CN107296962A - 化药/基因共转运功能化碳纳米管的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种化药/基因共转运功能化碳纳米管的制备方法：将甜菜碱与聚乙烯亚胺在有机溶剂中于20‑40℃下搅拌反应，透析后得到聚合物单体；将表面酰氯化的碳纳米管在保护气氛下，在有机溶剂中与聚合物单体于60‑85℃下反应，得到聚合物修饰的碳纳米管；将抗癌药物与聚合物修饰的碳纳米管在缓冲溶液中混匀，避光搅拌12‑24h，得到载药功能化碳纳米管；将其与磷脂‑聚乙二醇‑马来酰亚胺、靶向穿透肽BR2‑SH以及siRNA在分散液中混匀，在30‑40℃下孵育。本发明还提供了上述方法所制备的化药/基因共转运功能化碳纳米管在制备治疗肿瘤靶向药物中的应用。

Description

化药/基因共转运功能化碳纳米管的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种化药/基因共转运功能化碳纳米管的制备方法及应用。
背景技术
恶性肿瘤严重威胁着人类的健康，但其治疗效果差、转移率高，治疗困难较大。目前治疗恶性肿瘤的手段主要有外科手术治疗、化学药物治疗、放射治疗、免疫疗法和基因治疗等手段。常用的化学药物治疗虽然能够快速杀死肿瘤细胞，但药物缺乏选择性，会对正常的细胞或组织产生高毒副作用。基因治疗中使用的siRNA生物稳定性差，易被血清中的核酸酶降解，体内干扰持续时间短，这些缺点限制了其广泛应用。近年来，组合治疗在医药领域中得到了广泛应用。大量研究证实，化药和基因共给药具有增加药物抗肿瘤疗效和提高基因转染效率的协同作用，但是实现化药/基因共转运的挑战之一是共转运载体的构建。有效的共转运载体能良好地负载化药与基因，克服体内、胞内的各种屏障，特异性识别靶向部位，并将药物及基因递送至肿瘤细胞内，发挥抗肿瘤作用。因此，构建一种新型化药/基因共转运纳米载体，改善化药和siRNA在治疗中的缺陷，并发挥药物与基因的协同作用具有重要的科学意义。
碳纳米管(Carbon Nanotubes,CNTs)是单层或多层的石墨卷曲形成的圆柱状结构材料，作为一种新型的纳米载体，因其独特的物理、化学和生物学性能，引起了人们广泛的关注。单壁碳纳米管(Single-walled Carbon Nanotubes，SWCNTs)是一种特殊的CNTs，它具有比表面积大、非特异性吸附、高细胞穿透能力等特点，在载体研究中占据了很大的空间。原始的CNTs由于其自身所具有的疏水结构，使其难以均匀分散于体液中，容易在生物组织和细胞中聚集，故需采用化学的方法对原始CNTs进行共价或非共价修饰，不仅能够有效地提高CNTs在溶剂中的分散性和生物相容性，而且进入生物体内的CNTs还可以通过肾脏代谢等途径，通过尿液将其排出体外。CNTs具有类似石墨表面的π-π共轭结构，使得其表面具有很强的吸附药物分子的能力。基因或核酸、蛋白质以及其他难溶性的含芳环药物等可以通过物理包覆和π-π吸附等方式加载到CNTs表面。因此，CNTs作为一种新颖的药物和基因载体，可以实现药物和基因在生物体内的高效转运和利用。
聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine，PEI)作为一种非病毒商业化基因载体而被广泛地应用。PEI具有较强的核酸结合能力、细胞黏合能力和缓冲能力，因其“质子海绵”效应，PEI与基因复合物被内吞进入细胞后，能在内涵体的酸性环境中吸收H+，使其渗透压增高，导致膜不稳定甚至破裂，从而使被吞噬的复合物逃逸出来，避免了DNA被溶酶体内酶的降解。大分子量的PEI具有高效的基因转染效率，但因其大量正电荷的存在以及非生物降解性，显示出较大的细胞毒性；低分子量的PEI毒性低，但基因转染效率也随之降低，这样就严重限制了它在临床医学中的应用。
靶向穿透肽BR2是一种含有17个氨基酸的多肽，该靶向穿透肽能特异性地识别肿瘤细胞，通过与癌细胞表面神经节苷脂的相互作用，从而进入细胞；同时，BR2可使纳米粒靶向进入肿瘤细胞，提高siRNA的转染效率。
至今未出现以新型功能化SWCNTs为载体，同时负载抗肿瘤药和siRNA，构建肿瘤微环境响应性化药与基因共转运的靶向纳米载体。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种化药/基因共转运功能化碳纳米管的制备方法及应用，本发明的制备方法操作简单、易得、可靠，所制备的功能化碳纳米管在水中分散性和生物相容性较好，药物及基因负载能力高，具有明显的肿瘤细胞靶向能力和控制药物、基因释放的能力。
本发明的提供了一种化药/基因共转运功能化碳纳米管的制备方法，包括以下步骤：
(1)将甜菜碱与聚乙烯亚胺在有机溶剂中于20-40℃下搅拌反应，透析后得到聚合物单体；
(2)将表面酰氯化的碳纳米管在保护气氛下，在有机溶剂中与步骤(1)得到的聚合物单体于60-85℃下反应，离心、洗涤沉淀后得到聚合物修饰的碳纳米管；
(3)将抗癌药物与步骤(2)得到的聚合物修饰的碳纳米管在pH为6.0-8.0的缓冲溶液中混匀，搅拌12-24h，离心后在上清液中加入步骤(2)得到的聚合物修饰的碳纳米管，重复多次直至上清液无色，得到载药功能化碳纳米管；
(4)将步骤(3)得到的载药功能化碳纳米管、磷脂-聚乙二醇-马来酰亚胺、靶向穿透肽BR2-SH以及siRNA在葡萄糖水溶液中混匀，在30-40℃下进行孵育，得到化药/基因共转运功能化碳纳米管。
进一步地，在步骤(2)中，表面酰氯化的碳纳米管的制备方法包括以下步骤：
(S1)将单壁碳纳米管在浓硫酸和浓硝酸混匀后，在60-80℃下搅拌4-8h，过滤、干燥后得到氧化碳纳米管；
(S2)将氧化碳纳米管、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和氯化亚砜(SOCl2)混合均匀，在50-70℃下搅拌反应16-32h，洗涤、离心、干燥，得到表面酰氯化的碳纳米管。
进一步地，在步骤(1)中，聚乙烯亚胺的分子量为10-30KDa。
进一步地，在步骤(1)中，聚乙烯亚胺与甜菜碱的摩尔比为1:80-120。
进一步地，在步骤(1)中，有机溶剂为甲醇、乙醇和乙腈中的一种或几种。
进一步地，在步骤(2)中，有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙酸异丙酯和四氢呋喃中一种。
进一步地，在步骤(2)中，保护气氛为氮气、氦气、氖气、氩气、氙气或氡气气氛。
进一步地，在步骤(2)中，表面酰氯化的碳纳米管与聚合物单体的质量比为1:10-30。
进一步地，在步骤(3)中，抗癌药物为多西紫杉醇(Docetaxel)、紫杉醇(Taxol)、阿霉素(DOX)和柔红霉素中的一种或几种。
进一步地，在步骤(3)中，聚合物修饰的碳纳米管与抗癌药物的质量比为1:1-5。
进一步地，在步骤(4)中，首先将载药功能化碳纳米管与磷脂-聚乙二醇-马来酰亚胺(DSPE-PEG-Mal)在葡萄糖水溶液中涡旋10-20min，然后加入靶向穿透肽BR2-SH震荡12-24h，最后加入siRNA进行孵育。磷脂-聚乙二醇-马来酰亚胺中，聚乙二醇分子量为1500-5000g/mol。靶向穿透肽BR2-SH的氨基酸序列表如SEQ ID No.1所示，siRNA的核苷酸序列如SEQID No.2或SEQ ID No.3(反义RNA序列)所示。
进一步地，在步骤(4)中，靶向穿透肽BR2-SH与磷脂-聚乙二醇-马来酰亚胺与的摩尔比为1:20-30。
进一步地，在步骤(4)中，siRNA与载药功能化碳纳米管的N/P比为1-30:1。
进一步地，在步骤(4)中，葡萄糖水溶液中葡萄糖的质量分数为3-5％。
本发明还提供了上述制备方法所制备的化药/基因共转运功能化碳纳米管在制备治疗肿瘤靶向药物中的应用。
进一步地，上述制备方法所制备的化药/基因共转运功能化碳纳米管的直径为10-20nm，长度为150-250nm。
本发明首先通过迈克尔加成反应，将甜菜碱嫁接到PEI表面，合成PB聚合物单体，将聚合物单体以酰胺键的形式共价连接在酰氯化碳纳米管表面，然后通过物理吸附及π-π作用成功将具有芳环类结构的抗肿瘤药物、siRNA负载到功能化的单壁碳纳米管上，并将靶向穿透肽BR2-SH通过DSPE-PEG-Mal非共价修饰在碳纳米管的表面，使碳纳米管同时负载抗癌药物与siRNA，增加载体的分散性和生物相容性，具有较好的靶向作用。该制备方法操作简单可行可靠，原料易得。所得到的碳纳米管载体载药量高，药物、siRNA具有明显的pH响应性释放，且具有明显的肿瘤细胞靶向能力，体内外抗肿瘤效果好，为化药/基因共转运靶向纳米载体的研究提供了理论依据。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
(1)本发明将甜菜碱嫁接到PEI表面，合成新型PB聚合物单体；与PEI相比，PB聚合物单体中的PEI正电荷得到中和，降低了PEI的毒性；同时PB聚合物单体可在溶酶体酸性环境中吸收H+，使其渗透压快速增高破裂，加速溶酶体的逃逸速度，使载体具有肿瘤pH微环境响应性溶酶体逃逸能力。
(2)本发明将PB聚合物以酰胺键的形式共价连接在酰氯化单壁碳纳米管的表面，制备PB聚合物修饰的碳纳米管(以下简称SPB)；该载体不仅能够提高SWCNTs的分散性，并利用其巨大比表面积，将结构中存在芳环的抗肿瘤药物通过π-π键的相互作用吸附于SPB的内腔或表面，使其具有较高的载药量。
(3)采用一种新型靶向穿透肽BR2-SH，通过DSPE-PEG-Mal非共价连接在负载了药物的SPB表面，同时将siRNA静电吸附在SPB表面，形成化药/基因共转运靶向纳米载体。
(4)本发明首次公开了肿瘤微环境响应性化药/基因共转运功能化碳纳米管，其在水中分散性较好，生物相容性好，药物负载能力高；并且该递药系统具有pH敏感性，抗肿瘤效果好，具有明显的肿瘤细胞靶向能力和控制药物、基因释放的能力。
(5)本发明公开的肿瘤微环境响应性化药/基因共转运功能化碳纳米中，PB改善了碳纳米管的分散性和生物相容性；同时使得递药系统具有pH响应性，将药物及基因同时递送至肿瘤细胞中，提高肿瘤胞内的有效药物浓度，改善药物及基因的治疗效果。
(6)本发明制备的肿瘤微环境响应性化药/基因共转运功能化碳纳米管利用强的穿透细胞的能力和主动靶向性将药物与基因带入癌细胞中，在溶酶体酸性环境中吸收H十，使其渗透压快速增高破裂，加速溶酶体的逃逸速度，使载体具有肿瘤pH微环境响应性溶酶体逃逸能力，使药物与基因在肿瘤组织浓度增加，提高了载体向肿瘤细胞内的特异性转运和胞内药物的高浓度释放，增加了体内外的抗肿瘤作用，从而提高药物及基因的治疗效果，并能减少对正常组织的毒性。
(7)本发明公开的制备方法操作简单、制备条件温和，产物易得、可靠，后处理简单，适合工业化生产。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1是实施例1中单壁碳纳米管，氧化单壁碳纳米管，PB聚合物修饰的功能化碳纳米管和PEI修饰的功能化碳纳米管的红外谱图；
图2是实施例1中单壁碳纳米管，氧化单壁碳纳米管，PB聚合物修饰的功能化碳纳米管和PEI修饰的功能化碳纳米管的热重分析图；
图3为实施例2中功能化碳纳米管对A549和293T细胞毒性结果图；
图4为实施例4中负载DOX和siRNA的功能化SWCNTs在A549细胞中的摄取结果；
图5图示了实施例4中负载DOX和siRNA的功能化SWCNTs共定位结果；
图6为实施例5中肿瘤微环境影响性化药/基因共转运载体在裸鼠体内的抗肿瘤试验结果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1 PB聚合物修饰的碳纳米管
(1)称取DMAPAA(二甲胺基丙基丙烯酰胺)，加入无水丙酮溶液溶解，后转移至干燥的圆底烧瓶中。再称取1,3-丙磺酸内酯，加入无水丙酮溶液溶解至澄清，半小时内逐滴加入到上述烧瓶中，并不断搅拌，室温反应16h。将反应产生的白色沉淀用丙酮冲洗过滤，35℃下真空干燥后即得到甜菜碱(Betaines)。
(2)在氮气保护下向反应瓶中加入分子量为25KDa的PEI，并加入甲醇溶解至澄清，将步骤(1)合成好的Betaines加入反应瓶中，室温搅拌反应3天后，采用透析袋(MWCO＝3500)在去离子水中进行透析，每12小时更换一次双蒸水，透析两天后，将透析袋中液体收集并冷冻干燥，即得PB聚合物单体。
(3)将长度为1-5μm的单壁碳纳米管加入强酸混合溶液中(98％H2SO4和65％HNO3体积比为1:1)，超声分散30min，80℃油浴中机械搅拌下冷凝回流8h，反应结束后冷却静置一段时间，去除上层酸液并用蒸馏水稀释，经0.22μm混合纤维素滤膜真空抽滤，滤饼用大量去离子水洗涤至滤液pH值为中性，50℃下真空干燥，得到截短的氧化单壁碳纳米管(O-SWCNTs)；取干燥的O-SWCNTs，放入圆底烧瓶中，加入无水DMF和SOCl2，60℃条件下剧烈搅拌反应24h，得到的产物15000r/min高速离心15min，弃去棕红色上清液，沉淀用无水THF洗涤3次，洗涤后的固体粉末置于真空干燥箱中60℃干燥12h，得到酰氯化的SWCNTs(SWCNTs-COCl)。
(4)将SWCNTs-COCl加入无水DMF中，超声分散均匀后，加入步骤(2)合成好的PB聚合物单体，在氮气保护下，在80℃条件下超声反应24h。得到的反应液15000r/min高速离心15min。弃去上清液，沉淀用去离子水洗涤3次，洗涤后置于真空干燥箱中40℃干燥12h，得到PB聚合物修饰的功能化碳纳米管(SWCNTs-PEI-Betaines，SPB)。
图1为上述单壁碳纳米管，氧化单壁碳纳米管(O-SWCNTs)，PB聚合物修饰的功能化碳纳米管(SPB)和作为对照的PEI修饰的功能化碳纳米管的(SP)红外谱图，从红外图谱中可看出，PB以酰胺共价键的形式连接在单壁碳纳米管上。
图2为上述O-SWCNTs，SPB和SP的热重分析结果，热重分析图谱表明PB及PEI以酰胺共价键的形式部分连接在单壁碳纳米管上。
实施例2 功能化碳纳米管的安全性评价
采用WST-1试剂盒对细胞存活率进行检测。将对数生长期的A549细胞和293T细胞，按8×104个/mL接种于96孔板，每孔100μL，调零孔中加入相同体积的PBS，孵育24h。细胞长满后吸出培养基，分别加入含有不同浓度(3.125、6.25、12.5、25、50、100μg/mL)SWCNTs、O-SWCNTs、SP和SPB的培养基，每孔100μL。空白对照组加入等体积的不含SWCNT的培养基，培养箱中孵育24h和48h后，吸取孔中培养基，用PBS(pH 7.4)冲洗两遍，每孔加入100μL培养基，再每孔加入10μL WST-1溶液，在细胞培养箱内继续孵育2h，置于微型振荡器振荡10min，用酶联免疫检测仪分别于450nm和630nm处测定其吸光度值。实验重复3次。作为对照的未加入样品的细胞存活率定位100％，加入WST-1试剂(无细胞)的孔被用来校准分光光度计，定义为零吸光度。
计算各组吸光度值平均值，根据下列公式计算细胞存活率。
OD＝OD450nm-OD630nm
图3为A549和293T细胞经功能化碳纳米管处理24h和48h后的细胞存活率图，其中，人肾上皮细胞系293T细胞模拟正常细胞，人肺腺癌细胞A549模拟肿瘤细胞分别进行了细胞毒性实验。图3A代表采用A549细胞处理24h后的结果，图3B代表A549细胞处理48h后的结果，图3C代表293T细胞处理24h后的结果，图3D代表293T细胞处理48h后的结果。图3表明，经混酸处理后，O-SWCNTs的安全性得到了显著改善。与SP载体相比，SPB的生物安全性显著提高，说明PB共价修饰在SWCNTs表面后，能显著改善生物安全性。当载体浓度为100μg/mL时，SPB的细胞存活率在80％以上，且两种细胞株之间无显著性差异。上述结果表明，PB修饰的SWCNTs在浓度100μg/mL以内对293T细胞和A549细胞无明显毒性，具有良好的生物安全性。
实施例3 化药/基因共转运功能化碳纳米管的制备
(1)将抗癌药物(DOX)溶解在PBS缓冲液中，再将实施例1制备的SPB固体加入pH＝7.4的PBS缓冲液。将上述溶液用细胞粉碎机进行超声直至SPB均匀分散在溶液中，再加入到抗癌药物溶液中，抗癌药物DOX与SPB的质量比为3:1，室温下磁力搅拌反应16h。所得产物离心10min，收集上清液体，加入PBS缓冲液，重复离心多次，直至上清液体为无色，得到载药功能化碳纳米管。
(2)将载药功能化碳纳米管粉末，加入5％的葡萄糖溶液，放入超声波细胞粉碎机中超声30min，得到黑色液体，然后向黑色液体中加入100μl浓度为1mg/mL的DSPE-PEG2000-Mal水溶液，涡旋15min。在步骤(1)制备的载药功能化碳纳米管的溶液中加入浓度为1mg/mL的BR2-SH水溶液)，其中，BR2与DSPE-PEG2000-Mal的摩尔比为1:20，涡旋5min，室温恒温震荡12h，靶向载药功能化碳纳米管成功构建。取20μl的siRNA与载体进行混合，siRNA与SPB的N/P比为25:1，涡旋5min，室温静置30min后孵育完毕，即肿瘤微环境响应性化药/基因共转运功能化碳纳米管(DOX-SPBB-siRNA)。靶向穿透肽BR2-SH的氨基酸序列表如SEQ ID No.1所示，siRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.2或SEQ ID No.3(反义RNA序列)所示。
实施例4 化药与siRNA在肿瘤细胞内的共摄取
(1)细胞培养：人肺腺癌细胞株A549培养于含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基中，常规添加1％青霉素-链霉素，培养箱温度保持在37℃，CO2浓度保持为5％。每日倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况，对增殖状况良好的细胞用0.25％的胰酶消化并传代，待稳定后开始实验。
(2)负载DOX和siRNA的功能化SWCNTs在A549细胞中的摄取：将A549细胞按1×105个/mL浓度铺于6孔板，培养24h(37℃，5％CO2)。给药前弃去旧培养基，每孔加入2mL含有各组药物的新鲜无血清培养基，轻轻摇匀，继续培养6h(37℃，5％CO2)，弃培养基。转染后的细胞经胰酶消化收集，PBS洗3次，用流式细胞仪检测细胞对DOX及siRNA的摄取率。为了比较DOX和siRNA共转运效果，分别考察单独负载DOX(DOX-SPBB-siRNA)、单独负载siRNA(SPBB-siRNA)和共负载siRNA和DOX的SPBB(DOX-SPBB-siRNA)(实施例3中最终产物)在A549细胞中的摄取情况。流式细胞定量分析的结果如附图4，A图为DOX和siRNA在A549细胞中共摄取比较，各组给药情况分别为DOX-SPBB(图4A(a))、SPBB-siRNA(图4A(b))和DOX-SPBB-siRNA(图4A(c)、图4A(d))。B图所示的是不同功能化碳纳米管在A549细胞中摄取的定量分析，从图中所示A549细胞对DOX-SPBB中DOX的摄取高达95％；对SPBB-siRNA中siRNA的摄取高达93％；在共转运DOX-SPBB-siRNA载体中DOX的摄取为99％，与单独负载组相当，而siRNA的摄取为69％。以上说明构建的化药/基因共转运功能化碳纳米管能将化药与siRNA同时递送至细胞内发挥作用。
(3)负载DOX和siRNA的功能化SWCNTs在A549细胞内的定位：将A549细胞按1×105个/mL浓度铺于6孔板，培养24h(37℃，5％CO2)。给药前弃去旧培养基，每孔加入2mL含有DOX-SPBB-siRNA药物的新鲜无血清培养基，轻轻摇匀，继续培养6h(37℃，5％CO2)，弃培养基。转染后的细胞用PBS洗3次，加入Hoechst 33342(10μg/mL)染核，37℃孵育15min，PBS洗3次，加入固定液室温固定20min，PBS洗3次，50％甘油封片，通过共聚焦显微镜观察细胞中siRNA和DOX在细胞内的共定位情况。结果如附图5，Hoechst 33342下的两幅图代表细胞核，显蓝色荧光，DOX下的两幅图代表化药在细胞内的分布情况，显红色荧光，FAM-siRNA下的两幅图代表基因在细胞内的分布情况，显绿色荧光，Merge代表化药与基因在细胞内的共定位。从图中可以看出，2h时红色荧光信号和绿色荧光信号很弱，主要分布在细胞核周围。随着时间的延长，4h时二者信号强度显著增强，重叠之后呈棕黄色荧光。且红色信号开始向细胞核中迁移，绿色信号主要分布在细胞核周围。说明功能化修饰的SPBB载体能够有效递送DOX和siRNA于细胞内，并在胞浆中与DOX、siRNA分离，siRNA分布在细胞胞浆中，DOX逐渐向细胞核中迁移。DOX-SPBB-siRNA为化疗药物和基因药物共同发挥作用创造了有利条件。
实施例5 体内抗肿瘤活性的检测
(1)荷瘤裸鼠模型的建立：健康雌性Balb/c裸鼠24只，体重18-20g，4-6周龄裸鼠分笼饲养，自由饮食，于SPF环境下饲养。取对数生长期人非小细胞肺癌A549细胞，加一定的PBS将离心后的细胞吹散成细胞悬液，悬液的浓度调整为5×107cells/mL。在4-6周龄的Balb/c裸鼠的右上腋窝处皮下注射200μL细胞悬液，共接种Balb/c裸鼠24只。接种后Balb/c裸鼠饲养于SPF环境中；
(2)抗肿瘤试验：接种2-3周后裸鼠的肿瘤形成，待皮下瘤组织长至50-80mm3大小时入组进行实验。随机选取24只荷瘤裸鼠分为4组，每组分别依次为生理盐水空白组(NS组)、SPBB-siRNA组、DOX-SPBB组和DOX-SPBB-siRNA组。尾静脉每隔两天分别注射4组药物，siRNA的给药浓度为2mg/kg，DOX的给药浓度为5mg/kg。对照组注射等体积的生理盐水。治疗当天开始隔日用游标卡尺测量裸鼠肿瘤最长直径A和最短直径B，称体重，直到第10天结束试验。按下列公式计算肿瘤体积：V＝A×B2×0.5，根据测量的结果计算出相对肿瘤体积(relative tumor volume，RTV)，计算公式为：RTV＝Vd/V0，其中Vd为给药后测量所得肿瘤体积，V0为第0天时测量所得肿瘤体积。肿瘤抑制率计算公式：抑瘤率＝(对照组平均肿瘤体积-实验组组平均肿瘤体积)/对照组平均肿瘤体积×100％。根据测得肿瘤体积分别绘制肿瘤体积变化曲线，见附图6。从附图6可以发现NS组肿瘤生长较快，而SPBB-siRNA、DOX-SPBB和DOX-SPBB-siRNA给药组肿瘤生长得到抑制，各给药组的抑瘤率分别为14.48％、48.31％和69.22％。在给药10天时，NS组的RTV为6.01±2.05，SPBB-siRNA、DOX-SPBB和DOX-SPBB-siRNA组的RTV分别为5.14±1.15(P＝0.3868vs NS)，3.11±0.85(P＝0.0095vsNS)，1.85±0.39(P＝0.0006vs NS)。DOX-SPBB组、DOX-SPBB-siRNA组均可明显抑制肿瘤的生长，而SPBB-siRNA组抑瘤效果不明显。说明共转运载体SPBB能将DOX及siRNA运输至肿瘤组织中，发挥联合效应，达到抑制肿瘤增长的作用。
本发明制备了负载DOX和siRNA共转运靶向纳米载体，该共转运靶向纳米载体进入肿瘤细胞后，能在溶酶体的酸性环境中吸收H+，使其渗透压快速增高破裂，加速溶酶体的逃逸速度，从而使基因及化药物蓄积在肿瘤组织中，达到杀伤肿瘤细胞，提高了药物治疗效果的作用。对给药10天后各组的裸鼠的脏器和肿瘤组织进行切片观察。与NS组比较，各种心脏结构正常，心肌纤维及心肌细胞未见明显病理改变；肝脏结构正常，肝小叶结构清晰，肝细胞形态正常，中央静脉及汇管区无异常；肾小球分布正常；脾脏未见明显的病理损伤。这说明在此治疗方案下未产生明显的毒性。在肿瘤组织中，NS组和SPBB-siRNA组的肿瘤细胞边界明显，染色清晰，两者无显著性差异，而DOX-SPBB、DOX-SPBB-siRNA组肿瘤组织发生了不同程度的细胞破碎和细胞碎片，其中DOX-SPBB-siRNA组细胞破碎明显，产生明显的空洞现象。说明负载siRNA和DOX的共转运载体DOX-SPBB-siRNA能够显著增强抑瘤效果，具有协同作用。
本发明属于医药技术领域，具体涉及肿瘤微环境响应性化药/基因共转运功能化碳纳米管的制备方法。本发明通过迈克尔加成反应，将甜菜碱单体(Betaines)嫁接到PEI表面，合成新型PEI-Betaines(PB)聚合物单体，接着将PB聚合物单体以酰胺键的形式共价连接在酰氯化单壁碳纳米管的表面，制备SPB。该载体不仅能够提高SWCNTs的分散性，并利用其巨大比表面积，将抗肿瘤药物通过π-π键的相互作用吸附于SPB的内腔或表面，使其具有较高的载药量，最后采用一种新型靶向穿透肽BR2-SH，通过DSPE-PEG2000-Mal非共价连接在DOX-SPB表面，同时将siRNA静电吸附在其表面，形成化药/基因共转运纳米载体。制备的共转运的功能化碳纳米管同时负载化药与基因，促进药物及基因在低pH的肿瘤细胞环境中的释放，使药物在肿瘤组织浓度增加，杀伤肿瘤细胞，增加抗肿瘤效果，降低毒副作用。本发明公开的制备方法操作简单、制备条件温和，产物易得、可靠，后处理简单，适合工业化生产。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
<110> 苏州大学
<120> 化药/基因共转运功能化碳纳米管的制备方法及应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 17
<212> PRT
<213> 氨基酸序列
<400> 1
Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Leu Leu Arg Arg Leu
5 10 15
Leu Arg
17
<210> 2
<211> 21
<212> PRT
<213> 核苷酸序列
<400> 2
GAAGCAGUUU GAAGAAUUAT T 21
<210> 3
<211> 21
<212> PRT
<213> 核苷酸序列
<400> 3
UAAUUCUUCA AACUGCUUCT T 21

Claims (10)

1.一种化药/基因共转运功能化碳纳米管的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将甜菜碱与聚乙烯亚胺在有机溶剂中于20-40℃下搅拌反应，透析后得到聚合物单体；
(2)将表面酰氯化的碳纳米管在保护气氛下，在有机溶剂中与步骤(1)得到的所述聚合物单体于60-85℃下反应，得到聚合物修饰的碳纳米管；
(3)将抗癌药物与步骤(2)得到的所述聚合物修饰的碳纳米管在pH为6.0-8.0的缓冲溶液中混匀，搅拌12-24h，得到载药功能化碳纳米管；
(4)将步骤(3)得到的所述载药功能化碳纳米管、磷脂-聚乙二醇-马来酰亚胺、靶向穿透肽BR2-SH以及siRNA在葡萄糖水溶液中混匀，在30-40℃下进行孵育，得到所述化药/基因共转运功能化碳纳米管。
2.根据权利要求1所述的化药/基因共转运功能化碳纳米管的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述表面酰氯化的碳纳米管的制备方法包括以下步骤：
(S1)将碳纳米管在浓硫酸和浓硝酸混匀后，在60-85℃下搅拌4-8h，得到氧化碳纳米管；
(S2)将所述氧化碳纳米管、N,N-二甲基甲酰胺和氯化亚砜混合均匀，在50-70℃下搅拌反应16-32h，得到所述表面酰氯化的碳纳米管。
3.根据权利要求1所述的化药/基因共转运功能化碳纳米管的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述聚乙烯亚胺的分子量为10-30KDa。
4.根据权利要求1所述的化药/基因共转运功能化碳纳米管的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述聚乙烯亚胺与甜菜碱的摩尔比为1:80-120。
5.根据权利要求1所述的化药/基因共转运功能化碳纳米管的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述表面酰氯化的碳纳米管与聚合物单体的质量比为1:10-30。
6.根据权利要求1所述的化药/基因共转运功能化碳纳米管的制备方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述抗癌药物为多西紫杉醇、紫杉醇、阿霉素和柔红霉素中的一种或几种。
7.根据权利要求1所述的化药/基因共转运功能化碳纳米管的制备方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述聚合物修饰的碳纳米管与抗癌药物的质量比为1:1-5。
8.根据权利要求1所述的化药/基因共转运功能化碳纳米管的制备方法，其特征在于：在步骤(4)中，所述靶向穿透肽BR2-SH与磷脂-聚乙二醇-马来酰亚胺的摩尔比为1:10-30。
9.根据权利要求1所述的化药/基因共转运功能化碳纳米管的制备方法，其特征在于：在步骤(4)中，所述siRNA与载药功能化碳纳米管的N/P比为1-30:1。
10.根据权利要求1-9中任一项制备方法所制备的化药/基因共转运功能化碳纳米管在制备治疗肿瘤靶向药物中的应用。
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