CN105381467B - 具有叶酸靶向pH-还原双重响应的抗肿瘤活性的两亲嵌段聚合物及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种了具有叶酸靶向pH‑还原双重响应的抗肿瘤活性的两亲性嵌段共聚物；是将功能化的二硫单体，酸刺激响应的甲氧基聚乙二醇，功能化的叶酸通过RAFT聚合形成一种生物相容良好的高分子嵌段共聚物——二硫单体‑酸性PEG‑叶酸共聚物。该共聚物具有pH和还原双重刺激响应，且带有叶酸主动靶向的聚合物载药胶束，能够有效的在靶向位点释放阿霉素。这种智能响应性的胶束有低的细胞毒性，可生物降解，具有恰当的载药水平，能够促进大量的药物更快的在肿瘤组织部位堆积，不仅能在酸性的细胞质之间，也能在高的还原性的细胞质和细胞核内作用，因此，作为药物载体在制备抗肿瘤药物中具有很好的应用前景。

Description

具有叶酸靶向pH-还原双重响应的抗肿瘤活性的两亲嵌段聚 合物及其制备和应用
技术领域
本发明属于高分子化学领域，涉及一种具有叶酸靶向pH和还原双重响应的抗肿瘤活性的两亲嵌段聚合物——（甲基丙烯酰二硫乙醇-三甲氧基苯甲酸）-腙键-聚乙二醇-聚叶酸；本发明同时还涉及该两亲性嵌段共聚物的制备和作为药物载体在制备抗肿瘤药中的应用，属于高分子化学领域和生物医药应用技术领域。
背景技术
癌症已经成为人类健康的主要威胁之一，且呈明显上升趋势。现今治疗癌症的主要方法包括放疗、化疗、手术疗法和基因疗法。其中放疗和化疗是极其重要的非手术疗法，但是放疗和化疗在杀死肿瘤细胞的同时也对机体正常细胞产生严重损伤。
甲氧基聚乙二醇（PEG）是一种高分子药物载体，具有良好的生物相容性，不仅能够降低药物的毒副作用，减少抗药性，提高药物在体内的稳定性，同时增加药物在肿瘤部位的富集，使药效得到更好的发挥等特点，被作为肿瘤靶向药物载体已应用于临床。PEG的其结构式如下：
。
叶酸是一种很重要的能靶向到特定的细胞膜并通过该细胞膜表面的叶酸受体使得胶束纳米微粒内吞进入细胞溶酶体。叶酸修饰的纳米载药系统主要是将药物输送到肿瘤细胞，如宫颈癌、子宫内膜、直肠癌、乳腺癌、肺癌、肾细胞癌、脑转移上皮癌和神经内分泌癌。此外，叶酸价格低、容易与载体偶联、容易生产和储存。因此，叶酸是应用较为广泛的靶向分子在抗肿瘤方面，其结构是如下：
。
因此，将水溶性好的甲氧基聚乙二醇（PEG）、功能化的叶酸与功能化的双（2-羟基乙基）二硫醚通过一定的方式形成共聚物，使其抗肿瘤活性进行叠加，以促进聚合物对肿瘤的抑制作用，同时体现出良好的生物相溶性，以减少对正常组织的伤害，有望为抗癌领域提供了更多的选择。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有叶酸靶向pH-还原双重响应的抗肿瘤活性的两亲性嵌段聚合物；
本发明的另一目的是提供一种上述两亲性嵌段聚合物的制备方方法；
本发明还有一个目的，就是提供该两亲性嵌段聚合物作为抗肿瘤药物载体的应用。
一、具有叶酸靶向pH-还原双重响应的抗肿瘤活性的两亲性嵌段聚合物的结构
本发明具有叶酸靶向pH-还原双重响应的抗肿瘤活性的两亲性嵌段聚合物，是将功能化的二硫单体，酸刺激响应的甲氧基聚乙二醇，功能化的叶酸通过RAFT聚合形成一种生物相容良好的高分子嵌段共聚物——二硫单体-酸性PEG-叶酸共聚物，其结构如下：
式中，m=42~44mol%，n=40~39mol%, o=18~17mol%；数均分子量Mn=1.38×104~1.42×104，Mw/Mn=1.14~1.16。
本发明的聚合物将三甲氧基苯甲酸和修饰了的叶酸，酸响应性的甲氧基聚乙二醇的抗肿瘤活性进行叠加，进一步促进了对肿瘤的抑制作用；嵌段共聚物中的二硫键使得药物载体到达肿瘤靶向部位之后载体释放出小分子药物阿霉素，这不仅降低了药物毒性，还能在肿瘤细胞内智能释放抗癌药物；靶向分子叶酸，使得药物能够更好地识别肿瘤细胞；高分子载体甲氧基聚乙二醇，使共聚物体现出良好的生物相溶性，从而减少了对正常组织的伤害，所以在制备抗肿瘤药物方面具有很好的应用前景。
二、具有叶酸靶向pH-还原双重响应的抗肿瘤活性的两亲性嵌段聚合物的制备
本发明具有叶酸靶向pH-还原双重响应的抗肿瘤活性的两亲性嵌段聚合物的制备，包括以下工艺步骤：
（1）化合物的制备：以二氯甲烷为溶剂，三乙胺作为缚酸剂，双（2-羟基乙基）二硫醚与甲基丙烯酰氯为反应底物，于0~5℃反应20~24小时；反应结束后，用pH等于8.0的磷酸缓冲溶液洗涤反应液，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析分离纯化，得无色油状液体即为化合物；其结构式为：
双（2-羟基乙基）二硫醚与甲基丙烯酰氯的摩尔比为1:1.5~1:2.0；三乙胺与双（2-羟基乙基）二硫醚的摩尔比为2.2:1~2.5:1。
（2）化合物的制备：以二氯甲烷为溶剂，以4-二甲基氨基吡啶为催化剂，N,N-二环己基碳二亚胺为活化剂，使化合物与3,4,5-三甲氧基苯甲酸于0~5℃反应20~24小时；过滤，旋蒸除去溶剂，粗产物通过硅胶色谱柱纯化，得到白色固体化合物；其结构式为：
化合物与3,4,5-三甲氧基苯甲酸的摩尔比为1:5~1:5.2；化合物与活化剂N,N-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:3~1:3.5；化合物与催化剂4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1:0.9~1:1.1。
（3）化合物的制备：在二氯甲烷/四氢呋喃的混合溶剂中，以N,N-二环己基碳二亚胺（DCC）为活化剂，4-二甲氨基吡啶（DMAP）为催化剂，甲氧基聚乙二醇和4-甲醛基苯甲酸溶于0~5℃反应20~24小时；过滤，用乙醚沉淀，真空干燥，得到的白色固体即为化合物；其结构式为：
甲氧基聚乙二醇PEG与4-醛基苯甲酸的摩尔比为1:3~1:3.2；甲氧基聚乙二醇PEG与活化剂N,N-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:3~1:3.2；甲氧基聚乙二醇PEG与催化剂4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1:0.9~1:1.1；二氯甲烷/四氢呋喃的混合溶剂中，二氯甲烷与四氢呋喃的体积比为1:1~1:2。
（4）化合物的制备：以乙醇为溶剂，氮气保护下，化合物与2-羟乙基肼在30~40℃避光反应45~50h，反应结束后除去溶剂，所得固体用乙醚洗涤纯化，干燥，得到白色固体为化合物；其结构式为：
所述化合物与2-羟乙基肼的摩尔比为1:5~1:5.2。
（5）化合物的制备：以二氯甲烷为溶剂，三乙胺为催化剂，化合物与甲基丙烯酰氯于0~5℃反应20~24小时；反应完全后，用pH等于8.0的磷酸缓冲溶液和蒸馏水洗涤，无水硫酸钠干燥，粗产物通过硅胶色谱柱纯化，得化合物；其结构式为：
所述化合物与甲基丙烯酰氯的摩尔比为1:1.5~1:2.0；催化剂三乙胺与化合物的摩尔比为2.2:1~2.5:1。
（6）化合物的制备：二甲基亚砜为溶剂，N,N-二环己基碳二亚胺为活化剂，4-二甲氨基吡啶为催化剂，使叶酸与烯丙基胺于室温反应20~24小时，过滤，滤液用乙酸乙酯沉淀，干燥，得黄色固体即化合物；其结构式为：
叶酸与烯丙基胺的摩尔比为1:2~1:2.5；叶酸与二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:1.0~1:1.5；叶酸与催化剂4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1:2~1:2.5。
（7）化合物的制备：以二甲基亚砜为溶剂，偶氮二异丁腈为引发剂，RAFT试剂作用，55~65℃下，化合物自身聚合20~24小时；加入化合物的DMSO溶液，继续反应20~24小时，用乙酸乙酯沉淀，干燥，得化合物；其结构式为：
所述RAFT试剂为2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸，其结构式为：
RAFT试剂与化合物的摩尔比为1:15~1:15.5；引发剂偶氮二异丁腈的用量为化合物、化合物质量总和的5%~10%；化合物与化合物的摩尔比为2:1~2.3:1。
（8）目标化合物的制备：以二甲基亚砜为溶剂，偶氮二异丁腈为引发剂，RAFT试剂作用下，化合物和化合物于55~65℃聚合20~24小时，产物用乙酸乙酯沉淀，干燥，得黄色聚合产物即为目标化合物。其结构式如下：
引发剂偶氮二异丁腈的用量为化合物和化合物质量总和的5%~20%；化合物与化合物的摩尔比为1:5~1:5.5。对应结构式中，m=42~44mol%，n=40~39mol%, o=18~17mol%；数均分子量Mn=1.38×104~1.42×104。
图1为上述方法制备的具有pH和还原双重响应性叶酸靶向的抗肿瘤活性的两亲性嵌段共聚物的核磁共振氢谱。通过核磁共振氢谱分析可以得出，由1H NMR谱化学位移在3.62-3.85ppm为PEG的特征峰上亚甲基的452个H，化学位移在8.12ppm、7.95ppm为酸刺激响应性PEG中苯环的特征峰上的H，化学位移在6.67ppm、7.65ppm和8.68ppm为叶酸上的苯环上的两个H和杂环上的一个H，二硫单体苯基氢化学位移在7.20ppm为二流功能化单体苯基上的H，核磁共振氢谱说明用上述方法制备的共聚产物与设计的共聚物结构一致，表明成功合成了该共聚物。
二、抗肿瘤活性实验
1、胶束的制备以及表征
（1）共聚物胶束的制备
将两亲性聚合物（化合物）充分溶于N,N′-二甲基甲酰胺中，缓慢滴加去离子水，溶液出现蓝色乳光形成胶束溶液；然后将胶束溶液装入透析袋（MWCO=3000）置于去离子水中透析45~50h，取出胶束溶液，用去离子水调节胶束溶液的浓度至0.8~1.2mg/mL，即得共聚物胶束。
（2）载药聚合物胶束制备
将两亲性聚合物（聚合物）和阿霉素解于DMF中，搅拌2~5小时，然后在室温滴加去离子水，继续搅拌10~12h，然后在去离子水中透析20~24小时，得到载药胶束溶液。两亲性聚合物和阿霉素质量比为2.5:1~3.0:1；两亲性聚合物与去离子的质量体积比为0.8~1.2mg/mL。
（3）胶束的表征
用纳米粒径仪对上述制备的聚合物载药胶束的粒径及粒径分布进行检测，粒径大约120nm左右（见图2）；采用透射电镜（TEM）观察了胶束的形貌为纳米级的小球（见图3）。
2、体外抑制肿瘤细胞生长实验
阿霉素是一种抗肿瘤抗生素，可抑制RNA 和DNA的合成，对RNA的抑制作用最强，抗瘤谱较广，对多种肿瘤均有作用，属周期非特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用, 主要适用于急性白血病，对急性淋巴细胞白血病及粒细胞白血病均有效。本实验选用了肝癌细胞进行了实验。
采用四氮唑盐还原法（MTT）对人体宫颈癌Hela细胞株进行试验：取处于生长对数期的Hela细胞，将细胞浓度调为2×104个／ml，在96孔培养板中加入90 µl/孔，边缘孔用无菌PBS填充。在5% CO2，37℃孵育，培养箱中放置待贴壁后再加药。对于本发明高分子聚合物载阿霉素无叶酸胶束、载阿霉素有叶酸胶束和游离阿霉素，均分别设定浓度为1.2、2.5、5、10、15、20 µg/ml 6个梯度。实验组与对照组均设4个复孔，加药后细胞在温度37 ℃二氧化碳培养箱内继续分别培养24h后，取出先离心，后弃去96孔板内的上清培养液，小心用PBS冲洗2~3遍后，每孔加人20 µl MTT （四氮唑，5 mg/ml，即0.5% MTT）溶液，置于37℃二氧化碳培养箱内继续培养4h。终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入150 µl的DMSO，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶标仪570 nm测定各孔的吸光OD值。 细胞生长抑制率按以下公式计算：
抑制率= [(1－实验组平均OD值)/对照组平均OD值]×100％
测试结果见表1：
3、体外模拟的水解、释放实验
（1）通过紫外分光光度计测定了3,4,5-三甲氧基苯甲酸282nm处的吸光度计算其水解率。取两份5ml聚合物胶束，分别置于100ml的pH 7.4（100mM）；pH 7.4（100mM），DTT（二硫苏糖醇）；pH 5.0（100mM）；pH 5.0（100mM），DTT的缓冲溶液中，透析24小时，按照一定的时间间隔取样，测紫外吸收，并与最终滴加了HCl时的吸光度进行比较，所得三甲氧基苯甲酸的水解率分别为12.78%，93.3%，13.18%和96.75%。说明了在pH 5.0，DTT的环境下，水解的效果更好。
（2）通过紫外分光光度计测定阿霉素在482nm处的吸光强度计算载药胶束的药物释放率。取两份5ml载药聚合物胶束，分别置于100ml的pH7.4（100mM）；pH 7.4 （100mM），DTT（二硫苏糖醇）；pH 5.0（100mM）；pH 5.0（100mM），DTT的缓冲溶液中，透析48小时，按照一定的时间间隔取样，测紫外吸收，并与聚合物中包载的阿霉素进行比较，最终释放率分别为17.97%，64.05%，72.22%和92.48%，说明了在pH 5.0，DTT时会更好的释放出阿霉素。
4、细胞毒性和成像实验
采用四氮唑盐还原法（MTT）对Hela细胞株进行试验，结果显示细胞存活率>90%。用Hoechst33342细胞核燃料对细胞核进行标记，具有蓝色荧光，而药物阿霉素具有强烈的红光。荧光强弱代表着细胞内各组分的含量，首先对Hela细胞的细胞核进行标记，分别加入被动靶向载药胶束和主动靶向载药胶束，分别进行孵化4h和12h进行测定。明显可以发现两种聚合物胶束都可以进入细胞核内，且随着时间增长，荧光强度明显增强。
综上所述，本发明设计合成具有pH刺激响应性腙键连接亲水性的PEG作为亲水外壳，同时选用具有还原刺激响应性的二硫单体作为疏水内核，在最外层负载叶酸靶向配体，加强了抗癌药物阿霉素在体内释放。这种智能响应性的胶束有低的细胞毒性，可生物降解，具有恰当的载药水平，在pH 7.4, 37℃的条件下48小时释放百分比18.95%足够稳定释放药量少，能够促进大量的药物更快的在肿瘤组织部位堆积，不仅能在酸性的细胞质之间，也能在高的还原性的细胞质和细胞核内作用。负载叶酸靶向能够特异性的识别并內吞进入细胞内，进一步促进药物在肿瘤治疗中的效果。这种具有叶酸靶向和pH-还原双重刺激响应的性的生物可降解的药物智能识别控制释放的载体微胶束，提供了一个良好的控制药物释放的有效的化疗方法。
附图说明
图1为本发明制备的具有PH和还原双重响应性叶酸靶向的抗肿瘤活性的两亲性嵌段共聚物的核磁共振氢谱。
图2为本发明胶束载体的粒径分布图；
图3为本发明胶束载体的透射电镜图。
图4为本发明载药胶束在pH 7.4，pH 7.4，DTT，pH 5.0和pH 5.0，DTT时水解的体外模拟释放曲线。
图5为本发明载药胶束在pH 7.4，pH 7.4，DTT，pH 5.0和pH 5.0，DTT时阿霉素释放的的体外模拟曲线。
图6为本发明载药胶束细胞毒性图。
图7为本发明载药胶束细胞毒性的抑制率图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明高分子共聚物的合成及结构表征作进一步的说明。
实施例1
（1）化合物的制备：称取3.08 g 双（2-羟基乙基）二硫醚溶于30mL二氯甲烷中，加入4g 三乙胺作为缚酸剂搅拌20分钟，在冰浴下用恒压漏斗缓慢的滴入1.08 g甲基丙烯酰氯，继续搅拌反应24小时。待反应完全后，反应液用100 mmol/l pH为8.0的磷酸缓冲和蒸馏水洗三次，有机层用无水硫酸钠干燥，然后溶剂旋转蒸发，粗产物通过硅胶色谱柱纯化，得白1.62g色固体，即为化合物，产率为73%。
1H NMR (400 MHz, CDCl3, δ, ppm): 6.13 (s, 1H, CHH = C(CH3)CO-), 5.59(s, 1H, CHH = C(CH3)CO-), 4.41 (t, J = 6.6Hz, 2H, -COOCH 2 CH2SSCH2CH2OH), 3.87(t, J = 6.5Hz, 2H, -COOCH2CH2SSCH2CH 2 OH), 2.96 (t, J = 6.7Hz, 2H, -COOCH2CH 2 SSCH2CH2OH), 2.87 (t, J = 5.8Hz, 2H, -COOCH2CH2SSCH 2 CH2OH), 1.93 (s,3H, -CH 3 )。
（2）化合物的制备：222mg化合物 溶解于30mL二氯甲烷中，冰浴的条件下，加入619mgN,N'-二环己基碳，122mg 4-二甲氨基吡啶和636mg 3,4,5-三甲氧基苯甲酸，混合物搅拌反应24小时，沉淀过滤除去，溶剂旋转蒸发，粗产物通过硅胶色谱柱纯化得0.37g淡黄色固体，即为化合物，产率为89%。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, δ, ppm): 6.03 (s, 1H, CHH = C(CH3)CO-), 5.68(s, 1H, CHH = C(CH3)CO-), 4.51 (t, J = 6.3Hz, 2H, -COOCH2CH2SSCH2CH 2 COOC6H2(OCH3)3), 4.35 (t, J = 6.4Hz, 2H, -COOCH 2 CH2SSCH2CH2COOC6H2(OCH3)3), 3.13 (t, J= 6.3Hz, 2H, -COOCH2CH2SSCH 2 CH2COOC6H2(OCH3)3), 3.04 (t, J = 6.4Hz, 2H, -COOCH2CH 2 SSCH2CH2COOC6H2(OCH3)3), 1.86 (s, 3H, -CH3), 3.73-3.82 (s, 9H, Ar-OCH 3), 7.25 (s, 2H, Ar-CH)。
（3）化合物的制备：5gPEG750和0.45g 4-甲醛基苯甲酸溶解于二氯甲烷-THF（30ml/30ml）的混合物中，在冰浴中搅拌。然后将619mg DCC和122mg DMAP加入到反应溶液中，搅拌24h；过滤除去沉淀物，并在减压下除去溶剂；用冷的乙醚纯化三次，真空干燥，得到4.82g白色固体，即为化合物。产率为94%。
1H NMR (400 MHz, CDCl3, δ, ppm): 10.11 (1H, s, –CHO), 8.23–7.97 (4H,m, phenyl group), 4.52 (2H, t, –CH2CH 2 OOC), 3.65 (H, m, –OCH 2 CH 2 O), 3.38 (3H,s,–OCH 3)。
（4）化合物的制备：0.513g化合物溶解在12ml乙醇中，在氮气保护下，加入2-羟乙基肼的乙醇溶液（10%v/v），35℃避光搅拌48h。待反应完全后减压除去溶剂。反应产物用冷的乙醚中纯化沉淀三次，真空干燥，得到0.452g白色固体，即为化合物。产率为87%。
1H NMR (400 MHz, CDCl3, δ, ppm): 8.12–7.6 (4H, m, phenyl group), 7.58(1H, s, –phenyl CHNNHCH2CH2–), 4.5 (2H, t, –CH2CH 2 OOC–), 3.81 (2H, t, –C6H4CHNNHCH2CH 2 OH), 3.65 (H, m, –OCH 2 CH 2 O–), 3.48 (2H, t, –C6H4CHNNHCH 2 CH2OH ),3.38 (3H, s, –OCH 3 )。
（5）化合物的制备：1.13g化合物溶解于30ml的二氯甲烷中，冰浴下加入0.25g三乙胺，搅拌20分钟，用恒压漏斗加入0.19 g甲基丙烯酰氯继续搅拌24小时。待反应完全后，反应液用100 mmol/l pH为8.0的磷酸缓冲和蒸馏水洗三次，有机层用无水硫酸钠干燥，然后溶剂旋转蒸发，粗产物通过在乙醚中沉淀纯化，得到0.92g淡黄色固体，即为化合物。产率为73%。
1H NMR (400 MHz, CDCl3, δ, ppm): 8.12–7.6 (4H, m, phenyl group),7.58(1H, s, –phenyl CHNNHCH2CH2–), 6.13 (CH2 = CCH3COOCH2CH2-), 5.74 (CH2 =CCH3COOCH2CH2-),4.5 (2H, t, –CH2CH2OOC–), 3.81 (2H, t, –C6H4CHNNHCH2CH2OH ),3.65 (H, m, –OCH2CH2O–), 3.48 (2H, t, –C6H4CHNNHCH2CH2OH ), 3.38 (3H, s, –OCH3), 3.25 (2H, t, –SCH2(CH2)8CH2CH3), 1.9 (2H, t, –SCH2(CH2)8CH2CH3), 1.7(6H, s, –OOC(CH3)2CS(S)CSCH2(CH2)8CH2CH3), 0.8 (3H, t, –SCH2(CH2)8CH2CH3)。
（6）化合物的制备：500.0mg叶酸溶解于30ml二甲基亚砜溶液中，50℃下油浴，用233.0mg DCC（N,N-二环己基碳二亚胺）活化6小时；冷却至室温后加入276.0mg 4-二甲氨基吡啶和129mg烯丙基胺，在室温下反应20h。过滤，粗产物用丙酮沉淀，过滤，洗涤，干燥，得到棕色固体385.9mg，即为化合物。产率为71%。
1HNMR (400MHz, DMSO-d6): δ 8.62 (s, 1H, 叶酸–CH– ), 7.61 (d, J = 8.6Hz, 2H, –CH2NHC6 H 2 H2CONHCH(COOH)CH2CH2CO–), 6.64 (d, J = 8.6 Hz, 2H, –CH2NHC6H2 H 2 CONHCH(COOH)CH2CH2CO–), 5.88 (m, 1H, –NHCH2CH=CH2), 5.28 (dd, J =27.0, 14.0 Hz, 2H, –NHCH2CH=CH 2 ), 4.46 (s, 2H, –CH 2 NHC6H4CONHCH(COOH)CH2CH2CO–), 4.19 (t, J = 7.3 Hz, 1H, –CH2NHC6H4CONHCH(COOH)CH2CH2CO–), 3.41 (d,J = 7.0 Hz, 2H, –NHCH 2 CH=CH2), 2.25 (t, J = 7.4 Hz, 2H, –CH2NHC6H4CONHCH(COOH)CH2CH 2 CO–), 1.92 (m, 2H, –CH2NHC6H4CONHCH(COOH)CH 2 CH2CO–)。
（7）化合物的制备：取4g RAFT试剂，63mg二硫单体，10mg AIBN，溶解在2mlDMSO中的Schlenk烧瓶，在冰浴中充氮气30分钟后，将Schlenk烧瓶放入恒温油浴中60℃下反应24小时，然后加入74mg化合物，并补充AIBN继续在氮气保护，60℃油浴中聚合24小时。粗产物在石油醚/乙酸乙酯中沉淀，得到0.172g白色固体即为化合物，产率为81%。Mn:1.18 ×104。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, δ, ppm): 8.12-7.95 (4H, m, phenyl group ofacid labile PEG-macroRAFT), 7.20 (2H, d, phenyl group of MAOHD-TMOBA), 4.46(2H, t, -COOCH2CH2SSCH2CH 2 COOC6H2(OCH3)3 of MAOHD-TMOBA), 4.11 (2H, t, -COOCH 2 CH2SSCH2CH2COOC6H2(OCH3)3 of MAOHD-TMOBA), 3.74 (9H, s, -OCH 3 ), 3.51 (–OCH 2 CH 2 O– of acid labile PEG-macroRAFT ), 3.10 (2H, t, -COOCH2CH2SSCH 2 CH2COOC6H2(OCH3)3 of MAOHD-TMOBA), 2.93 (2H, t, -COOCH2CH 2 SSCH2CH2COOC6H2(OCH3)3 of MAOHD-TMOBA), 0.8 (–CH 3 of acid labile PEG-macroRAFT).
（8）目标化合物的制备：取0.12g化合物（Mn=1.18×104g/mol），24mg化合物和26mg AIBN溶解于3ml DMSO中的Schlenk烧瓶中，在冰浴中充氮气30分钟后，将Schlenk烧瓶放入恒温油浴中，在60℃下反应24小时。反应液用乙醚沉淀，得到0.12g浅黄色粉末即为化合物，产率为65%。Mn: 1.42×104。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, δ, ppm):8.65 (–CH– of FA heterocyclic),8.12-7.95 (4H, m, phenyl group of acid labile PEG-macroRAFT), 7.66 (–CH2NHC6 H 2 H2CONHCH(COOH)CH2CH2CO– of FA), 6.65 (–CH2NHC6H2 H 2 CONHCH(COOH) CH2CH2CO–of FA), 4.46 (–CH 2 NHC6H4CONHCH(COOH)CH2CH2CO– of FA), 4.41 (2H, t, -COOCH2CH2SSCH2CH 2 COOC6H2 (OCH3)3 of MAOHD-TMOBA), 4.33 (–CH2NHC6H4CONHCH(COOH)CH2CH2CO– of FA), 4.04 (2H, t, -COOCH 2 CH2SSCH2CH2COOC6H2(OCH3)3 of MAOHD-TMOBA),3.69 (9H, s, -OCH 3 ), 3.51 (–OCH 2 CH 2 O– of acid labile PEG-macroRAFT ), 3.09(2H, t, -COOCH2CH2SSCH 2 CH2COOC6H2(OCH3)3 of MAOHD-TMOBA), 2.87 (2H, t, -COOCH2CH 2 SSCH2CH2COOC6H2(OCH3)3 of MAOHD-TMOBA), 2.32 (–CH2NHC6H4CONHCH(COOH)CH2CH 2 CO– of FA), 2.18 (–CH2NHC6H4CONHCH(COOH)CH 2 CH2CO– of FA), and 1.40–1.96(–CH 2 – of polymer backbone), 0.61–1.24 (–CH 3 ), 0.8 (–CH 3of acid labile PEG-macroRAFT)。
实施例2
（1）化合物、、、、、和化合物的制备：同实施例1。
（2）目标化合物的制备：取0.11g化合物（Mn=1.18×104g/mol），24mg叶酸单体和26mg AIBN溶解于3ml DMSO的Schlenk烧瓶放中，在冰浴中充氮气30分钟后，将Schlenk烧瓶放入恒温油浴中，在60℃下反应24小时。反应液用乙醚沉淀，得到0.104g浅黄色粉末化合物，产率为58%。Mn: 1.42×104。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, δ, ppm):8.65 (–CH– of FA heterocyclic),8.12-7.95 (4H, m, phenyl group of acid labile PEG-macroRAFT), 7.66 (–CH2NHC6 H 2 H2CONHCH(COOH)CH2CH2CO– of FA), 6.65 (–CH2NHC6H2 H 2 CONHCH(COOH) CH2CH2CO–of FA), 4.46 (–CH 2 NHC6H4CONHCH(COOH)CH2CH2CO– of FA), 4.41 (2H, t, -COOCH2CH2SSCH2CH 2 COOC6H2 (OCH3)3 of MAOHD-TMOBA), 4.33 (–CH2NHC6H4CONHCH(COOH)CH2CH2CO– of FA), 4.04 (2H, t, -COOCH 2 CH2SSCH2CH2COOC6H2(OCH3)3 of MAOHD-TMOBA),3.69 (9H, s, -OCH 3 ), 3.51 (–OCH 2 CH 2 O– of acid labile PEG-macroRAFT ), 3.09(2H, t, -COOCH2CH2SSCH 2 CH2COOC6H2(OCH3)3 of MAOHD-TMOBA), 2.87 (2H, t, -COOCH2CH 2 SSCH2CH2COOC6H2(OCH3)3 of MAOHD-TMOBA), 2.32 (–CH2NHC6H4CONHCH(COOH)CH2CH 2 CO– of FA), 2.18 (–CH2NHC6H4CONHCH(COOH)CH 2 CH2CO– of FA), and 1.40–1.96(–CH 2 – of polymer backbone), 0.61–1.24 (–CH 3 ), 0.8 (–CH 3of acid labile PEG-macroRAFT)。

Claims (10)

1.一种具有叶酸靶向pH-还原双重响应的抗肿瘤活性的两亲嵌段聚合物，其结构如下：
式中：m=42~44mol%，n=39~40mol%，o=17~18mol%；数均分子量Mn=1.38×104~1.42×104，Mw/Mn=1.14~1.16。
2.如权利要求1所述具有叶酸靶向pH-还原双重响应的抗肿瘤活性的两亲嵌段聚合物制备方法，包括以下工艺步骤：
（1）化合物的制备：以二氯甲烷为溶剂，三乙胺作为缚酸剂，双（2-羟基乙基）二硫醚与甲基丙烯酰氯于0~5℃反应20~24小时；反应结束后，用pH等于8.0的磷酸缓冲溶液洗涤反应液，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析分离纯化，得无色油状液体即为化合物；
（2）化合物的制备：以二氯甲烷为溶剂，以4-二甲基氨基吡啶为催化剂，N,N-二环己基碳二亚胺为活化剂，使化合物与3,4,5-三甲氧基苯甲酸于0~5℃反应20~24小时；过滤，旋蒸除去溶剂，粗产物通过硅胶色谱柱纯化，得到白色固体化合物；
（3）化合物的制备：在二氯甲烷/四氢呋喃的混合溶剂中，以N,N-二环己基碳二亚胺为活化剂，4-二甲氨基吡啶为催化剂，使甲氧基聚乙二醇和4-甲醛基苯甲酸于0~5℃反应20~24小时；过滤，用乙醚沉淀，真空干燥，得到的白色固体即为化合物；
（4）化合物的制备：以乙醇为溶剂，氮气保护下，化合物与2-羟乙基肼在30~40℃下避光反应45~50h，反应结束后除去溶剂，所得固体用乙醚洗涤纯化，干燥，得到白色固体为化合物；
（5）化合物的制备：以二氯甲烷为溶剂，三乙胺为催化剂，化合物与甲基丙烯酰氯于0~5℃反应20~24小时；反应完全后，用pH等于8.0的磷酸缓冲溶液和蒸馏水洗涤，无水硫酸钠干燥，粗产物通过硅胶色谱柱纯化，得化合物；
（6）化合物的制备：二甲基亚砜为溶剂，N,N-二环己基碳二亚胺为活化剂，4-二甲氨基吡啶为催化剂，使叶酸与烯丙基胺于室温反应20~24小时，过滤，滤液用乙酸乙酯沉淀，干燥，得黄色固体即化合物；
（7）化合物的制备：以二甲基亚砜为溶剂，偶氮二异丁腈为引发剂，RAFT试剂作用、55~65℃下，化合物自身聚合20~24小时；加入化合物的DMSO溶液，继续反应20~24小时，用乙酸乙酯沉淀，干燥，得化合物；
（8）目标化合物的制备：以二甲基亚砜为溶剂，偶氮二异丁腈为引发剂，化合物和化合物于55~65℃聚合20~24小时，产物用乙酸乙酯沉淀，干燥，得黄色聚合产物即为目标化合物；所述引发剂偶氮二异丁腈的用量为化合物和化合物质量总和的5%~20%；化合物与化合物的摩尔比为1:5~1:5.5。
3.如权利要求2所述具有叶酸靶向pH-还原双重响应的抗肿瘤活性的两亲嵌段聚合物制备方法，其特征在于：步骤（1）中，双（2-羟基乙基）二硫醚与甲基丙烯酰氯的摩尔比为1:1.5~1:2.0；三乙胺与双（2-羟基乙基）二硫醚的摩尔比为2.2:1~2.5:1。
4.如权利要求2所述具有叶酸靶向pH-还原双重响应的抗肿瘤活性的两亲嵌段聚合物制备方法，其特征在于：步骤（2）中，化合物与3,4,5-三甲氧基苯甲酸的摩尔比为1:5~1:5.2；化合物与活化剂N,N-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:3~1:3.5；化合物与催化剂4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1:0.9~1:1.1。
5.如权利要求2所述具有叶酸靶向pH-还原双重响应的抗肿瘤活性的两亲嵌段聚合物制备方法，其特征在于：步骤（3）中，甲氧基聚乙二醇与4-醛基苯甲酸的摩尔比为1:3~1:3.2；甲氧基聚乙二醇PEG与活化剂N,N-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:3~1:3.2；甲氧基聚乙二醇PEG与催化剂4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1:0.9~1:1.1；二氯甲烷/四氢呋喃的混合溶剂中，二氯甲烷与四氢呋喃的体积比为1:1~1:2。
6.如权利要求2所述具有叶酸靶向pH-还原双重响应的抗肿瘤活性的两亲嵌段共聚物制备方法，其特征在于：步骤（4）中，化合物与2-羟乙基肼的摩尔比为1:5~1:5.2。
7.如权利要求2所述具有叶酸靶向pH-还原双重响应的抗肿瘤活性的两亲嵌段共聚物制备方法，其特征在于：步骤（5）中，化合物与甲基丙烯酰氯的摩尔比为1:1.5~1:2.0；催化剂三乙胺与化合物的摩尔比为2.2:1~2.5:1。
8.如权利要求2所述具有叶酸靶向pH-还原双重响应的抗肿瘤活性的两亲嵌段共聚物制备方法，其特征在于：步骤（6）中，叶酸与烯丙基胺的摩尔比为1:2~1:2.5；叶酸与二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:1.0~1:1.5；叶酸与催化剂4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1:2~1:2.5。
9.如权利要求2所述具有叶酸靶向pH-还原双重响应的抗肿瘤活性的两亲嵌段共聚物制备方法，其特征在于：步骤（7）中，所述RAFT试剂为2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸，RAFT试剂与化合物的摩尔比为1:15~1:15.5；引发剂偶氮二异丁腈的用量为化合物、化合物质量总和的5%~10%；化合物与化合物的摩尔比为2:1~2.3:1。
10.如权利要求1所述具有叶酸靶向pH-还原双重响应的抗肿瘤活性的两亲嵌段聚合共聚物作为抗肿瘤药物载体的应用。
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