CN107648614A - 内外双层逐级刺激响应纳米传输载体及制备方法与应用 - Google Patents

内外双层逐级刺激响应纳米传输载体及制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种内外双层逐级刺激响应纳米传输载体及制备方法与应用。本发明通过二硫键修饰的MCM‑41型介孔硅纳米粒子分散在溶液中，表面偶联阳离子聚合物，然后通过阳离子聚合物，在纳米粒子表面偶联2,3‑DMMA，制备具有双重刺激响应的介孔硅纳米载体。该纳米载体具有外层为pH刺激响应、内层为氧化还原刺激响应的由外层到内层逐级刺激响应特性，药物分子可以封装到纳米粒子的介孔孔道中，阳离子聚合物则可以绑定基因，适合制备药物传输载体、核酸传输载体或药物‑核酸共传输载体。

Description

内外双层逐级刺激响应纳米传输载体及制备方法与应用
技术领域
本发明属于纳米药剂领域，特别涉及一种内外双层逐级刺激响应纳米传输载体及制备方法与应用。
背景技术
近年来，基于纳米技术的药物传递系统(DDS)在癌症治疗中展现出显著的成绩，主要原因是纳米药物载体可通过加强渗透与滞留效应(EPR)，提高药物的动力学和药效学水平。其中，介孔硅纳米粒子(MSNs)是一种多孔道结构的纳米粒子，基于MSNs的DDS系统在药物、基因的传输控释方面受到广泛关注，MSNs作为纳米传输载体有以下优点：①良好的生物相容性，无细胞毒性；②具有有序的孔道结构、巨大的表面积，能够有效地将小分子和生物大分子包埋在粒子内部，且粒子尺寸可调控；③表面易修饰，通过不同分子的表面修饰，可实现传输载体的环境响应释放。
然而，受限于体内复杂的生理环境，介孔硅纳米传输载体容易被免疫系统清除、负载药物提前释放、细胞内在化率低及胞内药物释放量少等问题，导致药物的生物利用度低，临床应用效率低。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于介孔硅纳米粒子的内外双层逐级刺激响应纳米传输载体的制备方法。
本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的内外双层逐级刺激响应纳米传输载体。
本发明的再一目的在于提供所述的内外双层逐级刺激响应纳米传输载体的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种内外双层逐级刺激响应纳米传输载体的制备方法，包括以下步骤：
(1)将MCM-41型介孔硅纳米粒子分散在溶液中，加入3,3’-二硫代二丙酸(TPA)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，反应，得到的含二硫键修饰的纳米粒子；
(2)将含二硫键修饰的纳米粒子分散于含阳离子聚合物的溶液中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)催化反应；反应完毕，冷冻干燥，得到阳离子聚合物修饰的介孔硅纳米粒子；
(3)将2,3-二甲基马来酸酐溶于二甲基亚砜(DMSO)中，加入阳离子聚合物修饰的介孔硅纳米粒子，惰性气体保护下反应，反应完毕，离心分离，得到内外双层逐级刺激响应介孔硅纳米载体。
步骤(1)中所述的MCM-41型介孔硅纳米粒子优选孔径为2～20纳米的介孔硅纳米粒子；更优选粒径为100～200nm、孔径为2～20纳米的介孔硅纳米粒子。
步骤(1)中所述的MCM-41型介孔硅纳米粒子优选通过如下步骤制备得到：以正硅酸乙酯(TEOS)为原料和γ-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)共水解，十六烷基三甲基溴化铵为表面活性剂，1,3,5-三甲基苯为制孔剂，控制γ-氨基丙基三乙氧基硅烷的比例，反应，制备得到MCM-41型介孔硅纳米粒子。
所述的γ-氨基丙基三乙氧基硅烷的加入摩尔量相当于正硅酸乙酯摩尔量的0～0.3倍；优选为0.05倍。
所述的1,3,5-三甲基苯的用量为TEOS摩尔量的0.5～2倍。
所述的反应的温度优选为70～80℃。
所述的MCM-41型介孔硅纳米粒子更优选通过如下步骤制备得到：将1.0g CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)溶于480mL水与3.5mL 2.0mol/L NaOH配成的混合溶液中，升温至70℃，分别滴加5.0mL(22mmol)TEOS(正硅酸乙酯)、0.25mL(1.1mmol)APIES(γ-氨基丙基三乙氧基硅烷)和2.0mL1,3,5-三甲基苯，保持反应温度70℃，剧烈搅拌反应2h。反应完毕，滤过沉淀物，用甲醇洗涤，将得到的产物分散在50mL乙醇-HCl溶液(48mL无水乙醇+2mL浓度为37％(w/v)的浓盐酸混合得到)中，80℃剧烈搅拌10h，除去CTAB，最后过滤沉淀，真空干燥，得到氨基化介孔硅纳米粒子。
所述的3,3’-二硫代二丙酸的质量用量相当于所述的介孔硅纳米粒子质量的1/4。
所述的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量用量相当于所述的介孔硅纳米粒子质量的1/5。
步骤(2)中所述的阳离子聚合物是具有pH敏感性的阳离子聚合物，优选为聚丙烯酰亚胺(PEI)、聚酰胺-胺型树枝状高分子(PAMAM)、树枝状聚赖氨酸(PLLD)和壳聚糖中的一种或至少两种形成的共聚物。
步骤(2)中所述的反应是通过点击化学法在介孔硅纳米粒子表面接枝含量可控的阳离子聚合物。
步骤(2)中所述的阳离子聚合物的用量按其与介孔硅纳米粒子＝重量比1∶10～1∶1配比。
步骤(3)中所述的惰性气体优选为氮气。
步骤(3)中所述的反应的时间优选为24h。
一种具有内外双层逐级刺激响应特性的介孔硅纳米载体，通过上述制备方法得到。
所述的内外双层逐级刺激响应介孔硅纳米载体水分散性良好、生物相容性良好、毒性低、粒径尺寸为100-200nm、孔径尺寸为2-10nm且分布均匀。
所述的内外双层逐级刺激响应介孔硅纳米载体在制备药物传输载体、核酸传输载体或药物-核酸共传输载体中的应用。该内外双层逐级刺激响应介孔硅纳米载体，能够有效地保持纳米粒子的介孔结构，孔道直径在2-10nm，药物分子通过吸附作用，能够大量贮存在孔道内部，因此对药物具有较强的负载能力；该内外双层逐级刺激响应介孔硅纳米载体，通过静电作用可以和带负电荷的核酸形成紧密的复合物，因此对核酸也具有较强的负载能力，在用作核酸传输载体时，传输载体表面所带正电荷与核酸的摩尔比为1:1-80:1；该内外双层逐级刺激响应介孔硅纳米载体也可同时负载药物和核酸，实现药物和核酸的共传输。
所述的药物包括化学分子药物、蛋白药物以及中药提取制剂等等。
所述的核酸包括RNA和DNA。
所述的RNA包括siRNA、shRNA和miRNA等。
本发明的原理：本发明以介孔硅纳米粒子为核心，通过二硫键在MSNs表面偶联水溶性良好的阳离子聚合物，然后通过阳离子聚合物在纳米粒子表面引入2,3-二甲基马来酸酐，构建具有内外双重刺激响应的肿瘤靶向DDS系统。传输载体在血液中循环可保持稳定，进入肿瘤细胞后，在肿瘤细胞外弱酸性环境下脱落2,3-二甲基马来酸酐，表面电荷由负电荷反转为正电荷，既避免免疫系统的清除，又能提高肿瘤细胞的吞噬，实现纳米载体的外在刺激响应性；进入肿瘤细胞后，在肿瘤细胞内高浓度谷胱甘肽(GSH)的剌激下，阳离子聚合物从纳米载体表面脱落，从而在细胞内特异性释放出负载的药物，实现纳米载体的内在刺激响应性。通过上述设计，制备水分散性良好、生物相容性良好、具有内外双重刺激响应的肿瘤靶向DDS系统，及其在基因和药物传输载体上的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明提供的内外双层逐级刺激响应的介孔硅纳米载体，具有外层为pH刺激响应、内层为氧化还原刺激响应的由外层到内层逐级刺激响应特性。载体表面具有负电荷，能够有效避免血液中巨噬细胞对载体的清除，提高纳米载体负载的药物在血液环境中稳定性(图1体外模拟药物释放曲线)；到达靶细胞组织后，由于pH值变化使2,3-二甲基马来酸酐脱落，载体表面带正电荷(图2Zeta电位测定载体表面电荷随pH变化图)，提高肿瘤细胞的吞噬效率；进入肿瘤细胞后，在胞内谷胱甘肽的作用下，产生内层刺激响应，表面修饰的聚合物脱落，负载的药物在肿瘤细胞内靶向累积释放(图5阿霉素在Hela细胞内的累积释放照片)，将有效提高药物生物利用度。
(2)本发明提供的内外双层逐级刺激响应介孔硅纳米载体水分散性良好、生物相容性良好、毒性低、粒径尺寸为100-200nm、孔径尺寸为2-10nm且分布均匀。
附图说明
图1为实施例1制备的纳米传输载体所负载的阿霉素在模拟血液GSH浓度(0.01mM)和肿瘤细胞微环境的GSH浓度下(10mM)累计释放曲线图。
图2为实施例1制备的介孔硅纳米粒子在不同条件下的Zeta电位检测结果图。
图3为MTT法测定实施例1、4、5制备的纳米传输载体体外细胞毒性的检测结果图。
图4为实施例1、4和5(分别对应A、B、C)制备的纳米载体透射电镜照片图。
图5为不同条件下阿霉素在Hela细胞内的释放结果图。
图6为流式细胞测定Hela细胞凋亡的结果图。
图7为实施例5制备的纳米传输载体复合pDNA后的凝胶电泳图。
图8为实施例5制备的纳米传输载体复合不同比例pDNA后转染效率结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)将1.0g CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)溶于480mL水与3.5mL 2.0mol/L NaOH配成的混合溶液中，升温至70℃，分别滴加5.0mL(22mmol)TEOS(正硅酸乙酯)、0.25mL(1.1mmol)APTES(γ-氨基丙基三乙氧基硅烷)和2.0mL1,3,5-三甲基苯，保持反应温度70℃，剧烈搅拌反应2h。反应完毕，滤过沉淀物，用甲醇洗涤，将得到的产物分散在50mL乙醇-HCl溶液(48mL无水乙醇+2mL浓度为37％(w/v)的浓盐酸混合得到)中，80℃剧烈搅拌10h，除去CTAB，最后过滤沉淀，真空干燥，得到氨基化介孔硅纳米粒子。将0.20g氨基化介孔硅纳米粒子分散在水溶液中，加入0.05g 3,3’-二硫代二丙酸和0.04g EDC，室温下反应24h，离心分离，得到含二硫键的纳米粒子。
(2)将0.20g含二硫键的纳米粒子，加入到5ml含有0.02g盐酸阿霉素的PBS溶液中(pH7.4，0.1M)，搅拌24h，使阿霉素充分吸附到介孔硅纳米粒子中，然后在负载阿霉素的纳米粒子分散液中加入0.10g PEI，再加入0.05g EDC和0.03g NHS催化反应。反应完毕，10,000转/min离心5分钟，除去未接枝的聚合物。产物冷冻干燥，即得负载阿霉素的PEI/介孔硅纳米载体。
(3)将0.05g 2,3-二甲基马来酸酐溶于10ml DMSO中，加入负载阿霉素(DOX)的PEI/介孔硅纳米载体0.20g，氮气保护下反应24h，反应完毕，离心分离，得到2,3-二甲基马来酸酐修饰的负载阿霉素的PEI/介孔硅纳米载体。
(4)空白载体的制备：将步骤(1)制备的含二硫键的纳米粒子0.20g和0.10g PEI混匀，再加入0.05g EDC和0.03g NHS催化反应。反应完毕，10,000转/min离心5分钟，除去未接枝的聚合物。产物冷冻干燥，即得PEI修饰的介孔硅纳米载体。将0.05g 2,3-二甲基马来酸酐溶于10ml DMSO中，加入PEI修饰的介孔硅纳米粒子0.20g，氮气保护下反应24h，反应完毕，离心分离，得到空白载体。
实施例2
(1)作为参比，以等量的丁二酸酐代3,3’-二硫代二丙酸，其他步骤同实施例1步骤(1)，制备不含二硫键的纳米粒子。
(2)将0.20g不含二硫键的纳米粒子，加入到5ml含有0.02g盐酸阿霉素的PBS溶液中(pH7.4)，搅拌24h，使阿霉素充分吸附到介孔硅纳米粒子中，然后在负载阿霉素的纳米粒子分散液中加入0.10g PEI，再加入0.05g EDC和0.03g NHS催化反应。反应完毕，10,000转/min离心5分钟，除去未接枝的聚合物。产物冷冻干燥，即得负载阿霉素的PEI/介孔硅纳米载体。
(3)将0.05g 2,3-二甲基马来酸酐溶于10ml DMSO中，加入负载阿霉素的PEI/介孔硅纳米载体0.20g，氮气保护下反应24h，反应完毕，离心分离，得到2,3-二甲基马来酸酐修饰的负载阿霉素的PEI/介孔硅纳米载体。
实施例3
(1)制备过程同实施例1步骤(1)，得到含二硫键的纳米粒子。
(2)二代聚酰胺-胺型树枝状高分子(PAMAM)按文献[Mesoporous silicananoparticles with controlled loading of cationic dendrimer for genedelivery.Materials Research Express,2014,1:035403.]报道的方法进行制备。
(3)将0.20g含二硫键的纳米粒子，加入到5ml含有0.02g盐酸阿霉素的PBS溶液中(pH7.4)，搅拌24h，使阿霉素充分吸附到介孔硅纳米粒子中，然后在负载阿霉素的纳米粒子分散液中加入0.10g PAMAM，再加入0.05g EDC和0.03g NHS催化反应。反应完毕，10,000转/min离心5分钟，除去未接枝的聚合物。产物冷冻干燥，即得负载阿霉素的PAMAM/介孔硅纳米载体。
(4)将0.05g 2,3-二甲基马来酸酐溶于10ml DMSO中，加入步骤(3)得到的纳米粒子0.20g，氮气保护下反应24h，反应完毕，离心分离，得到2,3-二甲基马来酸酐修饰的负载阿霉素的PAMAM/介孔硅纳米载体。
实施例4
(1)制备过程同实施例1步骤(1)，得到含二硫键的纳米粒子。
(2)三代树枝状聚赖氨酸(PLLD)按文献[A star-shaped porphyrin-argininefunctionalized poly(L-lysine)copolymer for photo-enhanced drug and gene co-delivery.Biomaterials,2014,35：4357-4367]报道的方法进行制备。
(3)将0.20g含二硫键的纳米粒子，加入到5ml含有0.02g盐酸阿霉素的PBS溶液中(pH7.4)，搅拌24h，使阿霉素充分吸附到介孔硅纳米粒子中，然后在负载阿霉素的纳米粒子分散液中加入0.10g PLLD，再加入0.05g EDC和0.03g NHS催化反应。反应完毕，10,000转/min离心5分钟，除去未接枝的聚合物。产物冷冻干燥，即得负载阿霉素的PLLD/介孔硅纳米载体。
(4)将0.05g 2,3-二甲基马来酸酐溶于10ml DMSO中，加入步骤(3)得到的纳米粒子0.20g，氮气保护下反应24h，反应完毕，离心分离，得到2,3-二甲基马来酸酐修饰的负载阿霉素的PLLD/介孔硅纳米载体。
(5)空白载体的制备：将步骤(1)制备的含二硫键的纳米粒子0.20g和0.10g PLLD混匀，再加入0.05g EDC和0.03g NHS催化反应。反应完毕，10,000转/min离心5分钟，除去未接枝的聚合物。产物冷冻干燥，即得PLLD修饰的介孔硅纳米载体。将0.05g 2,3-二甲基马来酸酐溶于10ml DMSO中，加入PLLD修饰的介孔硅纳米粒子0.20g，氮气保护下反应24h，反应完毕，离心分离，得到空白载体。
实施例5
(1)制备过程同实施例1步骤(1)，得到含二硫键的纳米粒子。
(2)将0.20g含二硫键的纳米粒子，加入到5ml含有0.02g盐酸阿霉素的醋酸溶液中(0.5wt％)，搅拌24h，使阿霉素充分吸附到介孔硅纳米粒子中，然后在负载阿霉素的纳米粒子分散液中加入0.10g壳聚糖，再加入0.05g EDC和0.03g NHS催化反应。反应完毕，10,000转/min离心5分钟，除去未接枝的聚合物。产物冷冻干燥，即得负载阿霉素的壳聚糖/介孔硅纳米载体。
(3)将0.05g 2,3-二甲基马来酸酐溶于10ml DMSO中，加入步骤(3)得到的纳米粒子0.20g，氮气保护下反应24h，反应完毕，离心分离，得到2,3-二甲基马来酸酐修饰的负载阿霉素的壳聚糖/介孔硅纳米载体。
(4)空白载体的制备：将步骤(1)制备的含二硫键的纳米粒子0.20g和0.10g壳聚糖混匀，再加入0.05g EDC和0.03g NHS催化反应。反应完毕，10,000转/min离心5分钟，除去未接枝的聚合物。产物冷冻干燥，即得壳聚糖修饰的介孔硅纳米载体。将0.05g 2,3-二甲基马来酸酐溶于10ml DMSO中，加入壳聚糖修饰的介孔硅纳米粒子0.20g，氮气保护下反应24h，反应完毕，离心分离，得到空白载体。
实施例6
(1)制备过程同实施例1步骤(1)，得到含二硫键的纳米粒子。
(2)PAMAM接枝壳聚糖共聚物(PAMAM-g-CS)按文献[Dendronized ChitosanDerivative as a Biocompatible Gene Delivery Carrier.Biomacromolecules 2011,12,642–649.]报道的方法进行制备。
(3)将0.20g含二硫键的纳米粒子，加入到5ml含有0.02g盐酸阿霉素的PBS溶液中(pH7.4)，搅拌24h，使阿霉素充分吸附到介孔硅纳米粒子中，然后在负载阿霉素的纳米粒子分散液中加入0.10g PAMAM-g-CS，再加入0.05g EDC和0.03g NHS催化反应。反应完毕，10,000转/min离心5分钟，除去未接枝的聚合物。产物冷冻干燥，即得负载阿霉素的PAMAM-g-CS/介孔硅纳米载体。
(4)将0.05g 2,3-二甲基马来酸酐溶于10ml DMSO中，加入步骤(3)得到的纳米粒子0.20g，氮气保护下反应24h，反应完毕，离心分离，得到2,3-二甲基马来酸酐修饰的负载阿霉素的PAMAM-g-CS/介孔硅纳米载体。
对所制备的阳离子聚合物接枝介孔硅纳米传输载体进行分析：
图1研究了GSH作为触发，实施例1制备的纳米载体的药物释放行为(0.01mM和10mM的GSH溶液中，温度37℃进行药物释放实验)。在0.01mM的GSH溶液中，24小时内只有23.8％的药物从纳米载体释放出；而GSH浓度提高了10mM，24小时内有73.6％的药物从纳米载体释放出。并且在前6小时药物释放量达到46％左右，这有利于药物短时间内在肿瘤中形成高浓度的药物，提高肿瘤细胞的凋亡。
图2研究了实施例1制备的纳米载体的Zeta电位，将样品分散在水中(2.0mg/mL)，超声(频率40KHz)分散5分钟，Zeta电位分析仪(ZetaPALS，美国布鲁克海文)。从图中可以看出，含氨基的介孔硅(MSN-NH2)Zeta电位为+16.12mV左右，接羧基(MSN-COOH)后Zeta电位变为-26.71mV，偶联PEI后(MSN-CP)，Zeta电位重新变为+36.36mV。修饰2,3-二甲基马来酸酐后(MSN-CP-TPA)表面电荷变为-16.32mV，表面负电荷的性质有利于纳米载体在血液中的稳定性，避免吞噬系统的清除；而在pH值为5.0的PBS溶液中，2,3-二甲基马来酸酐从载体表面离去，载体电荷重新变为+32.56mV，这有利于肿瘤细胞对纳米载体的吞噬。
图3为MTT法测定实施例1、4、5制备的空白纳米载体对Hela细胞毒性实验，将Hela细胞接种于含有完全培养基(DMEM+10％小牛血清)的96孔培养板(1×104细胞/孔)中，37℃、5％CO2环境下培养24h，待细胞长到80％左右，吸去培养液，加入无血清培养液，在细胞孔中加入不同浓度的实施例1、4、5制备的空白纳米载体。24h后，每孔加入20μl MTT，继续培养箱内孵育，4h后将培养基及MTT吸出，加入150μL DMSO，摇床摇匀15min，在酶标仪上490nm波长处检测吸光度值。从图中可以看出，即使纳米载体的浓度达到100μg/mL，Hela细胞存活率依然可以达到80％以上，说明所制备的纳米载体具有良好的生物安全性和较低的细胞毒性。
图4为实施例1、4和5(分别对应A、B、C)制备的负载阿霉素纳米载体的透射电镜照片图，将样品粉末超声(频率40KHz)分散在乙醇中，取适量滴加到铜网上，透射电镜(JEM-100CX,JEOL)观察纳米粒子形态。从照片中可以看出，通过溶胶-凝胶法制得的MSNs粒径分散均匀，约100nm左右，并且可以清楚地观察到纳米粒子表面的聚合物层，粒子与粒子之间产生了一定的粘连。同时，在纳米粒子表面能够清楚地观察到平行条带，这表明纳米粒子接枝后，载体仍然能够有效地维持纳米粒子的介孔结构。
图5为通过激光共聚焦显微镜观察亚细胞定位和细胞内药物的荧光强度情况。将Hela细胞接种于6孔培养板(1×104细胞/孔)中培养24h，在细胞孔中加入不同浓度的实施例1、2制备的载药纳米载体，维持培养皿中DOX浓度为5μg/mL，继续培养3小时后除去培养基，PBS润洗细胞三次，加入Hoechst 33342和Lysotracker Green对细胞核与溶酶体进行染色，30分钟后在激光共聚焦显微镜下观察(红色为阿霉素荧光，蓝色为细胞核染色后发出的荧光)。图A为实施例1制备的不偶联2,3-二甲基马来酸酐的纳米载体(即实施例1步骤(2)制备的负载阿霉素的PEI/介孔硅纳米载体)，其呈现蓝色；图B为实施例1制备的纳米载体(即实施例1步骤(3)制备的介孔硅纳米载体)，其主要呈现红色，可见有蓝色；图C为实施例2制备的不含双硫键的对比纳米载体(即实施例2步骤(3)制备的介孔硅纳米载体)，其主要呈现蓝色，可见有红色。实验结果表明，内外双层逐级刺激影响对阿霉素的肿瘤细胞内累计释放具有非常明显的影响，2,3-二甲基马来酸酐修饰的纳米载体表现出更加明显的肿瘤细胞吞噬能力，在相同培育时间内，抗肿瘤药物阿霉素在Hela细胞内的浓度明显高于没有2,3-二甲基马来酸酐修饰的纳米载体；而没有二硫键修饰的纳米载体，阿霉素不能有效从载体中释放出来，在Hela细胞内的浓度更低，这也说明了内外双层逐级刺激响应控制释放有利于肿瘤细胞内药物浓度的提高。
图6为流式细胞测定Hela细胞凋亡，Hela细胞按照1×105/孔种于24孔板内，培养基终体积为500μl，待细胞长到合适的密度后，将各样品分别加入各孔中(5μg/孔)，37℃、5％CO2环境下培养4h后，将培养液换掉，加入新鲜培养液继续培养44h。然后取出培养液，向板孔中加入一定量的胰酶消化细胞，细胞样品经离心后重新悬浮于PBS中，采用流式细胞仪定量分析Hela细胞凋亡。A1为实施例1制备的空白纳米载体(步骤(4)制备得到)，A2为实施例1制备的不偶联2,3-二甲基马来酸酐的负载阿霉素纳米载体(即实施例1步骤(2)制备的负载阿霉素的PEI/介孔硅纳米载体)，A3个为实施例1制备的负载阿霉素的纳米载体(步骤(3)制备得到)。实验结果表明，空白纳米载体具有良好的生物安全性，细胞毒性非常低，当负载阿霉素后，能引起非常明显的肿瘤细胞凋亡。A3则表明偶联2,3-二甲基马来酸酐的纳米载体表现出更加明显的肿瘤细胞吞噬能力，造成更高的肿瘤细胞凋亡。B为流式细胞测定的细胞凋亡率。
图7是实例5纳米载体复合pDNA(负载阿霉素载体复合pDNA)后的凝胶电泳图，4℃下，按照不同比例取纳米载体和p53质粒分散在PBS缓冲溶液中(pH7.4)，轻轻搅拌1h。TAE缓冲溶液，100V电压下，30min，通过琼脂糖凝胶电泳实验研究纳米载体对pDNA的复合能力。如图所示，纳米载体在质量比值大于5:1时，就能完全阻止p53在凝胶电泳中的迁移。以上结果说明纳米载体具有较强的复合pDNA能力。
图8是实例5纳米载体复合不同比例pDNA后转染效率(详细测定方法见MaterialsResearch Express,2014,1,035403)。在Hela细胞中，纳米载体/p53的转染效率可以达到81.77％，并且纳米载体的转染效率随质量比值的增加而增加，当质量比为20:1时其转染效率达到最高。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种内外双层逐级刺激响应纳米传输载体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将MCM-41型介孔硅纳米粒子分散在溶液中，加入3,3’-二硫代二丙酸和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，反应，得到的含二硫键修饰的纳米粒子；
(2)将含二硫键修饰的纳米粒子分散于含阳离子聚合物的溶液中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺催化反应；反应完毕，冷冻干燥，得到阳离子聚合物修饰的介孔硅纳米粒子；
(3)将2,3-二甲基马来酸酐溶于二甲基亚砜中，加入阳离子聚合物修饰的介孔硅纳米粒子，惰性气体保护下反应，反应完毕，离心分离，得到内外双层逐级刺激响应介孔硅纳米载体；
步骤(2)中所述的阳离子聚合物是具有pH敏感性的阳离子聚合物。
2.根据权利要求1所述的内外双层逐级刺激响应纳米传输载体的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的MCM-41型介孔硅纳米粒子是孔径为2～20纳米的介孔硅纳米粒子。
3.根据权利要求2所述的内外双层逐级刺激响应纳米传输载体的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的MCM-41型介孔硅纳米粒子是粒径为100～200nm、孔径为2～20纳米的介孔硅纳米粒子。
4.根据权利要求1所述的内外双层逐级刺激响应纳米传输载体的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的MCM-41型介孔硅纳米粒子通过如下步骤制备得到：以正硅酸乙酯为原料和γ-氨基丙基三乙氧基硅烷共水解，十六烷基三甲基溴化铵为表面活性剂，1,3,5-三甲基苯为制孔剂，控制γ-氨基丙基三乙氧基硅烷的比例，反应，制备得到MCM-41型介孔硅纳米粒子。
5.根据权利要求4所述的内外双层逐级刺激响应纳米传输载体的制备方法，其特征在于：所述的γ-氨基丙基三乙氧基硅烷的加入摩尔量相当于正硅酸乙酯摩尔量的0～0.3倍；
所述的1,3,5-三甲基苯的用量为正硅酸乙酯摩尔量的0.5～2倍；
所述的反应的温度为70～80℃。
6.根据权利要求4所述的内外双层逐级刺激响应纳米传输载体的制备方法，其特征在于：所述的MCM-41型介孔硅纳米粒子通过如下步骤制备得到：将1.0g CTAB溶于480mL水与3.5mL 2.0mol/L NaOH配成的混合溶液中，升温至70℃，分别滴加5.0mL正硅酸乙酯、0.25mLγ-氨基丙基三乙氧基硅烷和2.0mL1,3,5-三甲基苯，保持反应温度70℃，剧烈搅拌反应2h；反应完毕，滤过沉淀物，用甲醇洗涤，将得到的产物分散在由48mL无水乙醇+2mL浓度为37％(w/v)的浓盐酸混合得到的乙醇-HCl溶液中，80℃剧烈搅拌10h，除去CTAB，最后过滤沉淀，真空干燥，得到氨基化介孔硅纳米粒子。
7.根据权利要求1所述的内外双层逐级刺激响应纳米传输载体的制备方法，其特征在于：
所述的3,3’-二硫代二丙酸的质量用量相当于所述的介孔硅纳米粒子质量的1/4；
所述的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量用量相当于所述的介孔硅纳米粒子质量的1/5；
步骤(2)中所述的阳离子聚合物为聚丙烯酰亚胺、聚酰胺-胺型树枝状高分子、树枝状聚赖氨酸和壳聚糖中的一种或至少两种形成的共聚物；
步骤(2)中所述的阳离子聚合物的用量按其与介孔硅纳米粒子＝重量比1∶10～1∶1配比；
步骤(3)中所述的惰性气体为氮气；
步骤(3)中所述的反应的时间为24h。
8.一种内外双层逐级刺激响应纳米传输载体，其特征在于：通过权利要求1～7任一项所述的制备方法得到，其水分散性良好、生物相容性良好、毒性低、粒径尺寸为100-200nm、孔径尺寸为2-10nm且分布均匀。
9.权利要求8所述的内外双层逐级刺激响应纳米传输载体在制备药物传输载体、核酸传输载体或药物-核酸共传输载体中的应用。
10.根据权利要求9所述的内外双层逐级刺激响应纳米传输载体在制备药物传输载体、核酸传输载体或药物-核酸共传输载体中的应用，其特征在于：
所述的药物包括化学分子药物、蛋白药物以及中药提取制剂；
所述的核酸包括RNA和DNA。
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