CN107353399B - 酸敏感型紫杉醇前药、其制备方法及前药纳米胶束 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种酸敏感型紫杉醇前药，具有式(I)所示结构，及其制备方法和应用。所述酸敏感型紫杉醇前药中，聚合物前体为乙烯基醚官能化的两亲性两嵌段共聚物，药物分子通过缩醛键与两亲性两嵌段共聚物共价链接；上述紫杉醇前药可在水溶液中自组装形成以聚乙二醇亲水链段为外表面、以侧基官能化聚己内酯及通过缩醛键键合到聚合物主链上的抗肿瘤药物紫杉醇为疏水内核的前药纳米胶束。该胶束载药量较高，在体内循环过程中能够避免药物的泄露和突释。聚合物前药含有pH敏感性的缩醛键，在正常细胞中的弱碱性环境下无法释放药物，在肿瘤细胞中的酸性环境下药物缓慢释放，能够特异性的杀伤肿瘤细胞，从而降低药物的毒副作用。

Description

酸敏感型紫杉醇前药、其制备方法及前药纳米胶束

技术领域

本发明涉及药物化学技术领域，尤其涉及一种酸敏感型紫杉醇前药、其制备方法及前药纳米胶束。

背景技术

全球每年有800多万人因患癌症失去生命，而且这个数字还在逐年递增。癌症的治疗已成为二十一世纪人类所面临的的最大考验和难题之一。随着人类对肿瘤学、基因组学、蛋白组学、药学等相关科学领域的不断探索，使得许多行之有效的抗肿瘤药物被设计开发出来。然而，目前绝大多数抗肿瘤药物为小分子，具有毒副作用大、疏水性强、生物利用度差等缺点，从而极大地限制了小分子抗肿瘤药物在临床方面的应用。

紫杉醇是从太平洋紫衫树的树皮中分离出来的一种天然产物，具有良好的抗肿瘤活性，其对有丝分裂纺锤体具有毒性，是较强的细胞抑制剂，已成为继阿霉素和顺铂之后的第三代抗肿瘤药物。由于其对卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤具有良好的治疗效果，因而紫杉醇具有重要的应用价值和经济效益。与其它小分子抗肿瘤药物相似，紫杉醇极低的水溶性往往要求其与表面活性剂(如聚氧乙烯蓖麻油)、乙醇等混合使用，这极大地增强了其对人体的毒副作用。

为了解决紫杉醇疏水性强、生物利用率低、对人体毒副作用大等问题，人们研究多种聚合物前药或药物载体等来改变其进入机体的方式和在体内的分布。聚合物前药是指药物在保持基本结构不变的情况下，在其某些官能团上进行结构修饰，并通过可断裂的化学键链接到聚合物链上，该前药在体内，尤其是作用部位可经酶或非酶作用，将其修饰性基团除去，恢复为原药而发挥药效。为了解决紫杉醇临床应用的诸多问题，紫杉醇前药的开发受到越来越多的重视。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种酸敏感型紫杉醇前药、其制备方法及前药纳米胶束，制备的纳米胶束具有较高的载药量。

本发明提供了一种酸敏感型紫杉醇前药，结构如式(I)所示：

其中，n＝22～227，x+y+z＝10～80，x＝3～70，y＝5～40，z＝2～20。

上述酸敏感型紫杉醇前药为两亲性两嵌段共聚物，以聚乙二醇为亲水端，分子量优选为1000～10000道尔顿，更优选2000～5000道尔顿；聚己内酯的聚合度(x+y+z)为10～80，优选10～50，更优选20～40；紫杉醇的取代度(z)为2～40，优选2～20，更优选2～12，最优选为2～6。

本发明还提供了上述酸敏感型紫杉醇前药的制备方法，包括以下步骤：

A)式(Ⅱ)所示官能化己内酯单体和聚乙二醇单甲醚在含锡催化剂的作用下，在隔离空气的条件下，进行反应，苯甲酸终止反应后，得到式(Ⅲ)所示两嵌段共聚物；

B)式(Ⅲ)所示两嵌段共聚物进行酯水解反应，得到羧基功能化的聚合物；

C)羧基功能化的聚合物在缩合剂的作用下，与2-乙烯氧基乙醇发生酯化反应，得到式(Ⅴ)所示的乙烯基醚官能化的两亲性两嵌段共聚物；

D)式(Ⅴ)所示的乙烯基醚官能化的两亲性两嵌段共聚物在酸性催化剂作用下，与紫杉醇发生加成反应，得到式(I)所示酸敏感型紫杉醇前药；

其中，n＝22～227，m＝10～80，x＝3～70。

首先，在聚合反应器中加入官能化己内酯单体、聚乙二醇单甲醚和含锡催化剂，在隔离空气的条件下，进行聚合反应，苯甲酸终止反应，得到式(Ⅲ)所示两嵌段共聚物。反应式如下：

所述聚乙二醇单甲醚的分子量优选为1000～10000道尔顿，更优选2000～5000道尔顿。

所述含锡催化剂优选为辛酸亚锡、辛酸锡、二丁基氧化锡或二月桂酸二丁基锡。

所述反应的温度优选为120～160℃，反应时间优选为12～72h。

上述聚乙二醇单甲醚和官能化己内酯单体的物质的量比优选为1:10～80。

上述含锡催化剂和聚乙二醇单甲醚物质的量比优选为1:0.2～10。

本发明中，苯甲酸终止反应后，得到的是混合物，优选对其进行纯化，具体的：

用0℃的甲醇对反应体系进行沉淀纯化，沉淀物经干燥，得到式(Ⅲ)所示两嵌段共聚物。

所述沉淀纯化优选重复3～5次。

本发明对上述干燥的方法并无特殊限定，可以为本领域技术人员熟知的的干燥方法，本发明优选的，在真空烘箱中于40℃下真空干燥。

然后对式(Ⅲ)所示两嵌段共聚物进行酯水解反应，脱去保护基，优选的，在酸的作用下，使共聚物侧基的酯键水解，得到羧基功能化的聚合物。

所述羧基功能化的聚合物结构如下：

反应式如下：

所述酸优选为三氯乙酸、三氟乙酸和对甲苯磺酸中的一种或几种。

然后上述羧基功能化的聚合物在缩合剂的作用下，与2-乙烯氧基乙醇发生酯化反应。反应式如下：

所述缩合剂优选为二环己基碳二亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、4-二甲氨基吡啶和1-羟基苯并三唑中的一种或几种。

最后上述乙烯基醚官能化的两亲性两嵌段共聚物在酸性催化剂作用下，与紫杉醇发生加成反应，即可得到上述式(I)所示酸敏感型紫杉醇前药。

反应式如下：

所述酸性催化剂优选为苯甲酸、对甲苯磺酸、三氯乙酸和三氟乙酸中的一种或几种。

本发明上述结构式中的单键，表示甲基。

本发明提供的上述酸敏感型紫杉醇前药具有良好的生物相容性和pH敏感性，可应用于制作前药纳米胶束。得到的纳米胶束可以利用肿瘤细胞内的内涵体/溶酶体的酸性环境实现药物的定点释放，达到降低抗肿瘤药物的毒副作用，提高肿瘤治疗效果的目的。

本发明还提供了一种紫杉醇前药纳米胶束，由上述酸敏感型紫杉醇前药或上述制备方法制备的酸敏感型紫杉醇前药制备得到。

本发明对上述胶束的制备方法并无特殊限定，可以为本领域技术人员熟知的方法，本发明优选的，上述酸敏感型紫杉醇前药在水性介质中自组装即可。

在本发明的某些具体实施例中，所述胶束的制备包括以下步骤：

将酸敏感型紫杉醇前药溶于有机溶剂中制成聚合物溶液，在滴速为0.01～0.10mL/min滴入搅拌速率为400～2000rpm的超纯水中，再在400～2000rpm搅拌24～48h，蒸发有机溶剂，得到含纳米胶束的液体，所述有机溶剂优选为四氢呋喃或丙酮或任意体积比的四氢呋喃与丙酮的混合液。

所述酸敏感型紫杉醇前药、有机溶剂和超纯水的比例优选为10～100mg：1～10mL：10～100mL。

本发明提供的上述胶束，壳由聚乙二醇单甲醚构成，核由以侧基官能化聚己内酯及通过缩醛键键合到聚合物主链上的紫杉醇构成。

所述胶束的粒径优选为50～200nm。

本发明提供的上述新型的酸敏感型紫杉醇前药纳米胶束，制备过程简单易行。抗肿瘤药物通过可断裂的化学键键合到聚合物上，使得其在体内循环过程中更为稳定，能够有效避免药物过早释放。所述纳米胶束兼具前药和胶束二者优点，通过细胞的内吞作用进入细胞并通过癌细胞内的弱酸性环境水解断裂缩醛键实现药物的快速释放，同时药物保持其原有结构，具有强效杀伤肿瘤细胞的作用，且实现抗肿瘤药物的靶向性释放及毒副作用的降低。

与现有技术相比，本发明公开了一种酸敏感型紫杉醇前药，具有式(I)所示结构，及其制备方法和应用。所述酸敏感型紫杉醇前药中，聚合物前体为乙烯基醚官能化的两亲性两嵌段共聚物，药物分子通过缩醛键与两亲性两嵌段共聚物共价链接；上述紫杉醇前药可在水溶液中自组装形成以聚乙二醇亲水链段为外表面、以侧基官能化聚己内酯及通过缩醛键键合到聚合物主链上的抗肿瘤药物紫杉醇为疏水内核的前药纳米胶束。该胶束载药量较高，在体内循环过程中能够避免药物的泄露和突释。聚合物前药含有pH敏感性的缩醛键，在正常细胞中的弱碱性环境下无法释放药物，在肿瘤细胞中的酸性环境下药物缓慢释放，能够特异性的杀伤肿瘤细胞，从而降低药物的毒副作用。

附图说明

图1为本发明制备的酸敏感型紫杉醇前药(I)的核磁共振H谱图；

图2为实施例5制备的紫杉醇前药胶束体外药物释放曲线；

图3为紫杉醇前药胶束体外生物活性图；

图4为本发明制备的乙烯基醚官能化的两亲性两嵌段共聚物安全性评价图。

具体实施方式

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的酸敏感型紫杉醇前药、其制备方法及前药纳米胶束进行详细描述。

实施例1

1)聚合反应：

在10mL聚合反应器中加入1.29g官能化己内酯单体、0.5g聚乙二醇单甲醚2000和0.0506g辛酸亚锡，在隔离空气的条件下，在130℃反应36h后，加入苯甲酸终止反应得两嵌段共聚物混合物。用5mL二氯甲烷溶解反应混合物后，将混合溶液在冰水浴条件下倒入50mL甲醇中。重复溶解-沉淀过程3次，收集滤渣，在真空烘箱中于40℃下真空干燥得到两嵌段共聚物(III)。

2)酯键水解

氮气保护下，将1.79g的两嵌段共聚物(III)溶解于100mL二氯甲烷中。0℃，搅拌条件下，向该溶液中缓慢滴加7.75mL三氯乙酸。加毕后，0℃继续搅拌4小时。减压蒸除溶剂，残余物以1.5mL二氯甲烷溶解，搅拌条件下，将其滴加至15mL冰乙醚中沉降，过滤，收集滤渣，在真空烘箱中于40℃下真空干燥得到羧基功能化的聚合物(IV)。

3)酯化反应

氮气保护下，将1.51g羧基功能化的聚合物(IV)溶解于50mL无水1,4-二氧六环中。0℃，搅拌条件下，分别向该溶液中加入0.042g HOBT和5.47g DCC。加毕后，该反应液恢复至室温，继续搅拌4小时。继而向其中加入2.2mL2-乙烯氧基乙醇，室温条件下，避光搅拌20小时。减压蒸除溶剂，残余物溶解于5mL无水四氢呋喃中，继而将其转入透析袋(MWCO 3500)，透析48小时，冷冻干燥，得到乙烯基醚官能化的两亲性两嵌段共聚物(V)。

4)酸敏感型紫杉醇前药(I)的制备：

氮气保护下，将200mg乙烯基醚官能化的两亲性两嵌段共聚物(V)、32mg PTX，0.26mg苯甲酸以及1g分子筛加入到含有10mL无水DMF的茄形瓶中，室温条件下，搅拌48小时。将反应液转移至透析袋(MWCO 3500)，以250mL无水DMF透析24小时，继而以500mL蒸馏水透析48小时，冷冻干燥，得到酸敏感型紫杉醇前药(I)。

采用核磁共振对制备的酸敏感型紫杉醇前药(I)结构进行表征，氢谱图如图1所示。

实施例2

1)聚合反应：

在10mL聚合反应器中加入1.032g官能化己内酯单体、0.4g聚乙二醇单甲醚5000和0.0162g辛酸亚锡，在隔离空气的条件下，在120℃反应48h后，加入苯甲酸终止反应得两嵌段共聚物混合物。用5mL二氯甲烷溶解反应混合物后，将混合溶液在冰水浴条件下倒入50mL甲醇中。重复溶解-沉淀过程3次，收集滤渣，在真空烘箱中于40℃下真空干燥得到两嵌段共聚物(III)。

2)酯键水解

氮气保护下，将1.432g的两嵌段共聚物(III)溶解于100mL二氯甲烷中。0℃，搅拌条件下，向该溶液中缓慢滴加7.75mL三氟乙酸。加毕后，0℃继续搅拌4小时。减压蒸除溶剂，残余物以1mL二氯甲烷溶解，搅拌条件下，将其滴加至10mL冰乙醚中沉降，过滤，收集滤渣，在真空烘箱中于40℃下真空干燥得到羧基功能化的聚合物(IV)。

3)酯化反应

氮气保护下，将1.208g羧基功能化的聚合物(IV)溶解于50mL无水1,4-二氧六环中。0℃，搅拌条件下，分别向该溶液中加入0.037g DMAP和6.27g DCC。加毕后，该反应液恢复至室温，继续搅拌4小时。继而向其中加入2.9mL2-乙烯氧基乙醇，室温条件下，避光搅拌20小时。减压蒸除溶剂，残余物溶解于5mL无水四氢呋喃中，继而将其转入透析袋(MWCO3500)，透析48小时，冷冻干燥，得到乙烯基醚官能化的两亲性两嵌段共聚物(V)。

4)酸敏感型紫杉醇前药(I)的制备：

氮气保护下，将200mg乙烯基醚官能化的两亲性两嵌段共聚物、56mg PTX，0.32mg苯甲酸以及1g分子筛加入到含有10mL无水DMF的茄形瓶中，室温条件下，搅拌48小时。将反应液转移至透析袋(MWCO 3500)，以250mL无水DMF透析24小时，继而以500mL蒸馏水透析48小时，冷冻干燥，得到酸敏感型紫杉醇前药(I)。

实施例3

1)聚合反应：

在10mL聚合反应器中加入1.032g官能化己内酯单体、0.5g聚乙二醇单甲醚10000和0.0101g辛酸亚锡，在隔离空气的条件下，在160℃反应36h后，加入苯甲酸终止反应得两嵌段共聚物混合物。用5mL二氯甲烷溶解反应混合物后，将混合溶液在冰水浴条件下倒入50mL甲醇中。重复溶解-沉淀过程3次，收集滤渣，在真空烘箱中于40℃下真空干燥得到两嵌段共聚物(III)。

2)酯键水解

氮气保护下，将1.532g的两嵌段共聚物(III)溶解于100mL二氯甲烷中。0℃，搅拌条件下，向该溶液中缓慢滴加7.75mL对甲苯磺酸。加毕后，0℃继续搅拌4小时。减压蒸除溶剂，残余物以2mL二氯甲烷溶解，搅拌条件下，将其滴加至20mL冰乙醚中沉降，过滤，收集滤渣，在真空烘箱中于40℃下真空干燥得到羧基功能化的聚合物(IV)。

3)酯化反应

氮气保护下，将1.292g羧基功能化的聚合物(IV)溶解于50mL无水1,4-二氧六环中。0℃，搅拌条件下，分别向该溶液中加入0.067g HOBT和8.54g EDC。加毕后，该反应液恢复至室温，继续搅拌4小时。继而向其中加入5.1mL2-乙烯氧基乙醇，室温条件下，避光搅拌40小时。减压蒸除溶剂，残余物溶解于5mL无水四氢呋喃中，继而将其转入透析袋(MWCO3500)，透析48小时，冷冻干燥，得到乙烯基醚官能化的两亲性两嵌段共聚物(V)。

4)酸敏感型紫杉醇前药(I)的制备：

氮气保护下，将200mg乙烯基醚官能化的两亲性两嵌段共聚物、103mg PTX，0.28mg苯甲酸以及1g分子筛加入到含有15mL无水DMF的茄形瓶中，室温条件下，搅拌48小时。将反应液转移至透析袋(MWCO 3500)，以250mL无水DMF透析24小时，继而以500mL蒸馏水透析48小时，冷冻干燥，得到酸敏感型紫杉醇前药(I)。

实施例4

敏感型紫杉醇前药胶束的制备

将10mg敏感型紫杉醇前药溶解于1mLTHF中，待其完全溶解后将该溶液转移至透析袋(MWCO 3500)，以10mM磷酸盐缓冲液透析24小时，离心，上清液以0.22μm微孔滤膜过滤，冷冻干燥，得到敏感型紫杉醇前药胶束。

实施例5

敏感型紫杉醇前药胶束的体外药物释放

将0.5mg敏感型紫杉醇前药胶束溶解于1mLpH 7.4的磷酸盐缓冲液中，继而将该溶液转移至透析袋(MWCO 3500)。37℃，漏槽条件下，分别于pH5.0、6.0、7.4的磷酸盐缓冲液中透析48小时。在0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、8、10、12、24、36、48小时，取3mL释放液以紫外分光光度计，228nm波长下测试稀释液吸光度，通过Lambert-Beer定律即可得到释放液中紫杉醇的浓度。

相应的紫杉醇前药胶束体外药物释放曲线如图2所示。

实施例6

敏感型紫杉醇前药胶束体外生物活性测试

将MCF-7细胞接种于96孔板中，每个孔大约种5000个细胞，37℃下孵育24小时，弃去培养液。向含有细胞的培养基中加入10μL敏感型紫杉醇前药胶束溶液。在37℃，5％二氧化碳条件下继续培养48小时，最后加入10μL的3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)的PBS溶液，将96孔板放入培养箱4小时后将培养液吸出，活细胞产生的紫色结晶用100μLDMSO溶解，样品的光学密度用酶标仪在492nm处测定。空白孔中加入与样品相同体积的PBS作为对照，记为100％存活。IC₅₀(细胞凋亡一半时对应的药物浓度)的值通过SPSSStatistics分析计算得到。

紫杉醇前药胶束体外生物活性如图3所示。

实施例7

乙烯基醚官能化的两亲性两嵌段共聚物安全性评价

将MCF-7细胞接种于96孔板中，每个孔大约种5000个细胞，37℃下孵育24小时，弃去培养液。向含有细胞的培养基中加入10μL乙烯基醚官能化的两亲性两嵌段共聚物胶束溶液。在37℃，5％二氧化碳条件下继续培养48小时，最后加入10μL的3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)的PBS溶液，将96孔板放入培养箱4小时后将培养液吸出，活细胞产生的紫色结晶用100μLDMSO溶解，样品的光学密度用酶标仪在492nm处测定。空白孔中加入与样品相同体积的PBS作为对照，记为100％存活。IC₅₀(细胞凋亡一半时对应的药物浓度)的值通过SPSS Statistics分析计算得到。

乙烯基醚官能化的两亲性两嵌段共聚物安全性评价结果如图4所示。

由上述实施例可知，本发明制备的酸敏感型紫杉醇前药具有优异的生物相容性和pH敏感性。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种酸敏感型紫杉醇前药，其特征在于，结构如式(I)所示：

其中，n＝22～227，x+y+z＝10～80，x＝3～70，y＝5～40，z＝2～40。

2.权利要求1所述的酸敏感型紫杉醇前药的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

A)式(Ⅱ)所示官能化己内酯单体和聚乙二醇单甲醚在含锡催化剂的作用下，在隔离空气的条件下，进行反应，苯甲酸终止反应后，得到式(Ⅲ)所示两嵌段共聚物；

B)式(Ⅲ)所示两嵌段共聚物进行酯水解反应，得到羧基功能化的聚合物；

C)羧基功能化的聚合物在缩合剂的作用下，与2-乙烯氧基乙醇发生酯化反应，得到式(Ⅴ)所示的乙烯基醚官能化的两亲性两嵌段共聚物；

D)式(Ⅴ)所示的乙烯基醚官能化的两亲性两嵌段共聚物在酸性催化剂作用下，与紫杉醇发生加成反应，得到式(I)所示酸敏感型紫杉醇前药；

其中，n＝22～227，m＝10～80，x＝3～70。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述含锡催化剂为辛酸亚锡、辛酸锡、二丁基氧化锡或二月桂酸二丁基锡。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤A)反应的温度为120～160℃，反应时间为12～72h。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤A)中，聚乙二醇单甲醚的分子量为1000～10000道尔顿。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤A)苯甲酸终止反应后，还包括：

用0℃的甲醇对反应体系进行沉淀纯化，沉淀物经干燥，得到式(Ⅲ)所示两嵌段共聚物。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤C)的缩合剂为二环己基碳二亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、4-二甲氨基吡啶和1-羟基苯并三唑中的一种或几种。

8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤D)的酸性催化剂为苯甲酸、对甲苯磺酸、三氯乙酸和三氟乙酸中的一种或几种。

9.一种紫杉醇前药纳米胶束，由权利要求1所述的酸敏感型紫杉醇前药或权利要求2～8任一项所述的制备方法制备的酸敏感型紫杉醇前药制备得到。

10.根据权利要求9所述的紫杉醇前药纳米胶束，其特征在于，所述胶束的粒径为50～200nm。