CN109172542B

CN109172542B - 一种多级pH响应介孔二氧化硅复合纳米粒子及其应用

Info

Publication number: CN109172542B
Application number: CN201811246637.3A
Authority: CN
Inventors: 章莉娟; 袁晓哲; 彭诗元
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2018-10-25
Filing date: 2018-10-25
Publication date: 2020-06-19
Anticipated expiration: 2038-10-25
Also published as: CN109172542A

Abstract

本发明属于纳米材料技术领域，公开了一种多级pH响应介孔二氧化硅复合纳米粒子及其应用。本发明复合纳米粒子以介孔二氧化硅为内核，以酰腙键作为连接键，功能化聚合物为外壳，功能化聚合物由疏水基团聚丙交酯、亲水基团聚乙二醇及亲水基团末端吗啉基团构成，结构式如下所示：

其中，m＝30～130，n＝23～68。本发明的多级pH响应介孔二氧化硅复合纳米粒子可作为可控释放的载体，表现出优良的pH控制释放性能：选用阿霉素作为客体分子，纳米粒子的负载量可达12wt％，包封率高达87％；其在pH 7.4和pH 6.5的环境下，24h累计释放量仅为7％和14％，但处于pH 5.0的环境下，24h累计释放量增长至43％。

Description

一种多级pH响应介孔二氧化硅复合纳米粒子及其应用

技术领域

本发明属于纳米材料技术领域，特别涉及一种多级pH响应介孔二氧化硅复合纳米粒子及其应用。

背景技术

介孔材料在催化剂、工业分离、燃料电池、生物医药等方面都有很大的前景。介孔二氧化硅纳米粒子是目前应用最广泛的有序介孔材料。介孔二氧化硅之所以受到广大研究者的关注，主要因为其合成方法简单，形貌可调、粒径可控、孔径均一且大小可调，孔道可以提供空间用来负载客体分子；其次，其成品性状稳定均一，相对于生物有机材料为基础的纳米载体，理化性质更加稳定，不易受外界因素影响；再者，具有良好的生物相容性。此外，介孔二氧化硅表面存在大量的羟基，可以进行化学修饰。

为了使介孔二氧化硅纳米粒子适应不同环境中的应用，研究者结合刺激响应体系可以对外界环境中的不同刺激产生不同的响应进而实现不同的功能，制备了一系列具有刺激响应的介孔二氧化硅纳米粒子。目前已经报道了针对不同刺激的刺激响应介孔二氧化硅材料，比如pH、温度、光、还原性、酶、电场、磁场等，材料根据刺激发生结构或性质等一系列的变化发生响应。比如专利CN 107648614A公布了一种内外双重刺激响应的纳米传输载体，该载体以介孔硅纳米粒子为核心，通过二硫键在表面偶联水溶性良好的阳离子聚合物；然后通过阳离子聚合物在纳米粒子表面引入2,3-二甲基马来酸酐，构建外层为pH刺激响应，内层为氧化还原响应的由外层到内层逐级刺激响应的特性。

近几年，功能化的介孔二氧化硅纳米粒子在抗癌药物载体领域收到了极大的关注。但是，目前大部分药物载体面临细胞摄取率低的问题，导致进入细胞的药物浓度低于治疗水平，无法达到预期的治疗效果。提高肿瘤细胞对纳米粒子的吸收，是提高药物治疗效果的有效且易实现的方式。有研究表明，纳米粒子的表面电荷对细胞对粒子的吸收起着重要的作用。由于肿瘤细胞膜带负电荷，带正电荷的粒子更容易被肿瘤组织保留，且更容易被肿瘤细胞内化。然而，血液中含有大量带有负电荷的蛋白质，带正电荷的纳米粒子在血液中容易聚集，进而导致迅速被清除，相反带负电荷的粒子可以延长粒子的循环时间，以及肿瘤组织对粒子的吸收或渗透。因此，纳米载药粒子在不同的传输阶段被希望具有不同的表面电荷。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种多级pH响应介孔二氧化硅复合纳米粒子。

本发明复合纳米粒子以介孔二氧化硅为内核，不但可以调节纳米粒子的粒径，还可以用于负载客体分子；以酰腙键作为连接键，对pH4～5酸性环境响应发生断裂，用于控制孔道的打开和闭合状态；功能化聚合物为外壳，功能化聚合物由疏水基团聚丙交酯、亲水基团聚乙二醇及亲水基团末端吗啉基团构成，用于封堵介孔二氧化硅孔道，同时聚合物上的吗啉基团可以在pH<7的环境下发生质子化，用于改变粒子表面电荷。其可作为具有改变粒子表面电荷和控制释放客体分子两种功能的载体。

本发明另一目的在于提供上述多级pH响应介孔二氧化硅复合纳米粒子作为载体的应用。

本发明的目的通过下述方案实现：

一种多级pH响应介孔二氧化硅复合纳米粒子，以介孔二氧化硅(MSN)为内核，以酰腙键作为连接键，功能化聚合物为外壳，功能化聚合物由疏水基团聚丙交酯、亲水基团聚乙二醇及亲水基团末端吗啉基团构成，结构式如下所示：

其中，m＝30～130，n＝23～68。

本发明的多级pH响应介孔二氧化硅复合纳米粒子，其内核为介孔二氧化硅纳米粒子，用于调节纳米粒子的粒径和负载客体分子；连接键酰腙键可以对pH 4～5酸性环境响应发生断裂，用于控制孔道的打开和闭合状态；所述的功能聚合物，用于封堵介孔二氧化硅的孔道，同时聚合物上的吗啉基团可以在pH<7的环境下发生质子化，用于改变粒子表面电荷。

本发明复合纳米粒子通过连接键酰腙键的pH刺激响应控制孔道的打开和闭合；通过吗啉基团的pH刺激响应实现纳米粒子表面电荷反转，且两者的pH敏感范围不同，具有由外层到内层可以逐级刺激响应的特性。

本发明多级pH响应介孔二氧化硅复合纳米粒子由表面修饰酮基的介孔二氧化硅和末端含有酰肼基团的聚合物通过缩合反应得到。

本发明多级pH响应介孔二氧化硅复合纳米粒子可通过包括以下步骤的方法制备得到：(1)先采用溶胶-凝胶法制得有序介孔二氧化硅纳米粒子；将其与含有氨基的硅烷偶联剂反应制备表面氨基化的介孔二氧化硅，然后与丙酮酸进行酰化反应得到表面修饰酮基的介孔二氧化硅；(2)通过酯化反应得到一端修饰吗啉基团的聚乙二醇，并作为引发剂，依次经过与D,L-丙交酯的开环反应、4-硝基苯基氯甲酸酯的酯化反应和水合肼的还原反应，得到末端含有酰肼基团的聚合物；(3)表面修饰酮基的介孔二氧化硅与末端含有酰肼基团的聚合物通过缩合反应形成酰腙键，得到多级pH响应的介孔二氧化硅复合纳米粒子。

具体可通过包括以下步骤的方法制备得到：

(1)采用溶胶-凝胶法制得有序介孔二氧化硅纳米粒子；

(2)将有序介孔二氧化硅纳米粒子和3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)、有机溶剂混合，100～110℃下反应24～48h，经过分离，去除模板剂，干燥得到表面氨基化的介孔二氧化硅(MSN-NH₂)；

(3)将步骤(2)得到的产物和丙酮酸、催化剂体系B溶解在水中，室温下反应24～48h，得到表面修饰酮基的介孔二氧化硅(MSN-PA)；

(4)将聚乙二醇、吗啉-4-基乙酸盐酸盐、缚酸剂、4-二甲氨基吡啶溶解于有机溶剂中，搅拌均匀，加入缩合剂，30～50℃反应24～36h，得到一端修饰吗啉的亲水聚合物(Morp-PEG-OH)；

(5)在真空条件下，将步骤(4)得到的产物和疏水单体混合，80～90℃搅拌1～2h；在惰性气体保护下，加入有机溶剂中，将温度升到110～130℃，加入辛酸亚锡，140～150℃反应6～12h，得到两亲性聚合物(MOP)；

(6)在惰性气体保护下，将步骤(5)得到的产物和4-硝基苯基氯甲酸酯、缚酸剂溶解在有机溶剂，冰浴反应0.5～2h后，室温下反应24～48h，得到末端酯化的聚合物(MOP-NPC)；

(7)将步骤(6)得到的产物和水合肼、溶剂混合，室温反应24～48h，得到末端具有酰肼基团的聚合物(MOP-NHNH₂)；

(8)将步骤(3)得到的产物分散在溶剂中，加入催化体系B，活化，加入步骤(7)得到的聚合物溶液，室温反应24～48h，得到具有多级pH响应的介孔二氧化硅复合纳米粒子(MSN-hyd-MOP)。

本发明制备方法中，各步骤反应物的质量份数如下：

步骤(2)中，含模板剂的二氧化硅34.58～51.39份；3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)48.61～65.42份；

步骤(3)中，氨基化的介孔二氧化硅34.48～41.67份；丙酮酸52.08～60.35份；催化剂体系B催化量；

步骤(4)中，聚乙二醇65.38～85.00份；吗啉-4-基乙酸盐酸盐5.15～11.87份；缚酸剂4.29～9.91份；4-二甲氨基吡啶0.18～0.42份；缩合剂5.38～12.42份；

步骤(5)中，步骤(4)所得产物17.41～29.69份；疏水单体70.28～82.57份；辛酸亚锡0.02～0.03份；

步骤(6)中，步骤(5)所得产物86.18～92.87份；4-硝基苯基氯甲酸酯6.10～11.84份；缚酸剂1.03～1.98份；

步骤(7)中，步骤(6)所得产物89.80～94.85份；水合肼5.15～10.20份；

步骤(8)中，修饰酮基的介孔二氧化硅55.56～62.50份；末端酰肼化的聚合物18.75～29.78份；催化剂体系B催化量。

步骤(1)中，所述溶胶-凝胶法为常规方法即可，如可包括以下步骤：将模板剂、催化剂A溶解在溶剂中，在80～90℃下搅拌20～30min后，加入硅源，反应2～3h，得到含有模板剂的介孔二氧化硅。

优选地，各组分质量份用量为：模板剂0.15～0.25份；催化剂A催化量；硅源0.95～0.96份；水98.75～98.84份。

本发明制备方法中，未进行具体限定的试剂均为本领域常规使用的试剂即可。

步骤(1)中，所述的模板剂为十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)中的至少一种，优选为CTAB。

步骤(1)中，所述的硅源为正硅酸甲酯、正硅酸乙酯(TEOS)、正硅酸丙酯和硅酸钠中的至少一种，优选为正硅酸乙酯(TEOS)。

步骤(4)中，所述聚乙二醇的分子量可为1000，2000和3000中的至少一种。

步骤(5)中，所述的疏水单体为D-丙交酯、L-丙交酯和D,L-丙交酯中的至少一种，优选为D,L-丙交酯。

步骤(1)中，所述的溶剂可为水和醇-水体系，醇可采用甲醇、乙醇、异丙醇，优选为水。

步骤(2)中，所述的有机溶剂为无水甲苯、无水乙醇中的至少一种，优选为无水甲苯。步骤(2)优选在无水条件下进行。

步骤(4)中，所述的有机溶剂为二氯甲烷、N,N-二甲基吡啶、二甲基亚砜中的至少一种，优选二氯甲烷。

步骤(1)中，所述的催化剂A为常规碱性物质即可，如可为氢氧化钠、氢氧化钾、三乙胺、三乙醇胺和氨水中的至少一种，优选为氢氧化钠；

步骤(2)中，所述的去模板剂指将产物分散在NH₄NO₃乙醇溶液或盐酸-甲醇溶液中80～90℃回流24h，重复2次。

步骤(3)和(8)中，所述的催化剂体系B均为N-3-(二甲氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，质量比约为4:3～2:1。

步骤(4)中，所述的缩合剂为N,N'-二异丙基碳化二亚胺(DIC)和二环己基碳二亚胺(DCC)，优选为DIC。

步骤(4)和(6)中，所述的缚酸剂相同或不同的分别为三乙胺和吡啶中的至少一种，优选分别为三乙胺。

步骤(8)中，所述的溶剂为水或磷酸缓冲溶液。

步骤(1)和步骤(3)中，所述反应后分别可通过分离、洗涤、干燥得到产物。

步骤(4)中，所述反应后可经过沉淀、过滤、干燥得到产物。

步骤(5)中，所述反应后可经过纯化、沉淀、过滤、干燥得到产物。

步骤(6)中，所述反应后可经过沉淀、过滤、干燥得到产物。

步骤(4)、(5)、(6)中，所述的沉淀指将反应液逐滴加入0℃冷乙醚中，反应液与冷乙醚的体积比为1:5～1:10，优选1:10。

步骤(5)中，所述的纯化指向反应液中加入冷水，消耗掉未反应的疏水单体，再使用三氯甲烷对产物进行萃取。

步骤(7)中，所述反应后可经过透析、冷冻干燥得到产物。

步骤(8)中，所述反应后经过离心、水洗、冷冻干燥得到产物。所述的离心，采用的转速为5000～10000rpm，离心时间15～30min。

本发明还提供上述多级pH响应介孔二氧化硅复合纳米粒子作为载体的应用。作为载体的应用，可通过以下步骤实现：

先将表面修饰酮基的介孔二氧化硅与客体分子分散于溶液中，搅拌12～24h，再加入末端含有酰肼基团的聚合物，反应，得到负载客体分子的纳米粒子。

所述搅拌12～24h是为了让客体分子扩散到介孔中从而实现负载。

所用表面修饰酮基的介孔二氧化硅、末端含有酰肼基团的聚合物的质量比优选为10:3～2:1。

本发明的多级pH响应介孔二氧化硅复合纳米粒子，其可作为可控释放的载体，表现出优良的pH控制释放性能：选用阿霉素作为客体分子，纳米粒子的负载量可达12wt％，包封率高达87％；其在pH 7.4和pH 6.5的环境下，24h累计释放量仅为7％和14％，但处于pH5.0的环境下，24h累计释放量增长至43％。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：

(1)本发明提供了一种多级pH响应的介孔二氧化硅复合纳米粒子，其形貌均一，其粒径、比表面积、孔径和孔容都能通过控制反应条件进行调控。

(2)本发明的多级pH响应介孔二氧化硅复合纳米粒子可作为载体，其具有良好的负载量，且能有效地封堵孔道，防止泄露。

(3)本发明多级pH响应介孔二氧化硅复合纳米粒子中连接孔道封堵剂的酰腙键可对pH 4～5的酸性环境响应而发生断裂，可以控制孔道的打开与闭合，因此具有pH响应控制释放的性能；吗啉基团可以智能调节复合纳米粒子表面电荷，提高复合纳米粒子的分散性和稳定性。

附图说明

图1为实施例1中MSN-hyd-MOP纳米粒子的透射电镜(TEM)图。

图2为实施例1中MSN-NH₂、MSN-PA和MSN-hyd-MOP纳米粒子的红外光谱对比图。

图3为实施例1中MSN-NH₂、MSN-PA和MSN-hyd-MOP纳米粒子的热重分析对比图。

图4为实施例1中MSN-hyd-MOP纳米粒子的¹³C核磁谱图。

图5为实施例1中MSN-NH₂、MSN-PA和MSN-hyd-MOP纳米粒子的N₂吸附脱附曲线对比图。

图6为实施例1中MSN-NH₂、MSN-PA和MSN-hyd-MOP纳米粒子的孔径分布对比图。

图7为实施例1中MSN-hyd-MOP纳米粒子在不同pH条件下的zeta电位图。

图8为实施例3中MSN-hyd-MOP@Dox(实施例2产物)载药粒子体外药物释放曲线图。

图9为实施例4中MSN-hyd-MOP(实施例1产物)空白复合纳米粒子的体外细胞毒性。

图10为实施例4中MSN-hyd-MOP@Dox(实施例2产物)载药粒子的体外细胞毒性。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中涉及的物料均可从商业渠道获得。

实施例1：多级pH响应介孔二氧化硅复合纳米粒子的制备，各组分用量比例按照质量体积摩尔份计算，g/mL/mmol：

(1)含有表面活性剂的介孔二氧化硅的制备：称取CTAB(0.2质量份)加入96体积份水，加热到80℃，加入氢氧化钠溶液(2M，0.7体积份)，搅拌30min，使模板剂形成胶束。然后逐滴加入TEOS(1.0体积份)，80℃反应2h。反应完成后，冷却到室温，10000rpm离心分离，用水洗涤数次，30℃真空干燥24h，得白色粉末(MSN@CTAB)。

所述步骤(1)中反应物的重量份数如下：CTAB 0.20份；氢氧化钠0.06份；TEOS0.96份；水98.78份；

(2)表面氨基化介孔二氧化硅的制备：合成反应式如下：

称取MSN@CTAB(0.5质量份)分散在20体积份无水甲苯中，置于110℃油浴锅中，回流2h，用注射器将硅烷偶联剂APTES(0.75体积份)逐滴加入，110℃回流反应24h。反应完成后，冷却至室温，5600rpm离心分离反应液，使用乙醇洗涤沉淀3次，收集沉淀。将沉淀重新分散在NH₄NO₃的乙醇溶液中(0.4质量份NH₄NO₃/70体积份乙醇)，置于80℃的油浴锅中，回流24h，去除模板剂。冷却至室温后，5600rpm离心分离，用乙醇洗涤3次，将离心得到的白色固体置于30℃真空干燥24h，得到白色固体(MSN-NH₂)。

所述步骤(2)中的反应物的重量份数如下：含模板剂的介孔二氧化硅41.34份；APTES 58.66份；

(3)表面修饰酮基的介孔二氧化硅的制备：

合成反应式如下：

将MSN-NH₂(0.5质量份)分散在5体积份水中得到MSN-NH₂的悬浮液。取30体积份水、丙酮酸(PA，0.6体积份)以及催化体系EDC(0.05质量份)和NHS(0.025质量份)，室温下搅拌2h，活化羧基。将MSN-NH₂的悬浮液加入上述反应液中，室温下反应24h。反应完成后，5600rpm离心分离，用水洗涤沉淀3次，30℃真空干燥24h，得到淡黄色固体即产物(MSN-PA)。介孔二氧化硅表面酮基的表面密度为0.25mmol/g。

所述步骤(3)中反应物的质量份数如下：氨基化的介孔二氧化硅37.74份；丙酮酸56.60份；催化剂体系B 5.66份；

(4)一端修饰吗啉的亲水聚合物吗啉-4-乙酰基-聚乙二醇(Morp-PEG-OH)的制备，合成反应式如下：

称取亲水聚合物PEG(2摩尔份)、吗啉-4-基乙酸盐酸盐(2摩尔份)、催化剂4-二甲氨基吡啶(0.01摩尔份)置于反应瓶中，密封，抽真空-通氩气3次，使用注射器将20体积份二氯甲烷(DCM)和缚酸剂三乙胺(3摩尔份)注入，搅拌30min，使固体全部溶解。将缩合剂N,N'-二异丙基碳化二亚胺(DIC)(3摩尔份)溶于5体积份DCM中，逐滴加入反应液中，将茄形瓶转移至油浴锅中，加热到40℃，反应24h。反应完成后，旋蒸移除大部分溶剂。将浓缩液滴入0℃冷乙醚(体积比1：10)生成沉淀，过滤收集沉淀。将沉淀再次溶解在30体积份DCM中，用饱和食盐水洗涤3次，取无水硫酸镁加入溶液中，干燥过夜，过滤。将滤液缓慢滴入0℃冷乙醚中再沉淀，过滤收集沉淀。将沉淀置于30℃下真空干燥24h，即可得到白色固体。

所述步骤(4)中反应物的质量份数如下：聚乙二醇2000 79.11份；吗啉-4-基乙酸盐酸盐7.18份；三乙胺5.93份；二甲氨基吡啶0.26份；缩合剂7.52份；

(5)两亲聚合物吗啉-4-乙酰基-聚乙二醇-b-聚丙交酯(MOP)的制备

合成反应式如下：

取Morp-PEG-OH(1.2质量份，0.6摩尔份)、D,L-丙交酯(3.98质量份，28摩尔份)密封后抽真空-通氩气，重复3次，再次抽真空后，置于80℃油浴锅中搅拌2h。冷却到室温后，再次抽真空-通氩气，重复3次，将4体积份甲苯注入反应瓶中，转移至120℃油浴锅中。加入辛酸亚锡(0.010体积份)溶于1体积份甲苯，注入反应瓶中，搅拌均匀。将油浴锅加热到150℃，反应12h。反应完成后，冷却到室温后，加入20体积份冷水，除去未反应的丙交酯，用20体积份三氯甲烷萃取产物。将萃取得到的溶液，滴入200体积份冷乙醚中使产品沉淀，过滤，重复2次。将沉淀置于30℃真空干燥即可得到半透明固体MOP。M_n＝6800，PDI＝1.29。

所述步骤(5)中反应物的质量份数如下：修饰吗啉的亲水聚合物23.16份；疏水单体76.82份；辛酸亚锡0.02份；

(6)聚合物吗啉-4-乙酰基-聚乙二醇-b-聚丙交酯的对硝基氯甲酸苯酯衍生物(MOP-NPC)的制备

合成反应式如下：

取聚合物MOP(M_n＝6800，0.5摩尔份，3.4质量份)密封后抽真空-通氩气，重复3次。使用注射器加入5体积份含有三乙胺(TEA，0.5摩尔份，0.07体积份)的DCM，用冰水浴将反应瓶冷却到0℃。取4-硝基苯基氯甲酸酯(NPC，1.5摩尔份，0.3023质量份)溶解在5体积份DCM中，用注射器逐滴加入反应瓶中，冰浴反应1h后，室温反应24h。将反应液滴入冷乙醚(体积比1：10)中形成沉淀，再使用10体积份DCM溶解沉淀，再次使用冷乙醚沉淀，重复3次，将沉淀置于30℃下，真空干燥得到白色固体。

所述步骤(6)中反应物的质量份数如下：步骤(5)所得产物90.62份；4-硝基苯基氯甲酸酯8.05份；缚酸剂1.33份；

(7)聚合物吗啉-4-乙酰基-聚乙二醇-b-聚丙交酯的肼衍生物(MOP-NHNH₂)的制备

合成反应式如下：

取聚合物MOP-NPC(0.3摩尔份，2.1质量份)密封后抽真空-通氩气，重复3次，注入20体积份DMF，搅拌30min，使产物溶解。将水合肼(3摩尔份，0.138体积份)加入5体积份DMF中稀释，使用注射器将稀释溶液逐滴注入反应瓶中，室温下反应12h。反应完成后，将反应液转移至透析袋(MWCO 3500)中，用1L水透析3天，第一天4h更换依次透析介质，后两天8h更换一次透析介质。将聚合物溶液冷冻干燥，得到白色固体。

所述步骤(7)中反应物的质量份数如下：步骤(6)所得产物93.3份；水合肼6.67份；

(8)多级pH刺激响应的介孔二氧化硅纳米粒子的制备

合成反应式如下：

将MSN-PA(0.1质量份)分散在10体积份水中，滴入2滴醋酸，加入EDC(0.02质量份)和NHS(0.01质量份)搅拌2h。将聚合物MOP-NHNH₂(40质量份)溶解在1体积份THF溶液中。使用注射器将聚合物的溶液缓慢滴加至混合溶液中，室温搅拌24h。反应完成后，5600rpm离心分离，用PBS缓冲溶液(pH 7.4)洗涤沉淀3次，冷冻干燥。

所述步骤(8)中反应物的质量份数如下：修饰酮基的介孔二氧化硅58.82份；末端酰肼化的聚合物23.52份；催化剂体系B 17.65份。

对实施例制备得到的纳米粒子进行表征，结果见图1～图7。

图1为实施例1中MSN-hyd-MOP纳米粒子的透射电镜(TEM)图。

图4为实施例1中MSN-hyd-MOP纳米粒子的¹³C核磁谱图。

实施例2：负载阿霉素纳米粒子的制备

将MSN-PA(0.1质量份)、盐酸阿霉素(Dox)(0.02质量份)分散在10体积份PBS(pH7.4)缓冲溶液中，室温下避光搅拌24h。滴入2滴醋酸，加入催化剂体系EDC(0.02质量份)和NHS(0.01质量份)搅拌2h。将聚合物MOP-NHNH₂(0.18质量份，0.03摩尔份)溶解在1体积份THF溶液中。使用注射器将聚合物的溶液缓慢滴加入混合溶液中，室温搅拌24h。反应完成后，5600rpm离心分离，用PBS缓冲溶液(pH 7.4)洗涤至上清液几乎无色，冷冻干燥，即可得到载药颗粒(MSN-hyd-MOP@Dox)。载药量为12wt％，包封率为87％。

实施例3：释放实验

释放性能的测定：精确称取25mg负载阿霉素纳米粒子分别分散在40mL pH 7.4磷酸缓冲溶液、pH 6.5磷酸缓冲溶液和pH 5.0醋酸缓冲溶液中，然后放置在温度为37.2℃，转速150rpm的空气摇床中。一定时间间隔取一次样，每次取出4体积份悬浮液，离心分离，倒出上清液，将沉淀转入原悬浮液中，补充4体积份新鲜缓冲液。用紫外分光光度计测量取出的上清液在480nm处的吸光度，计算不同时间释放液中阿霉素的浓度，每个实验重复三次，取平均值绘制释放曲线，结果见图8。

由图8可见，载药粒子MSN-hyd-MOP@Dox(实施例2的产物)在pH 7.4条件下，经过24h的释放，仅7％Dox从MSN-hyd-MOP中释放出来，表明聚合物可以有效的将药物封堵在介孔孔道中。当酸性降至pH 6.5条件下，药物的释放量也仅为14％，而当pH降低到pH 5.0条件下，酰腙键断裂，聚合物脱离介孔二氧化硅表面暴露孔道，药物载体24h累积释放量为43％。载体在不同pH环境下的释放差异，表明载体MSN-hyd-MOP具有pH智能控制释放特性。

实施例4多级pH响应介孔二氧化硅复合纳米粒子的细胞毒性测试

毒性测试：取96孔平底组织培养板，将四周孔板中分别加入200μL细胞培养基(DMEM)作为空白组。中间60个孔中每孔以1x10⁴细胞/孔(200μL)的细胞浓度接种HepG2细胞(购买于ATCC)，其中第2列作为对照，将96孔板放置到37℃，饱和湿度，5％CO₂培养箱中培养48h。

随后将游离阿霉素、空白纳米粒子、载药纳米粒子用DMEM稀释成不同的聚合物浓度(空白粒子1～200mg/L)或药物浓度(游离阿霉素或载药粒子，0.1～20mg/L)。在移走96孔板中从第2列到第11列所有孔中的细胞培养介质后，在第2列中加入新鲜的培养介质，作为对照。从第3列到第10列，向所有的孔中分别加入200μL的样品溶液，每个浓度的样品加入到6个孔中进行重复。

在经过48h的培养后，吸走所有含有细胞的孔中的上清液，加入200μL的PBS润洗细胞，然后吸走PBS。从第2列到第11列，分别向每个孔中加入20μL的MTT溶液和180μL的培养介质，然后将96孔板放置于培养箱中培养4h。随后吸走未还原的MTT溶液和培养介质。每个孔用200μL的PBS洗一遍，并吸走PBS。向每个孔中加入200μL的DMSO溶解MTT结晶。整个96孔板放在37℃摇床中振荡10min，然后利用酶标仪测定490nm处每个孔的吸光度，进而计算细胞存活率。

图9是空白粒子(实施例1产物)的毒性结果，从图中可知，纳米粒子MSN-hyd-MOP对HepG2细胞基本无毒，在200mg/L的高浓度下细胞存活率仍然高达91％。

图10是游离Dox、Dox载药纳米粒子(实施例2产物)的细胞毒性结果。从图中可知，经过48h培养后，低浓度(0.1mg/L)的载药粒子就可以杀死细胞，有明显的增强作用；在高浓度(20mg/L)时，载药粒子和游离Dox杀死细胞的效果是相似的，有超过80％的细胞被杀死。实施例2产物制备的Dox载药粒子与游离阿霉素有相近的细胞毒性，说明阿霉素经包载后可以有效的保持其抗癌活性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种多级pH响应介孔二氧化硅复合纳米粒子，其特征在于以介孔二氧化硅为内核，以酰腙键作为连接键，功能化聚合物为外壳，功能化聚合物由疏水基团聚丙交酯、亲水基团聚乙二醇及亲水基团末端吗啉基团构成，结构式如下所示：

其中，m＝30～130，n＝23～68。

2.根据权利要求1所述的多级pH响应介孔二氧化硅复合纳米粒子，其特征在于由表面修饰酮基的介孔二氧化硅和末端含有酰肼基团的聚合物通过缩合反应得到。

3.根据权利要求1所述的多级pH响应介孔二氧化硅复合纳米粒子，其特征在于通过包括以下步骤的方法制备得到：(1)先采用溶胶-凝胶法制得有序介孔二氧化硅纳米粒子；将其与含有氨基的硅烷偶联剂反应制备表面氨基化的介孔二氧化硅，然后与丙酮酸进行酰化反应得到表面修饰酮基的介孔二氧化硅；(2)通过酯化反应得到一端修饰吗啉基团的聚乙二醇，并作为引发剂，依次经过与D,L-丙交酯的开环反应、4-硝基苯基氯甲酸酯的酯化反应和水合肼的还原反应，得到末端含有酰肼基团的聚合物；(3)表面修饰酮基的介孔二氧化硅与末端含有酰肼基团的聚合物通过缩合反应形成酰腙键，得到多级pH响应的介孔二氧化硅复合纳米粒子。

4.根据权利要求1所述的多级pH响应介孔二氧化硅复合纳米粒子，其特征在于具体通过包括以下步骤的方法制备得到：

(1)采用溶胶-凝胶法制得有序介孔二氧化硅纳米粒子；

(2)将有序介孔二氧化硅纳米粒子和3-氨基丙基三乙氧基硅烷、有机溶剂混合，100～110℃下反应24～48h，经过分离，去除模板剂，干燥得到表面氨基化的介孔二氧化硅；

(3)将步骤(2)得到的产物和丙酮酸、催化剂体系B溶解在水中，室温下反应24～48h，得到表面修饰酮基的介孔二氧化硅；

(4)将聚乙二醇、吗啉-4-基乙酸盐酸盐、缚酸剂、4-二甲氨基吡啶溶解于有机溶剂中，搅拌均匀，加入缩合剂，30～50℃反应24～36h，得到一端修饰吗啉的亲水聚合物；

(5)在真空条件下，将步骤(4)得到的产物和疏水单体混合，80～90℃搅拌1～2h；在惰性气体保护下，加入有机溶剂中，将温度升到110～130℃，加入辛酸亚锡，140～150℃反应6～12h，得到两亲性聚合物；

(6)在惰性气体保护下，将步骤(5)得到的产物和4-硝基苯基氯甲酸酯、缚酸剂溶解在有机溶剂，冰浴反应0.5～2h后，室温下反应24～48h，得到末端酯化的聚合物；

(7)将步骤(6)得到的产物和水合肼、溶剂混合，室温反应24～48h，得到末端具有酰肼基团的聚合物；

(8)将步骤(3)得到的产物分散在溶剂中，加入催化体系B，活化，加入步骤(7)得到的聚合物溶液，室温反应24～48h，得到具有多级pH响应的介孔二氧化硅复合纳米粒子；

步骤(3)和(8)中，所述的催化剂体系B均为N-3-(二甲氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，质量比为4:3～2:1。

5.根据权利要求4所述的多级pH响应介孔二氧化硅复合纳米粒子，其特征在于：各步骤反应物的质量份数如下：

步骤(2)中，含模板剂的二氧化硅34.58～51.39份；3-氨基丙基三乙氧基硅烷48.61～65.42份；

6.根据权利要求4所述的多级pH响应介孔二氧化硅复合纳米粒子，其特征在于：步骤(1)中，所述溶胶-凝胶法包括以下步骤：将模板剂、催化剂A溶解在溶剂中，在80～90℃下搅拌20～30min后，加入硅源，反应2～3h，得到含有模板剂的介孔二氧化硅；各组分质量份用量为：模板剂0.15～0.25份；催化剂A催化量；硅源0.95～0.96份；水98.75～98.84份；

所述的催化剂A为常规碱性物质。

7.根据权利要求4所述的多级pH响应介孔二氧化硅复合纳米粒子，其特征在于：

步骤(1)中，所述的溶胶-凝胶法中的模板剂为十六烷基三甲基溴化铵和十六烷基三甲基氯化铵中的至少一种；

步骤(1)中，所述的溶胶-凝胶法中的硅源为正硅酸甲酯、正硅酸乙酯、正硅酸丙酯和硅酸钠中的至少一种；

步骤(4)中，所述聚乙二醇的分子量为1000，2000或3000中的至少一种；

步骤(5)中，所述的疏水单体为D-丙交酯、L-丙交酯和D,L-丙交酯中的至少一种。

8.权利要求2～7任一项所述的多级pH响应介孔二氧化硅复合纳米粒子作为载体的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于通过以下步骤实现：先将表面修饰酮基的介孔二氧化硅与客体分子分散于溶液中，搅拌12～24h，再加入末端含有酰肼基团的聚合物，反应，得到负载客体分子的纳米粒子。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所用表面修饰酮基的介孔二氧化硅、末端含有酰肼基团的聚合物的质量比为10:3～2:1。