CN117645698B - 一种两亲性21臂的光敏剂-前药星型聚合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
本发明属于生物医用高分子聚合物材料技术领域，公开了一种两亲性21臂的光敏剂‑前药星型聚合物及其制备方法和应用。该聚合物制备步骤如下：先分别对光敏剂曙红和小分子药物喜树碱进行修饰得到可聚合光敏剂单体和含有二硫键的可聚合单体，然后制备基于β环糊精的大分子引发剂[β‑CD‑(Br)21]，再制备两亲性21臂的光敏剂‑前药星型聚合物β‑CD‑(PEOSMA‑b‑PCPTMA‑b‑PPEGMA)21。本发明星型聚合物可在水介质中自组装成纳米级别的单分子胶束，结构稳定，可实现控制释放药物，具有光动力‑化学疗法协同治疗作用，达到同时抗肿瘤和抗菌目的，很好的应用于制备同时具有抗肿瘤和抗菌功效的药物。
Description
技术领域
本发明属于生物医用高分子聚合物材料技术领域，特别涉及一种两亲性21臂的光敏剂-前药星型聚合物及其制备方法和应用。
背景技术
化学药物治疗是一种全身性治疗肿瘤的手段，但对肿瘤细胞并无特异性，杀伤肿瘤细胞的同时也杀死了正常细胞。光动力治疗是一种非侵入性治疗肿瘤的方法，具有副作用小、选择性好等优势。光动力疗法的疗效依赖于光敏剂产生活性氧(ROS)，该活性氧可直接与生物底物反应，导致毒性和随后的癌症细胞死亡。近年来，两亲性聚合物纳米胶束递送系统可灵活荷载药物和光敏剂，并携载它们克服生理、病理屏障，完成持续和靶向递送，实现抗肿瘤增效减毒，已成为新型药物递送体系研发的重点方向之一。然而，现有的体系大部分都是通过物理包载药物/光敏剂的多分子自组装胶束体系，而药物/光敏剂分子自身有更强的相互作用而形成相应的聚集体，使得有效荷载率在肿瘤组织处累积极低。在复杂的生理环境变化下，这些自组装胶束结构容易发生解离，导致所运载的药物和光敏剂泄漏。单分子胶束的特点是每一聚合物分子表现为一个胶束，即使在稀溶液中它也不会发生解离，这是因为单分子胶束的核与壳通过共价键相连，能够在外界条件变化时仍然保持胶束结构的完整性。将抗癌药物和光敏剂通过化学键连接到聚合物并构建成荷载方式和结构均稳定的单分子胶束，是构建递送体系的理想方法。目前文献报道的合成这种聚合物-药物缀合物的方法通常单独合成聚合物和药物，随后再将二者连接，存在合成步骤繁琐、纯化困难以及产率较低等缺点。此外，体系中药物的分布十分不均一且载入量也较难控制。采用“自下而上”策略合成聚合物-药物缀合物时，只需在药物上修饰一个可以聚合的官能团得到可聚合的前药单体，随后将这个可聚合前药单体直接通过自由基聚合引入到体系中。在此过程里，“自下而上”策略中前体合成等步骤都是明确可控的，而这种可控性、材料合成的高重复性对生物医用材料至关重要。
在人类的肿瘤里，存在许多细菌，而不同的肿瘤样本，细菌的种类也有区分。一些肿瘤中的细菌，可能会让抗菌剂或化疗药物失效，进而保护肿瘤免受治疗。根据以上报道推测细菌是一种潜在的致癌物，它们可以使得机体处于炎症环境从而促进肿瘤的发生，还可以通过分泌毒素扰乱细胞信号的表达，扰乱细胞生长规律。目前医学临床上会同时使用抗肿瘤药物和抗菌药物来治疗肿瘤与细菌感染。但是，多种药物的同时使用会增加毒副作用并且容易产生一些耐药细菌的出现，给治疗带来了挑战，多重耐药性是一个全球性的公共健康风险。综上所述，目前临床上需要迫切开发一种稳定的、副作用小的，通过化疗和光动力治疗联合，同时达到抗肿瘤和抗菌目的的单分子胶束递送体系，以帮助病人快速恢复健康。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种两亲性21臂的光敏剂-前药星型聚合物。
本发明的另一目的在于提供一种上述两亲性21臂的光敏剂-前药星型聚合物的制备方法；该方法首先用将光敏剂曙红修饰成为可聚合的单体 (EOSMA) ，制备含有二硫键的小分子后将药物喜树碱修饰成为含二硫键的可聚合喜树碱单体 (CPTMA) ；用溴化剂将21臂β-环糊精末端羟基溴化得到大分子引发剂β-CD-(Br)21，接着用该大分子引发剂依次引发单体EOSMA、CPTMA和亲水性单体甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯 (PEGMA) 进行电子转移活化再生原子转移自由基聚合反应 (ARGET ATRP) 聚合，最终得到两亲性21臂的光敏剂-前药星型聚合物。
本发明的再一目的在于提供一种基于上述两亲性21臂的光敏剂-前药星型聚合物的单分子胶束。
本发明的又一目的在于提供一种上述两亲性21臂的光敏剂-前药星型聚合物的应用；该聚合物同时具有抗肿瘤和抗菌的功效，可以应用于制备同时具有抗肿瘤和抗菌功效的药物。
本发明的再一目的在于提供上述单分子胶束的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种两亲性21臂的光敏剂-前药星型聚合物，该聚合物具有如下式(1)所示的结构：
其中，x=1~4，y=3~7，z=15~30。
所述聚合物的数均分子量范围为272~346 Kda。
上述的一种两亲性21臂的光敏剂-前药星型聚合物的制备方法，包括以下操作步骤：
(1)将曙红Y (EOS-Y) 、4-氯甲基苯乙烯、碳酸钾溶于超干N,N-二甲基甲酰胺中，在80 ℃下反应6 h，洗涤所得反应产物，得到可聚合光敏剂单体 (EOSMA) ；
(2)将甲基丙烯酰氯溶于超干四氢呋喃 (THF)中，在0 ℃下逐滴加入到双(2-羟乙基)二硫化物的四氢呋喃溶液和三乙胺 (TEA) 的混合液中，然后在室温下反应过夜，过滤、提纯和干燥后得到含有二硫键的小分子前驱体 (BHDMA) ；
(3)将喜树碱、4-二甲氨基吡啶和三光气分散于超干二氯甲烷中，搅拌30 min，得到混合液；然后将步骤(2)所得的含有二硫键的小分子前驱体溶于四氢呋喃，在氮气氛围下逐滴加入上述混合液中，过夜反应，洗涤、干燥、提纯得到含有二硫键的可聚合单体(CPTMA) ；
(4)将β-环糊精溶于溶剂中，冰浴下加入三乙胺 (TEA)和酰化剂2-溴异丁酰溴(BIBB) ，在冰浴中反应后，室温下继续反应，洗涤、干燥、过滤、硅胶柱纯化得到大分子引发剂 [β-CD-(Br)21] ；
(5)将步骤(4)所得大分子引发剂[β-CD-(Br)21]和催化剂CuBr2溶于溶剂中，依次加入步骤(1)所得可聚合光敏剂单体 (EOSMA) 、配体1, 1, 4, 7, 10, 10-六甲基三乙烯四胺 (HMTETA) 和还原剂 [Sn(Oct)2] 混合均匀，加热反应后依次加入步骤(3)所得含有二硫键的可聚合单体 (CPTMA) 、亲水性单体甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯进行反应，反应结束后去除催化剂得到两亲性21臂的光敏剂-前药星型聚合物(β-CD-(PEOSMA-b-PCPTMA-b-PPEGMA)21，简称βPECP)。
所述步骤(5)中大分子引发剂[β-CD-(Br)21]、CuBr2、可聚合光敏剂单体(EOSMA) 、含有二硫键的可聚合单体 (CPTMA) 、亲水性单体甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯(PEGMA) 、1, 1, 4, 7, 10, 10-六甲基三乙烯四胺 (HMTETA) 、Sn(Oct)2的摩尔比范围为1: (6~12): (21~84): (63~147): (315~630): (8~21): (8~21)。
步骤(5)中所述的加热反应是指加热到50~70 ℃。
步骤(1)-(5)中所述的反应均在惰性气体保护和无水条件下进行。
一种基于上述两亲性21臂的光敏剂-前药星型聚合物的单分子胶束，将两亲性21臂的光敏剂-前药星型聚合物经过三次溶解和沉淀重复操作，透析72 h得到单分子胶束。
所述单分子胶束在溶液或者细胞中都能产生单线态氧。
上述的两亲性21臂的光敏剂-前药星型聚合物在制备同时具有抗肿瘤和抗菌功效的药物中的应用。
上述的单分子胶束在制备同时具有抗肿瘤和抗菌功效的药物中的应用。
本发明相对于现有技术，具有以下主要优点：
(1)本发明两亲性21臂的光敏剂-前药星型聚合物是通过“自下而上”策略制备：只需在药物上修饰一个可以聚合的官能团得到可聚合的前药单体，随后将这个可聚合前药单体直接通过自由基聚合引入到体系中；在此过程里，合成步骤大大简化，功能化试剂在基体中分散十分均匀，所得材料的结构也较为规整。
(2)本发明所得的两亲性21臂的光敏剂-前药星型聚合物可自组装成单分子胶束，能够解决胶束解离和大颗粒的问题：单分子胶束的特点是每一聚合物分子表现为一个胶束，能够在外界条件变化时仍然保持胶束结构的完整性。
(3)本发明所得两亲性21臂的光敏剂-前药星型聚合物单分子胶束可以实现光动力治疗和化疗联合治疗：纳米胶束荷载光敏剂和药物，实现抗肿瘤增效减毒。
(4)本发明所得两亲性21臂的光敏剂-前药星型聚合物单分子胶束可以克服当前临床治疗肿瘤存在的多重耐药性：通过化疗和光动力治疗联合，同时达到抗肿瘤和抗菌目的，将很好地应用于制备同时具有抗肿瘤和抗菌功效的药物。
附图说明
图1为实施例1中两亲性21臂的光敏剂-前药星型聚合物的核磁氢谱。
图2为实施例1中两亲性21臂的光敏剂-前药星型聚合物的GPC曲线。
图3为实验例1中两亲性21臂的光敏剂-前药星型聚合物单分子胶束在溶液中活性氧产生的检测曲线。
图4为实验例2中两亲性21臂的光敏剂-前药星型聚合物单分子胶束的体外释药曲线。
图5为实验例3中两亲性21臂的光敏剂-前药星型聚合物单分子胶束的体外抗菌活性曲线。
图6为实验例4中两亲性21臂的光敏剂-前药星型聚合物单分子胶束的细胞中单线态氧产生检测结果。
图7为实验例4中两亲性21臂的光敏剂-前药星型聚合物单分子胶束的细胞增殖抑制曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。
实施例1：制备两亲性21臂的光敏剂-前药星型聚合物β-CD-(PEOSMA-b-PCPTMA-b-PPEGMA)21(x = 3, y = 7, z = 19)
(1)制备可聚合曙红单体EOSMA：将曙红Y (1 mmol) 、4-氯甲基苯乙烯 (1 mmol)、碳酸钾 (K2CO3, 2 mmol) 溶解在超干N, N-二甲基甲酰胺 (DMF, 5 mL) 后，加热混合物反应6 h。蒸发掉所有溶剂后，产物重新溶解在二氯甲烷中，洗涤纯化，柱层析得到纯净的产物，即为可聚合曙红单体EOSMA。本步骤的合成反应式见公式(1)。
(2)制备二硫小分子BHDMA：甲基丙烯酰氯 (20 mmol) 的超干四氢呋喃(THF, 15mL) 溶液在0 ℃下被逐滴加入到双(2-羟乙基)二硫化物 (BHD, 100 mmol) 的THF溶液和三乙胺 (TEA, 20 mmol) 混合液中，在室温下反应过夜，初产物经过过滤、硅胶柱提纯，室温干燥24 h得到纯净产物，即为二硫小分子BHDMA。本步骤的合成反应式见公式(2)。
(3)用步骤(2)所得BHDMA制备含二硫键的可聚合喜树碱单体CPTMA：喜树碱 (4mmol) 和4-二甲氨基吡啶 (DMAP, 12.64 mmol) 先在氮气保护下分散在超干二氯甲烷(60 mL) 中，加入三光气 (Triphosgene, 1.6 mmol) ，并在室温下搅拌30 min，得到混合液；溶于THF (12 mL) 的BHDMA (4.4 mmol) 溶液被逐滴加入到上述混合液中，室温搅拌，过夜反应。反应混合物经过洗涤、干燥、硅胶柱纯化，得到产物，即为含二硫键的可聚合喜树碱单体CPTMA。本步骤的合成反应式见公式(3)。
(4)将21臂β-环糊精末端羟基完全溴化得到大分子引发剂β-CD-(Br)21：β-环糊精(β-CD, 2 mmol) 加入反应瓶中，抽真空-通氮气三次，打入超干THF (80 mL) ，将三乙胺(TEA, 90 mmol) 注入烧瓶中，0 ℃条件下将2-溴异丁酰溴 (BIBB, 90 mmol) 逐滴加入。先在0 ℃反应5 h后再在室温下反应24 h。将反应液除去溶剂再重新溶解在二氯甲烷中，经过萃取洗涤、干燥、过滤、硅胶柱纯化分离，真空干燥得到最后产物，即为大分子引发剂β-CD-(Br)21。本步骤的合成反应式见公式(4)。
(5)引发剂β-CD-(Br)21(0.015 mmol) 和溴化铜 (CuBr2, 0.09 mmol) 分散在3mL超干二甲基亚砜 (DMSO) 里。把第一单体EOSMA (0.945 mmol)加于瓶中封口，抽真空-通氮气三次。将配体HMTETA (0.12 mmol) 加入瓶中，搅拌10 min；再将还原剂辛酸亚锡 [Sn(Oct)2, 0.12 mmol] 溶于0.2 mL超干DMSO中，搅拌5 min后转入70 ℃反应一定时间。7 h后，降温至50 ℃，加入第二单体CPTMA (2.205 mmol) 继续进行反应。12 h后，加入第三单体PEGMA (5.985 mmol) 继续进行反应96 h。反应完成后，用冰水冷却至室温，加入THF并搅拌使其溶解，经过中性氧化铝柱子过滤除去催化剂(以THF作洗脱剂)，得到的反应液浓缩后缓慢加入到十倍量的冷正己烷中沉淀，再次溶解-沉淀，重复三次，透析72 h，冻干48 h，得到两亲性21臂的光敏剂-前药星型聚合物(β-CD-(PEOSMA-b-PCPTMA-b-PPEGMA)21，简称为βPECP) 单分子胶束。本步骤的合成反应式见公式(5)。利用核磁和GPC对分子结构和组成进行分析，结果见图1和图2，M n=38.5 KDa，M w/M n=2.6。
实施例2：制备两亲性21臂的光敏剂-前药星型聚合物β-CD-(PEOSMA-b-PCPTMA-b-PPEGMA)21(x = 1, y = 3, z = 23)
(1)制备可聚合曙红单体EOSMA：将曙红Y (1 mmol) 、4-氯甲基苯乙烯 (1 mmol)、碳酸钾 (K2CO3, 2 mmol) 溶解在超干N, N-二甲基甲酰胺 (DMF, 5 mL) 后，加热混合物反应6 h。蒸发掉所有溶剂后，产物重新溶解在二氯甲烷中，洗涤纯化，柱层析得到纯净的产物，即为可聚合曙红单体EOSMA。
(2)制备二硫小分子BHDMA：甲基丙烯酰氯 (20 mmol) 的超干四氢呋喃(THF, 15mL) 溶液在0 ℃下被逐滴加入到双(2-羟乙基)二硫化物 (BHD, 100 mmol) 的THF溶液和三乙胺 (TEA, 20 mmol) 混合液中，在室温下反应过夜，初产物经过过滤、硅胶柱提纯，室温干燥24 h得到纯净产物，即为二硫小分子BHDMA。
(3)用步骤(2)所得BHDMA制备含二硫键的可聚合喜树碱单体CPTMA：喜树碱 (4mmol) 和4-二甲氨基吡啶 (DMAP, 12.64 mmol) 先在氮气保护下分散在超干二氯甲烷(60 mL) 中，加入三光气 (Triphosgene, 1.6 mmol) ，并在室温下搅拌30 min，得到混合液；溶于THF (12 mL) 的BHDMA (4.4 mmol) 溶液被逐滴加入到上述混合液中，室温搅拌，过夜反应。反应混合物经过洗涤、干燥、硅胶柱纯化，得到产物，即为含二硫键的可聚合喜树碱单体CPTMA。
(4)将21臂β-环糊精末端羟基完全溴化得到大分子引发剂β-CD-(Br)21：β-环糊精(β-CD, 2 mmol) 加入反应瓶中，抽真空-通氮气三次，打入超干THF (80 mL) ，将三乙胺(TEA, 90 mmol) 注入烧瓶中，0 ℃条件下将2-溴异丁酰溴 (BIBB, 90 mmol) 逐滴加入。先在0 ℃反应5 h后再在室温下反应24 h。将反应液除去溶剂再重新溶解在二氯甲烷中，经过萃取洗涤、干燥、过滤、硅胶柱纯化分离，真空干燥得到最后产物，即为大分子引发剂β-CD-(Br)21。
(5)引发剂β-CD-(Br)21(0.015 mmol) 和溴化铜 (CuBr2, 0.09 mmol) 分散在3mL超干二甲基亚砜 (DMSO) 里。把第一单体EOSMA (0.315 mmol)加于瓶中封口，抽真空-通氮气三次。将配体HMTETA (0.12 mmol) 加入瓶中，搅拌10 min；再将还原剂辛酸亚锡 [Sn(Oct)2, 0.12 mmol] 溶于0.2 mL超干DMSO中，搅拌5 min后转入70 ℃反应一定时间。7 h后，降温至50 ℃，加入第二单体CPTMA (0.945 mmol) 继续进行反应。12 h后，加入第三单体PEGMA (7.245 mmol) 继续进行反应96 h。反应完成后，用冰水冷却至室温，加入THF并搅拌使其溶解，经过中性氧化铝柱子过滤除去催化剂(以THF作洗脱剂)，得到的反应液浓缩后缓慢加入到十倍量的冷正己烷中沉淀，再次溶解-沉淀，重复三次，透析72 h，冻干48 h，得到两亲性21臂的光敏剂-前药星型聚合物(β-CD-(PEOSMA-b-PCPTMA-b-PPEGMA)21，简称为βPECP) 单分子胶束。
实施例3：制备两亲性21臂的光敏剂-前药星型聚合物β-CD-(PEOSMA-b-PCPTMA-b-PPEGMA)21(x = 2, y = 4, z = 30)
(1)制备可聚合曙红单体EOSMA：将曙红Y (1 mmol) 、4-氯甲基苯乙烯 (1 mmol)、碳酸钾 (K2CO3, 2 mmol) 溶解在超干N, N-二甲基甲酰胺 (DMF, 5 mL) 后，加热混合物反应6 h。蒸发掉所有溶剂后，产物重新溶解在二氯甲烷中，洗涤纯化，柱层析得到纯净的产物，即为可聚合曙红单体EOSMA。
(2)制备二硫小分子BHDMA：甲基丙烯酰氯 (20 mmol) 的超干四氢呋喃(THF, 15mL) 溶液在0 ℃下被逐滴加入到双(2-羟乙基)二硫化物 (BHD, 100 mmol) 的THF溶液和三乙胺 (TEA, 20 mmol) 混合液中，在室温下反应过夜，初产物经过过滤、硅胶柱提纯，室温干燥24 h得到纯净产物，即为二硫小分子BHDMA。
(3)用步骤(2)所得BHDMA制备含二硫键的可聚合喜树碱单体CPTMA：喜树碱 (4mmol) 和4-二甲氨基吡啶 (DMAP, 12.64 mmol) 先在氮气保护下分散在超干二氯甲烷(60 mL) 中，加入三光气 (Triphosgene, 1.6 mmol) ，并在室温下搅拌30 min，得到混合液；溶于THF (12 mL) 的BHDMA (4.4 mmol) 溶液被逐滴加入到上述混合液中，室温搅拌，过夜反应。反应混合物经过洗涤、干燥、硅胶柱纯化，得到产物，即为含二硫键的可聚合喜树碱单体CPTMA。
(4)将21臂β-环糊精末端羟基完全溴化得到大分子引发剂β-CD-(Br)21：β-环糊精(β-CD, 2 mmol) 加入反应瓶中，抽真空-通氮气三次，打入超干THF (80 mL) ，将三乙胺(TEA, 90 mmol) 注入烧瓶中，0 ℃条件下将2-溴异丁酰溴 (BIBB, 90 mmol) 逐滴加入。先在0 ℃反应5 h后再在室温下反应24 h。将反应液除去溶剂再重新溶解在二氯甲烷中，经过萃取洗涤、干燥、过滤、硅胶柱纯化分离，真空干燥得到最后产物，即为大分子引发剂β-CD-(Br)21。
(5)引发剂β-CD-(Br)21(0.015 mmol) 和溴化铜 (CuBr2, 0.09 mmol) 分散在3mL超干二甲基亚砜 (DMSO) 里。把第一单体EOSMA (0.63 mmol) 加于瓶中封口，抽真空-通氮气三次。将配体HMTETA (0.12 mmol) 加入瓶中，搅拌10 min；再将还原剂辛酸亚锡 [Sn(Oct)2, 0.12 mmol] 溶于0.2 mL超干DMSO中，搅拌5 min后转入70 ℃反应一定时间。7 h后，降温至50 ℃，加入第二单体CPTMA (1.26 mmol) 继续进行反应。12 h后，加入第三单体PEGMA (9.45 mmol) 继续进行反应96 h。反应完成后，用冰水冷却至室温，加入THF并搅拌使其溶解，经过中性氧化铝柱子过滤除去催化剂(以THF作洗脱剂)，得到的反应液浓缩后缓慢加入到十倍量的冷正己烷中沉淀，再次溶解-沉淀，重复三次，透析72 h，冻干48 h，得到两亲性21臂的光敏剂-前药星型聚合物(β-CD-(PEOSMA-b-PCPTMA-b-PPEGMA)21，简称为βPECP) 单分子胶束。
实验例1：溶液中单线态氧产生测定
将二甲基-4-亚硝基苯胺和咪唑配制成PBS溶液，随后各取500 µL一起加入实施例1所得两亲性21臂的光敏剂-前药星型聚合物单分子胶束 (光敏剂的有效浓度是37.8μg/mL) 的PBS溶液中，得到混合液。随后用绿光LED灯 (波长530 nm，功率7 W/cm2) 照射上述混合液，在不同照射时间测定混合液在440 nm处的紫外吸收值，将下降差值与照射时间做图。结果如图3所示，在没有绿光辐照的情况下，440 nm处的紫外吸收值在黑暗中保持基本不变，说明体系中几乎没有产生单线态氧；经过绿光LED照射之后，吸光度比一开始明显下降，证明该胶束在水溶液中可以有效生成单线态氧的能力。
实验例2：体外药物释放实验
将0.1 mg实施例1所得两亲性21臂的光敏剂-前药星型聚合物单分子胶束分散于1mL磷酸缓冲液 (PBS) 后转入透析袋 (截留分子量为3500) 中，每个样品平行2份，将透析袋放入80 mL含有不同二硫苏糖醇 (DTT) 浓度的PBS中，置于摇床的37 ℃，100 rpm转速下进行体外释放，定时取样3 mL，经0.45微米过滤头过滤后测其在365 nm处的紫外吸光度，并加入3 mL相对应的新鲜缓冲液。用下列公式计算药物 (CPT) 累积释放量：
式中：：药物累积释放量，%；/>：缓冲液置换体积，3 mL；/>：缓冲液的总体积，80 mL；/>：第i次置换取样时样品浓度，mg/L；/>：胶束中CPT的质量，mg；/>：置换缓冲液的次数。
结果如图4所示，胶束的药物释放速率均与DTT的浓度有关，随着DTT浓度的增大，药物累积释放量越大。在没有DTT或存在2 μM DTT的情况下，只检测到不足5%的累积释放量，这表明在非还原条件下药物基本保持在胶束上不会泄漏；当DTT浓度增加到10 mM，培养105 h后发现CPT的累积释放可高达70%，证明胶束中含有的二硫键可以在还原性的条件下断裂，使得药物释放出来。
实验例3：体外抗菌活性实验
取300 μL密度约为107CFU/mL的培养过夜的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌菌悬液加到24孔板中，然后将300 μL的纯PBS、实施例1所得两亲性21臂的光敏剂-前药星型聚合物单分子胶束的PBS溶液分别添加到各孔中 (每组4平行) 。各组的喜树碱的有效浓度为20 μg/mL。光照组用绿光LED照射15 min后，统一在恒温摇床37 ℃，50 rpm培养。培养一段时间后，用酶标仪测定各组的光密度 (OD600) 值。结果如图5所示，在无光照条件下经过了24小时的培养，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌存活率都还比较高；而当用绿光照射与光敏剂-前药星型聚合物胶束共培养的金黄色葡萄球菌存活率降低到35％以下，大肠杆菌的存活率降低到50％以下，表明胶束具有对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌都具有杀伤能力。
实验例4：细胞中的光动力治疗和化疗效果测试
选用人体乳腺癌细胞MCF-7作为模型细胞。培养细胞贴壁生长，在不同孔中分别加入无血清DMEM配置的实施例1所得两亲性21臂的光敏剂-前药星型聚合物(光敏剂的有效浓度为20 µg/mL)。随后将上述细胞孵育4 h使胶束和药物充分进入细胞，再向孔板中加入每孔20 µL 2,7-二氯荧光素二乙酸酯 (DCFH-DA) 溶液，孵育20 min使DCFH-DA充分进入细胞内。随后将光照组取出用绿光LED灯照射样品15 min，在流式细胞仪上测试并分析细胞的荧光。结果如图6所示，光照条件下，两亲性21臂的光敏剂-前药星型聚合物单分子胶束处理的细胞其荧光强度比未光照的细胞提升了114倍，表明经过光照后该胶束能促进MCF7细胞内单线态氧的生成。
用CCK8试剂盒检测游离的喜树碱和两亲性21臂的光敏剂-前药星型聚合物单分子胶束对细胞活性的影响：把细胞接种铺好材料的96孔板上 (1×104个/孔/100μL) ，在37℃，5% CO2恒温培养箱内培养24 h。对于细胞暗毒性，将加药处理的细胞直接孵育24 h。对于光照条件下的细胞毒性，先将加药处理的细胞孵育4 h使药物充分进入细胞，再将细胞置于绿光LED灯下照射15 min，最后将细胞继续孵育20 h。孵育结束后，将孔中旧培养基吸出，向每个孔中加入20 µL CCK8溶液，并在37 ℃继续孵育2 h。最后用酶标仪测在450 nm处的光密度值(OD)。细胞存活率的计算公式如下：
结果如图7所示，两亲性21臂的光敏剂-前药星型聚合物单分子胶束在黑暗中无法产生单线态氧，故几乎没有表现出细胞毒性；而在光照条件下，随着喜树碱有效浓度的增加，细胞增殖抑制率明显增加，胶束表现出比游离的喜树碱杀死肿瘤细胞更好的效果，在高浓度 (20 mg/L) 时，有超过75%的细胞与胶束共培养后被杀死。较高的细胞毒性表明胶束进入肿瘤细胞，释放出来的药物和负载的光敏剂表现出协同的化学和光动力疗效。单线态氧检测试验和CCK8试验结果一致，证实本发明所得两亲性21臂的光敏剂-前药星型聚合物单分子胶束是一个很有前途的化疗-光动力双重治疗平台。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种同时具有抗肿瘤和抗菌功效的两亲性21臂的光敏剂-前药星型聚合物，其特征在于：该聚合物具有如下式(1)所示的结构：
其中，x=1~4，y=3~7，z=15~30。
2.根据权利要求1所述的一种同时具有抗肿瘤和抗菌功效的两亲性21臂的光敏剂-前药星型聚合物，其特征在于：所述聚合物的数均分子量范围为272~346 KDa。
3.根据权利要求1所述的一种同时具有抗肿瘤和抗菌功效的两亲性21臂的光敏剂-前药星型聚合物的制备方法，其特征在于包括以下操作步骤：
(1)将曙红Y、4-氯甲基苯乙烯、碳酸钾溶于超干N,N-二甲基甲酰胺中，在80 ℃下反应6h，洗涤所得反应产物，得到可聚合光敏剂单体；
(2)将甲基丙烯酰氯溶于超干四氢呋喃中，在0 ℃下逐滴加入到双(2-羟乙基)二硫化物的四氢呋喃溶液和三乙胺的混合液中，然后在室温下反应过夜，过滤、提纯和干燥后得到含有二硫键的小分子前驱体；
(3)将喜树碱、4-二甲氨基吡啶和三光气分散于超干二氯甲烷中，搅拌30 min，得到混合液；然后将步骤(2)所得的含有二硫键的小分子前驱体溶于四氢呋喃，在氮气氛围下逐滴加入上述混合液中，过夜反应，洗涤、干燥、提纯得到含有二硫键的可聚合单体；
(4)将β-环糊精溶于溶剂中，冰浴下加入三乙胺和酰化剂2-溴异丁酰溴，在冰浴中反应后，室温下继续反应，洗涤、干燥、过滤、硅胶柱纯化得到大分子引发剂β-CD-(Br)21；
(5)将步骤(4)所得大分子引发剂β-CD-(Br)21和催化剂CuBr2溶于溶剂中，依次加入步骤(1)所得可聚合光敏剂单体、配体1, 1, 4, 7, 10, 10-六甲基三乙烯四胺和还原剂 Sn(Oct)2混合均匀，加热反应后依次加入步骤(3)所得含有二硫键的可聚合单体、亲水性单体甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯进行反应，反应结束后去除催化剂得到同时具有抗肿瘤和抗菌功效的两亲性21臂的光敏剂-前药星型聚合物β-CD-(PEOSMA-b-PCPTMA-b-PPEGMA)21。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中大分子引发剂β-CD-(Br)21、CuBr2、可聚合光敏剂单体、含有二硫键的可聚合单体、亲水性单体甲基丙烯酸单甲氧基聚乙二醇酯、1, 1, 4, 7, 10, 10-六甲基三乙烯四胺、Sn(Oct)2的摩尔比范围为1:(6~12): (21~84): (63~147): (315~630): (8~21): (8~21)。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(5)中所述的加热反应是指加热到50~70 ℃。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)-(5)中所述的反应均在惰性气体保护和无水条件下进行。
7.一种基于权利要求1所述的同时具有抗肿瘤和抗菌功效的两亲性21臂的光敏剂-前药星型聚合物的单分子胶束，其特征在于：将两亲性21臂的光敏剂-前药星型聚合物经过三次溶解和沉淀重复操作，透析72 h得到单分子胶束。
8.根据权利要求7所述的单分子胶束，其特征在于：所述单分子胶束在溶液或者细胞中都能产生单线态氧。
9.根据权利要求1所述的一种两亲性21臂的光敏剂-前药星型聚合物在制备同时具有抗肿瘤和抗菌功效的药物中的应用。
10.根据权利要求7所述的单分子胶束在制备同时具有抗肿瘤和抗菌功效的药物中的应用。
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