CN103834002A

CN103834002A - 基于聚乙二醇的酸敏感性阿霉素前药及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN103834002A
Application number: CN201410054812.4A
Authority: CN
Inventors: 倪沛红; 王海蓉; 何金林; 张明祖; 李飞; 陶云锋
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2014-02-18
Filing date: 2014-02-18
Publication date: 2014-06-04
Anticipated expiration: 2034-02-18
Also published as: CN103834002B

Abstract

本发明公开了一种基于聚乙二醇的酸敏感性阿霉素前药及其制备方法与应用。具体制备方法为利用双末端含二叠氮乙基二缩醛基的聚乙二醇与对硝基苯基炔丙基碳酸酯反应，制备末端含酸敏感性缩醛基和对硝基苯酯叠氮基团的聚乙二醇；然后利用所制备的聚乙二醇与阿霉素盐酸盐反应，获得基于聚乙二醇的酸敏感性阿霉素前药。这类具有酸敏感性的水溶性阿霉素前药具有良好的生物相容性和酸敏感性，因而可以用作刺激敏感性抗肿瘤前药。

Description

基于聚乙二醇的酸敏感性阿霉素前药及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物医用高分子材料领域，具体涉及一种基于聚乙二醇的酸敏感性阿霉素前药、其制备方法及其作为前药的应用。

背景技术

全球每年有700多万人因患癌症失去生命，而且这个数字正在逐年上升。癌症的治疗是二十一世纪人类面临的最大考验和难题。据世界卫生组织2013年2月发布的调查报告显示，2008年全球死于癌症的人数达760万，每年约有1300万新增癌症患者，其中三分之二新增癌症患者和死于癌症的患者来自发展中国家。

随着科学技术的不断进步与发展，目前已有多种行之有效的抗肿瘤药物被临床使用，但是，临床上使用的药物绝大多数是低分子量化合物（通常在500 g·mol^-1），在血液流动中的半衰期很短，具有较高的清除率。这些小分子药物通常是通过多价而不是单价键与给定的受体结合。此外，它们可迅速扩散到体内健康组织，并在全身均匀分布，结果导致只有少量药物到达靶位点，产生治疗过程疗效的不确定性与较大的毒副作用，因而大大限制了这些抗肿瘤药物的应用。

许多优良的疏水性药物，如紫杉醇，阿霉素等，由于极难溶于水和较大的毒性，从而限制了其在临床上的应用。随着人类对肿瘤学、分子生物学、药学及化学等相关科学的不断探索，使得对抗肿瘤药物的研究有了长足的进步。

通过前药化，可以有效地解决上述问题。前药(prodrug)，也称药物前体、前驱药物，是指经过生物体转化后具有药理作用的化合物，具体可分为载体前体药物和生物前体药物。其中，载体前体药物是指具有活性的药物与起运输作用的载体通过共价键结合，在体循环过程中可通过简单的水解作用卸除载体，释放出活性化合物，发挥药理作用。对于载体的结构，要求对生物体无害，并且能及时释放出活性药物。前药本身并没有生物活性或者活性很低，经过体内代谢后转变为具有活性的物质，这一过程的目的在于提高药物的利用率，增强靶向性，降低药物的毒副作用。

通过对PEG进行末端官能化后与疏水性药物键合制备前药，可以极大地提高原药的水溶性，增加药物稳定性，减小毒副作用，延长原药在体内的半衰期，因此，PEG在前药的应用中得到了广泛的研究。

与传统的药物释放体系相比，具有刺激响应性的药物载体具有一定的优点。表现为在特定的刺激作用条件下可以快速释放出所包载或者键合的药物，达到有效治疗的目的。这些刺激作用包括：pH值，光强，离子浓度，氧化还原介质等。

一般来说，肿瘤和炎症等病变组织内部的pH值都要比正常体液的pH值低，呈现出弱酸性。因此，可以很好地利用这一特点进行前药的设计，将一些在酸性条件下易分解的组分引入前药中。它们在水溶液中可以组装成前药胶束并稳定存在，但是在酸性条件下，酸敏感性基团或链段会发生断裂使胶束被破坏，从而可以将其聚集在胶束内部的药物快速地释放出来，这些酸敏感性基团包括缩醛基、腙键、原甲酸酯等。

在现有技术中，已有一些关于酸敏感性的前药的报道。但是，作为抗肿瘤前药，应当具有良好的生物相容性和生物可降解性，并且，作为抗肿瘤前药，还应当具有下列特征：在水溶液中可以形成稳定的聚合物胶束，亲水性外壳起到稳定胶束、提高胶束血液循环时间的作用；前药胶束在体内循环时，具有抗凝血和抗蛋白吸附的性能；当载药胶束到达肿瘤或病变组织时，能够利用局部组织的pH值较低的特点，破坏胶束，快速地释放出抗癌药物。

因此，需要寻求更多的药效明显、且在细胞环境下具有酸敏感性的抗肿瘤前药。

发明内容

本发明的目的是，提供一种基于聚乙二醇的酸敏感性阿霉素前药，该阿霉素前药具有良好的生物相容性和抑制肿瘤细胞增殖的能力，可用作制备抗癌药物。

为达到上述目的，本发明的总体构思是：采用结构中含有酸敏感基团的聚乙二醇（PEG）作为基本原料，经“点击”化学反应活化后与抗癌药物阿霉素反应，制备基于聚乙二醇的酸敏感性阿霉素前药。具体为首先利用双末端含二叠氮乙基二缩醛基的聚乙二醇（N₃-a-PEG-a-N₃）与对硝基苯基炔丙基碳酸酯反应，制备末端含酸敏感性缩醛基和对硝基苯基的聚乙二醇（NC-a-PEG-a-NC）；然后利用所制备的NC-a-PEG-a-NC与阿霉素盐酸盐反应，获得基于聚乙二醇的酸敏感性阿霉素前药。

本发明具体的技术方案为：一种基于聚乙二醇的酸敏感性阿霉素前药，由下列化学结构式表达：

；

n为35～135。

上述技术方案中，具有酸敏感性的基团为缩醛基，其化学结构式为：

；该具有酸敏感性的阿霉素前药在结构上既含有的疏水性阿霉素部分，用于形成胶束的内核，PEG亲水性部分包裹在内核外边形成胶束的外壳，起到稳定胶束的作用；又含有在酸性条件下可发生水解的缩醛基，在一定pH条件下缩醛基发生水解，胶束被破坏，从而快速地释放出聚集在胶束内部的疏水性抗癌药物。

优选的技术方案中，基于聚乙二醇的酸敏感性阿霉素前药的数均分子量为2500～7000 g·mol^-1。

本发明还公开了上述基于聚乙二醇的酸敏感性阿霉素前药的制备方法，包括以下步骤：

(1) 惰性气体气氛条件下，在“点击”化学反应催化剂和配体的存在下，以双末端含有二叠氮乙基二缩醛基的聚乙二醇与对硝基苯基炔丙基碳酸酯为原料，以无水四氢呋喃为溶剂，通过“点击”化学法制备获得末端为对硝基苯基的聚乙二醇；

其中，双末端含有二叠氮乙基二缩醛基聚乙二醇、对硝基苯基炔丙基碳酸酯和“点击”化学反应催化剂的摩尔比为1∶(2.1～2.4) ∶1；“点击”化学反应催化剂和配体的摩尔比为1∶(1～2)；

所述末端为对硝基苯基的聚乙二醇的化学结构式为：

所述双末端含有二叠氮乙基二缩醛基的聚乙二醇的结构式为：

上述n为35～135；

所述对硝基苯基炔丙基碳酸酯的结构式为：

(2) 以无水N,N-二甲基甲酰胺作为溶剂，在缚酸剂的存在下，用步骤(1)获得的末端含有对硝基苯基的聚乙二醇与阿霉素盐酸盐反应，制备得到所述基于聚乙二醇的酸敏感性阿霉素前药；

所述末端含有对硝基苯基的聚乙二醇、缚酸剂和阿霉素盐酸盐的摩尔比为1∶(6～12) ∶(2～4)。

上述技术方案中，步骤(1)中，惰性气体为氩气；“点击”化学反应时，反应温度为25℃～35℃，反应时间为20 h～40 h；步骤(2)中，末端含有对硝基苯基的聚乙二醇与阿霉素盐酸盐反应反应时，反应温度为40℃～60℃，反应时间为24 h～48 h。

上述技术方案中，步骤(1)中，“点击”化学反应催化剂选自氯化亚铜或溴化亚铜；配体选自：联吡啶、五甲基二亚乙基三胺、四甲基乙二胺或六甲基三亚乙基四胺中的一种。

上述技术方案中，步骤(2)中，缚酸剂为三乙胺，乙二胺，四甲基乙二胺，N,N-二异丙基乙胺中的一种。

“点击”化学反应是一种新型、简单、高效、快速的合成方法，这种方法具有以下显著特点：(1) 所用原料和试剂容易获得；(2) 反应条件简单；(3) 产率高；(4) 立体选择性好；(5) 产物净化技术简单；(6) 产物稳定性好。众多的优点使得“点击”化学反应在高分子化学、材料修饰、生物医学等领域得到广泛应用。至今还没有关于通过“点击”化学反应制备末端含有酸敏感性的缩醛基和末端为活性较高的对硝基苯酯结构的文献报道。

进一步的技术方案，在步骤(1)～(2)完成后，分别对产物进行提纯处理，所述纯化过程包括以下步骤：

(i) 末端含有对硝基苯基的聚乙二醇的纯化：在反应结束后，接触空气，使反应终止，待溶液变成绿色后，除去溶剂得到绿色固体，将其溶解在二氯甲烷和乙醇的混合溶剂中并使溶液通过装有碱性Al₂O₃的柱子，然后除去溶剂，再将浓缩液逐滴加入冰乙醚中，过滤并将收集到的固体产物溶解于四氢呋喃中，待固体产物溶解后将溶液逐滴加入冰乙醚中，然后过滤并将收集到的固体物置于真空烘箱中干燥至恒重，得到淡黄色产物为末端含有对硝基苯基的聚乙二醇；

(ii) 基于聚乙二醇的酸敏感性阿霉素前药的纯化：在反应结束后，除去溶剂，将浓缩液溶于无水甲醇中，用无水甲醇透析20 h～30 h后用超纯水透析48 h～96 h；最后，将透析袋中所得到的红色透明液体冷冻干燥，获得深红色固体产物，即为基于聚乙二醇的酸敏感性阿霉素前药。

上述技术方案中，步骤(i)中，所述二氯甲烷与无水乙醇的体积比为1∶0.5～1.5；步骤(ii)中，透析时采用截留分子量为3500 Da的透析袋。

本发明公开的基于聚乙二醇的酸敏感性阿霉素前药DOX-a-PEG-a-DOX可以在水溶液中自组装形成前药胶束，疏水性药物阿霉素形成胶束的核；亲水性PEG链段形成胶束的外壳，起到稳定胶束的作用；而疏水性内核和亲水性PEG链段之间具有酸敏感性的缩醛基，在弱酸性条件下会发生水解断裂，从而使胶束被破坏，快速地释放出聚集在胶束核中的抗癌药物。因此本发明同时请求保护上述基于聚乙二醇的酸敏感性阿霉素前药在制备刺激响应性抗癌药物中的应用。

由于上述方案的实施，本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1、本发明首次采用生物相容性良好的聚乙二醇和疏水性抗癌药物阿霉素分别作为亲水性和疏水性的链段，以在酸性条件下可发生水解的缩醛基作为酸敏感性连接基团，制备了具有良好生物相容性的酸敏感性两亲性阿霉素前药；与原药阿霉素相比，前药具有良好的水溶性和贮存稳定性，而在肿瘤细胞环境中易于分解，加速药物释放，大大增加了其应用价值；

2、本发明获得的基于聚乙二醇的酸敏感性阿霉素前药在水中可自组装形成稳定的聚合物胶束，疏水性的阿霉素部分聚集形成胶束内核，亲水性聚乙二醇作为胶束外壳起到稳定胶束、提高胶束血液循环时间的作用，亲水部分和疏水部分通过在酸性条件下可裂解的缩醛基相连；当前药胶束到达肿瘤或病变组织时，局部pH值的降低会使缩醛基发生断裂，胶束被破坏，从而快速释放出抗癌药物，增加了药物的利用率与靶向性，在癌症的治疗方面，具有潜在的应用价值；

3、本发明提供的基于聚乙二醇的酸敏感性阿霉素前药结构合理明确，对药物的键合效率高，合成条件不苛刻，制备容易，提纯方便，适合工业化生产。

附图说明

图1为实施例一中N₃-a-PEG₄₅-a-N₃和NC-a-PEG₄₅-a-NC的核磁共振氢谱图，溶剂为氘代氯仿；

图2为实施例二中DOX-a-PEG₄₅-a-DOX和阿霉素盐酸盐的核磁共振氢谱图，溶剂为氘代氯仿；

图3为实施例一中N₃-a-PEG₄₅-a-N₃和NC-a-PEG₄₅-a-NC的红外光谱图；

图4为实施例二中DOX-a-PEG₄₅-a-DOX在pH 7.4缓冲溶液中自组装形成的胶束的动态光散射曲线和透射电镜照片；

图5为DOX-a-PEG₄₅-a-DOX前药与裸药阿霉素的抑制肿瘤细胞增殖性能测试图；

图6为实施例二中DOX-a-PEG₄₅-a-DOX形成的聚合物前药胶束与裸药阿霉素在不同pH值的缓冲溶液中的药物释放曲线。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步描述：

实施例一：具有酸敏感性的末端为对硝基苯基的聚乙二醇（NC-a-PEG₄₅-a-NC）的合成

首先通过双末端含二叠氮乙基二缩醛基的聚乙二醇（N₃-a-PEG₄₅-a-N₃）、对硝基苯基炔丙基碳酸酯，在“点击”化学反应催化剂和配体的作用下发生点击化学反应，制备末端为对硝基苯基的聚乙二醇（NC-a-PEG₄₅-a-NC）。具体合成方法如下：

将放入搅拌子的支管圆底烧瓶在120℃烘箱中至少干燥24 h后，塞上玻璃塞，通过乳胶管与油泵相连抽至室温后，再通入高纯氩气，抽真空，如此反复三次后充满氩气，迅速加入末端含二叠氮乙基二缩醛基的聚乙二醇N₃-a-PEG₄₅-a-N₃（489 mg, 0.22 mmol）、对硝基苯基炔丙基碳酸酯（255 mg, 1.16 mmol）、溴化亚铜（0.014 g，0.10 mmol）和五甲基二亚乙基三胺（21 μL，0.10 mmol），用油泵抽、充氩气，反复三次以除去瓶中空气，再用干燥的注射器加入20 mL溶剂四氢呋喃（THF），搅拌至混合物完全溶解，溶液呈蓝色。然后将圆底烧瓶移至25℃的油浴中，搅拌反应24 h。上述N₃-a-PEG₄₅-a-N₃已被公开（参见：Hairong Wang, Jinlin He,Mingzu Zhang, Yunfeng Tao, Fei Li, Kam Chiu Tam,Peihong Ni. Biocompatible and cid-cleavable poly(3-caprolactone)-acetal-poly(ethylene lycol)-acetal-poly(3-caprolactone)triblock copolymers: synthesis, haracterization and pH-triggered doxorubicin delivery. J. Mater. Chem. B, 2013, 1,6596）。

反应结束后，接触空气使反应终止，减压除去四氢呋喃，将得到的固体用100 mL体积比为1∶1的二氯甲烷和无水乙醇的混合溶剂溶解后，使溶液通过碱性Al₂O₃柱子除去溶液中的铜盐，混合液旋转蒸发除去溶剂使溶液浓缩，在150 mL冰乙醚中进行沉淀，再过滤，过滤后的产物溶解在5 mL四氢呋喃中，继续在150 mL冰乙醚中进行沉淀，过滤并将收集到的固体产物置于真空烘箱中干燥至恒重，得到末端含对硝基苯基的聚乙二醇（NC-a-PEG₄₅-a-NC，455 mg），产率78%。

实施例二：基于聚乙二醇的酸敏感性阿霉素前药（DOX-a-PEG₄₅-a-DOX）的合成

将放入搅拌子的50 mL圆底烧瓶及玻璃塞在120℃烘箱中至少干燥24 h后冷却至室温，向圆底烧瓶中依次加入NC-a-PEG₄₅-a-NC（123 mg, 0.05 mmol），阿霉素盐酸盐（0.119 g, 0.2 mmol），三乙胺（0.1 mL, 0.6 mmol）以及10 mL二甲基甲酰胺（DMF）；在60℃的条件下反应48 h；反应结束后在50℃下用真空油泵抽去DMF，加入2 mL无水甲醇溶解后，对无水甲醇透析24 h，接着用超纯水透析48 h后，冷冻干燥至恒重，得到深红色固体产物（DOX-a-PEG₄₅-a-DOX，78 mg），产率60%。

分别利用核磁共振氢谱（¹H NMR）和红外光谱（FT-IR）验证所得聚合物以及基于聚乙二醇的酸敏感性阿霉素前药的结构。附图1为聚合物NC-a-PEG₄₅-a-NC的核磁共振氢谱图、附图2为基于聚乙二醇的酸敏感性阿霉素前药DOX-a-PEG₄₅-a-DOX的核磁共振氢谱图、附图3为N₃-a-PEG₄₅-a-N₃和NC-a-PEG₄₅-a-NC的红外光谱图，其中A为N₃-a-PEG₄₅-a-N₃的红外光谱图，B为NC-a-PEG₄₅-a-NC的红外光谱图。结合附图1、2、3可以证明反应产物符合实验设计。

实施例三：具有酸敏感性的末端为对硝基苯基的聚乙二醇（NC-a-PEG₉₀-a-NC）的合成

将放入搅拌子的支管圆底烧瓶在120℃烘箱中至少干燥24 h后，塞上玻璃塞，通过乳胶管与油泵相连抽至室温后，再通入高纯氩气，抽真空，如此反复三次后充满氩气，迅速加入末端含二叠氮乙基二缩醛基的聚乙二醇N₃-a-PEG₉₀-a-N₃（439 mg, 0.1 mmol）、对硝基苯基炔丙基碳酸酯（81 mg, 0.36 mmol）、溴化亚铜（0.014 g，0.10 mmol）和五甲基二亚乙基三胺（21 μL，0.10 mmol），用油泵抽、充氩气，反复三次以除去瓶中空气，再用干燥的注射器加入20 mL溶剂四氢呋喃（THF），搅拌至混合物完全溶解，溶液呈蓝色。然后将圆底烧瓶移至25℃的油浴中，搅拌反应24 h。

反应结束后，接触空气使反应终止，减压除去四氢呋喃，将得到的固体用100 mL体积比为1∶1的二氯甲烷和无水乙醇的混合溶剂稀释后，使溶液通过碱性Al₂O₃柱子除去溶液中的铜盐，混合液旋转蒸发除去溶剂使溶液浓缩，在150 mL冰乙醚中进行沉淀，滤后的产物溶解在5 mL四氢呋喃中，继续在150 mL冰乙醚中进行沉淀，过滤并将收集到的固体产物置于真空烘箱中干燥至恒重，得到末端含对硝基苯基的聚乙二醇（NC-a-PEG₉₀-a-NC）。

实施例四：基于聚乙二醇的酸敏感性阿霉素前药（DOX-a-PEG₉₀-a-DOX）的合成

将放入搅拌子的50 mL圆底烧瓶及玻璃塞在120℃烘箱中至少干燥24 h后冷却至室温，向圆底烧瓶中依次加入NC-a-PEG₉₀-a-NC（455 mg, 0.068 mmol），阿霉素盐酸盐（170 mg, 0.29 mmol），三乙胺（0.1 mL, 0.6 mmol）以及10 mL二甲基甲酰胺（DMF）。在60℃的条件下反应48 h。反应结束后在50℃下用真空油泵抽去DMF，加入2 mL无水甲醇溶解后，对无水甲醇透析24 h，接着用超纯水透析48 h后，冷冻干燥至恒重，得到深红色固体产物（DOX-a-PEG₉₀-a-DOX）。

实施例五：具有酸敏感性的末端为对硝基苯基的聚乙二醇（NC-a-PEG₁₃₅-a-NC）的合成

将放入搅拌子的支管圆底烧瓶在120℃烘箱中至少干燥24 h后，塞上玻璃塞，通过乳胶管与油泵相连抽至室温后，再通入高纯氩气，抽真空，如此反复三次后充满氩气，迅速加入末端含二叠氮乙基二缩醛基的聚乙二醇N₃-a-PEG₁₃₅-a-N₃（1.01 g, 0.16 mmol）、对硝基苯基炔丙基碳酸酯（150 mg, 0.67 mmol）、溴化亚铜（0.014 g，0.10 mmol）和五甲基二亚乙基三胺（21 μL，0.10 mmol），用油泵抽、充氩气、反复三次以除去瓶中空气，再用干燥的注射器加入20 mL溶剂四氢呋喃（THF），搅拌至混合物完全溶解，溶液呈蓝色。然后将圆底烧瓶移至25℃的油浴中，搅拌反应24 h。

反应结束后，接触空气使反应终止，减压除去四氢呋喃，将得到的固体用100 mL体积比为1:1的二氯甲烷和无水乙醇的混合溶剂稀释后，使溶液通过碱性Al₂O₃柱子除去溶液中的铜盐，混合液旋转蒸发除去溶剂使溶液浓缩，在150 mL冰乙醚中进行沉淀，抽滤后的产物溶解在5 mL四氢呋喃中，继续在150 mL冰乙醚中进行沉淀，过滤并将收集到的固体产物置于真空烘箱中干燥至恒重，得到末端含对硝基苯基的聚乙二醇（NC-a-PEG₁₃₅-a-NC）。

实施例六：基于聚乙二醇的酸敏感性阿霉素前药（DOX-a-PEG₁₃₅-a-DOX）的合成

将放入搅拌子的50 mL圆底烧瓶及玻璃塞在120℃烘箱中至少干燥24 h后冷却至室温，向圆底烧瓶中依次加入NC-a-PEG₁₃₅-a-NC（123 mg, 0.05 mmol），阿霉素盐酸盐（0.119 g, 0.2 mmol），三乙胺（0.1 mL, 0.6 mmol）以及10 mL二甲基甲酰胺（DMF）。在60℃的条件下反应48 h。反应结束后在50℃下用真空油泵抽去DMF，加入2 mL无水甲醇溶解后，对无水甲醇透析24 h，接着用超纯水透析48 h后，冷冻干燥至恒重，得到深红色固体产物（DOX-a-PEG₁₃₅-a-DOX）。

实施例七：采用直接溶解法制备聚合物前药胶束

将1.0 mg聚合物前药DOX-a-PEG₄₅-a-DOX加入到10mL容量瓶中并在超纯水中定容，搅拌24 h，促使聚合物前药进行自组装，从而得到浓度为0.1 mg·mL^-1的胶束溶液。附图4为DOX-a-PEG₄₅-a-DOX在超纯水中自组装形成的胶束的动态光散射曲线（A）和透射电镜照片（B）；如附图4（B）所示，聚合物前药在水溶液中自组装形成胶束结构，附图4（A）为对应胶束粒径的动态光散射测试曲线图，可以看出聚合物前药胶束平均粒径为105 nm。

实施例八：聚合物前药胶束抑制肿瘤细胞增殖性能测试

将人子宫颈癌细胞(HeLa cells)培养在补充有10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中，置于37℃，5% CO₂(相对湿度为90%)的培养箱中培养，定期更换培养液。选择处在生长活跃期的细胞接种于每孔含有100 μL DMEM培养基的96孔板中，培养24 h。用直接溶解法配置聚合物前药DOX-a-PEG_n-a-DOX(n为45、90或者135)的胶束母液（阿霉素浓度为50 μg mL^-1），将一系列不同浓度的胶束溶液加入到96孔板中，继续培养48 h。接着加入25 μL的MTT试剂，进一步培养4 h后，用酶标仪(Bio-Rad model 680)在570 nm下测量对应的吸光度。细胞存活率的计算方法为：细胞存活率 (Cell viability) (%) = [A]_test/[A]_control × 100%，其中，[A]_test为DOX-a-PEG_n-a-DOX(n为45、90或者135)聚合物前药胶束存在下测得的吸光度，而[A]_control为不含聚合物前药的情况下测得的吸光度。每个样品测试三次，取其平均值。如图5所示，与抗癌药物阿霉素相比，所合成的聚合物前药具有良好的生物相容性和抑制HeLa细胞增殖的能力。

实施例九：聚合物前药以及阿霉素的体外药物释放测试

分别称取25 mg聚合物前药DOX-a-PEG₄₅-a-DOX加入到50 mL容量瓶中并定容，从而得到浓度为0.5 mg mL^-1的聚合物前药胶束水溶液。取5 mL聚合物前药胶束溶液置于截留分子量为1000的透析袋中，分别用20 mL不同pH值的缓冲溶液加入到放有透析袋的烧杯中，将其置于恒温振荡器，在37℃的恒温水浴下释放。每隔一段时间取5 mL透析袋外部溶液，同时补充5 mL新鲜相同pH值的缓冲溶液。用荧光分光光度计检测释放的DOX的含量。载有阿霉素的聚合物胶束在不同pH条件下的释放曲线如图6所示，在pH 5.0时药物释放速率明显快于pH 7.4，说明该三嵌段聚合物载药胶束具有明显的pH敏感性，可以达到控制释放的目的。

配置质量浓度为0.01 mg mL^-1的裸药阿霉素水溶液，取5 mL阿霉素溶液于截留分子量为1000的透析袋中，外部加入20 mL不同pH值的缓冲溶液，将其置于恒温振荡器中，在37℃的恒温水浴下释放。每隔一段时间取5 mL透析袋外部溶液，同时补充5 mL新鲜相同pH值的缓冲溶液。用荧光分光光度计检测释放的DOX的含量。阿霉素溶液在不同pH条件下的释放曲线如图6所示，结果表现出明显的“突释”现象。与裸药阿霉素溶液的释放结果相比，聚合物前药胶束溶液的释放速率具有可控性。

Claims

1.一种基于聚乙二醇的酸敏感性阿霉素前药，其特征在于，由下列化学结构式表达：

；

式中，n为35～135。

2.根据权利要求1所述基于聚乙二醇的酸敏感性阿霉素前药，其特征在于：所述基于聚乙二醇的酸敏感性阿霉素前药的数均分子量范围为2500～7000 g·mol^-1。

3.一种权利要求1所述基于聚乙二醇的酸敏感性阿霉素前药的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述基于聚乙二醇的酸敏感性阿霉素前药的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，惰性气体为氩气。

5.根据权利要求3所述基于聚乙二醇的酸敏感性阿霉素前药的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，“点击”化学反应催化剂选自氯化亚铜或溴化亚铜；配体选自：联吡啶、五甲基二亚乙基三胺、四甲基乙二胺或六甲基三亚乙基四胺中的一种。

6.根据权利要求3所述基于聚乙二醇的酸敏感性阿霉素前药的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，缚酸剂为三乙胺，乙二胺，四甲基乙二胺，N,N-二异丙基乙胺中的一种。

7.根据权利要求3所述基于聚乙二醇的酸敏感性阿霉素前药的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，“点击”化学反应时，反应温度为25℃～35℃，反应时间为20 h～40 h；步骤(2)中，末端含有对硝基苯基的聚乙二醇与阿霉素盐酸盐反应反应时，反应温度为40℃～60℃，反应时间为 24 h～48 h。

8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：在步骤(1)～(2)完成后，分别对产物进行提纯处理，所述纯化过程包括以下步骤：

(i) 末端含有对硝基苯基的聚乙二醇的纯化：在反应结束后，接触空气，使反应终止，待溶液变成绿色后，除去溶剂得到绿色固体，将其溶解在二氯甲烷和无水乙醇的混合溶剂中并使溶液通过装有碱性Al₂O₃的柱子，然后除去溶剂，再将浓缩液逐滴加入冰乙醚中，过滤并将收集到的固体产物溶解于四氢呋喃中，待固体产物溶解后将溶液逐滴加入冰乙醚中，然后过滤并将收集到的固体物置于真空烘箱中干燥至恒重，得到淡黄色产物为末端含有对硝基苯基的聚乙二醇；

(ii) 基于聚乙二醇的酸敏感性阿霉素前药的纯化：在反应结束后，除去溶剂，将浓缩液溶于无水甲醇中，用无水甲醇透析20～30h后用超纯水透析48～96 h；最后，将透析袋中所得到的红色透明液体冷冻干燥，获得深红色固体产物，即为基于聚乙二醇的酸敏感性阿霉素前药。

9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：步骤(i)中，所述二氯甲烷与无水乙醇的体积比为1∶0.5～1.5；步骤(ii)中，透析时采用截留分子量为3500 Da的透析袋。

10.权利要求1或2所述基于聚乙二醇的酸敏感性阿霉素前药在制备刺激响应性抗癌药物中的应用。