CN111686076B - 载阿霉素聚合物胶束及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了载阿霉素聚合物胶束及其制备方法与应用，本发明采用新的氨基吴茱萸碱与聚乙二醇反应，自组装得到的胶束作为载体装载阿霉素，制备的mPEG‑CO‑NH‑EVO胶束和mPEG‑CO‑NH‑EVO‑OCH3胶束对正常肝细胞的毒性低，将这两种两亲性聚合物胶束作为载体，用来负载DOX制备了DOX负载的聚合物胶束mPEG‑CO‑NH‑EVO/DOX胶束和mPEG‑CO‑NH‑EVO‑OCH3/DOX胶束，DOX通过透析作用进入胶束的疏水壳中；用透射电镜和扫描电镜对胶束的形貌进行表征，用紫外分光光度计测试并计算了DOX的载药率和包封率，最后用CCK‑8法进行了细胞毒性的评价，细胞毒性实验表明DOX负载的聚合物的对乳腺癌细胞有抑制作用，尤其对正常肝细胞的毒性大大减少。

Description

载阿霉素聚合物胶束及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于载药胶束技术，具体涉及载阿霉素聚合物胶束及其制备方法与应用。
背景技术
阿霉素是广谱抗肿瘤药物，阿霉素水溶性差，临床上使用的是阿霉素的盐酸盐，对心肌、肝脏的毒副作用大。阿霉素分子本身具有多个活性基团，如羟基、氨基和羰基等。利用不同的聚合物载体与这些活性基团进行化学反应即可对阿霉素进行化学修饰，从而制备阿霉前药。阿霉素还可以通过疏水作用负载在两亲性聚合物载体中，通过形成聚合物纳米粒子进行药物的递送，一方面改善阿霉素的溶解性，另一方面降低了阿霉素的毒副作用。天然抗癌药物通常是脂溶性的，水溶性差，使得药物无法有效达到最佳治疗的血药浓度，加大给药剂量虽然可以提高血药浓度，但其毒副作用也会大大加深。为克服抗癌药物的缺点，将药物与纳米技术相结合，通过物理或化学方式包裹于纳米载体中，开发了多种纳米载药体系，如：聚合物胶束，脂质体，枝状大分子、聚合物前药等。肿瘤组织中新生血管通透性大，小粒径纳米粒子和大分子药物能渗透过去，在肿瘤部位积累的比正常组织中多，这就是“EPR效应。纳米载体通过EPR效应被动靶向富集在肿瘤细胞中，释放小分子药物，延长了血液循环，降低了毒性，从而实现药物的长效性、靶向作用和控制释放。通过使用不同取代基的原料，可以对吴茱萸碱EVO进行结构修饰，得到不同位点、不同取代基的衍生物，这些改性对抗肿瘤活性有较大影响，取代基可以改变吴茱萸碱的表面性质以及电子性质，从而对改性分子的性能有重要影响。
发明内容
本发明公开了新的氨基吴茱萸碱，并与聚乙二醇反应，自组装得到的胶束作为载体装载阿霉素，制备的mPEG-CO-NH-EVO 胶束和mPEG-CO-NH-EVO-OCH3 胶束对正常肝细胞的毒性低，将这两种两亲性聚合物胶束作为载体，用来负载DOX制备了DOX 负载的聚合物胶束mPEG-CO-NH-EVO /DOX 胶束和mPEG-CO-NH-EVO-OCH3 /DOX 胶束，DOX通过透析作用进入胶束的疏水壳中；用透射电镜和扫描电镜对胶束的形貌进行表征，用紫外分光光度计测试并计算了DOX的载药率和包封率。最后用CCK-8法进行了细胞毒性的评价。
本发明采用如下技术方案：
载阿霉素聚合物胶束，由聚合物胶束以及聚合物胶束内的阿霉素组成，所述聚合物胶束以氨基吴茱萸碱为核、聚合物为壳。
本发明公开了所述载阿霉素聚合物胶束的制备方法，包括以下步骤，将聚合物与氨基吴茱萸碱反应制备氨基吴茱萸碱聚合物偶联物；再将阿霉素溶液加入氨基吴茱萸碱聚合物偶联物溶液中，得到混合液；再将化合物加入水中，透析得到载阿霉素聚合物胶束，以溶液形式存在，去除溶剂，得到纯载阿霉素聚合物胶束。
本发明中，氨基吴茱萸碱具有如下化学结构式：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
聚合物为聚乙二醇；
氨基吴茱萸碱聚合物偶联物具有如下化学结构式：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
本发明中，R为氢、烷基或者烷氧基。
本发明中，将带有羧基和甲氧基封端的聚乙二醇（mPEG-COOH2000）分别与氨基吴茱萸碱衍生物2-NH2-EVO、10-OCH3-2-NH2-EVO在氮气保护下，以DMAP为催化剂、EDC为脱水剂条件下反应生成mPEG-CO-NH-EVO及mPEG-CO-NH-EVO-OCH3偶联物。
本发明中，反应为0℃反应2h，再室温反应48h。
本发明中，阿霉素溶液、氨基吴茱萸碱聚合物偶联物溶液中，溶剂为DMF；透析在截留分子量1000的透析袋中进行。
本发明通过透析法成功制备了DOX负载的聚合物胶束mPEG-CO-NH-EVO/DOX 胶束和mPEG-CO-NH-EVO-OCH3/DOX 胶束。mPEG-CO-NH-EVO/DOX 胶束的负载率为5.59%，mPEG-CO-NH-EVO-OCH3/DOX 胶束的负载率为6.95%聚合物胶束在500nm附近有紫外最大吸收，证明了DOX被成功负载。细胞毒性实验表明DOX负载的聚合物的对乳腺癌细胞有抑制作用，尤其对正常肝细胞的毒性大大减少。
附图说明
图1为载阿霉素聚合物胶束结构示意图；
图2为负载DOX的胶束的形貌图。 (a) mPEG-CO-NH-EVO/DOX 胶束的透射电镜,(b) mPEG-CO-NH-EVO/DOX 胶束的扫描电镜, (c)mPEG-CO-NH-EVO-OCH3/DOX 胶束的透射电镜, (d) mPEG-CO-NH-EVO-OCH3/DOX 胶束的扫描电镜；
图3为负载DOX的聚合物胶束的紫外光谱。(a) mPEG-CO-NH-EVO 胶束和mPEG-CO-NH-EVO/DOX 胶束的紫外吸收光谱, (b) mPEG-CO-NH-EVO-OCH3 胶束和mPEG-CO-NH-EVO-OCH3/DOX 胶束的紫外吸收光谱；
图4为负载DOX的聚合物胶束中DOX的体外释放。(a) mPEG-CO-NH-EVO/DOX 胶束的缓释曲线，(b) mPEG-CO-NH-EVO-OCH3/DOX 胶束的缓释曲线；
图5为负载DOX的聚合物胶束的体外细胞毒性评价。(a) mPEG-CO-NH-EVO/DOX 胶束和游离DOX与乳腺癌MDA-MB-231细胞共培养48h的存活率, 横坐标浓度为0.1、1、5、10、25μg/mL，(b) mPEG-CO-NH-EVO-OCH3/DOX 胶束和游离DOX与正常肝LO2细胞共培养48h的存活率, 横坐标浓度为0.016、0.08、0.4、2、10 μg/mL。
具体实施方式
本发明的载阿霉素聚合物胶束，由聚合物胶束以及聚合物胶束内的阿霉素组成，所述聚合物胶束以氨基吴茱萸碱为核、聚合物为壳，结构示意图参见图1。
Figure DEST_PATH_IMAGE003
合成例
参见申请人同日提交的另一篇申请：发明名称为氨基吴茱萸碱衍生物及其制备方法与应用，公开了氨基吴茱萸碱；发明名称为氨基吴茱萸碱聚合物胶束及其制备方法与应用，公开了氨基吴茱萸碱聚合物偶联物。
首先合成2个带有硝基的化合物2-硝基吴茱萸碱（7a）和10-甲氧基-2-硝基吴茱萸碱（7b）；然后再通过还原反应生成2-氨基吴茱萸碱（8a）和10-甲氧基-2-氨基吴茱萸碱（8b）。合成路线如下所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE005
化合物3,4-二氢-β-咔啉（3a）的合成
在250mL单口烧瓶中加入色胺（1a）4g（M=160.22，24.97mmol），甲酸乙酯120mL（既是反应物又是溶剂），澄清浅黄色液体，加热回流，60℃回流18小时。旋蒸，得油状液体。在烧瓶中加入二氯甲烷至溶解，0-5℃冰盐浴条件下，用滴液漏斗滴入（10分钟滴完）10mlPOCl3，冰盐浴条件下反应2h后室温反应3h。旋蒸，得黑褐色油状液体。加入10%乙酸水溶液至全部溶解。用二氯甲烷萃取多次，收集上层（水层）液体。加氨水调节pH至9.5，析出黄色固体，抽滤，得浅黄色固体，用乙酸乙酯萃取滤液并收集上层有机层，将浅黄色固体溶于乙酸乙酯中，合并有机层并旋蒸得黄色固体3,4-二氢-β-咔啉（3a）3.2g。
化合物N甲基-7-硝基靛红酸酐（6）的合成
在250ml蒸馏烧瓶中，加入2-氨基-4-硝基苯甲酸（4）4.500g（M=182.14，24.7mmol），三光气3.014g（M=296.73，10.16mmol），100ml四氢呋喃。固体全部溶解，颜色变为浅黄色。70℃回流5h，有固体析出，冷却至室温，将反应液倒入300ml冰水中，析出大量沉淀。抽滤，超纯水淋洗3次，二氯甲烷淋洗3次，烘干得淡黄色固体7-硝基靛红酸酐（5）5.01g。在250ml圆底烧瓶中，加入1.015g化合物5（M=208.13，4.88mmol），50mLDMF，溶液为黄色液体，加入氢化钠0.300g（M=24，12.5mmol），为红色液体，活化2h。滴加（10分钟滴完）碘甲烷液体3.142g（M=141.94，22.14mmol），冰水浴下反应4h。将反应液倒入300ml冰水中，析出沉淀。抽滤，用超纯水淋洗三次，烘干得黄色固体N-甲基-7-硝基靛红酸酐（6）0.670g。
2-氨基吴茱萸碱（8a）的合成
在250ml圆底烧瓶中，加入1.11g化合物6（M=222.16，5mmol），0.85g化合物3a（M=170.22，5mmol）和100mL二氯甲烷，溶解，呈澄清黄色液体。45℃加热回流18小时。抽滤，得橙黄色固体2-硝基吴茱萸碱（7a，称为2-NO2-EVO）1.164g。在250mL烧瓶里加入1.164g化合物7a（M=348，3.34mmol），然后依次加入4.00g（M=225.65，17.7mmol）的氯化亚锡二水合物，50mLDMF和10mL浓盐酸。溶液为橙红色，之后变为黄色液体。反应过夜，有沉淀析出。用NaOH调碱性至pH7-9，用乙酸乙酯萃取，旋蒸，蒸干溶剂，残留物用硅胶柱层析（二氯甲烷：乙醇=80:1）得到黄色固体2-氨基吴茱萸碱（8a，称为2-NH2-EVO）100mg。
10-甲氧基-2-氨基吴茱萸碱（8b，称为10-OCH3-2-NH2-EVO）的合成同上述方法，将色胺（1a）替换为色胺（1b），即R1为甲氧基，其余不变。化合物7b称为10-OCH3-2-NO2-EVO。
氨基吴茱萸碱聚合物偶联物的合成
将带有羧基和甲氧基封端的聚乙二醇（mPEG-COOH2000）分别与氨基吴茱萸碱衍生物2-NH2-EVO、10-OCH3-2-NH2-EVO反应，在氮气保护下，以DMAP为催化剂、EDC为脱水剂条件下反应生成mPEG-CO-NH-EVO及mPEG-CO-NH-EVO-OCH3偶联物。合成路线如下所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE007
将122.38mg（0.061mmol）mPEG-COOH2000溶于20mL干燥的DCM中，39.73mg（0.125mmol）2-NH2-EVO溶解在3mLDMF中，再补加17mL干燥的DCM，磁力搅拌均匀。氮气保护，0℃冰浴条件下用注射器缓慢滴入10mL溶有100mg（0.522mmol）EDC和8mg（0.066mmol）DMAP的DCM溶液，0℃反应2h，再室温反应48h。反应完毕后，用饱和碳酸钠溶液洗涤，再用稀盐酸洗涤，用DCM萃取，收集下层有机层，并用无水硫酸镁干燥过夜，过滤，浓缩，用冰乙醚沉淀，得 100mg黄色固体（mPEG-CO-NH-EVO偶联物）。
mPEG-CO-NH-EVO-OCH3偶联物的合成同上述方法。
实施例一 负载DOX的聚合物胶束的制备
mPEG-CO-NH-EVO/DOX 胶束的制备：
称取3mg盐酸阿霉素溶于1mLDMF，5当量的三乙胺中和盐酸，避光搅拌2h，将10mg聚合物mPEG-CO-NH-EVO-OCH3溶于1mLDMF，再将阿霉素溶液滴入聚合物溶液中，搅拌1h，再将溶液滴入10mL超纯水中，在截留分子量1000的透析袋中，透析48h，每隔4h换一次水，即得mPEG-CO-NH-EVO/DOX 胶束溶液。
mPEG-CO-NH-EVO-OCH3/DOX 胶束的制备方法如上。
作为对比，以现有氨基吴茱萸碱衍生物替换本发明2-NH2-EVO，经过同样的方法，得到mPEG-CO-NH-ENH/DOX 胶束；现有氨基吴茱萸碱衍生物化学结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE008
胶束的性能表征
（1）胶束的形貌
载药聚合物胶束的尺寸和形貌利用透射电镜(TEM)进行表征。取10uL制备的聚合物胶束溶液滴于电镜铜网上，晾干。溶剂挥发后通过透射电镜观察胶束形貌及尺寸并拍摄照片。聚合物胶束的尺寸和形貌利用扫描电镜(SEM, JSM-6610LV)进行表征。先将样品平铺在铝片上，进行喷金，模式设为传输电子，加速电压设为 3KV 观察样品形貌及尺寸。
（2）动态光散射粒径分析(DLS)
载药聚合物胶束的粒径(Dn)、粒径分布(PDI)及Zeta电位等均通过动态光散射仪(DLS, Zetasizer Nano)进行检测。测粒径用四通的石英比色池，电位用Zeta电位样品池。
载药率和包封率
阿霉素的含量通过紫外-可见分光光度计进行测量。阿霉素的标准曲线：精密称取5mg 2-NH2-EVO，置于10ml棕色容量瓶中，甲醇定容，配制成500μg/mL的储备液。将储备液稀释至5，10，25，40，60，100μg/mL等一系列不同浓度的标准溶液。以甲醇为空白，在490nm处测定溶液的吸光度（A）。以吸光度（A）为纵坐标，浓度（C）为横坐标进行线性回归。
将制备的DOX负载的聚合物胶束取3mL用紫外分光光度法测定吸光度，计算载药量和包封率。
Figure DEST_PATH_IMAGE009
采用动态透析法考察载药胶束在不同pH条件下的释放性能。吸取5mL胶束溶液放入透析袋（MW=500），置于装有200mL的pH为5.0、6.5和7.4 释放介质的烧杯中，37 ℃，200r/min恒温振荡，分别于不同时间点取出3mL透析液，同时补加3mL的空白释放介质，采用紫外分光光度法测释放介质中2-NH2-EVO的含量。
（1）pH7.4、6.5、5.0PBS缓冲液的配制
首先配制母液，称取14.32gNa2HPO4溶于200mL超纯水中得0.2M的Na2HPO4母液A。称取6.24gNaH2PO4溶于200mL超纯水中得0.2M的NaH2PO4母液B。取40.5mL母液A和9.5mL母液B，超纯水稀释至1000mL，用pH计调节pH至7.4，即得10mM pH7.4的PBS缓冲液。取15.75mL母液A和34.25mL母液B，超纯水稀释至1000mL，用pH计调节pH至6.5，即得10mM pH7.4的PBS缓冲液。取6.5mL母液A和93.5mL母液B，超纯水稀释至1000mL，用pH计调节pH至5.0，即得10mMpH7.4的PBS缓冲液。
（2）标准曲线的制备
精密称取5mg 2-NH2-EVO，置于10ml棕色容量瓶中，甲醇定容，配制成500ug/mL的储备液。将储备液稀释至1，5，20，25，50ug/mL等一系列不同浓度的标准溶液。以甲醇为空白，在285nm处测定溶液的吸光度（A）。以吸光度（A）为纵坐标，浓度（C）为横坐标进行线性回归。
（3）缓释实验
采用透析的方法在pH7.4、6.5、5.0的PBS磷酸缓冲液中进行释放。依据公式计算药物的累积释放率，同时绘制释放曲线。
药物累积释放率的计算公式：
Figure DEST_PATH_IMAGE010
式中：V0为释放介质的体积，Ct为每个时间点释放介质中2-NH2-EVO的浓度；W0为聚合物胶束中药物的总含量。
DOX的体外释放，在pH7.4、6.5、5.0的PBS磷酸缓冲液中进行释放。
体外细胞毒性试验
细胞培养
（1）细胞复苏
从-78℃冰箱中取出细胞的冻存管在37℃水浴中，使其快速融化。于800r离心5min后；弃去原液，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，吹打，制成重悬液，再倒入含有5mL培养液的培养瓶中，摇匀，放于37℃，5%CO2培养箱中培养。
（2）细胞换液
细胞培养第二天时，弃掉培养液，用PBS洗一遍，加入5mL新鲜的培养基。
（3）细胞传代（一传三）
当培养瓶内细胞的密度达到80~90%时则需将其传代。首先，将培养液弃掉，用2mLPBS冲洗2遍，加入1mL胰酶，放入37℃培养箱2min，显微镜下看到团聚的细胞正在一点点消化分开变圆，加入1mL培养液终止消化，轻轻吹打下贴壁细胞，转移至15mL离心管内，于800r离心5min后；弃去上清液，再加入1mL DMEM培养基混匀，各取300uL细胞悬液于3个培养瓶中，摇匀， 37℃，5%CO2培养箱中培养。传至第四代后方可用于体外细胞实验。
（4）细胞冻存
将一瓶细胞消化离心后，弃去培养液，加入冻存液（90%血清+10%DMSO），每个冻存管里500μL冻存液，放在冻存盒-78低温冻存。
体外细胞毒性
（1）细胞种板
分别取处于对数生长期的乳腺癌、正常肝细胞等，将细胞用胰酶进行消化后离心，弃去上清液，加入新鲜培养基制成细胞悬液，经细胞计数板进行细胞的计数，计数后将细胞接种至96孔的培养皿中。接种数量为：每孔为1×104个细胞，100uL细胞悬液。37℃，5%CO2培养箱中培养。
（2）加药
孵育24h细胞贴壁贴壁，然后进行加药。5组样品，每组均设置不同浓度。同时设置空白对照，将96孔板中的培养基弃去，加入含有不同药物浓度的100uL的培养基，培养48h。
（3）加CCK-8
在孵育48h后，每孔加入10μL的CCK-8溶液，再次放入CO2的恒温培养箱中孵育4h。利用酶标仪（450 nm）测定每孔的OD值，计算出各组样品的存活率。
Figure DEST_PATH_IMAGE011
取对数生长期的细胞，依次进行96孔板铺板、加药、共同孵育48h后加入CCK-8试剂用酶标仪在450nm处测定吸光度并计算细胞存活率。
细胞毒性实验，取对数生长期的细胞，依次进行96孔板铺板、加药、共同孵育48h后加入CCK-8试剂用酶标仪在450nm处测定吸光度并计算细胞存活率。评价负载DOX的聚合物胶束及游离的DOX对乳腺癌细胞MDA-MB-231和正常肝LO2细胞的抑制作用。
实验结果
胶束的性能
图2为DOX负载的胶束的透射和扫描电镜，2a为mPEG-CO-NH-EVO/DOX 胶束的透射电镜图，胶束形貌为圆球形，大小均匀且分布均匀，尺寸约为30nm 。2b为mPEG-CO-NH-EVO /DOX 胶束扫描电镜图，形貌为圆球，尺寸约60nm。2c为mPEG-CO-NH-EVO-OCH3/DOX 胶束的透射电镜图，形貌为圆球形，尺寸约为40nm。2d为mPEG-CO-NH-EVO-OCH3/DOX 胶束扫描电镜图，胶束形貌为圆球，分布均匀，尺寸约45nm。表1为DOX负载的聚合物胶束的Size 和Zeta电位。mPEG-CO-NH-EVO/DOX 胶束的水和直径为670nm，Zeta电位为-22.1mV，mPEG-CO-NH-EVO-OCH3/DOX 胶束的水和直径为510nm，Zeta电位为-19.9mV。
Figure DEST_PATH_IMAGE012
载药率及包封率见表2：
Figure DEST_PATH_IMAGE013
DOX负载的聚合物胶束的体外释药
图3为胶束的紫外吸收光谱。3a显示mPEG-CO-NH-EVO/DOX 胶束在500nm处有最大吸收。3b显示mPEG-CO-NH-EVO-OCH3/DOX 胶束在497nm处有最大吸收，证明DOX被成功负载。
分别将mPEG-CO-NH-EVO/DOX 胶束和mPEG-CO-NH-EVO-OCH3/DOX 胶束在pH7.4、6.5、5.0的PBS缓冲液中进行释放，通过累积释放率绘制出释放曲线如图4。DOX在500nm的紫外吸收与浓度所做的标准曲线为y=0.0156x+0.0042。
从图4a中可以看出，在最初的20h内，mPEG-CO-NH-EVO/DOX 胶束中DOX在pH7.4的PBS缓冲溶液中释放最快，60h的累计释放率为65%，能够缓慢持久的释放。随着时间的增长，DOX在pH6.5的PBS缓冲溶液中释放量逐渐增加，到60h的累积释放率达到77%，在pH5.0的PBS缓冲溶液中释放较慢，60h的累计释放率达到65%。在图4b中，mPEG-CO-NH-EVO-OCH3/DOX 胶束中DOX在pH6.5的PBS缓冲溶液中释放最快，60h的累积释放率达到59%，在pH5.0的PBS缓冲溶液中释放稍微较慢，60h的累积释放率达到47%，在pH7.4的PBS缓冲溶液中释放稍微最慢。由此可能这两种DOX负载的胶束在pH6.5的PBS缓冲溶液中，能够快速且持久的释放DOX，达到缓释的效果。
细胞毒性评价
图5为mPEG-CO-NH-EVO/DOX 胶束、mPEG-CO-NH-EVO-OCH3/DOX 胶束及DOX 对乳腺癌MDA-MB-231细胞和正常肝LO2细胞的毒性。从图5a可以看出mPEG-CO-NH-EVO-OCH3/DOX胶束及DOX对乳腺癌细胞的抑制作用呈浓度依赖，浓度越高，存活率越低；同样的方法，测试mPEG-CO-NH-ENH/DOX 胶束，其浓度为10μg/mL时，MDA-MB-231细胞存活率为68%，浓度为25μg/mL时，MDA-MB-231细胞存活率为51%。从图5b可以看出DOX负载的聚合物胶束对正常细胞的毒性远小于游离DOX，从侧面也说明这种聚合物胶束由于外层聚合物的存在起到很好的保护作用，在机体循环过程中，可以降低对正常细胞的毒副作用，延长血液循环时间，使更多的DOX达到肿瘤组织附近。
本发明通过透析法成功制备了DOX负载的聚合物胶束mPEG-CO-NH-EVO/DOX 胶束和mPEG-CO-NH-EVO-OCH3/DOX 胶束。mPEG-CO-NH-EVO/DOX 胶束的负载率为5.59%，mPEG-CO-NH-EVO-OCH3/DOX 胶束的负载率为6.95%聚合物胶束在500nm附近有紫外最大吸收，证明了DOX被成功负载。细胞毒性实验表明DOX负载的聚合物的对乳腺癌细胞的抑制作用小于游离DOX，但是对正常肝细胞的毒性也大大减少。
本发明通过对吴茱萸碱进行结构修饰，研究了不同官能团（-NO2，-OCH3及-NH2）修饰的吴茱萸碱衍生物的抗肿瘤活性，与先导化合物吴茱萸碱相比，发现合成的四种化合物中2-NH2-EVO对乳腺癌MDA-MB-231细胞表现出最好的抗肿瘤活性，对正常肝细胞的毒性较小，能够显著诱导乳腺癌细胞的凋亡，有望发展成为有潜力的抗肿瘤小分子化合物。然后引入无毒且生物相容性良好的聚乙二醇作为水溶性载体，通过酰胺键将亲水性羧基聚乙二醇和疏水性氨基吴茱萸碱连接起来，该聚合物能够在水溶液中自组装成聚合物胶束，采用溶剂挥发法成功制备了两种胶束（mPEG-CO-NH-EVO 胶束和mPEG-CO-NH-EVO-OCH3 胶束）形貌圆球形且分布均匀，聚合物胶束拥有较低的临界胶束浓度，符合作为一种稳定且毒性较低的两亲性载体，用来负载毒性较大的疏水性抗癌药物，用于药物传递。采用透析法成功将阿霉素（DOX）负载到两亲性聚合物胶束中，DOX负载的聚合物胶束对乳腺癌细胞有抑制作用，尤其是大大降低了DOX对正常肝细胞的毒性。

Claims (8)

1.载阿霉素聚合物胶束，由聚合物胶束以及聚合物胶束内的阿霉素组成，所述聚合物胶束以氨基吴茱萸碱为核、聚合物为壳；氨基吴茱萸碱具有如下化学结构式：
Figure 57934DEST_PATH_IMAGE001
R为氢或者甲氧基；
聚合物为聚乙二醇。
2.根据权利要求1所述载阿霉素聚合物胶束，其特征在于，所述载阿霉素聚合物胶束的制备方法，包括以下步骤，将聚合物与氨基吴茱萸碱反应制备氨基吴茱萸碱聚合物偶联物；再将阿霉素溶液加入氨基吴茱萸碱聚合物偶联物溶液中，得到混合液；再将化合物加入水中，透析得到载阿霉素聚合物胶束。
3.根据权利要求2所述载阿霉素聚合物胶束，其特征在于，反应为0℃反应2h，再室温反应48h；反应在氮气保护下，催化剂、脱水剂存在下进行。
4.根据权利要求2所述载阿霉素聚合物胶束，其特征在于，阿霉素溶液、氨基吴茱萸碱聚合物偶联物溶液中，溶剂为DMF；透析在截留分子量1000的透析袋中进行。
5.权利要求1所述载阿霉素聚合物胶束在制备纳米药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述纳米药物为抑制乳腺癌的纳米药物。
7.载阿霉素聚合物胶束的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，将聚合物与氨基吴茱萸碱反应制备氨基吴茱萸碱聚合物偶联物；再将阿霉素溶液加入氨基吴茱萸碱聚合物偶联物溶液中，得到混合液；再将化合物加入水中，透析得到载阿霉素聚合物胶束；氨基吴茱萸碱聚合物偶联物具有如下化学结构式：
Figure 443916DEST_PATH_IMAGE002
R为氢或者甲氧基。
8.根据权利要求7所述载阿霉素聚合物胶束的制备方法，其特征在于，透析48h，每隔4h换一次水。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103284947A (zh) * 2012-02-23 2013-09-11 重庆医科大学 吴茱萸碱纳米乳
CN107029240A (zh) * 2017-04-13 2017-08-11 江苏大学 树枝状大分子聚酰胺‑胺在吴茱萸碱中的用途

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103284947A (zh) * 2012-02-23 2013-09-11 重庆医科大学 吴茱萸碱纳米乳
CN107029240A (zh) * 2017-04-13 2017-08-11 江苏大学 树枝状大分子聚酰胺‑胺在吴茱萸碱中的用途

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
吴茱萸次碱衍生物的合成及荧光性质研究;杨若澜 等;《化学通报》;20181231;第81卷(第11期);第1028-1032页 *
新型吴茱萸碱衍生物抗小细胞肺癌活性效应的初步评价;江雪均 等;《第三军医大学学报》;20191231;第41卷(第10期);第961-986页 *

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