CN107233309B - 基于阿霉素前药和基因共载的混合胶束药物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于阿霉素前药和基因共载的混合胶束药物及其制备方法。具体制备方法为利用聚乙二醇和聚磷酸酯制备两亲性聚合物主链mPEG‑b‑PBYP，然后通过两步反应制备酸敏感的阿霉素前药（mPEG‑b‑PBYP‑hyd‑DOX）和可质子化的阳离子载体（mPEG‑b‑PBYP‑g‑DAT），最后将这两种聚合物制成混合胶束并与p53基因混合后制成共载阿霉素与p53基因的混合胶束。这种具有pH和酶响应性的混合胶束具有良好的生物相容性和生物可降解性，可以在酸性和磷酸二酯酶存在条件下快速的释放出药物和基因，因而在癌症的治疗方面具有较大的应用前景。

Description

基于阿霉素前药和基因共载的混合胶束药物及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医用高分子材料领域，具体涉及基于阿霉素前药和基因共载的混合胶束药物及其制备方法。
背景介绍
癌症是机体在各种致癌因素作用下，局部组织的细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控导致异常增生与分化而形成的新生物。新生物一旦形成，不因病况消除而停止生长，其生长不受正常机体生理调节，而是破坏正常组织与器官，最终导致人们因器官功能的衰竭而死亡。近年来，癌症在全球的发病率不断增长，其中肺癌在男性中的发病率和死亡率居于首位，在女性中的死亡率也居于第二位，严重威胁了人类的身体健康，所以如何有效地治疗肺癌引起人们的广泛关注。
目前临床上用于癌症治疗的方法主要有手术治疗、化学疗法、放射疗法、基因疗法等。最常用的是化学疗法。但是，化疗过程中使用的小分子药物（如：紫杉醇，阿霉素，喜树碱等），在杀死肿瘤细胞的同时对正常细胞也有很强的损伤作用，同时，小分子药物在血液循环中易被清除，很难到达肿瘤部位，严重限制了这些药物在临床上的疗效。通过前药化，可以有效地解决上述问题。前药，也称药物前体、前驱药物等，是指药物经过化学结构修饰后得到的在体外无活性或活性较小、在体内经酶或非酶的转化释放出活性药物而发挥药效的化合物。这种方式可以延长药物在血液循环中的时间，降低毒副作用，有效提高药物的利用率。基因治疗是将特定的目的基因通过一定方式导入患者特定的组织细胞中进行适当表达，治疗由于基因缺陷或异常而引起的疾病。与传统治疗相比，基因治疗具有许多优点：可以有效降低耐药性，减少毒副作用，减轻病人的痛苦。
药物与基因联合治疗已成为一种研究方向。但是，现有体系，尤其是载体无法满足共装载并协同发挥性能的要求，存在装载互相影响、药物释放不规律、释放效果差、病灶富集干扰严重等问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种阿霉素前药和基因共载的混合胶束药物的制备方法及其应用；该药物/基因共传输体系具有良好的生物相容性和抑制肿瘤细胞增殖的能力。
本发明具体的技术方案为：
一种基于阿霉素前药和基因共载的混合胶束药物的制备方法，包括以下步骤：
(1) 在催化剂的存在下，以6-叠氮己酰肼与阿霉素盐酸盐为原料，通过反应得到阿霉素衍生物；
(2) 在惰性气体气氛保护下和催化剂的存在下，以聚乙二醇与炔基磷酸酯单体为原料，通过反应获得侧链含有炔基的两嵌段共聚物；
(3) 惰性气体气氛保护下，在铜盐催化剂和配体的存在下，以步骤(2)侧链含有炔基的两嵌段共聚物与步骤(1)获得的阿霉素衍生物为原料，通过反应制备酸敏感的阿霉素前药mPEG-b-PBYP-hyd-DOX；
(4) 紫外光照条件，在光引发剂的催化作用下，用步骤(2)侧链含有炔基的两嵌段共聚物与2-二甲氨基乙硫醇盐酸盐为原料，制备侧链含有叔胺基团的两嵌段共聚物mPEG-b-PBYP-g-DAT；
(5) 将步骤(3)的阿霉素前药（mPEG-b-PBYP-hyd-DOX）和步骤(4)的侧链含有叔胺基团的两嵌段共聚物（mPEG-b-PBYP-g-DAT）混合组装形成混合胶束；
(6) 将步骤(5)的混合胶束与基因复合，得到基于阿霉素前药和基因共载的混合胶束药物。
本发明将阿霉素和基因（p53）共载能够实现药物和基因治疗的相互促进，能够抑制肿瘤细胞，促进细胞凋亡，增加肿瘤细胞的化疗敏感性，降低多药耐药性的影响。与单纯的药物输送和基因治疗相比，能够显著提高阿霉素的利用率，实现药物和基因的相互结合。
本发明还公开了一种基于阿霉素前药的混合胶束药物的制备方法，包括以下步骤：
(1) 在催化剂的存在下，以6-叠氮己酰肼与阿霉素盐酸盐为原料，通过反应得到阿霉素衍生物；
(2) 在惰性气体气氛保护下和催化剂的存在下，以聚乙二醇与炔基磷酸酯单体为原料，通过反应获得侧链含有炔基的两嵌段共聚物；
(3) 惰性气体气氛保护下，在铜盐催化剂和配体的存在下，以步骤(2)侧链含有炔基的两嵌段共聚物与步骤(1)获得的阿霉素衍生物为原料，通过反应制备酸敏感的阿霉素前药mPEG-b-PBYP-hyd-DOX；
(4) 紫外光照条件，在光引发剂的催化作用下，用步骤(2) 侧链含有炔基的两嵌段共聚物与2-二甲氨基乙硫醇盐酸盐为原料，制备侧链含有叔胺基团的两嵌段共聚物；
(5) 将步骤(3)的阿霉素前药（mPEG-b-PBYP-hyd-DOX）和步骤(4)的侧链含有叔胺基团的两嵌段共聚物（mPEG-b-PBYP-g-DAT）混合组装形成基于阿霉素前药的混合胶束药物。
上述技术方案中，步骤(4)中，光引发剂选自安息香二甲醚或2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮，所述侧链含有炔基的两嵌段共聚物、2-二甲氨基乙硫醇盐酸盐和光引发剂的摩尔比为1：(200～300) ：(15～25)；步骤(5)中，阿霉素前药与侧链含有叔胺基团的两嵌段共聚物的质量比为1：(0.5～2)。
本发明还公开了一种阿霉素前药或者阿霉素前药胶束的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1) 在催化剂的存在下，以6-叠氮己酰肼与阿霉素盐酸盐为原料，通过反应得到阿霉素衍生物；
(2) 在惰性气体气氛保护下和催化剂的存在下，以聚乙二醇与炔基磷酸酯单体为原料，通过反应获得侧链含有炔基的两嵌段共聚物；
(3) 惰性气体气氛保护下，在铜盐催化剂和配体的存在下，以步骤(2)侧链含有炔基的两嵌段共聚物与步骤(1)获得的阿霉素衍生物为原料，通过反应制备阿霉素前药；
(4) 将步骤(3)的阿霉素前药组装形成阿霉素前药胶束。
本发明中，步骤(1)中，6-溴己酸甲酯与叠氮化钠反应，得到6-叠氮己酸甲酯，然后6-叠氮己酸甲酯与水合肼反应，制备得到6-叠氮己酰肼，所述6-叠氮己酰肼与阿霉素盐酸盐的摩尔比为1：(2～6)，所述催化剂为冰醋酸；步骤（2）中，炔基磷酸酯单体为2-炔丁基-2-氧代-1,3,2-二氧磷杂环戊烷，所述聚乙二醇和炔基磷酸酯单体的摩尔比为1：(60～80)，所述催化剂为辛酸亚锡或1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯；步骤(3)中，铜盐催化剂选自五水合硫酸铜、氯化亚铜或溴化亚铜，配体选自抗坏血酸钠、联吡啶、五甲基二亚乙基三胺、四甲基乙二胺或六甲基三亚乙基四胺中的一种，所述侧链含有炔基的两嵌段共聚物、阿霉素盐酸盐和铜盐催化剂的摩尔比为1：(10～20)：(10～20)，所述铜盐催化剂和配体的摩尔比为1：(1～2)。
本发明还公开了一种阳离子载体胶束的制备方法，包括以下步骤：
(1) 在惰性气体气氛保护下和催化剂的存在下，以聚乙二醇与炔基磷酸酯单体为原料，通过反应获得侧链含有炔基的两嵌段共聚物；
(2) 紫外光照条件，在光引发剂的催化作用下，用步骤(1)侧链含有炔基的两嵌段共聚物与2-二甲氨基乙硫醇盐酸盐为原料，制备侧链含有叔胺基团的两嵌段共聚物；
(3) 将步骤(2)的侧链含有叔胺基团的两嵌段共聚物组装形成胶束。
本发明还公开了一种基于基因的胶束药物的制备方法，包括以下步骤：
(1) 在惰性气体气氛保护下和催化剂的存在下，以聚乙二醇与炔基磷酸酯单体为原料，通过反应获得侧链含有炔基的两嵌段共聚物；
(2) 紫外光照条件，在光引发剂的催化作用下，用步骤(1)侧链含有炔基的两嵌段共聚物与2-二甲氨基乙硫醇盐酸盐为原料，制备侧链含有叔胺基团的两嵌段共聚物；
(3) 将步骤(2)的侧链含有叔胺基团的两嵌段共聚物组装形成胶束，将胶束与基因混合，得到基于基因的胶束药物。
本发明中，基因药物优选p53基因，其是一种重要的抑癌基因，肺癌中p53基因的突变率高达50%-70%。p53基因对细胞的生长、凋亡和DNA修复起重要作用，同时可以抑制细胞内多药耐药性（MDR）基因的表达。p53基因的突变或缺失会导致癌细胞对化疗不敏感，大大降低化疗药物的治疗效果。因此，外源导入p53基因不仅可以抑制癌细胞增殖，调控细胞生长凋亡，同时可以增加癌细胞对多种化疗药物的敏感性。
本发明还公开了一种两嵌段共聚物的制备方法，用三氯化磷和乙二醇为原料、氧化剂存在下反应，获得2-氯-2-氧代-1,3,2,-二氧磷杂环戊烷；然后在缚酸剂存在下，将2-氯-2-氧代-1,3,2,-二氧磷杂环戊烷与3-丁炔-1-醇反应制备2-炔丁基-2-氧代-1,3,2-二氧磷杂环戊烷；然后在惰性气体气氛保护下和催化剂的存在下，以聚乙二醇与2-炔丁基-2-氧代-1,3,2-二氧磷杂环戊烷为原料，通过反应获得侧链含有炔基的两嵌段共聚物。
然后在光引发剂存在下，用侧链含有炔基的两嵌段共聚物与2-二甲氨基乙硫醇盐酸盐为原料，制备得到所述两嵌段共聚物。
本发明还公开了上述的制备方法制备的产品。
本发明的阿霉素前药为mPEG-b-PBYP-hyd-DOX，其化学结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
式中，m为22～113，n为15～70，x为2～11。
本发明还公开了上述产品在制备纳米药物中的应用或者在制备阿霉素前药和基因共同载体中的应用；本发明上述方法可以制备得到侧链含有炔基的两嵌段共聚物，接枝阿霉素得到阿霉素前药，因此本发明还公开了侧链含有炔基的两嵌段共聚物在制备纳米药物中的应用或者在制备阿霉素前药和基因共同载体中的应用。所述纳米药物含有阿霉素和/或基因药物。
本发明中，PEG亲水性部分包裹在内核外边形成胶束的外壳，对胶束的稳定性具有很好的作用。聚合物前药（mPEG-b-PBYP-hyd-DOX）的结构中含有疏水性阿霉素部分以及阳离子载体侧链含有叔胺基团的两嵌段共聚物（mPEG-b-PBYP-g-DAT）中固定了p53基因的部分，用于形成混合胶束的内核，共同溶解于二甲亚砜中，滴加二次水，在水溶液中自组装形成混合胶束，透析除去二甲亚砜获得混合胶束。在肿瘤细胞的pH条件和磷酸二酯酶的存在下，酸敏感基团以及主链磷酸酯键断裂，胶束被破坏，从而快速地释放出聚集在胶束内部的疏水性药物阿霉素以及抑癌基因p53。采用生物可降解的聚磷酸酯作为主链，用酸敏感的基团连接药物，利用不同嵌段共聚物自组装形成的混合胶束实现药物和基因的共同输送，可以有效提高物理稳定性和载药能力，减少药物和基因在运输过程中的相互影响，保证两者的共同运输；同时简化了合成过程，可以直接方便地得到共同输送药物和基因的多功能复合体系。
优选的技术方案中，侧链含有炔基的两嵌段共聚物的数均分子量为13000～20000g·mol-1；酸敏感的阿霉素前药的数均分子量为18000～30000 g·mol-1；侧链含有叔胺基团的两嵌段共聚物的数均分子量为20000～30000 g·mol-1；所形成的混合胶束的粒径为150～180 nm。
本发明采用结构中含有聚乙二醇和聚磷酸酯的嵌段共聚物作为基本原料，经铜盐及配体催化后与抗癌药物阿霉素反应，制备酸敏感的聚合物前药；经光引发剂催化后与含有叔胺基团的单体反应，制备可质子化的阳离子载体；利用这两种聚合物制备阿霉素前药和p53基因共载的混合胶束作为药物。
举例来说，本发明的制备方法包括以下步骤：
(1) 以6-叠氮己酰肼与阿霉素盐酸盐（DOX•HCl）作为原料，无水甲醇为溶剂，冰醋酸为催化剂，通过化学反应获得阿霉素衍生物（N3-hyd-DOX•HCl）；
其中，阿霉素盐酸盐与6-叠氮己酰肼的摩尔比为1：(2～6)；
所述6-叠氮己酰肼的化学结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
所述阿霉素衍生物的化学结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
(2) 惰性气体氛围，在催化剂的存在下，以聚乙二醇与2-炔丁基-2-氧代-1,3,2-二氧磷杂环戊烷为原料，以无水二氯甲烷为溶剂，通过开环反应获得侧链含有炔基的两嵌段共聚物（mPEG-b-PBYP）；
其中，聚乙二醇，2-炔丁基-2-氧代-1,3,2-二氧磷杂环戊烷和催化剂的摩尔比为1：(60～80)：0.5；
所述聚乙二醇的结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE005
所述2-炔丁基-2-氧代-1,3,2-二氧磷杂环戊烷的结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE006
所述侧链含有炔基的两嵌段共聚物的结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE007
上述m为22～113，n为15～70
(3) 以无水N,N-二甲基甲酰胺作为溶剂，在铜盐催化剂和配体的存在下，以步骤(2)获得的两嵌段共聚物与步骤(1)获得的阿霉素衍生物作为原料，通过反应制备酸敏感的阿霉素前药（mPEG-b-PBYP-hyd-DOX）；
其中，两嵌段共聚物、阿霉素盐酸盐和铜盐催化剂的摩尔比为1：(10～20)：(10～20)；铜盐催化剂和配体的摩尔比为1：(1～2)；
(4) 以无水甲醇作为溶剂，在光引发剂的存在下，用步骤(2)获得的两嵌段共聚物与2-二甲氨基乙硫醇盐酸盐为原料，制备侧链含有叔胺基团的两嵌段共聚物阳离子载体（mPEG-b-PBYP-g-DAT）；
Figure DEST_PATH_IMAGE008
其中，两嵌段共聚物、2-二甲氨基乙硫醇盐酸盐和光引发剂的摩尔比为1：(200～300)：(15～25)；
(5) 以二甲亚砜作为溶剂，在匀速搅拌并逐滴滴加二次水的条件下，用步骤(3)获得的mPEG-b-PBYP-hyd-DOX和步骤(4)获得的mPEG-b-PBYP-g-DAT作为原料，制备得到用于阿霉素和p53基因共载的混合胶束；
其中，酸敏感的前药与阳离子载体质量比为1：(0.5～2)。
制备阿霉素衍生物（N3-hyd-DOX•HCl），主要通过三个步骤制备而成：
第一步，制备6-叠氮己酸甲酯。以6-溴己酸甲酯与叠氮化钠（NaN3）反应，以N,N-二甲基甲酰胺（DMF）为溶剂，进行叠氮化反应，获得6-叠氮己酸甲酯。其中，6-溴己酸甲酯、叠氮化钠的摩尔比为1：(1.5～5)；
第二步，制备6-叠氮己酰肼。以第一步合成的6-叠氮己酸甲酯与质量为85%的水合肼反应，以四氢呋喃（THF）作为溶剂，通过酰胺化反应，获得6-叠氮己酰肼。其中，6-叠氮己酸甲酯与水合肼的摩尔比为1：(10～30)；
第三步，制备阿霉素衍生物（N3-hyd-DOX•HCl）。采用第二步合成的6-叠氮己酰肼与阿霉素盐酸盐（DOX•HCl）作为原料，以无水甲醇（CH3OH）为溶剂，冰醋酸为催化剂，获得阿霉素衍生物。其中，阿霉素盐酸盐与6-叠氮己酰肼的摩尔比为1：(2～6)。
制备2-炔丁基-2-氧代-1,3,2-二氧磷杂环戊烷，主要通过两个步骤制备而成：
第一步，制备2-氯-2-氧代-1,3,2,-二氧磷杂环戊烷（COP）。以三氯化磷与乙二醇反应，以二氯甲烷（CH2Cl2）为溶剂，以氧气为氧化剂，获得2-氯-2-氧代-1,3,2,-二氧磷杂环戊烷。其中，三氯化磷和乙二醇的摩尔比为1：(0.8～1.2);
第二步，制备2-炔丁基-2-氧代-1,3,2-二氧磷杂环戊烷（BYP）。以2-氯-2-氧代-1,3,2,-二氧磷杂环戊烷（COP）与3-丁炔-1-醇反应，以无水四氢呋喃（THF）为溶剂，以三乙胺、吡啶或乙二胺为缚酸剂，制备得到2-炔丁基-2-氧代-1,3,2-二氧磷杂环戊烷。其中，2-炔丁基-2-氧代-1,3,2-二氧磷杂环戊烷，3-丁炔-1-醇与缚酸剂的摩尔比为1：(1～1.3)：(1～1.5)。
制备混合胶束包括以下几步：
利用酸敏感的阿霉素前药（mPEG-b-PBYP-hyd-DOX）和阳离子载体（mPEG-b-PBYP-g-DAT）为原料，以二甲亚砜作为溶剂，利用滴加透析的方法制备胶束，获得用于药物和基因共载的混合胶束。其中，酸敏感的前药与阳离子载体的质量比为1：(0.5～2)。
上述技术方案中，步骤(1)中，反应温度为60 ℃～80 ℃，反应时间为12 h～24 h；步骤(2)中，惰性气体为氮气；反应温度为25 ℃～40 ℃，反应时间为1 h～1.5 h；步骤(3)中，反应温度为40 ℃～50 ℃，反应时间为36 h～48 h；步骤(4)中，反应温度为25 ℃～50℃，反应时间为1 h～2 h。
本发明首次将合成的环境响应性聚合物前药与阳离子载体通过配方及参数的限定，制备得到混合胶束，作为药物和基因的共载体系，解决了现有的单一嵌段聚合物无法通过简单的修饰实现多种功能的问题，可以直接方便得到药物载体和基因载体的复合体系，是一种简单、高效、快速的制备方法。
进一步的技术方案，在步骤(1)～(4)完成后，分别对产物进行提纯处理，所述纯化过程包括以下步骤：
(i) 阿霉素衍生物N3-hyd-DOX•HCl的纯化：反应结束后，旋蒸除去溶剂后在冰乙醚中沉淀三次；采用离心法得到沉淀物，将其放置在真空干燥箱中干燥至恒重得到红色粉末状的产物N3-hyd-DOX•HCl；
(ii) 侧链含炔基的两嵌段共聚物（mPEG-b-PBYP）的纯化：反应结束后，滴加2～3滴冰醋酸搅拌1～2 h，除去溶剂后在混合沉淀剂（乙醚/甲醇=10/1）中沉淀三次；倾去上层清液，得到沉淀物，将其放置在真空干燥箱中干燥，得到白色粘稠状固体mPEG-b-PBYP；
(iii) 酸敏感阿霉素前药的纯化：反应结束后，用去离子水透析72 h，将透析袋中得到的紫色透明液体冷冻干燥，得到深紫色固体产物mPEG-b-PBYP-hyd-DOX。
(iv) 可质子化的阳离子载体的纯化：反应结束后，用去离子水透析72 h，将透析袋中得到的白色透明液体冷冻干燥，得到白色粘稠状固体产物mPEG-b-PBYP-g-DAT。
上述技术方案中，步骤(i)中，采用旋转蒸发的方法除去溶剂；步骤(iii)中透析时采用截留分子量为7000～14000 Da的透析袋；步骤(iv)中，透析时采用截留分子量为7000～14000 Da的透析袋。
具体的提纯包括以下步骤：
(i) 制备阿霉素衍生物（N3-hyd-DOX•HCl）的纯化：
第一步，制备6-叠氮己酸甲酯的纯化：反应结束后，用中性三氧化二铝的短柱过滤反应液，并用油泵减压除去溶剂DMF。随后，用大量的CH2Cl2溶解粗产物，用30 mL的二次水萃取三次，将有机相收集并用无水硫酸钠干燥4 h。最后，用棉花过滤无水硫酸钠，旋转蒸发除去滤液中的溶剂，将产物置于真空烘箱中干燥24 h，得到无色的液体产物6-叠氮己酸甲酯；
第二步，制备6-叠氮己酰肼的纯化：反应结束后，旋转蒸发除去THF后换用CH2Cl2溶解。在分液漏斗中，采用饱和氯化钠水溶液萃取粗产物。将有机相用无水Na2SO4干燥4 h，除去溶剂后真空干燥，最终收集到产物6-叠氮己酰肼；
第三步，制备阿霉素衍生物的纯化：反应结束后，用棉花过滤除去反应液中的Na2SO4，将滤液旋转蒸发除去溶剂后，在冰乙醚中沉淀三次。最终，采用离心法得到下面的沉淀物，将其放置在真空干燥箱中干燥24 h，得到红色粉末状产物，即为N3-hyd-DOX•HCl。
(ii) 侧链含炔基的两嵌段共聚物（mPEG-b-PBYP）的纯化：
第一步，制备2-氯-2-氧代-1,3,2,-二氧磷杂环戊烷（COP）的纯化：氧化反应结束后，水泵减压除去溶剂。随后，将得到的液体用油泵进行减压蒸馏，得到无色透明液体，即为COP；
第二步，制备2-炔丁基-2-氧代-1,3,2-二氧磷杂环戊烷（BYP）的纯化：反应结束后，用砂芯漏斗除去缚酸剂产生的盐酸盐，同时用水泵减压除去溶剂THF。随后，将得到的淡黄色液体减压蒸馏，最终得到无色透明液体，即为BYP；
第三步，制备侧链含炔基的两嵌段共聚物（mPEG-b-PBYP）的纯化：反应结束后，滴加2～3滴冰醋酸搅拌1～2 h，除去溶剂后在混合沉淀剂（乙醚/甲醇=10/1）中沉淀三次；倒掉上清液后得到沉淀物，将其放置在真空干燥箱中干燥得到白色粘稠状固体,即为mPEG-b-PBYP。
(iii) 酸敏感阿霉素前药（mPEG-b-PBYP-hyd-DOX）的纯化：
反应结束后，用去离子水透析72 h，将透析袋中得到的紫色透明液体冷冻干燥，得到深紫色固体产物。
(iv) 可质子化的阳离子载体（mPEG-b-PBYP-g-DAT）的纯化：
反应结束后，用去离子水透析72 h，将透析袋中得到的白色透明液体冷冻干燥，得到白色粘状固体产物。
本发明公开的基于阿霉素前药和基因共载的混合胶束可以在水溶液中自组装并固定p53基因形成稳定胶束药物。PEG亲水性部分包裹在内核外层形成胶束的外壳，对胶束的稳定性具有很好的作用。聚合物前药（mPEG-b-PBYP-hyd-DOX）含有的疏水性阿霉素部分以及阳离子载体（mPEG-b-PBYP-g-DAT）固定p53基因的部分，用于形成混合胶束的内核。在肿瘤细胞内的pH条件和磷酸二酯酶的存在下，酸敏感基团以及主链磷酸酯键断裂，胶束被破坏，从而快速地释放出聚集在胶束内部的疏水性药物阿霉素以及抑癌基因p53。因此，本发明同时请求保护上述阿霉素和p53基因共载的混合胶束在制备刺激响应性抗癌纳米药物中的应用。
由于上述方案的实施，本发明与现有技术相比，具有以下优点：
1、本发明采用生物相容性良好的聚乙二醇和聚磷酸酯作为主链，以在酸性条件下可以发生水解的基团连接药物，制备了具有良好生物相容性和生物可降解性的用于阿霉素前药和p53基因共载的混合胶束；该混合胶束可以大大提高药物的水溶性，增加了固定基因的稳定性，在肿瘤细胞环境中易于分解，加速药物和基因的共同输送和释放，大大提高了其应用价值。
2、本发明获得的用于阿霉素前药和p53基因共载的混合胶束可以在水溶液中自组装并固定p53基因形成稳定胶束，PEG亲水性部分包裹在内核外边形成胶束的外壳，对胶束的稳定性具有很好的作用，能够延长在血液中的循环时间。同时，聚合物主链中的磷酸酯键在酸性和酶存在的条件下可以发生降解，阿霉素也是通过酸敏感的基团连接到主链上，当胶束到达肿瘤或病变组织时，pH值降低，酸敏感基团以及主链的磷酸酯键断裂，胶束被破坏，从而快速地释放出聚集在胶束内部的疏水性药物阿霉素以及抑癌基因p53，增加了药物和基因的利用率和靶向性，在癌症的治疗方面，具有潜在的应用价值。
3、本发明提供的酸敏感前药（mPEG-b-PBYP-hyd-DOX）和阳离子载体（mPEG-b-PBYP-g-DAT），结构明确，合成条件温和，具有以下显著特点：(1) 所用原料和试剂容易获得；(2) 反应条件简单温和；(3) 产率高；(4) 产物分离简便；(5) 产物稳定性好等特点，制备容易，提纯方便，适合工业化生产。
附图说明
图1为实施例一中阿霉素衍生物（N3-hyd-DOX•HCl）的核磁共振氢谱图，溶剂为氘代二甲亚砜；
图2为实施例二中嵌段共聚物mPEG-b-PBYP的核磁共振氢谱图，溶剂为氘代氯仿；
图3为实施例三中阿霉素前药（mPEG-b-PBYP-hyd-DOX）的核磁共振氢谱图，溶剂为氘代氯仿；
图4为实施例四中阳离子载体（mPEG-b-PBYP-g-DAT）的核磁共振氢谱图，溶剂为氘代氯仿；
图5为红外光谱图，其中，(A) DOX、(B) DOX-hyd-N3、(C) mPEG-b-PBYP、(D) mPEG-b-PBYP-hyd-DOX、(E) mPEG-b-PBYP-g-DAT；
图6为实施例五中制备的两种聚合物在水溶液中自组装形成的混合胶束的动态光散射曲线和透射电镜照片图；
图7为实施例五中制备的混合胶束在不同pH值的缓冲溶液中的药物释放曲线图；
图8为共载阿霉素前药和p53基因的混合胶束抑制肿瘤细胞增殖性能测试图；
图9为mPEG-b-PBYP-hyd-DOX胶束、mPEG-b-PBYP-g-DAT/p53胶束和混合胶束/p53抑制肿瘤细胞增殖性能测试图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步描述：
实施例一：阿霉素衍生物（N3-hyd-DOX•HCl）的合成
阿霉素衍生物（N3-hyd-DOX•HCl）主要通过三个步骤制备而成。第一步，制备6-叠氮己酸甲酯；第二步，制备6-叠氮己酰肼；第三步，对阿霉素盐酸盐（DOX•HCl）进行修饰得到阿霉素衍生物（N3-hyd-DOX•HCl），具体合成方法如下：
合成小分子化合物6-叠氮己酸甲酯。将事先放置于120 ℃烘箱的玻璃装置取出，放入保干器中，待其冷却至室温，取出使用。分别称取6-溴己酸甲酯（2.35 g，11.24 mmol）和叠氮化钠（NaN3）（1.83 g，18.15 mmol），并用15 mL的DMF溶解在50 mL的圆底烧瓶中，在60 ℃冷凝水回流条件下反应12 h。反应结束后用中性三氧化二铝（Al2O3）的短柱过滤反应液，除去未反应的NaN3，并用油泵减压除去溶剂DMF。随后，用大量的二氯甲烷（CH2Cl2）溶解粗产物，用30 mL二次水萃取三次，将有机相收集并用无水硫酸钠（Na2SO4）干燥4 h。最后，用棉花过滤、旋转蒸发除去溶剂，将产物置于真空烘箱中干燥24 h，得到无色的液体产物6-叠氮己酸甲酯（1.14 g，产率：66.8%）；
在圆底烧瓶中加入已得到的6-叠氮己酸甲酯（0.54 g，3.17 mmol）和质量分数为85%的水合肼（4.70 g，79.4 mmol），采用四氢呋喃（THF）作为溶剂。同样，在80 ℃油浴并装有蛇形冷凝管的装置中，回流反应12 h。反应结束后，旋转蒸发除去THF，用CH2Cl2溶解。在分液漏斗中，采用饱和氯化钠水溶液萃取粗产物。将有机相用无水Na2SO4干燥4 h，除去溶剂后真空干燥，最终收集到产物6-叠氮己酰肼（0.29 g，产率：53.5%）；
分别称取6-叠氮己酰肼（102.0 mg，0.60 mmol），DOX•HCl（115.9 mg，0.20 mmol）和无水Na2SO4（103 mg，0.73 mmol）加入带有冷凝回流装置的圆底烧瓶中，用30 mL的无水甲醇（CH3OH）溶解。随后加入3滴冰醋酸，充分搅拌均匀后，在65 ℃油浴中避光反应24 h。反应结束后，用棉花过滤，除去反应液中的Na2SO4，除去溶剂后在冰乙醚中沉淀三次。最终，采用离心法得到下面的沉淀物，将其放置在真空干燥箱中干燥24 h，得到红色粉末状的产物，即为N3-hyd-DOX•HCl（93.5 mg，产率：62.4%）。
实施例二：侧链含炔基的两嵌段共聚物的合成
以聚乙二醇（mPEG）与2-炔丁基-2-氧代-1,3,2-二氧磷杂环戊烷（BYP）为原料，以1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯（DBU）为催化剂，二氯甲烷为溶剂，通过开环反应，获得侧链含炔基的两嵌段共聚物。具体合成方法如下：
提前4 h将所用玻璃仪器放置于120 ℃烘箱中烘干，取出后放在保干器内冷却至室温待用。首先，取分子量为5000的聚乙二醇（mPEG）（0.82 g，0.16 mmol）置于50 mL的支管烧瓶中，并加入25 mL的甲苯，采用两次常压甲苯共沸的方法除去杂质水。待其冷却后，在氮气保护下，加入7 mL干燥的CH2Cl2溶解，向支管烧瓶中依次加入2-炔丁基-2-氧代-1,3,2-二氧磷杂环戊烷（BYP）（2.12 g，11.9 mmol）和1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯（DBU）（0.049 g，0.32 mmol）。抽放气三次后，在氮气氛围下将装置密封后置于35 ℃油浴中反应1 h。反应结束后，旋转蒸发除去少量溶剂，然后将其在沉淀剂（乙醚/甲醇=10/1）中沉淀三次，收集沉淀物并真空干燥，得到两嵌段共聚物mPEG-b-PBYP（2.64 g，产率：89.8%）。
实施例三：酸敏感的阿霉素前药（mPEG-b-PBYP-hyd-DOX）的合成
在氮气保护下，将阿霉素衍生物（N3-hyd-DOX•HCl）与两嵌段共聚物（mPEG-b-PBYP）发生反应，获得酸敏感的阿霉素前药。具体合成方法如下：
将反应所需的玻璃仪器提前4 h放入120 ℃烘箱中烘干，取出后在保干器中冷却至室温待用。首先，在氮气氛围下，向支管烧瓶中依次加入溴化亚铜（CuBr）（64.3 mg，0.45mmol）和五甲基二乙烯三胺（PMDETA）（155.3 mg，0.90 mmol）,用5 mL 二甲亚砜（DMSO）将其充分溶解混合均匀。然后加入mPEG-b-PBYP（387.7 mg，0.02 mmol）和阿霉素衍生物（DOX-hyd-N3）（328.0 mg，0.45 mmol），再加入2 mL DMSO，使其充分溶解。最后充放气三次，在氮气氛围下将装置密封后置于45 ℃油浴中反应40 h。反应结束后，将反应液移到截留分子量为7000 Da的透析袋中，采用去离子水进行透析，每隔4 h后换一次去离子水。透析72 h后，将透析袋中溶液取出，冷冻干燥后得到紫色固体产物，即为阿霉素前药（mPEG-b-PBYP-hyd-DOX）（489.6 mg，68.4%）。
实施例四：可质子化的阳离子载体（mPEG-b-PBYP-g-DAT）的合成
利用含有叔胺基团的2-二甲氨基乙硫醇盐酸盐与嵌段共聚物（mPEG-b-PBYP）发生化学反应，获得可质子化的阳离子载体（mPEG-b-PBYP-g-DAT）。具体合成方法如下：
在50 mL石英瓶中依次加入mPEG-b-PBYP（396.3 mg，0.02 mmol），2-二甲氨基乙硫醇盐酸盐（907.0 mg，6.40 mmol）和光引发剂安息香二甲醚（DMPA）（107.7 mg，0.48 mmol），加入10 mL无水甲醇（CH3OH）使其充分溶解。随后，将石英反应瓶置于365 nm紫外光照射下搅拌反应1 h。反应结束后，将反应液移到截留分子量为7000 Da的透析袋中，采用去离子水进行透析，每隔4 h换一次去离子水。透析72 h后，将透析袋中溶液取出，冷冻干燥后得到白色粘性固体产物，即为mPEG-b-PBYP-g-DAT（562.3 mg，66.2%）。
分别利用核磁共振氢谱（1H NMR）和红外光谱（FT-IR）验证所得小分子化合物、聚合物以及阿霉素前药和阳离子载体的结构。附图1为阿霉素衍生物（N3-hyd-DOX•HCl）的核磁共振氢谱图；附图2为嵌段共聚物mPEG-b-PBYP的核磁共振氢谱图；附图3为阿霉素前药（mPEG-b-PBYP-hyd-DOX）的核磁共振氢谱图；附图4为阳离子载体（mPEG-b-PBYP-g-DAT）的核磁共振氢谱图；附图5为DOX（A）, DOX-hyd-N3（B）, mPEG-b-PBYP（C）, mPEG-b-PBYP-hyd-DOX（D）, mPEG-b-PBYP-g-DAT（E）的红外光谱图。结合附图1、2、3、4、5可以证明反应产物符合实验设计。
实施例五：采用滴加透析法制备共载阿霉素前药和p53基因的混合胶束
分别取阿霉素前药（mPEG-b-PBYP-hyd-DOX）12.5 mg和阳离子载体（mPEG-b-PBYP-g-DAT）12.5 mg，溶解在2 mL DMSO中。将转速控制在1000 r s-1，搅拌2 h。用微量注射器以2mL h-1的速度向溶液中滴加20 mL的去离子水，滴加结束后，继续搅拌4 h。随后，将溶液装入截留分子量为7000 Da的透析袋中，用去离子水透析24 h后，将溶液取出并定容至25 mL，最终得到浓度为1 mg mL-1的混合胶束溶液。取3 mL胶束溶液与100 μg p53基因混合，涡旋10秒，静置30 分钟，即形成共载阿霉素和p53基因的混合胶束。附图6为前药和阳离子载体在水中自组装形成的混合胶束的透射电镜照片（A）和动态光散射曲线（B）；如：附图6（A）所示为两种聚合物在水溶液中自组装形成球形胶束的形貌；附图6（B）所示为对应胶束粒径的动态光散射测试曲线图，可以看出混合胶束粒径为150～200 nm。
实施例六：混合胶束的体外药物释放测试
取5 mL预先制备好的混合胶束溶液（胶束浓度为1 mg mL-1）置于截留分子量为7000 Da的透析袋中，两端封好置于100 mL的大离心管中，随后，向相应的离心管中分别加入30 mL不同的缓冲溶液。缓冲溶液分为三种：（1）磷酸缓冲液（pH 7.4，10 mM）；（2）磷酸缓冲液（pH 6.0，10 mM）；（3）磷酸缓冲液（pH 5.0，10 mM）。然后，将大离心管置于37.5 ℃的恒温振荡仪中，以160 r/min速度进行振荡。在设定的时间点，依次取出5 mL释放液并补加相应体积的缓冲溶液。每组实验进行3个平行实验，最后取平均值。取出的释放液用荧光分光光度计对DOX浓度进行测定。载有阿霉素的聚合物胶束在不同pH条件下的释放曲线如附图7所示，随着pH值的降低，药物释放速率明显快于正常生理条件下；同时，在pH 5.0缓冲溶液中药物累计释放率最大。药物释放说明该混合胶束具有明显的pH响应性，可以达到控制药物释放的目的。
实施例七：共载阿霉素和p53基因的混合胶束抑制肿瘤细胞增殖性能测试
分别将两种不同的人肺癌细胞（A549 cells，H1299 cells）培养在补充有10%胎牛血清(FBS)的1640培养基中，置于37 ℃，5% CO2(相对湿度为90%)培养箱中培养，定期更换培养液。选择处在生长活跃期的细胞接种于每孔含有100 μL DMEM培养基的96孔板中（密度为60000），培养24 h。用滴加透析法制备复合p53基因的混合胶束母液（混合胶束的浓度为1000 mg L-1，阿霉素浓度为150 mg L-1，p53基因浓度为33.3 mg L-1），将一系列不同浓度的胶束溶液加入到96孔板中，继续培养48 h。接着每孔加入25 μL的MTT溶液（0.5 mg mL-1），进一步培养4 h后，将96孔板中液体吸出，每孔加入150 μL DMSO，用酶标仪(Bio-Rad model680)在570 nm下测量对应的吸光度。细胞存活率的计算方法为：细胞存活率 (Cellviability) (%) = [A]test/[A]control × 100%，其中，[A]test为混合胶束存在下测得的吸光度，而[A]control为不含混合胶束的情况下测得的吸光度。每个样品测试三次，取其平均值。如附图8所示，（A）和（B）分别为混合胶束与人非小细胞肺癌（A549细胞）和人肺癌细胞（H1299细胞）培养48 h后细胞的存活率。结果显示：所制备的共载阿霉素前药和p53基因的混合胶束具有良好的抑制A549细胞和H1299细胞增殖的能力。
同时制备与混合胶束相同浓度的mPEG-b-PBYP-hyd-DOX胶束和mPEG-b-PBYP-g-DAT/p53胶束，将三种不同的胶束加入96孔板中培养48 h后，利用相同的MTT测试法计算细胞存活率，比较不同胶束的抑癌效果。如附图9所示，本发明的单纯的药物或基因具有抗癌细胞作用，尤其是相比于单纯的药物或基因作用，利用DOX和p53基因共同作用表现出了更强的抑癌效果，表明了所制备的共载阿霉素前药和p53基因的混合胶束可以起到药物基因共同作用的效果。
本发明首先制备阿霉素衍生物（N3-hyd-DOX•HCl），然后合成了聚乙二醇和聚磷酸酯的嵌段共聚物mPEG-b-PBYP；再分别通过两步不同的反应合成了阿霉素前药（mPEG-b-PBYP-hyd-DOX）和阳离子载体（mPEG-b-PBYP-g-DAT）；最后，再通过滴加透析的方法制备了共载阿霉素前药和p53基因的混合胶束，更换本发明限定的其他催化剂、配体、抗癌药物和基因，同样可以得到产物；更换聚乙二醇的分子量以及本发明限定的原料比例，可以得到不同m值的产物；更换两种聚合物的质量比，可以得到不同比例的混合胶束，粒径与药物负载释放与上述近似。不同质量比混合胶束的效果见表1（10mg/L），N/P表示混合胶束中聚合物(N)的质量与DNA(P)的质量比例。
表1. 不同质量比混合胶束的抗癌效果
Figure DEST_PATH_IMAGE010
药物治疗和基因治疗都有其显著的优点，本发明将两种治疗方式相结合，实现药物和基因的共同输送，开发适合于人体的药物/基因共输送系统，能够实现药物和基因治疗的相互促进，可以有效抑制癌细胞增殖，加强基因表达，提高化疗敏感性，改善临床治疗结果，有效提高药物和基因的利用率；克服了现有技术无法有效协同药物与基因关系的问题。
本发明公开的聚合物药物载体中，聚合物材料具有良好的生物相容性，对药物至关重要，其中聚乙二醇和聚磷酸酯都具有良好的生物相容性和生物可降解性，通过合成聚乙二醇和聚磷酸酯的嵌段共聚物，并对聚磷酸酯进行侧链功能化修饰，制备聚合物前药和基因载体；通过分别制备聚合物前药和基因载体，然后制备混合胶束，解决了现有技术要在单一的嵌段共聚物上实现多种功能，需要对载体材料进行繁杂的修饰，合成步骤及分离纯化过程冗长，产率和纯度不够高这一问题。利用各嵌段性能不同，可具备多种性能，在基因及药物输送方面具有很大的优势；本发明由不同嵌段共聚物自组装形成的混合胶束，相对于单一嵌段共聚物形成的胶束而言，物理稳定性和载药能力都得到了提高，同时，通过将具有不同官能团的聚合物制备成混合胶束，可以直接方便得到共同输送药物和基因的多功能复合体系。
本发明限定的共载阿霉素前药和p53基因的混合胶束在水溶液中可以稳定存在，而在酸性和磷酸二酯酶存在条件下，敏感性基团或链段会发生断裂使胶束被破坏，从而可以将聚集在胶束内部的药物和基因快速地释放出来，用于治疗，p53基因突变是肺癌中发生频率最高的遗传改变，p53基因是人体的一种抑癌基因，对细胞的生长、凋亡和DNA修复起重要的调控作用，因此，可以通过将外源的p53基因导入体内起到治疗肺癌的效果；取得了如实施例记载的技术效果。

Claims (3)

1.基于阿霉素前药和基因共载的混合胶束药物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1) 在催化剂的存在下，以6-叠氮己酰肼与阿霉素盐酸盐为原料，通过反应得到阿霉素衍生物；
(2) 在惰性气体气氛保护下和催化剂的存在下，以聚乙二醇与炔基磷酸酯单体为原料，通过反应获得侧链含有炔基的两嵌段共聚物；
(3) 惰性气体气氛保护下，在铜盐催化剂和配体的存在下，以步骤(2)获得的侧链含有炔基的两嵌段共聚物与步骤(1)获得的阿霉素衍生物为原料，反应制备酸敏感的阿霉素前药；所述阿霉素前药为mPEG-b-PBYP-hyd-DOX，其化学结构式如下：
Figure 209454DEST_PATH_IMAGE002
式中，m为22～113，n为15～70，x为2～11；
(4) 紫外光照条件，在光引发剂的催化作用下，用步骤(2)侧链含有炔基的两嵌段共聚物与2-二甲氨基乙硫醇盐酸盐为原料，制备侧链含有叔胺基团的两嵌段共聚物；所述侧链含有叔胺基团的两嵌段共聚物的化学结构式如下：
Figure 500496DEST_PATH_IMAGE004
m为22～113，n为15～70；
(5) 将步骤(3)的阿霉素前药和步骤(4)的侧链含有叔胺基团的两嵌段共聚物混合组装形成混合胶束；阿霉素前药与侧链含有叔胺基团的两嵌段共聚物的质量比为1：(0.5～2)；
(6) 将步骤（5）的混合胶束与基因复合，得到基于阿霉素前药和基因共载的混合胶束药物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，光引发剂选自安息香二甲醚或2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮，所述侧链含有炔基的两嵌段共聚物、2-二甲氨基乙硫醇盐酸盐和光引发剂的摩尔比为1：(200～300) ：(15～25)。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，6-溴己酸甲酯与叠氮化钠反应，得到6-叠氮己酸甲酯，然后6-叠氮己酸甲酯与水合肼反应，制备得到6-叠氮己酰肼，所述6-叠氮己酰肼与阿霉素盐酸盐的摩尔比为1：(2～6)，所述催化剂为冰醋酸；步骤（2）中，炔基磷酸酯单体为2-炔丁基-2-氧代-1,3,2-二氧磷杂环戊烷，所述聚乙二醇和炔基磷酸酯单体的摩尔比为1：(60～80)，所述催化剂为辛酸亚锡或1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯；步骤(3)中，铜盐催化剂选自五水合硫酸铜、氯化亚铜或溴化亚铜，配体选自抗坏血酸钠、联吡啶、五甲基二亚乙基三胺、四甲基乙二胺或六甲基三亚乙基四胺中的一种，所述侧链含有炔基的两嵌段共聚物、阿霉素盐酸盐和铜盐催化剂的摩尔比为1：(10～20)：(10～20)，所述铜盐催化剂和配体的摩尔比为1：(1～2)。
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