物进行了有效的包封，且在常氧条件下不能发生裂解，药物不能被释放，因此不能发挥对肿瘤细胞的抑制作用。这说明在达到肿瘤组织之前，CS-COO-AZO-BG NPs保持稳定，不会发生碎裂，也就不能释放纳米核心的药物，因而能够有效降低药物对正常组织的毒副作用。
在低氧/不加酯酶条件下，功能性纳米载体包载各化疗药物的IC50值比游离的化疗药物显著降低。这表明CS-COO-AZO-BG NPs具有良好的低氧靶向性，其中的偶氮键在低氧条件下能够有效地被还原，从而使纳米载体碎裂，释放出纳米核心的药物和AGT抑制剂O6-(3-氨基)-苄基鸟嘌呤(O6-ABG)。O6-ABG能有效抑制AGT的活性，阻断了AGT对烷化剂造成的DNA烷化损伤的修复，增加了肿瘤细胞对药物的敏感性。
在常氧/加酯酶条件下，功能性纳米载体包载各化疗药物的IC50值与游离化疗药物的IC50值相比无明显差异。这表明所合成的CS-COO-AZO-BG NPs具有良好的酯酶响应性，其中的酯基在羧酸酯酶的作用下能有效地被水解，从而使纳米载体碎裂，释放位于纳米中心的药物。而在低氧/加酯酶条件下，低氧和羧酸酯酶可分别促进纳米载体偶氮键的断裂和酯基的水解，在释放出AGT抑制剂的同时，纳米核心的药物得以充分释放，提高化疗药物在肿瘤细胞中的浓度，并发挥抗耐药的作用，从而改善治疗效果。
以上结果表明，本发明所合成的功能性纳米载体能够发挥良好的抗耐药性和低氧/酯酶双重响应性。在低氧和酯酶高表达的肿瘤微环境中，该载体上低氧靶向基团偶氮苯和酯酶响应基团酯基能够被特异性地还原与水解，使得纳米载体碎裂，释放壳结构中的AGT抑制剂与核中的抗癌药物。本发明在靶向递送抗肿瘤药物的同时，发挥抗耐药的作用，提高了化疗药物的生物利用度，降低了游离药物的全身毒性。此外，功能性纳米载体CS-COO-AZO-BG NPs对抗癌药物进行包载，显著提高了药物的稳定性以及血液循环时间，从而有利于药物更好地发挥药效。
最后本发明的实施例仅为较易的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种兼有抗耐药性和低氧/酯酶双重响应的多功能纳米载体的制备方法,其特征在于，包括以下步骤：
1)低氧与酯酶双靶向性AGT抑制剂壳聚糖偶联物CS-COO-AZO-BG的合成方法：
低氧与酯酶双靶向性AGT抑制剂壳聚糖偶联物CS-COO-AZO-BG的结构式为：
Figure FDA0004159143640000011
称取(E)-4-((3-((2-氨基-9H-嘌呤-6-基)氧基)甲基)苯基)二氮基)苯甲酸(BZCOH)溶于无水乙醇中，得到浓度为0.25-1mg/mL的BZCOH乙醇溶液；向其中加入4-二甲基氨基吡啶(DMAP)和1,3-二环己基碳二亚胺(DCC)，其中BZCOH、DMAP和DCC的投料摩尔比为1:(1-5):(5-10)，得到混合液A，将混合液A于25-60℃条件下反应4-10h；称取壳聚糖溶于质量浓度为1％的醋酸水溶液中,得到混合液B，按壳聚糖与BZCOH的投入摩尔比为1:5-1:100将混合液B滴加至混合液A中，25-60℃条件下搅拌反应24-72h；然后，将上述反应液置于透析袋中，透析袋截留分子量为3500Da，使用无水乙醇/蒸馏水(v/v)＝3:1-1:1透析，透析时间为12-72h以除去未反应的小分子化合物；将透析液冻干，即得偶联物CS-COO-AZO-BG；
2)一种兼有抗耐药性和低氧/酯酶双重响应的多功能纳米载体CS-COO-AZO-BG NPs的制备：
称取偶联物CS-COO-AZO-BG冻干粉末溶于蒸馏水中得到浓度为5-30mg/mL的偶联物水溶液，冰浴下超声处理5-30min，超声功率设为200-500W；然后，将上述反应液通过混合纤维素滤膜过滤后，真空冷冻干燥12-36h，即得纳米载体CS-COO-AZO-BG NPs；
3)载化疗药物的一种兼有抗耐药性和低氧/酯酶双重响应的多功能抗肿瘤纳米药物CS-COO-AZO-BG/Drug NPs的制备：
将疏水性化疗药物溶于有机溶剂中得到浓度为5-100mg/mL的混合液C，将偶联物CS-COO-AZO-BG冻干粉末溶于蒸馏水中得到浓度为10-35mg/mL的混合液D,将混合液C用注射器均匀地滴加至混合液D中，继续搅拌反应3-10min；然后在冰浴条件下超声处理反应液5-30min，超声功率设为200-400W；接下来，将上述超声后的反应液加至透析袋中，透析袋截留分子量为1000-2000Da，透析液是pH＝7.4的PBS，透析2-6h以除去未包封的药物；最后，将透析袋中的液体冻干，即得包载化疗药物的抗耐药性和低氧/酯酶双重响应的多功能抗肿瘤纳米药物CS-COO-AZO-BG/Drug NPs。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中BZCOH乙醇溶液浓度为0.3-1mg/mL；混合液A中，BZCOH、DMAP和DCC的投料摩尔比为1:(3-5):(5-8)；所述壳聚糖相对分子量为10000-50000Da；混合液B中，壳聚糖与BZCOH的投料摩尔比为1:20-1:80；透析时间为12-36h。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)中CS-COO-AZO-BG水溶液浓度为10-25mg/mL；超声处理的时间为10-28min；超声功率为250-400W；真空干燥时间为12-24h。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3)所述的疏水性化疗药物为DNA烷化剂类药物；所述有机溶剂为四氢呋喃、甲醇、无水乙醇中的一种或多种；混合液C的浓度为10-50mg/mL；混合液D的浓度为10-30mg/mL；混合液C和混合液D的反应时间为3-8min；超声处理时间为5-20min，超声功率为300-400W；透析时间为2-4h。
5.按照权利要求1所述制备方法所制备的一种兼有抗耐药性和低氧/酯酶双重响应的多功能纳米载体在制备治疗肿瘤药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为脑瘤、骨髓瘤、黑色素瘤、肝癌、肺癌、胃癌、白血病、结肠癌、淋巴癌中的一种或多种。
7.一种低氧与酯酶双靶向性AGT抑制剂壳聚糖偶联物CS-COO-AZO-BG，其结构式为：
Figure FDA0004159143640000041
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