CN106883394B - Fa-f127-pcl叶酸靶向共聚物及其制备方法与应用 - Google Patents

Fa-f127-pcl叶酸靶向共聚物及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种含有叶酸靶向基团的、由聚氧乙烯‑氧丙烯‑氧乙烯作为亲水链段、聚己内酯作为疏水链段的两亲性嵌段具有新型化学结构的聚合物叶酸‑聚氧乙烯‑聚氧丙烯‑聚氧乙烯‑聚己内酯(FA‑F127‑PCL)，以及该化合物的制备方法。本发明化合物具有良好的缓释效果。

Description

FA-F127-PCL叶酸靶向共聚物及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种靶向高分子药物载体及其制备方法。
背景技术
两亲性高分子，尤其是生物相容的两亲性高分子(也就是含有亲水性和疏水性两种链段的高分子)被广泛研究，因为它们可以在水中通过疏水链段间的疏水作用等自聚集形成具有各种不同形态的纳米粒子，这种性质使得两亲性高分子在药物释放体系有很大的应用前景，如可控释放体系、靶向释放体系等。我们知道，目前大部分药物(如抗癌药物)是疏水性的，也就是不溶于水，很容易被人体内的一系列排斥反应排出体外，如药物抵制作用、酶降解作用等等，这大大限制了癌症等疾病治疗的有效性。而两亲性高分子形成的纳米粒子可以作为药物载体，把药物包埋在疏水核内，表面由纳米粒子的亲水层保护，这样药物便可被输送到病变部位(如肿瘤等)，从而起到有效治疗癌症的作用。
对高分子纳米粒子的表面进行靶向性基团的修饰，可以提高药物输送的选择性和疾病治疗的有效性。因为靶向型纳米粒子将包埋的药物定向输送到肿瘤等病变部位，这样既可以减少药物对正常细胞的损害，又可因提高药物利用率而减少药物的用量，从而减轻药物对人体产生的副作用。因此，靶向型高分子纳米粒子在药物释放体系有很大的应用前景。
叶酸是细胞(尤其是增生细胞)所必需的维生素，参与多种代谢途径的一碳转移反应。叶酸的细胞转运通过两种跨膜蛋白，即低亲和力的还原性叶酸载体和高亲和力的叶酸受体(folate receptor，FR)来完成。目前已证实FR在多种肿瘤细胞表面过度表达，而在多数正常组织中的表达仅限于一些难于进入血液循环的上皮细胞顶膜。正因为FR表达的特性，FR天然配体—叶酸(folic acid,FA)成为将药物靶向到肿瘤细胞的重要分子，叶酸具有与叶酸受体的高亲和力(Kd＝l×10-10mol·L-1)、低免疫原性、易于修饰、体积小(Mw＝441.4)、高度化学稳定性和生物学稳定性，高的肿瘤渗透性、易与药物结合，与有机和水性溶剂的相容性以及低成本等优点，使叶酸介导肿瘤靶向的研究得到迅速发展。
近年来，国内外对叶酸靶向的高分子药物释放体系已有较广泛地研究。Park等合成的叶酸修饰后的包埋紫杉醇的叶酸-聚己内酯-聚乙二醇(FA-PCL-PEO)纳米粒子比PCL-PEO纳米粒子对癌细胞有更高的细胞毒性(Park,E.K.；et al.Journal of ControlledRelease 2005,109,158)。
发明内容
本发明的目的就是提供一种新型化学结构的聚合物，具有药物靶向载体作用。
本发明的含叶酸靶向高分子药物载体，含有叶酸靶向基团的、由聚氧乙烯-氧丙烯-氧乙烯(PEO100-PPO65-PEO100,Pluronic F127)作为亲水链段、聚己内酯[polycaprolactone,PCL]作为疏水链段的两亲性嵌段共聚物叶酸-聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯-聚己内酯(FA-F127-PCL)，其化学结构式如下：
其中n代表己内酯的重复单元的数目。
本发明
其合成路线如图1，具体制备方法是：
(1)取0.71g(1.61mmol)的FA与0.36g(1.76mmol)的1,3-二环己基碳二亚胺(DCC)混合加入搅拌中的70ml的无水DMSO，在室温下搅拌48小时。再将干燥后的20g的F127与0.20mg(1.60mmol)的4-二甲氨基吡啶(DMAP)加入其中，再在25℃室温下搅拌48小时，之后在5000r/min转速下离心5min，取上清液在普通DMSO环境下用3500截留分子量的透析袋透析3小时，之后再用二蒸水透析24小时。旋干后用CH2Cl2溶解后沉入冻乙醚之中纯化两次，取沉淀烘干后制得FA-F127-OH；
(2)用FA-F127-OH做大分子引发剂和辛酸亚锡为催化剂，在无水、无氧的条件下，引发环状单体己内酯(caprolactone,CL)进行开环聚合反应，最终得到所需的共聚物。具体合成方法为：反应瓶通过抽真空-通氩气除氧除湿后，在氩气条件下加入FA-F127-OH、己内酯和辛酸亚锡，己内酯的量为FA-F127-OH重量的40–50％，辛酸亚锡的量为己内酯重量的0.1-0.15％，将反应物加热至140-160℃，搅拌下，反应持续15-17小时；将反应物二氯甲烷溶解，然后沉入甲醇中，有白色物质沉出，过滤；然后再用二氯甲烷溶解聚合物，并沉入甲醇中，过滤，干燥，得到FA-F127-PCL共聚物。
本发明还涉及FA-F127-PCL共聚物在包埋抗癌药物紫杉醇中的应用。
包埋紫杉醇的方法是：
1、包埋紫杉醇的FA-F127-PCL纳米粒子的制备
称取15mg FA-F127-PCL聚合物和5mg紫杉醇(Paclitaxel，PTX)于具塞试管中，加3ml四氢呋喃(THF)进行溶解。再将该THF溶液分散于15g超纯水中，倒入透析袋中透析24h，以除去未包封的紫杉醇。
2、紫杉醇包埋率和载药量的测定
取0.3ml步骤1中的纳米粒子水溶液冻干，然后加入0.7ml乙腈-水(7︰3v/v)混合溶液溶解，接着用高效液相色谱(HPLC)进行测试，测试条件如下：C18柱，以1.0ml·min-1流速的乙腈-水(7:3v/v)为流动相，在227nm处检测峰面积，通过与标准品的主峰面积相比较，计算样品中的紫杉醇浓度。
包埋率的计算公式如下：
3、包埋紫杉醇的FA-F127-PCL纳米粒子的释放
取10ml透析液，放置在对应的透析袋中；将透析袋(分子截留量3.5kDa)放在含有100ml PBS溶液的广口瓶中。广口瓶放在恒温震荡仪中，保持瓶中溶液在37.5℃震荡。在设定的时间点，从广口瓶中取5mL释放外液，再补充5ml的PBS的缓冲液，保持总量为100mL。释放液中紫杉醇的含量用HPLC法测定，测试条件同上。
本发明涉及的FA-F127-PCL两亲性嵌段共聚物是一个具有新型化学结构的聚合物。并且与现有的FA-F127-PLA共聚物相比，具有更好的药物缓释效果。
附图说明
图1本发明聚合物FA-F127-PCL的合成路线。
图2本发明聚合物FA-F127-PCL的紫外吸收图。
图3包埋紫杉醇的FA-F127-PCL纳米粒子的体外释放图。
具体实施方式
实施例1
本发明的FA-F127-PCL共聚物的制备方法如下：
(1)取0.71g(1.61mmol)的FA与0.36g(1.76mmol)的1,3-二环己基碳二亚胺(DCC)混合加入搅拌中的70ml的无水DMSO，在室温下搅拌48小时。再将干燥后的20g的F127与0.20mg(1.60mmol)的4-二甲氨基吡啶(DMAP)加入其中，再在25℃室温下搅拌48小时，之后在5000r/min转速下离心5min，取上清液在普通DMSO环境下用3500截留分子量的透析袋透析3小时，之后再用二蒸水透析24小时。旋干后用CH2Cl2溶解后沉入冻乙醚之中纯化两次，取沉淀烘干后制得FA-F127-OH；所得共聚物称重为18.0g,产率为81.7％。
(2)用FA-F127-OH做大分子引发剂和辛酸亚锡为催化剂，在无水、无氧的条件下，引发环状单体己内酯(caprolactone,CL)进行开环聚合反应，最终得到所需的共聚物。具体合成方法为：反应瓶通过抽真空-通氩气除氧除湿后，在氩气条件下加入FA-F127-OH(5g)、己内酯(2.25g)和辛酸亚锡2.5mg，将反应物加热至150℃，搅拌下，反应持续16小时；将反应物二氯甲烷溶解，然后沉入甲醇中，有白色物质沉出，过滤；然后再用二氯甲烷溶解聚合物，并沉入甲醇中，过滤，干燥，得到FA-F127-PCL共聚物0.7g，产率为9.6％。。
结构表征1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):1.01-1.05(m,-OCH2-CH(CH 3)-),1.25-1.35(m,-O-(CH2)2-CH 2-(CH2)2-CO-),1.4-1.7(m,-O-CH2-CH 2-CH2-CH 2-CH2-CO-),2.25-2.35(m,-O-(CH2)4-CH 2-CO-),3.35-3.7(m,-OCH 2-CH 2-and-OCH 2-CH(CH3)-),3.9-4.0(m,-O-CH 2-(CH2)4-CO-).4.21-4.24(t,-CO-OCH 2-CH2-).
制备得到的FA-F127-PCL共聚物的分子量和PCL的链段含量由FA-F127-PCL的核磁谱图计算得到，结果为FA-F127-PCL的分子量(Mn)为19440，PCL链段的含量为35.2wt％，也即相应聚合物的结构式为FA-PEO100-PPO65-PEO100-PCL30。FA-F127-PCL共聚物中FA的含量由紫外分光光度计测试得到。由288nm处FA的紫外吸收峰可知(见图2)，FA已成功连接到F127-PCL共聚物的端基上。
实施例2本发明FA-F127-PCL共聚物包埋紫杉醇
1、包埋紫杉醇的FA-F127-PCL纳米粒子的制备
称取15mg FA-F127-PCL聚合物和5mg紫杉醇(Paclitaxel，PTX)于具塞试管中，加3ml四氢呋喃(THF)进行溶解。再将该THF溶液分散于15g超纯水中，倒入透析袋中透析24h，以除去未包封的紫杉醇。
2、紫杉醇包埋率和载药量的测定
取0.3ml步骤1中的纳米粒子水溶液冻干，然后加入0.7ml乙腈-水(7︰3v/v)混合溶液溶解，接着用高效液相色谱(HPLC)进行测试，测试条件如下：C18柱，以1.0ml·min-1流速的乙腈-水(7:3v/v)为流动相，在227nm处检测峰面积，通过与标准品的主峰面积相比较，计算样品中的紫杉醇浓度。
包埋率的计算公式如下：
由计算结果可知，FA-F127-PCL共聚物的紫杉醇包埋率为45.4％。
实施例3
1.包埋紫杉醇的FA-F127-PCL纳米粒子的体外释放
取10ml透析液，放置在对应的透析袋中；将透析袋(分子截留量3.5kDa)放在含有100ml PBS溶液的广口瓶中。广口瓶放在恒温震荡仪中，保持瓶中溶液在37.5℃震荡。在设定的时间点，从广口瓶中取5mL释放外液，再补充5ml的PBS的缓冲液，保持总量为100mL。释放液中紫杉醇的含量用HPLC法测定，测试条件同上。由测试结果可知(见图3)，紫杉醇包埋在纳米粒子中后呈现较好的缓释过程；在释放141h后，只有约8％的紫杉醇释放出来。
2.包埋紫杉醇的FA-F127-PLA纳米粒子的体外释放
称取3mg FA-F127-PLA(Mn 27000,PLA 51.7wt％,FA 12.6mol％)聚合物和0.3mg紫杉醇(Paclitaxel，PTX)于具塞试管中，加3ml二甲基亚砜(DMSO)进行溶解。再将该DMSO溶液分散于10g超纯水中，倒入透析袋中透析，以除去未包封的紫杉醇。
取10ml透析液，放置在对应的透析袋中；将透析袋(分子截留量3.5kDa)放在含有100ml PBS溶液的广口瓶中。广口瓶放在恒温震荡仪中，保持瓶中溶液在37.5℃震荡。在设定的时间点，从广口瓶中取5mL释放外液，再补充5ml的PBS的缓冲液，保持总量为100mL。释放液中紫杉醇的含量用HPLC法测定，测试条件同上。由测试结果可知，紫杉醇包埋在FA-F127-PLA纳米粒子中后缓释效果不明显，10小时后已经有约65％的紫杉醇释放出来，96小时后释放量达到了约85％。
由结果比较可知，本发明FA-F127-PCL共聚物的紫杉醇释放率远低于FA-F127-PLA共聚物，也就是说紫杉醇在FA-F127-PCL纳米粒子中的缓释作用大大增强。

Claims (4)

1.一种聚合物，其分子结构式如下：
。
2.根据权利要求1所述聚合物，其制备方法包括以下步骤：
(1)取0.71g的FA与0.36g的1,3-二环己基碳二亚胺混合加入搅拌中的70ml的无水DMSO，在室温下搅拌48小时；再将干燥后的20g的F127与0.20mg的4-二甲氨基吡啶加入其中，再在25℃室温下搅拌48小时，之后在5000r/min转速下离心5min，取上清液在普通DMSO环境下用3500截留分子量的透析袋透析3小时，之后再用二蒸水透析24小时；旋干后用CH2Cl2溶解后沉入冻乙醚之中纯化两次，取沉淀烘干后制得FA-F127-OH；
(2)用FA-F127-OH做大分子引发剂，辛酸亚锡为催化剂，在无水、无氧的条件下，引发环状单体己内酯进行开环聚合反应，最终得到所需的共聚物；具体合成方法为：反应瓶通过抽真空-通氩气除氧除湿后，在氩气条件下加入FA-F127-OH、己内酯和辛酸亚锡，己内酯的量为FA-F127-OH重量的40–50％，辛酸亚锡的量为己内酯重量的0.1-0.15％，将反应物加热至140-160℃，搅拌下，反应持续15-17小时；将反应物二氯甲烷溶解，然后沉入甲醇中，有白色物质沉出，过滤；然后再用二氯甲烷溶解聚合物，并沉入甲醇中，过滤，干燥，得到FA-F127-PCL共聚物。
3.根据权利要求1所述的聚合物在制备治疗癌症药物的载体中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述治疗癌症药物为紫杉醇。
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