CN103059297A - 多功能可降解聚天冬酰胺改性聚合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多功能的可降解聚天冬酰胺改性聚合物,还公开了该改性聚合物的制备方法及利用该材料制备胶束和胶束装载药物的方法。该改性聚合物具有温度敏感、pH敏感、荧光示踪和靶向功能。该聚合物可通过处理快速形成胶束纳米粒子和药物装载,所装载药物的包封率很高,并且不需要使用有毒的有机溶剂。该聚合物主链部分是生物可降解的聚天冬酰胺,毒性很低;侧基疏水段组分可通过碳酸酯键水解失去疏水性基团转变成亲水性;肿瘤靶向基团则可引导载药胶束靶向进入肿瘤细胞降解释放出所载的有毒药物,避免化疗药物对人体正常组织细胞的伤害。
Description
技术领域
本发明涉及一种多功能可降解聚天冬酰胺改性聚合物及其制备方法,还涉及其胶束和载药胶束的制备方法。
背景技术
癌症已经成为威胁人类健康的重大疾病之一,根据世界卫生组织的预计,到2020年全世界每年将有1500多万癌症新病例和1000多万人死于癌症。癌症的治疗方法主要包括手术治疗、放疗和化疗。手术治疗对人体创伤大,特别是对出现肿瘤转移的患者,手术治疗和放疗很难有效,这时化疗很重要。虽然已发现很多化疗药物具有抗肿瘤活性,并且其中一些药物已在临床治疗中广泛使用,然而研制可根治肿瘤(特别是肺癌、胃癌、结肠癌等实体瘤)的药物仍然“任重道远”,药物治疗目前仍然面临多方面的挑战,A:传统的化疗药物在杀死癌细胞的同时,对人体正常细胞也带来了严重的损伤;B:用于癌症治疗的药物一般其自身水溶性很差,易聚集,不易制成合适的药物剂型使用(如喜树碱类),用小分子乳化剂分散药物的剂型也存在乳化剂毒性和体系稳定性差的问题;C:化疗药物代谢快,利用度低等问题。因此改善药物在水中的分散性和稳定性,延长其在体内的循环时间,提高其肿瘤靶向输送是提高药效、降低毒副作用的必要手段。
聚合物胶束是由两亲性高分子在水溶液中自组装形成的纳米粒子,聚合物胶束的疏水链段通过疏水作用形成胶束内核,亲水链段则构成胶束外壳,疏水内核可增溶疏水性药物而作为输送药物的载体,亲水性外壳则阻止胶束聚集,保持胶束稳定。相对于小分子表面活性剂,高分子胶束聚集体不仅稳定(临界胶束浓度低),而且无毒,可通过分子设计实现多重环境响应性、多功能自组装和可控释放药物。虽然癌症靶向治疗很关键,全世界也开展了深入广泛的研究,但目前还没有实现药物特定运送和可控释放到肿瘤部位的满意的解决方案。目前载药高分子胶束应用面临的主要困境在于,一是其进入体液后的稳定性不够[Bae,Y.H.,Yin,H.Q.(2008)Stability issues of polymeric micelles,Journal of Controlled Release,131(1),2-4.],很快消失[Soga,O.Biodegradable thermosensitive polymers:synthesis,characterization and drug delivery applications,Ph.D thesis of Utrecht University(ISBN:90-393-4188-5),2006],二是其载药工艺过程复杂,载药效率需要改善,三是其需要多功能化克服多种药物运输屏障。目前将水难溶性抗肿瘤药物有效地装载到聚合物胶束里的方法主要使用透析法或溶剂挥发法[Rapoport N,Physical stimuli-responsive polymeric micelles for anti-cancer drug delivery,PROGRESS IN POLYMER SCIENCE,2007,32(8-9),962-990]。透析法为实验室制备聚合物胶束的经典方法, 但一般透析法药物装载包封效率不高,没有被包封的在水中的药物回收困难,不是很适用于工业化大规模生产[Soga,O.Biodegradable thermosensitive polymers:synthesis,characterization and drug delivery applications,Ph.D Thesis,Utrech University,2006]。由于大多数所用聚合物是水不溶的,也难溶于乙醇,透析法或溶剂挥发法一般使用有毒的有机溶剂溶解聚合物,这样溶剂的彻底除去将很不容易。
由于聚氨基酸具有良好的生物相容性(主链可降解,无毒),作为药物载体材料被广泛研究[Y.Bae and K.Kataoka.Intelligent polymeric micelles from functional poly(ethylene glycol)-poly(amino acid)block copolymers.Adv Drug Deliv Rev.2009,61(10):768-784.]。聚天冬氨酸可由天冬氨酸小分子在酸催化条件下缩聚得到[T.Peng,S.X.Cheng and R.X.Zhuo.Synthesis and characterization of novel biodegradable amphiphilic graft polymers based on aliphatic polycarbonate.Journal of Polymer Science Part a-Polymer Chemistry.2004,42(6):1356-1361.],其酰亚胺环状结构可被碱性试剂开环,因此可以比较容易通过开环反应进行改性[Y.Tachibana,M.Kurisawa,H.Uyama,T.Kakuchi and S.Kobayashi.Biodegradable thermoresponsive poly(amino acid)s.Chemical Communications.2003,(1):106-107;H.Chen,W.Xu,T.Chen,W.Yang,J.Hu and C.Wang.Aggregation of biodegradable amphiphilic poly(succinimide-co-N-propyl aspartamide)and poly(N-dodecyl aspartamide-co-N-propyl aspartamide)in aqueous medium and its preliminary drug-released properties.Polymer.2005,46(6):1821-1827;H.J.Lee,S.R.Yang,E.J.An and J.-D.Kim.Biodegradable Polymersomes from Poly(2-hydroxyethyl aspartamide)Grafted with Lactic Acid Oligomers in Aqueous Solution.Macromolecules.2006,39(15):4938-4940.],因此对聚天冬酰胺改性多功能化有很好的工业化前景。
发明内容
本发明所解决的技术问题是克服现有技术的不足,提供一种多功能可降解聚天冬酰胺改性聚合物,还提供其制备方法,以及该聚合物的胶束和载药胶束的制备方法。
本发明提供的技术方案是:一种多功能可降解聚天冬酰胺改性聚合物,具体结构如通式(I)所示:
其中,R1=-(CH2)m-,m=2~6;R2为单取代甲氧基聚乙二醇或者为另一端含叶酸端基的聚乙二醇,聚乙二醇的数均分子量为1000~20000;R3为疏水性基团;R4为含有叔胺结构的基团;R5为含癌细胞靶向功能的基团;R6为含发荧光特性的基团;n为30~1000的整数;x,y,z,u,v分别为1~20,0~800,0~800,0~100,0~50的整数。
这种多功能可降解聚天冬酰胺衍生物,含亲水段组分聚乙二醇和疏水段组分,其亲疏水性的调整可以通过接入不同比例的侧基,即x,y,z的取值(由材料投料比例控制,通过核磁共振谱测得),并可得到具有对温度敏感性的聚合物。含有叔胺结构的基团R4的引入可以使该聚合物具有pH敏感性。其中,R2、R3、R4与聚天冬酰胺主链的连接碳酸酯键在碱性条件下易降解可失去R2、R3、R4转变成亲水性。
多功能可降解聚天冬酰胺改性聚合物中的亲水段组分优选数均分子量为2000~12000的聚乙二醇;R1优选3~5个亚甲基;n优选为50~500的整数;x,y,z,u,v分别优选为1~10,0~400,0~400,0~50,0~20的整数。
疏水性基团R3选自苄基、苯乙基、苯丙基、苯丁基、甲硝唑基的一种或几种;含有叔胺结构的基团R4选自2-二甲胺基乙基、3-二甲胺基-1-丙基、N,N-二甲胺基异丙基、N,N-二乙胺基甲基、N,N-二乙胺基乙基、3-二乙胺基-1-丙基、2-吗啉乙基、N-甲基-N-(N,N-二甲胺基乙基)氨基乙基的一种或几种,其结构式按顺序如下所示:
在这种多功能可降解聚天冬酰胺衍生物中,靶向基团R5选自下列通式(II)基团(含叶酸基团)、通式(III)基团(含RGD基团)、通式(IV)基团(含RGD基团)中的一种或几种,因为大多数肿瘤细胞表面过量表达叶酸受体和RGD受体,这样这些靶向基团的引入可提高载药胶束的肿瘤靶向传递特性;荧光基团R6为下列通式(V)基团(Amino-Oriented Rhodamine,乙二胺改性罗丹明B),以便示踪纳米粒子。
本发明还提供了一种制备多功能可降解聚天冬酰胺改性聚合物的方法,包括如下步骤:
1)由天冬氨酸经缩聚反应得到聚琥珀酰亚胺PSI;
2)用溶剂DMF溶解聚琥珀酰亚胺PSI,再加入含癌细胞靶向功能的基团R5的氨基化合物、含发荧光特性的基团R6的氨基化合物或者/含R1基团的氨基醇化合物的一种对PSI开环或者几种先后对PSI开环,制得侧基含羟基的聚天冬酰胺衍生物;
3)分别用N,N’-羰基二咪唑活化含R2、R3、R4基团化合物的醇羟基;
4)按照空间位阻从大到小的顺序分别将步骤3)得到的产物接入到步骤2)的到的产物聚天冬酰胺衍生物的侧基羟基上,纯化干燥后制得多功能可降解聚天冬酰胺改性聚合物。
本发明还提供了一种多功能可降解聚天冬酰胺改性聚合物胶束的制备方法,由于所述聚合物可溶解于毒性很低的溶剂中,如可用于人体注射的乙醇或者叔丁醇等,而不溶于水中,所以可以将浓度为0.1~20mg/mL的聚合物溶液直接加入水溶液中即可形成粒径在40~600纳米的胶束纳米粒子;或者所述聚合物为具有最低临界溶解温度(lower critical solution temperature,LCST)的热敏性聚合物,即在较低的温度时,将在低温水中溶解的聚合物水溶液快速加热到40~70℃即可形成胶束纳米粒子,这里的低温是指0~20℃;或者所述聚合物是具有pH转变点(transition point of the pH,pHt)的pH敏感性聚合物,即将在低pH缓冲液中溶解的聚合物水溶液的pH值快速调节到7.0~7.6即可形成胶束纳米粒子,这里的低pH是指pH为2~5,这里pH敏感性聚合物溶液浓度为1.0~150mg/mL;这里所述水溶液为pH为7.0~7.6的磷酸钠缓冲水溶液、0.6~1.2wt%的氯化钠水溶液或者3~8wt%葡萄糖水溶液。该方法明显不同于传统的制备胶束的透析法和溶剂挥发法,所形成的胶束粒子的粒径在40~600纳米。
本发明还提供了一种多功能可降解聚天冬酰胺改性聚合物制备的胶束装载药物的方法,通过简单的加热方法,将在低温中溶解的浓度为0.1~20mg/mL聚合物水溶液和药物在低温下混合并快速加热到40~70℃形成粒径在40~600纳米的载药胶束纳米粒子,这里的低温是指0~20℃;或者用毒性很低的溶剂溶解聚合物和药物,再加入纯水或者水溶液中形成粒径在40~600纳米的载药胶束纳米粒子,该溶剂为环境友好,可以用于人体注射的溶剂如乙醇,或 者经冷冻干燥容易除去的溶剂叔丁醇;载药胶束粒子的粒径在40~600纳米;或者通过简单的调节聚合物溶液pH值的方法,将在低pH条件下溶解的浓度为1.0~150mg/mL的聚合物溶液,同时加入药物和pH为8~9的缓冲溶液,快速调节溶液pH到7.0-7.6形成粒径在40~600纳米的载药胶束纳米粒子,这里的低pH是指2~5。
该聚合物具有温度/pH敏感性,可以溶解在低温的水中,或者可以溶解在pH为2~5的缓冲水溶液中,或者可以溶解在毒性很低的溶剂乙醇中。其毒性很低,使用该聚合物制备胶束和装载药物方法简单,药物装载包封效率很高,并且不需要使用有毒的有机溶剂。
本发明所述胶束装载药物方法工艺简单并且药物装载包封效率很高。可使用的药物可以包括以下列举的任何一种或者几种化合物,这些化合物能以一种稳定方式被聚合物胶束所包载,并能以医疗中有效剂量被给药。本发明中优选疏水性药物,包括抗肿瘤药物紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、阿霉素或者它们的混合物。这里所述药物为紫杉醇、多西紫杉醇、阿霉素中的一种或者二种以上的混合物时,优选有机溶剂为乙醇或者叔丁醇;所述药物为喜树碱类时,优选有机溶剂为DMSO。本发明中制得的多功能可降解聚天冬酰胺改性聚合物载药胶束纳米粒子水分散液,可经冻干得到粉末,可以再分散在用于人体注射用水溶液如pH为7.0~7.6的磷酸钠缓冲水溶液,0.6~1.2%的氯化钠水溶液,或者3~8%葡萄糖水溶液。本发明中的所指的水,不局限于纯水,可以是用于人体注射用水溶液如pH为7.0~7.6的磷酸钠缓冲水溶液,0.6~1.2%的氯化钠水溶液,或者3~8%葡萄糖水溶液等。本发明合成的的多功能可降解聚天冬酰胺改性聚合物因碳酸酯键连接在人体生理条件下水解断裂失去憎水性基团使疏水段组分转变成亲水性,胶束破坏,胶束所载药物释放。在该聚合物中连上肿瘤靶向基团R5如叶酸,含RGD的多肽和抗体,则可靶向进入肿瘤细胞降解释放出所载的有毒药物,避免化疗药物对人体正常组织细胞的伤害。
本发明披露了一种多功能(温敏性、pH敏感性、靶向性、可示踪性等)可降解聚天冬酰胺改性聚合物和其制备方法及其胶束和载药胶束的制备方法。该聚合物疏水段组分含有碳酸酯连接疏水性基团侧链单元,这种疏水段组分可通过碳酸酯键水解失去疏水性基团使疏水段组分转变成亲水性;并且该聚合物可以溶解在毒性很低的溶剂乙醇中,或者可以溶解在低温的水中,或者pH值较低的缓冲水溶液中;使用该聚合物制备胶束和装载药物的方法很简单,药物装载包封效率很高,并且不需要使用有毒的有机溶剂,因为有机溶剂可能会带来有害副作用并且需要通过蒸发或者透析加以除去。该聚天冬酰胺改性聚合物本身可以降解,毒性很低。制得的载药胶束粒子在储存运输和体液循环时很稳定,具有可控释放的能力。
附图说明
图1为P5胶束体系在37℃下不同pH值(pH=7.4,10.0,12.0)中光散射强度随时间的变化。
图2为本发明DLS测试聚合物P10胶束在37℃和pH=7.4的PBS(150mM)中的稳定性。其中,图2a为该胶束体系逐渐稀释过程中粒径以及粒径分散系数的变化情况;图2b为所形成的胶束(10mg/mL)在30小时内的粒径及其光散射强度的变化情况。
图3为本发明P5胶束载紫杉醇9.4%的纳米粒子在37℃和pH=7.4的PBS(150mM)条件下的体外释药特性。
图4为本发明P5胶束载喜树碱10%的纳米粒子在37℃和pH=7.4的PBS(150mM)条件下的体外释药特性。
图5为本发明P7胶束(1mg/mL)载紫杉醇药19.2%的纳米粒子在37℃下,在pH=5.0,7.4的缓冲溶液中的体外释药特性。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进行详细的描述,但不限于实施例所公开的内容。
实施例1
1-1聚琥珀酰亚胺PSI的制备
30克天冬氨酸,加入15.9克磷酸,在磷酸的催化下,180℃下,减压旋蒸脱水2h,停止旋蒸,趁热加入200mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF),使得固体物充分溶解,将溶液逐滴加入到1000mL蒸馏水中,得到白色沉淀,过滤,用蒸馏水洗至中性,干燥,重新用DMF溶解,然后再次用蒸馏水沉淀,过滤,真空干燥,得到聚琥珀酰亚胺(PSI)20.0克。通过类似的方法合成得到不同分子量的PSI,通过凝胶渗透色谱(GPC)测得其分子量和分子量分布(MWD)结果见表1:
表1.聚琥珀酰亚胺(PSI)的分子量表征结果
1-2活化含R2基团化合物的醇羟基
称取15克一端带甲氧基的聚乙二醇5000(mPEG5k)和16.2克羰基二咪唑(CDI)于100mL圆底烧瓶内,加入50mL氯仿,在37℃下磁力搅拌反应36小时后,用水洗三次(25mL×3),合并下层有机相,用MgSO4干燥,过滤,旋转蒸发溶剂,得到白色固体产物(mPEG5k-CI)13.9克,冷冻储存,用核磁氢谱表征了其结构。同样也合成了mPEG2k-CI和mPEG12k-CI。
先将叶酸用DCC,N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和三乙胺在DMSO中活化,再加入羟基-聚乙二醇-氨基(HO-PEG-NH2-5k)反应合成一端为羟基另一端为叶酸的聚乙二醇(HO-PEG-FA)。然后通过上述同样方法用CDI活化其羟端基制得另一端含叶酸端基的聚乙二醇FA-PEG-CI。
1-3活化含R3基团化合物的醇羟基
称取6.8克CDI于100mL圆底烧瓶内,加入40mL二氯甲烷得到悬浊液;然后将3克苯乙醇逐滴加入,在室温下搅拌反应2小时,用水洗反应混合物三次(25mL×3),合并有机相,干燥过滤,旋转蒸发掉溶剂,得到白色固体产物咪唑活化的苯乙醇(Ph-CI)4.6克,冷冻储存。用同样的方法可将苄醇、苯丙醇、苯丁醇中的羟基活化。
称取3.0克甲硝唑和6.8克CDI于100mL圆底烧瓶中,加入40mL二氯甲烷,于35℃下反应24小时,用水洗反应混合物三次(25mL×3),合并有机相,干燥过滤,最后旋转蒸发掉溶剂二氯甲烷,得到固体产品(MNI-CI)4.0克,冷冻储存。
1-4活化含R4基团化合物的醇羟基
称取3.0克二乙氨基乙醇和8.3克CDI于100mL圆底烧瓶中,加入45mL二氯甲烷,于35℃下反应2.5小时,用水洗反应混合物三次(25mL×3),合并有机相,干燥过滤,最后旋转蒸发掉溶剂二氯甲烷,得到粘稠液态产物(DEAE-CI)4.60克,冷冻储存。用同样的方法可将2-二甲胺基乙醇、3-二甲胺基-1-丙醇,N,N-二甲胺基异丙醇,N,N-二乙胺基甲醇,3-二乙胺基-1-丙醇,2-吗啉乙醇,N-甲基-N-(N,N-二甲胺基乙基)氨基乙醇中的羟基活化。
温度敏感性聚合物制备例2
戊醇胺开环PSI
称取2克制得的聚琥珀酰亚胺(PSI-3,合成实施例1-1),溶解于20mL DMF中,冰浴下滴加5-氨基戊醇胺(3.90克于5mL DMF中),室温搅拌半个小时,然后置于60℃油浴中反应24小时,用无水乙醚沉淀,真空干燥,得到3.5克聚合物(PHPA)。核磁共振氢谱表明PSI完全开环(其核磁共振氢谱上化学位移在5-6ppm之间无峰)。
PHPA 0.20克,0.24克mPEG5k-CI(合成实施例1-2)和0.12克催化剂(DMAP)于圆底烧瓶内,加入2mL无水DMF溶解,再升温在70℃油浴下磁力搅拌反应48小时。冷却至室温后加入95mg Ph-CI(合成实施例1-3),升温70℃下继续反应24小时停止,加入无水乙醚中沉淀,真空干燥,得到聚合物0.4克,该聚合物记为P5。用同样方法,保持mPEG5k-CI与PHPA投料比例相同,改变Ph-CI的投料比例,分别制得聚合物P1-P5,接入苯环的比例由 核磁共振氢谱计算得到(核磁共振氢谱中,化学位移在7.2~7.3ppm的峰为接上的苯环的质子峰,化学位移在1.2~1.5ppm的峰为戊醇胺上三个亚甲基的质子峰,通过这两个位置氢的积分可以算出接上苯环的比例,结果见表2。通过凝胶渗透色谱(GPC)测得各个聚合物的数均分子量Mn及多分散指数MWD。通过紫外可见分光光度计测不同温度时的透过率,以90%透过率时对应的温度值为最低临界转变温度(LCST,℃)。使用mPEG2k-CI或者mPEG12k-CI代替mPEG5k-CI,同样也合成了温度敏感性聚天冬酰胺类聚合物。使用苄醇、苯丙醇或者苯丁醇中的羟基活化物(合成实施例1-3)代替Ph-CI,同样也合成了温度敏感性聚天冬酰胺类聚合物。
表2.温度敏感性聚合物组成及表征。
合成聚合物例3
按照温度敏感性聚合物制备例2的方法投入0.10克PHPA,0.16克mPEG-CI,0.12克Ph-CI和适量催化剂DMAP,得到产品P6,聚合物P6不溶于水,溶于乙醇和DMSO,通过核磁共振氢谱计算得到接上苯环的摩尔比例为59%。使用苯丙醇或者苯丁醇中的羟基活化物(合成实施例1-3)代替Ph-CI,同样也合成了不溶于水但溶于乙醇的聚天冬酰胺类聚合物。
pH敏感性聚合物制备例4
称取0.2克制得的PHPA(温度敏感性聚合物制备例2),0.26克mPEG5k-CI(合成实施例1-2)和适量催化剂(DMAP)于圆底烧瓶内,加入2mL无水DMF溶解,再升温在70℃油浴下磁力搅拌反应24小时;冷却至室温后加入135mg Ph-CI(合成实施例1-3),升温70℃下继续反应24小时;冷却至室温后加入85mg DEAE-CI(合成实施例1-4),升温70℃下继续反应24小时停止,加入无水乙醚中沉淀,真空干燥,得到聚合物0.48克,该聚合物记为P7。用同样方法,保持mPEG5k-CI和DEAE-CI与PHPA投料比例相同,改变Ph-CI的投料比例,制得聚合物P8;接入苯环的比例及DEAE的比例由核磁共振氢谱计算得到(核磁共振氢谱中, 化学位移在7.2~7.3ppm的峰为接上的苯环的质子峰,化学位移在1.2~1.5ppm的峰为戊醇胺上三个亚甲基的质子峰,化学位移在0.8~1.0ppm的峰为DEAE上两个甲基的质子峰,通过这三个位置氢的积分可以算出接上苯环及DEAE的比例,结果见表3。通过凝胶渗透色谱(GPC)测得各个聚合物的数均分子量Mn及多分散指数MWD。通过紫外可见分光光度计测不同pH值时的透过率,以90%透过率时对应的pH值为pHt。使用另一端含叶酸端基的聚乙二醇FA-PEG-CI代替mPEG5k-CI,同样也合成了pH敏感性聚天冬酰胺类聚合物。使用2-二甲胺基乙醇、3-二甲胺基-1-丙醇、N,N-二甲胺基异丙醇、N,N-乙胺基甲醇、3-二乙胺基-1-丙醇、2-吗啉乙醇、N-甲基-N-(N,N-二甲胺基乙基)氨基乙醇中的羟基活化物(合成实施例1-4)的任一种或者几种的混合物代替DEAE-CI,同样也合成了pH敏感性聚天冬酰胺类聚合物。
表3.pH敏感性聚合物组成及表征
pH敏感性聚合物制备例5
称取0.2克制得的PHPA(温度敏感性聚合物制备例2),0.22克mPEG5k-CI(合成实施例1-2)和适量催化剂(DMAP)于圆底烧瓶内,加入2mL无水DMF溶解,再升温在70℃油浴下磁力搅拌反应24小时;冷却至室温后加入MNI-CI 0.20克(合成实施例1-3),再升温在70℃下反应24小时;冷却至室温后加入DEAE-CI 0.21克(合成实施例1-4),升温70℃下继续反应24小时停止,加入无水乙醚中沉淀,真空干燥,得到聚合物0.40克,该聚合物记为P9。用同样方法,保持mPEG5k-CI和DEAE-CI与PHPA投料比例相同,改变MNI-CI的投料比例,制得聚合物P10,接入MNI和DEAE的比例由核磁共振氢谱计算得到(核磁共振氢谱中,化学位移在8.0ppm的峰为接上的咪唑环上氢质子峰,化学位移在1.2~1.5ppm的峰为戊醇胺上三个亚甲基的质子峰,化学位移在0.8~1.0ppm的峰为DEAE上两个甲基的质子峰,通过这三个位置氢的积分可以算出接上MNI及DEAE的比例,结果见表4。通过凝胶渗透色谱(GPC)测得各个聚合物的数均分子量Mn及多分散指数MWD。通过紫外可见分光光度计测不同pH值时的透过率,以90%透过率时对应的pH值为pHt。
表4.pH敏感性聚合物组成及表征
多功能可降解聚天冬酰胺改性聚合物例6
6-1胱胺改性叶酸衍生物(FA-Cyst)的合成
6-1-1先合成一端叔丁氧羰基(Boc)保护的胱胺(Boc-Cyst):称取胱胺盐酸盐6克溶于100mL甲醇,并加入9mL三乙胺于250mL烧瓶中,冰浴搅拌下逐滴加入含二碳酸二叔丁酯(Boc酸酐)5.8克的50mL甲醇溶液,约两小时滴完;室温下搅拌24小时,旋干,得到白色固体。该固体用约60mL1.0M的磷酸二氢钾水溶液溶解,乙醚萃取3次,每次用30mL。收集水层,用2M的氢氧化钠溶液调pH值至9。用乙酸乙酯萃取5次,每次约30mL。保留酯层,用无水硫酸镁干燥,滤去干燥剂,旋干,得到淡黄色粘稠液体2.3克,即为Boc-Cyst。
6-1-2再合成一端叔丁氧羰基保护的胱胺改性叶酸(Boc-Cyst-FA):称量叶酸1.0克,Boc-Cyst 0.6克,N,N′-二环己基碳二亚胺(DCC)0.8克加入反应瓶中,再加入40mL的DMSO使它们溶解,室温搅拌反应24小时;过滤除去沉淀,剩下的液体滴入300mL碳酸钾溶液中,并不断搅拌,得到淡黄色悬浊液,冰箱中冷冻过夜。离心,弃去上层清液,得到淡黄色固体沉淀,分别用蒸馏水洗2次和乙醚洗2次,真空干燥,得到固体1.5克Boc-Cyst-FA。用核磁氢谱和紫外表征了其结构。
6-1-3脱Boc合成FA-Cyst:将上一步产物1.5克Boc-Cyst-FA溶解在15mL三氟乙酸中,室温下搅拌1至2小时,旋转蒸发掉三氟乙酸,再用无水乙醚洗去剩余的三氟乙酸,真空干燥得到黄色固体1.3克胱胺改性叶酸衍生物FA-Cyst。
6-2乙二胺改性罗丹明B(Rhodamine B,RB)的合成
由乙二胺和罗丹明B反应制备乙二胺改性罗丹明B (Amino-Oriented Rhodamine)[Xian-Zheng Zhang等,Core「Shell Nanosized Assemblies Mediated by theα-β Cyclodextrin Dimer with a Tumor-Triggered Targeting Property,ACS NANO,4,4211-4219]。
6-3多肽Fmoc-KRGDG-COOH的合成
参见文献[Xian-Zheng Zhang等,Dual targeting of a thermosensitive nanogel conjugated with transferrin and RGD-containing peptide for effective cell uptake and drug release,Nanotechnology,2009,20(33),文献编号:335101]。
称取制得的聚琥珀酰亚胺1.0克(PSI-2,合成实施例1-1)和0.575克胱胺改性叶酸衍生物(FA-Cyst,合成实施例6-1)溶解在10mL DMSO中,室温下搅拌反应24小时。产品用无水乙醇沉淀,收集沉淀,真空干燥,得到黄色固体(PSI-FA)1.05克。经紫外可见光谱检测接入叶酸的比例为7%(重量比)。
将得到的PSI-FA全部溶解在10mL DMF,加入1.0克乙二胺改性罗丹明B(合成实施例6-2)和5mL DMF混合,室温下搅拌反应5天。用无水乙醇沉淀,抽滤并真空干燥,得到粉红色固体叶酸和罗丹明B改性聚天冬酰胺(PSI-FA/RB)1.0克。经紫外可见光谱检测接入罗丹明B的比例为0.7%(重量比)。
将得到的PSI-FA/RB全部溶解在10mL DMF,冰浴下滴加5-氨基戊醇胺(1.9克于2mLDMF中),室温搅拌反应半个小时,然后升温60℃下反应24小时,用无水乙醚沉淀,真空干燥,得到侧基含羟基的聚天冬酰胺衍生物(PHPA-FA/RB)1.7克。核磁共振氢谱表明PSI完全开环(其核磁共振氢谱上化学位移在5~6ppm之间无峰)。
将得到的PHPA-FA/RB 0.13克、mPEG5k-CI(合成实施例1-2)0.16克和适量催化剂(DMAP)于圆底烧瓶内,70℃下反应24小时。冷却至室温后加入0.06克Ph-CI,再升温在70℃下反应24小时后停止反应。,加入无水乙醚中沉淀,真空干燥,制得多功能可降解聚天冬酰胺改性聚合物0.22克。它在4℃时为水溶性,通过核磁共振氢谱测得其苯环接入比例为20%。
称取制得的聚琥珀酰亚胺100mg(PSI-5,合成实施例1-1)和39mg多肽Fmoc-KRGDG-COOH(RGD,合成实施例6-3)溶解在2mL DMSO中,室温下搅拌反应48小时。再在冰浴下滴加5-氨基戊醇胺(0.2克于2mL DMF中),室温搅拌反应48小时,用无水乙醚沉淀,真空干燥,得到RGD改性的侧基含羟基的聚天冬酰胺衍生物(PHPA-RGD)0.19克。核磁共振氢谱表明PSI完全开环(其核磁共振氢谱上化学位移在5~6ppm之间无峰)。
将得到的PHPA-RGD 0.13克、mPEG5k-CI(合成实施例1-2)0.16克和适量催化剂(DMAP)于圆底烧瓶内,70℃下反应24小时。冷却至室温后加入0.06克Ph-CI,再升温在70℃下反应24小时后停止反应。加入无水乙醚中沉淀,真空干燥,制得靶向RGD改性的可降解聚天冬酰胺改性聚合物0.21克。它在4℃时为水溶性,通过核磁共振氢谱测得其苯环接入比例为20%。同样,利用多肽精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp,CAS:99896-85-2)代替多肽Fmoc-KRGDG-COOH也可以制得靶向RGD改性的可降解聚天冬酰胺改性聚合物。
胶束制备例7
取温度敏感性聚合物制备例2中制得的P5,在2~4℃下溶解在pH为7.0~7.6的150mM磷酸缓冲溶液中,得到浓度为2mg/mL的P5聚合物水溶液,然后置于55℃水浴中震荡加热1分钟后自然冷却至室温,得到稳定的纳米胶束粒子,经动态光散射(DLS)测得粒径为95nm,分散指数PDI为0.15。
通过核磁共振氢谱发现聚合物P1~P5在碱性条件下可以降解失去苯乙醇变成水溶性聚合物,并且水解随碱性增强而加快。以温度敏感性聚合物制备例2中制得的P5为例,在2~4℃下溶解在pH=7.410mM磷酸缓冲溶液中(离子强度为150mM),制得到浓度为1mg/mL的P5聚合物水溶液,然后置于55℃水浴中震荡加热1分钟后自然冷却至室温。用0.1M NaOH溶液分别调节聚合物溶液的pH值,得到pH=7.4,10,12的聚合物胶束水分散体系,用动态光散射分别检测其在37℃下光散射强度随时间的变化,结果见图1。从图1中可以看到,在将近4小时内,在pH=10.0条件下,P5胶束水分散体系的光散射强度减少到60%,而在pH=12.0条件下,P5胶束水分散体系的光散射强度减少到20%,这表明P5胶束在pH为10.0和12.0时很不稳定。这说明这类胶束在水中是可以降解的,并且这种降解随碱性增强而加快。
胶束制备例8
取合成聚合物例3中制得的低温不溶于水的聚合物P6溶解在乙醇中,浓度为10mg/mL,取300μL该P6聚合物乙醇溶液置于样品瓶中,加入pH=7.4磷酸缓冲溶液2700μL,震荡摇匀,得到稳定的纳米胶束粒子,聚合物的浓度为1.0mg/mL。经动态光散射(DLS)测得粒径为82nm,分散指数PDI为0.17。这里用pH 7.0~7.6的磷酸钠缓冲水溶液、0.6~1.2wt%的氯化钠水溶液或者3~8wt%葡萄糖水溶液代替pH=7.4磷酸缓冲溶液得到类似的效果。
胶束制备例9
取pH敏感性聚合物制备例4中30mg聚合物P7,溶解于pH约为3~5的3mL稀盐酸水溶液中,聚合物的浓度为10mg/mL,然后取其中300μL置于样品瓶中,加入2700μL pH为8~9的磷酸缓冲溶液,制得聚合物的浓度为1mg/mL和pH值为7.0~7.6的水分散体系,即形成稳定的纳米胶束粒子。经动态光散射(DLS)测得粒径为84nm,分散指数PDI分别为0.09。
胶束制备例10
取pH敏感性聚合物制备例5中30mg聚合物P10,溶解于pH约为3~5的3mL稀盐酸 水溶液中,聚合物的浓度为100mg/mL,然后取其中300μL置于样品瓶中,加入2700μL pH为8~9的磷酸缓冲溶液,制得聚合物的浓度为10mg/mL和pH值为7.0~7.6的水分散体系,即形成稳定的纳米胶束粒子。经动态光散射(DLS)测得粒径约为94nm,分散指数PDI分别为0.11。所形成的纳米胶束在逐渐稀释的过程中可以保持稳定(如图2a所示),且在30小时无明显聚集发生(如图2b所示)。
胶束载药例11
对于温度敏感性聚合物制备例2中制得的低温溶于水的聚合物P5的载药过程:先将P5在2~4℃下溶解在pH为7.0~7.6的150mM磷酸缓冲溶液中,低温过夜充分溶解制成浓度为2mg/mL的P5聚合物水溶液,同时配置20mg/mL的紫杉醇乙醇溶液。然后取2mL P5聚合物溶液于样品瓶中,加入20μL紫杉醇乙醇溶液,混合并快速置于55℃水浴中震荡加热1分钟后自然冷却至室温,用孔径为220纳米的过滤器过滤,除去可能未包进聚合物中而沉淀出来的紫杉醇,得到稳定的载药纳米胶束粒子,经动态光散射(DLS)测试粒径为87nm,分散指数PDI约为0.11。其载药量和载药包封效率通过HPLC测得(Angel C18分析色谱柱(250nm×4.6mm,5μm);流动相为乙腈:水(60:40,体积比);流速为0.5mL/min;检测波长为227nm;进样量为20μL),通过计算该胶束粒子装载紫杉醇药物包封效率为94%。改变投入的药物与聚合物的比例,制得不同载药量的载药胶束,结果总结在表5。由表5可看出,该胶束装载紫杉醇药物包封率很高,载药粒子粒径小,分布较窄;该载药操作过程简单,易于工业化。这里的pH 7.0~7.6的磷酸钠缓冲水溶液用0.6~1.2wt%的氯化钠水溶液或者3~8wt%葡萄糖水溶液代替得到类似的效果。
表5.不同载药量的P5装载紫杉醇胶束纳米粒子*
*载药量=(过滤后胶束中的紫杉醇质量/载药胶束聚合物质量)×100%,包封率=(过滤后胶束中的药物质量/所投药物质量)×100%。聚合物浓度为2.0mg/mL。
载药胶束稳定性:以表5中载药量为20%的载药胶束为例,用DLS测试其pH为7.4的 PBS中,37℃下不同时间的粒径及其分散指数,结果总结在表6中。由表6可知,该聚合物载药胶束粒子在192小时后,仍保持较低的粒径分布,可见该载药胶束纳米粒子非常稳定。
表6.P5载药胶束在pH为7.4的PBS和37℃条件下粒径及其分散系数随时间的变化
以表5中载药量为20%的载药胶束为例,DLS测试其在37℃下用pH=7.4的PBS缓冲溶液稀释后的结果于表7中。由该表可知,该聚合物载药胶束粒子稀释到0.125mg/mL时,粒径变化仍然较小,这说明该胶束载药纳米粒子很稳定。
表7.P5载药胶束稀释后不同聚合物浓度的粒径及其光散射强度
载药胶束的体外释放特性:通过透析的方法检测载药胶束的体外释放特性。使用如上所述的聚合物P5载药9.4%的胶束溶液2mL(聚合物2mg/mL),用150mM磷酸缓冲溶液稀释一倍,取稀释液1.2mL于透析袋(截留分子量3500)中,放入盛有400mL 150mM磷酸缓冲溶液的烧杯中透析(烧杯置于37℃摇床水浴中),以保证当全部紫杉醇释放出来的时候,浓度低于其在水中的溶解度(0.3μg/mL),即符合漏槽条件(sink condition)。间隔一定时间,吸取透析袋外液3mL置于冰箱保存待测,每次取样后都往其中补加3mL磷酸缓冲溶液,通过HPLC测试其紫杉醇浓度计算出释药百分比,结果见图3。由图3可以看出,该载药胶束在磷酸缓冲溶液里并没有明显的暴释现象。
胶束载药例12
对于温度敏感性聚合物制备例2中制得的低温溶于水的聚合物P5的载药喜树碱的过程:2~4℃下溶解在pH 7.0~7.6的150mM磷酸缓冲溶液中,低温过夜充分溶解制成浓度为1mg/mL的P5聚合物水溶液,同时配置10mg/mL的喜树碱二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide或DMSO)溶液。然后取3mL聚合物溶液于样品瓶中,加入30μL喜树碱DMSO溶液,混合并快速置于55℃的水浴中震荡加热1分钟后自然冷却至室温,用孔径为220纳米的过滤器过滤,除去可能未包进聚合物中而沉淀出来的喜树碱,得到稳定的载药胶束纳米粒子,经DLS测试粒径为107nm,分散指数PDI约为0.1。其载药量和载药包封效率通过紫外可见光谱仪测得,检测波长为372nm,通过计算该胶束粒子装载紫喜树碱药物包封效率接近100%。这说明该胶束纳米粒子装载药物包封率很高,且载药粒子粒径小,分布较窄。这里的pH 7.0~7.6的磷酸钠缓冲水溶液用0.6~1.2wt%的氯化钠水溶液或者3~8wt%葡萄糖水溶液代替得到类似的效果。
载药胶束的体外释放特性:通过透析的方法检测载药胶束的体外释放特性。使用如上所述的聚合物P5载药10%的胶束溶液3mL(聚合物1mg/mL,喜树碱0.1mg/mL),于透析袋(截留分子量3500)中,放入盛有400mL 150mM磷酸缓冲溶液的烧杯中透析(烧杯置于37℃摇床水浴中),间隔一定时间,吸取透析袋外液3mL置于冰箱保存待测,每次取样后都往其中补加3mL磷酸缓冲溶液,通过紫外可见光谱仪测试其喜树碱浓度计算出释药比例,结果见图4。由该图可以看出,该载药胶束在磷酸缓冲溶液里并没有明显的暴释现象。
同样,所载药物选用多烯紫杉醇或者阿霉素时,使用乙醇或者叔丁醇可以溶解药物,载药过程也基本相同。
胶束载药例13
对于合成聚合物例3中制得的低温不溶于水的聚合物P6的载药过程:先将聚合物P6和紫杉醇分别溶解在无水乙醇中,聚合物浓度为10mg/mL,紫杉醇乙醇溶液浓度为20mg/mL,然后取300μL聚合物乙醇溶液与一定量的紫杉醇溶液(A:15μL;B:30μL,即聚合物与药品紫杉醇的比例分别为10:1,10:2)混合后,往其中加入pH=7.4的PBS缓冲溶液到总体积3mL,摇匀并用孔径0.45微米的过滤器过滤除去未包进胶束而沉淀出来的紫杉醇,制得稳定的聚合物载药胶束纳米粒子,其聚合物胶束浓度为1.0mg/mL。经动态光散射(DLS)测试粒径,其载药量和载药包封效率通过HPLC测得,结果见表8。由该表可看出,该胶束粒子装载紫杉醇药物包封效率较高,载药粒子粒径小,分布较窄。
表8.不同载药量的P6装载紫杉醇胶束纳米粒子
*载药量=(过滤后胶束中的药物质量/载药胶束聚合物质量)×100%,包封率=(过滤后胶束中的药物质量/所投药物质量)×100%。
胶束载药例14
对于pH敏感性聚合物制备例4中制得的pH敏感聚合物P7的载药过程:取聚合物30mg溶解于pH约为3~5的3mL稀盐酸水溶液中,聚合物的浓度为10mg/mL,同时配置20mg/mL的紫杉醇乙醇溶液。然后取300μL聚合物溶液于样品瓶中,加入一定量的紫杉醇溶液(C:15μL;D:30μL),快速加入2700μLpH为8~9的磷酸缓冲溶液,这时聚合物的浓度为1mg/mL,pH值约为7.4,用孔径为450纳米的过滤器过滤,除去未包进聚合物胶束中而沉淀出来的紫杉醇,得到稳定的载药胶束纳米粒子,经动态光散射(DLS)测试粒径,其载药量和载药包封效率通过HPLC测得,其结果见表9。由该表可以看出,该胶束粒子装载紫杉醇药物包封效率很高,载药粒子粒径较小,分布较窄(PDI<0.1)。
表9.不同载药量的P7装载紫杉醇胶束纳米粒子*
*载药量=(过滤后胶束中的紫杉醇质量/载药胶束聚合物质量)×100%,包封率=(过滤后胶束中的药物质量/所投药物质量)×100%。聚合物浓度为1.0mg/mL。
载药胶束稳定性的考察:以表9中的载药胶束为例,用DLS测试其pH为7.4的PBS中,37℃下不同时间的粒径及其分散指数,结果总结在表10中。由表10可知,这些聚合物载药胶束粒子在43小时后,仍保持较低的粒径分布,PDI<0.1,可见该载药胶束纳米粒子非常稳定。
表10.P7载药胶束在37℃条件下粒径及粒径分散系数随时间的变化。
载药胶束的体外释放特性:通过透析的方法检测载药胶束的体外释放特性。使用如上所述的聚合物P7载药19.2%的胶束溶液2mL(聚合物1mg/mL),用150mM磷酸缓冲溶液稀释一倍,取稀释液1.2mL于透析袋(截留分子量3500)中,放入分别盛有400mL pH=5.0,7.4的150mM缓冲溶液的烧杯中透析(烧杯置于37℃摇床水浴中),以保证当全部紫杉醇释放出来的时候,浓度低于其在水中的溶解度(0.3μg/mL),即符合漏槽条件(sink condition)。间隔一定时间,吸取透析袋外液3mL置于冰箱保存待测,每次取样后都往其中补加3mL对应pH值的缓冲溶液,通过HPLC测试其紫杉醇浓度计算出释药比例,结果见图5。由该图可以看出,该载药胶束在pH为7.4的磷酸缓冲溶液里并没有明显的暴释现象,但在pH为5的酸性条件下药物释放速度很快,在1.0h和10h内分别释放19%和52%,说明该载药胶束有利于酸性肿瘤细胞中更多释药;在pH为5的10小时后测试透析袋外面的药物量未见增加,而我们发现在透析袋内有明显的药物沉淀,在46小时后,透析袋内分散液里和沉淀中PTX的量通过HPLC测试为紫杉醇总量的29%。
胶束载药例15
对于pH敏感性聚合物制备例5中制得的pH敏感聚合物P10的载药过程:取聚合物30mg溶解于pH约为3~5的3mL稀盐酸水溶液中,聚合物的浓度为10mg/mL,同时配置20mg/mL的紫杉醇乙醇溶液。然后取其中300μL聚合物溶液于样品瓶中,加入一定量的紫杉醇溶液(E:15μL;F:30μL;G:45μL;H:60μL;I:90μL;J:150μL即聚合物与药品紫杉醇的比例为10:1~10:10),快速加入2700μLpH为8~9的磷酸缓冲溶液,这时聚合物的浓度为1mg/mL,pH值约为7.4,用孔径为450纳米的过滤器过滤,除去未包进胶束而沉淀出来的紫杉醇,得到稳定的载药胶束纳米粒子,经动态光散射(DLS)测试粒径,其载药量和载药包封效率通过HPLC测得结果见表11。由该表可以看出,该胶束粒子装载紫杉醇药物包封效率很高,载药粒子粒径小,分布较窄(PDI<0.3)。
表11.不同载药量的P10装载紫杉醇胶束纳米粒子
载药胶束稳定性的考察:以表11中的载药胶束F为例,用DLS测试其pH为7.4的PBS中,37℃下不同时间的粒径及其分散指数,结果总结在表12中。由表12可知,这些聚合物载药胶束粒子在24小时后,仍保持较低的粒径分布,PDI<0.1,可见该载药胶束纳米粒子非常稳定。
表12.P10载药胶束在37℃条件下粒径及粒径分散系数随时间的变化。
Claims (10)
2.根据权利要求1所述的多功能可降解聚天冬酰胺改性聚合物,其特征在于:m=3~5;聚乙二醇的数均分子量为2000~12000;n为50~500的整数;x,y,z,u,v分别为1~10,0~400,0~400,0~50,0~20的整数。
3.根据权利要求1或2所述的多功能可降解聚天冬酰胺改性聚合物,其特征在于:所述的R3为苄基、苯乙基、苯丙基、苯丁基、甲硝唑基中的一种或几种。
4.根据权利要求1或2所述的多功能可降解聚天冬酰胺改性聚合物,其特征在于:所述的R4为2-二甲胺基乙基、3-二甲胺基-1-丙基,N,N-二甲胺基异丙基,N,N-二乙胺基甲基,N,N-二乙胺基乙基,3-二乙胺基-1-丙基,2-吗啉乙基,N-甲基-N-(N,N-二甲胺基乙基)氨基乙基中的一种或几种。
6.一种如权利要求1所述的多功能可降解聚天冬酰胺改性聚合物的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)由天冬氨酸经缩聚反应得到聚琥珀酰亚胺PSI;
2)用溶剂DMF溶解聚琥珀酰亚胺PSI,再加入含R5的氨基化合物、含R6的氨基化合物或者含R1的氨基醇化合物的一种对PSI开环或者几种先后对PSI开环,制得侧基含羟基的聚天冬酰胺衍生物;
3)分别用N,N’-羰基二咪唑活化含R2、R3、R4基团化合物的醇羟基;
4)按照空间位阻从大到小的顺序分别将步骤3)得到的产物接入到步骤2)得到的产物聚天冬酰胺衍生物的侧基羟基上,纯化干燥后制得多功能可降解聚天冬酰胺改性聚合物。
7.一种利用权利要求1所述的多功能可降解聚天冬酰胺改性聚合物制备胶束的方法,其特征在于:将0~20℃中浓度为0.1~20mg/mL的多功能可降解聚天冬酰胺改性聚合物水溶液加热到40~70℃形成粒径在40~600纳米的胶束纳米粒子;或者用乙醇或者叔丁醇溶解多功能可降解聚天冬酰胺改性聚合物,再加入到纯水或者水溶液中形成粒径在40~600纳米的胶束纳米粒子;或者将多功能可降解聚天冬酰胺改性聚合物溶解在pH为2~5的缓冲液中制备浓度为1.0~150mg/mL的聚合物溶液,调节溶液pH到7.0~7.6形成粒径在40~600纳米的胶束纳米粒子;所述水溶液为pH 7.0~7.6的磷酸钠缓冲水溶液、0.6~1.2wt%的氯化钠水溶液或者3~8wt%葡萄糖水溶液。
8.一种利用权利要求7所述的胶束装载药物的方法,其特征在于:由下述方法制得:将0~20℃中浓度为0.1~20mg/mL的多功能可降解聚合物水溶液和药物混合,加热到40~70℃形成粒径在40~600纳米的胶束纳米粒子;或者用有机溶剂分别溶解多功能可降解聚天冬酰胺改性聚合物和药物,然后同时加入到纯水或者水溶液中形成粒径在40~600纳米的载药胶束纳米粒子;或者将多功能可降解聚天冬酰胺改性聚合物溶解在pH为2~5的缓冲液中制备浓度为1.0~150mg/mL的聚合物溶液,同时加入药物和pH为8~9的缓冲溶液,调节溶液pH到7.0~7.6形成粒径在40~600纳米的载药胶束纳米粒子;所述水溶液为pH 7.0~7.6的磷酸钠缓冲水溶液、0.6~1.2wt%的氯化钠水溶液或者3~8wt%葡萄糖水溶液。
9.一种基于权利要求8所述的胶束装载药物的方法,其特征在于:所述药物选自紫杉醇、多西紫杉醇、喜树碱类、阿霉素中的一种或者二种以上的混合物。
10.根据权利要求8或9所述的胶束装载药物的方法,其特征在于:所述药物为紫杉醇、多西紫杉醇、阿霉素中的一种或者二种以上的混合物时,所述有机溶剂为乙醇或者叔丁醇;所述药物为喜树碱类时,所述有机溶剂为DMSO。
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- 2012-12-28 CN CN201210585852.2A patent/CN103059297B/zh active Active
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