CN104910252A - 一种基于树状分子的pH响应型脂质及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于树状分子的pH响应型脂质及其制备方法与应用，属于生物材料领域。本发明所涉及的pH响应型脂质在不同的pH环境下，其表面电荷有所不同。具体表现为在体内生理环境中呈现负电、中性或微正电，使之能够拥有良好的生物相容性，而在到达肿瘤组织处能够利用肿瘤组织与正常组织之间或肿瘤细胞内外的pH差异，逐渐暴露氨基而发生更多正电荷暴露或实现电荷翻转，完成正电性载体与负电性细胞膜接触，从而促进细胞内吞的过程。在细胞溶酶体中，阳离子载体继续发挥质子海绵作用或溶酶体膜裂解作用，逃出溶酶体。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学材料领域，特别涉及一种基于树状分子的pH响应型脂质及其制备方法与应用。
技术背景
越来越多与基因相关的疾病被认为是可以利用基因治疗的方法治愈，这些疗法通常需要将核酸药物递送到靶细胞，从而对一些肿瘤、哮喘和心血管疾病进行治疗。但是迄今为止，限制基因药物投放临床试验的瓶颈一直是安全有效的载体的研发。鉴于病毒载体的高免疫原性，非病毒载体成为了研究的热门。然而非病毒载体往往难以获得很高的体内外转染效率，为了提高非病毒载体的转染能力，就需要让非病毒载体获得如病毒一样的对复杂的机体环境进行响应的能力。然而，目前能够很好地模拟病毒载体，能够对复杂的机体环境进行响应的非病毒载体的研究还处在初步研究阶段，相应的载体材料还有待进一步的开发。
发明内容
研究表明，肿瘤环境与正常组织环境是有着一定差异的，例如pH、氧化还原物质浓度、酶的种类与数量、温度等。所以现在人们利用这种差异设计出多种单一响应式的载体系统，比如酶响应、温度响应、pH响应或还原响应等。
研究证明，正常组织中其体液pH为7.4即正常生理环境，而在肿瘤组织中由于肿瘤组织的供氧不足而产生乳酸和三磷酸腺苷(ATP)水解的产物，导致肿瘤组织pH值降低至6.8。继而载体颗粒进入细胞形成内涵体，随着细胞质中的氢离子被泵入使得纳米粒所在微环境的pH值进一步降低(<5.5)。普通的基因载体在这种转染环境中会无法避免DNA在酸性条件下发生降解，降低了转染效率。而利用这种转染过程中所遇到的阶梯式pH下降所设计的多重刺激响应型的病毒载体，可以智能化的增加细胞对基因的吞噬能力和从溶酶体的逃逸能力，大大加强了基因到达肿瘤细胞核的概率。
现在最常用的阳离子脂质载体中通常都含有各种阳离子磷脂成分，如DOGS、DOSPA等。这些磷脂成分在释放DNA后，由于降解缓慢会极大的地损伤细胞器而造成很高的细胞毒性。此外，过高的正电荷也会因吸附过多的非特异性血浆蛋白而导致转染效率在有血清条件下或在体内条件下急剧下降。将机体自有的氨基酸和易降解的酰胺键加入脂质中增加了载体的生物降解性，而制备出的表面电荷为负的脂质体也有效降低了传统脂质体的毒性。
基于上述研究分析，本发明提供了一种基于树状分子的pH响应型脂质及其制备方法及其在基因载体或药物载体中的应用，采用本发明所述的pH响应型脂质材料制备的基因载体或药物载体能够利用输送过程中体内微环境中的pH差异，达到有效快速传递基因或药物的效果。
本发明通过以下技术方案来实现：
一种基于树状分子的pH响应型脂质材料，所述脂质材料的主体为外围含氨基和\或胍基的树状分子，所述树状分子的一端连接有疏水基团，另一端连接有多个具有pH响应功能的亲水性基团，所述具有pH响应功能的亲水性基团为与所述树状分子末端的氨基或胍基相连的A类基团或B类基团中的至少一种，其中A类基团在环境pH为6.8以下时能够断裂脱落，B类基团在环境pH为5.5以下时能够断裂脱落。
在上述pH响应型脂质材料中同时含有疏水基团和亲水性基团为两亲性分子，有利于形成自组装体便于在应用中对药物或基因等进行包裹。所述的A类基团或B类基团具有负电性，对树状分子外围的氨基和\或胍基的正电荷具有屏蔽作用，使所述脂质材料整体带负电荷，能够形成具有较高负电荷的自组装体，可与不同的药物或阳离子基因载体、基因一起组成负电性的、中性的或微正电的具有pH响应能力的复合物，该复合物可以在肿瘤组织外正常pH环境下保持稳定，不会与体内负电性物质发生聚合，同时还可以保护DNA不被血清中的脱氧核糖核酸酶(DNase)降解，从而可以在体内进行长时间循环。同时，所述A类基团或B类基团具有pH敏感特性，能够在一定的酸性条件下断裂脱落，当环境pH在6.8以下时(如肿瘤组织处)，A类基团断裂脱落，使得三元复合物发生电荷翻转或者正电荷增多，利于与负电的细胞膜发生吸附作用，从而更好地被细胞内吞，增强了载体入胞能力。而内吞入胞后，当环境pH在5.5以下时(所形成的细胞溶酶体的微环境)，B类基团发生断裂，暴露更多的氨基，使得质子缓冲能力和破坏溶酶体膜的能力增加，达到加速从溶酶体中逃逸的效果。采用pH响应机制，使得载体具有类似病毒随着环境的变化而完成入胞、逃逸等过程，可以提高基因运输的效率，并远优于非响应性基因载体。
作为可选方式，在上述pH响应型脂质材料中，所述A类基团为(二甲基马来酸酐基团)，B类基团为 中的至少一种。
作为可选方式，在上述pH响应型脂质材料中，具有pH响应功能的亲水性基团只含有A类基团。所述脂质材料具有一重pH响应特性。当此类组装体进入体内，同样具有屏蔽体内负电性物质干扰和保护DNA的作用。只含有能够在pH 6.8断裂的pH敏感型基团的复合物在进入肿瘤组织后发生电荷翻转或者正电荷增多，获得更强的入胞能力，从而有利于药物或基因的传递。
作为可选方式，在上述pH响应型脂质材料中，具有pH响应功能的亲水性基团只含有B类基团。所述脂质材料具有一重pH响应特性。当此类组装体进入体内，同样具有屏蔽体内负电性物质干扰和保护DNA的作用。只含有能够在pH 5.5断裂的pH敏感型基团的复合物在进入细胞后，才发生电荷翻转或者正电荷增多，增强传递系统破坏溶酶体膜的能力，阻碍了溶酶体酶对DNA的降解，从而实现基因的高表达或药物的有效释放。
作为可选方式，在上述pH响应型脂质材料中，单个脂质分子结构中同时含有A类基团和B类基团，所述脂质材料具有多重pH响应特性。
作为可选方式，在上述pH响应型脂质材料中，所述脂质材料为只含A类基团的脂质与只含B类基团的脂质的混合物，所述脂质材料具有多重pH响应特性。进一步的，所述脂质材料是由两种类型的pH响应型脂质(分别含A类基团和B类基团)按不同同比例混合后制备成混合自组装体。所述自组装体的制备可采用溶剂注入法或薄膜超声法等常用的自组装体制备方法(具体方法可参见《现代药物制剂技术丛书——脂质体技术》，邓杰英主编，人民卫生出版社2007年出版)。
作为可选方式，在上述pH响应型脂质材料中，所述pH响应型脂质分子结构中50％以上的氨基上修饰pH响应型基团。足够高的接枝率才有利于保证所述脂质材料具有较高的电负性。
作为可选方式，在上述pH响应型脂质材料中，所述疏水基团为饱和或不饱和烃基或胆固醇衍生物。本发明中的烃基是指含碳、氢两种原子的官能团，可以看作是相应的烃失去一个氢原子(H)后剩下的自由基。优选为烷基、烯基，芳香基、更优选为C10-C20的烷基、C10-C20的烯基、含有芳香基的氨基酸衍生物。
作为可选方式，在上述pH响应型脂质材料中，可以选择具有多官能度的分子作为桥接单元来将疏水基团连接到树状分子的一端，可选用肽键连接，也可选用其他的连接方式代替肽键连接，也可以不使用桥接单元而将疏水基团直接连接到树状分子的一端。总之，以使树状分子的一端局部疏水性为目的，具体的连接方式可灵活选择。
作为可选方式，在上述pH响应型脂质材料中，所述疏水基团依靠谷氨酸通过肽键连接到树状分子的一端。谷氨酸中的氨基可与树状分子中的羧基缩合形成肽键，而谷氨酸另一端的两个羧基可分别连接疏水基团，从而使所述脂质材料具有两条疏水链，更有利于实现自组装。该可选方式旨在提供一种在树状分子的一端连接疏水基团的具体示例，本领域技术人员在本发明的总体构思下，可以选择其他具有多官能度的分子作为桥接单元来将疏水基团连接到树状分子的一端，可选用具有2个相同氨基或者羧基的氨基酸(如谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、鸟氨酸)，也可选用其他的连接方式代替肽键连接，也可以不使用桥接单元而将疏水基团直接连接到树状分子的一端。总之，以使树状分子的一端局部疏水性为目的，具体的连接方式可灵活选择。
作为可选方式，在上述pH响应型脂质材料中，所述树状分子为球形树状分子或扇形树状分子，优选扇形树状分子。采用扇形树状分子时，在其核心接枝疏水基团即可，在接枝较短的疏水链段的情况下就容易获得较好的自组装特性。
作为可选方式，在上述pH响应型脂质材料中，所述树状分子为二代以上的肽类树状分子，其重复单元为官能度大于等于3的氨基酸。更高代数的树状分子有利于提供更多的官能团，有利于接枝更多的具有pH响应功能的亲水性基团，有利于提高材料的pH响应能力和电负性。进一步的，所述树状分子的重复单元为赖氨酸、精氨酸或组氨酸中的至少一种，采用这类氨基酸作为重复单元，所得的树状分子外围本身就具备大量的氨基或胍基，无需进行进一步的接枝改性，可直接与具有pH响应功能的亲水性基团连接。
作为可选方式，所述的基于树状分子的pH响应型脂质材料的结构式如下：
……(式1)，
其中，K为树状分子的重复单元(不同代数间的重复单元可以相同也可以不同)，G1和Gn分别表示一代和n代树状分子，n为2或3或4或5，R1为具有pH响应功能的亲水性基团，R2为疏水基团。
作为可选方式，所述的基于树状分子的pH响应型脂质材料的结构式为：
……(式2)
……(式3)
其中，R1为具有pH响应功能的亲水性基团，R2为疏水基团。
作为可选方式，脂质为白色至黄色或者红棕色粉末，易溶于甲醇，可以在水中可自行组装成纳米尺寸的脂质体或胶束或囊泡。
本发明还提供了一种制备上述的基于树状分子的pH响应型脂质材料的方法，所述方法包括外围含氨基和\或胍基的树状分子的制备；在所述树状分子的一端接枝疏水基团；在所述树状分子外围的氨基和\或胍基上接枝具有pH响应功能的亲水性基团。
作为可选方式，所述外围含氨基和\或胍基的树状分子的制备步骤中，所述树状分子可以采用发散法或收敛法或发散-收敛相结合的方法合成，也可以采用市售的树状分子，然后根据需要对树状分子进行端基改性在其外围接枝大量氨基和\或胍基。当选择赖氨酸或精氨酸或组氨酸作为树状分子的重复单元时，则无需进行上述端基改性步骤。
作为可选方式，在所述树状分子的一端接枝疏水基团的步骤可以通过化学键直接将疏水基团连接在树状分子的一端，也可以采用具有多官能度的分子作为桥接单元来将疏水基团连接到树状分子的一端，如采用谷氨酸通过肽键连接到树状分子的一端。谷氨酸中的氨基可与树状分子中的羧基缩合形成肽键，而谷氨酸另一端的两个羧基可分别连接疏水基团，从而使所述脂质材料具有两条疏水链，更有利于实现自组装。
作为可选方式，所述pH响应功能基团接枝步骤具体包括：将外围含氨基和\或胍基的树状分子，在氮气的保护下溶于无水的吡啶，在冰水浴中加入无水三乙胺(无水的吡啶与无水三乙胺的体积比为1:0.1～10，优选为1:1)，搅拌混匀，然后加入与A类基团或B类基团对应的酸酐室温或加热搅拌反应，对产物进行分离纯化。进一步的，所述分离纯化步骤具体为反应结束后，旋干有机溶剂，用甲醇将固体初产物重溶，在乙醚中沉淀，得到粉末状固体。
本发明还提供了一种上述的基于树状分子的pH响应型脂质材料的应用，将其用作药物载体或基因载体。
本发明还提供了一种复合药物包括上述脂质材料和药物有效成分，所述药物有效成分包裹在所述脂质材料组装成的脂质体或胶束或囊泡。所述药物载体可实现药物在肿瘤部位或肿瘤细胞中的靶向释放。所述药物可以是脂溶性或水溶性药物，优选脂溶性药物如阿霉素。
本发明还提供了一种基因载体系统，包括基因(如质粒DNA、RNA等)、阳离子载体和上述任意一种基于树状分子的pH响应型脂质材料，所述阳离子载体和基因复合形成二元复合物颗粒，所述pH响应型脂质材料通过静电作用结合到所述二元复合物外围，形成三元复合物。
作为可选方式，在上述基因载体系统中，所述阳离子载体为本发明中未经pH响应型基团修饰的阳离子脂质或或者商品化的阳离子聚合物，如聚乙烯亚胺、聚丙烯亚胺、精胺、聚赖氨酸、氨基酸多肽、聚酰胺-胺型树枝状高分子、肽类树状大分子、含有肽类树状大分子的阳离子材料及其衍生物中的至少一种。
作为可选方式，在上述基因载体系统中，所述基因为质粒DNA，是含报告基因或细胞因子基因或抑癌基因的真核重组表达质粒。
作为可选方式，在上述基因载体系统中，所述pH响应型脂质材料与基因的质量比例为0.1:1～50:1，所述阳离子载体与基因的质量比例为0.1:1～50:1。
作为可选方式，在上述基因载体系统中，所述pH响应型脂质材料由分别含A类基团和B类基团两种pH响应型组装体组成，两种pH响应型组装体的质量比例：0.1:1～10:1。
作为可选方式，在上述基因载体系统中，还含有脂溶性或水溶性药物。进一步的，所述药物可以包裹在所述pH响应型脂质材料形成的组装体中，而所述基因则被包裹在所述阳离子载体中，实现了药物在细胞内释放，而基因则被运输到细胞核附近才被释放，实现药物与基因的分阶段释放。
作为可选方式，在上述基因载体系统中，还含有磁性纳米颗粒。通过复合磁纳米颗粒还可以实现磁靶向。
作为可选方式，在上述基因载体系统中，还含有阳性/阴性显影剂，所述显影剂可以包裹在所述组装体中，而所述基因则被包裹在所述阳离子载体中，实现显影剂聚集在肿瘤部位，而基因则被运输到细胞核附近才被释放，实现诊疗一体化。
本发明还提供了制备上述基因载体系统的方法，其具体步骤包括：
将质粒DNA溶于无菌的HBG缓冲溶液(4-羟乙基哌嗪乙磺酸20毫摩尔，5％葡萄糖)中，配制成0.1mg/mL的DNA溶液；将阳离子材料溶于HBG缓冲溶液中，配制成0.1～10mg/mL的溶液A；将上述任意一种pH响应型脂质材料用乙醇注入法或者薄膜超声法分别加入HBG缓冲溶液中，配制成0.1～10mg/mL的溶液B；或两种分别含A类基团和B类基团的pH响应型脂质材料用乙醇注入法或者薄膜超声法分别加入HBG缓冲溶液中，配制成0.1～10mg/mL的溶液B和C。
将上述步骤中得到的溶液A与DNA溶液混合，在室温下孵育20分钟后，得到二元复合物，再加入溶液B或按比例加入溶液B和C，在室温下孵育20分钟后，得到三元复合物。
本发明还提供了上述基因载体系统的应用：将其用于体外基因转染、肿瘤、哮喘或心血管疾病的基因治疗、基因与化学药物联合治疗、疾病诊疗一体化。
本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
本发明的有益效果：
1.本发明所公开的是一种具有一重或者多重pH响应型的基因载体，利用了电荷翻转的策略，更接近病毒载体的去屏蔽和解压缩过程，其基因转染效率明显优于其他非智能响应的传统基因载体。
2.本发明所公开的具有pH响应能力的组装体能够通过静电作用与表面带有正电荷的纳米尺度的二元基因复合物——阳离子材料与基因的复合物结合，形成表面具有很低正电荷或是负电荷的三元复合物。
3.本发明所公开的多重pH响应型组装体，因为能够具有屏蔽阳离子载体正电荷的作用，降低了阳离子载体的毒性及避免了血清蛋白引起的聚集，逃脱网状内皮系统的清除作用，从而减少阳离子聚合物的细胞毒性增强血清稳定性。同时，在载体系统到达肿瘤组织后，能够通过电荷翻转的作用，增强载体系统的入胞能力；而进入细胞后，更是能在溶酶体的低pH环境下暴露更多的伯氨基，从而通过“质子海绵效应”达到逃出溶酶体的目的，有利于提高转染效率。
4.本发明所公开的一重pH响应型基因传递系统在肿瘤的细胞外或者细胞内不同的pH条件下，通过分子化学结构的变化做出实时响应。这种pH响应能力可以使得基因载体系统具有在正常生理环境下保持稳定，保护基因的能力，而在一定的pH条件下，则或能增强细胞对载体系统的内吞；或能获得更强的质子海绵作用完成溶酶体逃逸从而实现了基因的高表达。
5.本发明所公开的基因载体系统的制备方法操作简单、便于大规模生产。
6.本发明所公开的基因载体系统，能够很方便地用于体内、外基因转染、肿瘤、哮喘和心血管疾病的基因治疗。
附图说明：
图1本发明所公开的pH响应型组装体在不同pH环境下表面电荷的变化。
图2本发明所公开的pH响应型组装体在不同pH环境下氨基暴露率。
图3本发明所公开的具有pH响应型组装体荷载pEGFP基因对HepG2细胞的转染效果。
图4本发明所公开的具有pH响应型组装体对HepG2细胞转染后的细胞存活率。
图5本发明所公开的具有pH响应型组装体荷载磁性纳米粒的透射电镜照片。
图6本发明所公开的具有pH响应型组装体荷载磁性纳米粒在小鼠体内的活体成像结果。
具体实施方式：
以下通过实施例的具体实施方式再对本发明的上述内容作进一步的详细说明。下面实例选用有与酸酐反应的二代赖氨酸或者精氨酸为头部的脂质体作为范例，本领域技术人员很容易将其推广到其他材料。应当理解，此处所描述的具体实例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。在不脱离本发明的精神和原则之内做的任何修改，以及根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的等同替换或者改进，均应包括在本发明的保护范围内。
实施例1
(1)采用发散法或收敛法或发散-收敛相结合的方法合成二代以上的树状分子(可参考公开号为CN 103554923A的专利文献所述的方法)，也可以采用市售的树状分子；
(2)对树状分子外围进行端基改性，在其外围接枝大量氨基和\或胍基。当选择赖氨酸或精氨酸或组氨酸作为树状分子的重复单元时，则无需进行上述端基改性步骤；
(3)对所得的外围含氨基和\或胍基的树状分子的外围官能团进行保护，仅裸露其一端的一个或两个官能团，然后通过该裸露的官能团在所述树状分子的一端接枝疏水基团；
(4)脱除树状分子外围的氨基和\或胍基的保护基团，然后在其上接枝A类基团或B类基团中的至少一种，得到pH响应型脂质材料。
作为可选方式，在上述步骤(3)中，可以通过化学键直接将疏水基团连接在树状分子的一端，也可以采用具有多官能度的分子作为桥接单元来将疏水基团连接到树状分子的一端，如采用谷氨酸通过肽键连接到树状分子的一端。
作为可选方式，所述A类基团为(二甲基马来酸酐基团)，B类基团为中的至少一种，在上述步骤(4)中，将外围含氨基和\或胍基的树状分子脱保护，在氮气的保护下溶于无水的吡啶，在冰水浴中加入无水三乙胺(两种溶液的体积比为1:10～10:1优选为1:1)，搅拌混匀，然后加入与上述A类基团或B类基团对应的酸酐室温或者加热搅拌反应(一般在室温下反应，在反应比较困难的情况下可适当加热)，对产物进行分离纯化。进一步的，所述分离纯化步骤具体为反应结束后，旋干有机溶剂，用甲醇将固体初产物重溶，在乙醚中沉淀，得到粉末状固体，即为pH响应型脂质材料。
通过上述方法，成功制得只含A类基团或只含B类基团或同时含有A类基团和B类基团的一系列pH响应型脂质材料。所得的任意一种pH响应型脂质材料在中性或碱性水溶液中可自组装形成纳米尺寸的脂质体或胶束或囊泡。当改变溶液的pH值至6.8或5.5以下时，所述自组装体发生解组装，证实了所述脂质材料具有pH响应特性。
将所得的任意一种pH响应型脂质材料与疏水性药物(如阿霉素)一起加入到中性或碱性水溶液中混匀，可自组装形成包裹药物纳米尺寸的脂质体或胶束或囊泡。得到脂质材料与药物的混合物。实验显示，所得药物混合物可在中性或碱性条件下稳定存在，将所得药物混合物干燥后重新分散于去离子水或pH7.4的磷酸缓冲溶液(PBS)中，浸提7天后所述去离子水或PBS中仍未见游离的疏水性药物。当改变溶液的pH值至6.8或5.5以下时，所得药物混合物可发生解组装，释放出其中包裹的疏水性药物。
实施例2
(1)将质粒DNA或RNA溶于无菌的HBG缓冲溶液(4-羟乙基哌嗪乙磺酸20毫摩尔，5％葡萄糖)中，配制成0.1mg/mL的基因溶液；将阳离子材料溶于HBG缓冲溶液中，配制成0.1～10mg/mL的溶液A；将实施例1中制备的任意一种pH响应型脂质材料分别加入HBG缓冲溶液中，配制成0.1～10mg/mL的溶液B；或将实施例1中制备的两种分别含A类基团和B类基团的pH响应型脂质材料用乙醇注入法分别加入HBG缓冲溶液中，配制成0.1～10mg/mL的溶液B和C。
(2)将上述步骤中得到的溶液A与基因溶液混合，在室温下孵育20分钟后，得到二元复合物，再加入溶液B或，按比例加入溶液B和C，在室温下孵育20分钟后，得到三元复合物。
作为可选，所述阳离子载体为本发明中未经pH响应型基团修饰的阳离子脂质或或者商品化的阳离子聚合物，本例分别采用聚乙烯亚胺、聚丙烯亚胺、精胺、聚赖氨酸、氨基酸多肽、聚酰胺-胺型树枝状高分子、肽类树状大分子、含有肽类树状大分子的阳离子材料及其衍生物作为阳离子材料均成功制得了三元复合物。
作为可选，所述pH响应型脂质材料与基因的质量比例为0.1:1～50:1，所述阳离子载体与基因的质量比例为0.1:1～50:1。
作为可选，所述步骤(2)中加入的溶液B和C中所含pH响应型组装体的质量比例：0.1:1～10:1。
作为可选，还可在上述步骤(2)中加入药物或磁性纳米粒子制得四元或五元化合物。
实验表明，所得基因载体可在中性或碱性条件下稳定存在，将所得基因载体干燥后重新分散于去离子水或pH7.4的磷酸缓冲溶液(PBS)中，浸提24小时后所述去离子水或PBS中仍未见游离的基因。当改变溶液的pH值至6.8或5.5以下时，所得基因载体可发生解组装，释放出其中包裹的阳离子载体和基因。
实施例3：柠康酸酐-二代赖氨酸-谷氨酸-正十一胺(CIT-Lys(G2)-Glu-UA2,CLG2C11)的制备
取1代和2代重复单元均为赖氨酸的扇形树状分子(二代氨基Pbf/Boc保护)，谷氨酸-正十一胺，缩合剂(如：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC，催化剂1-羟基苯并三唑(HOBt)、碱(N，N-二异丙基乙胺DIPEA)按照1:1:2:2:4的摩尔比，在0℃，氮气保护条件下，加入二氯甲烷溶剂，反应0.5小时；然后室温反应24小时，反应结束后，所得溶液依次用碳酸氢钠溶液、硫酸氢钠溶液和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥12小时，减压浓缩，以乙酸乙酯：石油醚＝1:1(体积比)做洗脱剂，柱层析分离得到带疏水尾部的树状分子(二代赖氨酸-谷氨酸-正十一胺)。
取上述带疏水尾部的树状分子1.2mmol，脱除二代氨基的Pbf/Boc保护，然后在氮气的保护下溶于无水的吡啶，在冰水浴中加入等量的无水三乙胺，搅拌30分钟。加入柠康酸酐(10mmol)，室温搅拌48h。反应结束后，旋干有机溶剂，用甲醇将固体初产物重溶，在乙醚中沉淀，得到红棕色粉末状固体，柠康酸酐-二代赖氨酸-谷氨酸-正十一胺(1.20g，0.79mmol，79％)。其核磁图谱分析结果如下：1H-NMR(CD2Cl2，400MHz，ppm)：0.85(t,6H,-CH2CH3),1.25-1.43(m,24H,-CH2CH2-(undecanoyl),-CHCH2CH2-(lysine)),1.53(q,6H,-NHCH2CH2-(lysine)),1.75(q,6H,-CHCH2CH2-(lysine)),2.05(s,4H,-CHCH2CH2-(glutamic)),2.98(t,2H,-NHCH-(glutamic)),3.16(t,8H,-NHCH-),3.34(s,12H,-CCH3),4.42(s,4H,-NHCH-),7.18(s，4H,-CCH-)。MS：[M+H+]＝1286。
所得的pH响应型脂质材料在中性或碱性水溶液中可自组装形成纳米尺寸的脂质体或胶束或囊泡。当改变溶液的pH值至5.5以下时，所述自组装体发生解组装，证实了所述脂质材料具有pH响应特性。
实施例4：丁二酸酐-二代精氨酸-谷氨酸-正十一胺(SA-Ays(G2)-Glu-UA2,SAG2C11)的制备
取1代重复单元为赖氨酸，2代重复单元为精氨酸的扇形树状分子，参照实施例3中所述的方法制备带疏水尾部的树状分子(二代精氨酸-谷氨酸-正十一胺)。
取上述带疏水尾部的树状分子(二代精氨酸-谷氨酸-正十一胺)1mmol，脱除二代氨基的Pbf/Boc，在氮气的保护下溶于无水的吡啶，在冰水浴中加入等量的无水三乙胺，搅拌30分钟。加入二甲基马来酸酐(10mmol)，室温搅拌48h。反应结束后，旋干有机溶剂，用甲醇将固体初产物重溶，在乙醚中沉淀，得到白色粉末状固体，丁二酸酐-二代精氨酸-谷氨酸-正十一胺(1.12g，0.86mmol，86％)。其核磁图谱分析结果如下：1H-NMR(CD2Cl2，400MHz，ppm)：0.85(t,6H,-CH2CH3),1.25-1.33(m,24H,-CH2CH2-(undecanoyl),-CHCH2CH2-(lysine)),1.55(q,6H,-NHCH2CH2-(lysine)),1.74(q,6H,-CHCH2CH2-(lysine)),2.05(s,4H,-CHCH2CH2-(glutamic)),2.45(16H,-CH2CH2-)，2.96(t,2H,-NHCH-(glutamic)),3.16(t,8H,-NHCH-),3.35(s,24H,-CCH3),4.44(s,4H,-NHCH-)。MS：[M+H+]＝1294。
所得的pH响应型脂质材料在中性或碱性水溶液中可自组装形成纳米尺寸的脂质体或胶束或囊泡。当改变溶液的pH值至5.5以下时，所述自组装体发生解组装，证实了所述脂质材料具有pH响应特性。
实施例5：柠康酸酐-二代赖氨酸-谷氨酸-油胺(CIT-Lys(G2)-Glu-OA2,CLG2C18)的制备
取1代和2代重复单元均为赖氨酸的扇形树状分子(二代氨基Pbf/Boc保护)，谷氨酸-油胺，缩合剂(如：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC，催化剂1-羟基苯并三唑(HOBt)、碱(N，N-二异丙基乙胺DIPEA)按照1:1:2:2:4的摩尔比，在0℃，氮气保护条件下，加入二氯甲烷溶剂，反应0.5小时；然后室温反应24小时，反应结束后，所得溶液依次用碳酸氢钠溶液、硫酸氢钠溶液和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥12小时，减压浓缩，以乙酸乙酯：石油醚＝1:1(体积比)做洗脱剂，柱层析分离得到带疏水尾部的树状分子(二代赖氨酸-谷氨酸-油胺)。
取上述带疏水尾部的树状分子(二代赖氨酸-谷氨酸-油胺)1mmol，脱除二代氨基的Pbf/Boc保护，在氮气的保护下溶于无水的吡啶，在冰水浴中加入等量的无水三乙胺，搅拌30分钟。加入柠康酸酐(1.12g，10mmol)，室温搅拌48h。反应结束后，旋干有机溶剂，用甲醇将固体初产物重溶，在乙醚中沉淀，得到红棕色粉末状固体，柠康酸酐-二代赖氨酸-谷氨酸-油胺(1.30g，0.87mmol，87％)。其核磁图谱分析结果如下：
1H-NMR(CD2Cl2，400MHz，ppm)：0.86(t,6H,-CH2CH3),1.25-1.33(m,60H,-CH2CH2-(stearyl),-CHCH2CH2-(lysine)),1.53(q,6H,-NHCH2CH2-(lysine)),1.77(q,6H,-CHCH2CH2-(lysine)),2.07(s,4H,-CHCH2CH2-(glutamic)),2.16(t,8H,-CH2CHCHCH2-),2.95(t,2H,-NHCH-(glutamic)),3.10(t,8H,-NHCH-),3.34(s,12H,-CCH3),4.22(s,4H,-NHCH-)。MS：[M+H+]＝1478。
所得的pH响应型脂质材料在中性或碱性水溶液中可自组装形成纳米尺寸的脂质体或胶束或囊泡。当改变溶液的pH值至5.5以下时，所述自组装体发生解组装，证实了所述脂质材料具有pH响应特性。
实施例6：二甲基马来酸酐-二代赖氨酸-谷氨酸-油胺(DMA-Lys(G2)-Glu-OA2,DLG2C18)的制备
取1代和2代重复单元均为赖氨酸的扇形树状分子，参照实施例4中所述的方法制备带疏水尾部的树状分子(二代赖氨酸-谷氨酸-油胺)。
取上述带疏水尾部的树状分子(二代赖氨酸-谷氨酸-油胺)1mmol，脱除二代氨基的Pbf/Boc，在氮气的保护下溶于无水的吡啶，在冰水浴中加入等量的无水三乙胺，搅拌30分钟。加入二甲基马来酸酐(1.26g，10mmol)，室温搅拌48h。反应结束后，旋干有机溶剂，用甲醇将固体初产物重溶，在乙醚中沉淀，得到黄色粉末状固体，二甲基马来酸酐-二代赖氨酸-谷氨酸-油胺(1.39g，0.90mmol，90％)。其核磁图谱分析结果如下：
1H-NMR(CD2Cl2，400MHz，ppm)：0.86(t,6H,-CH2CH3),1.24-1.33(m,60H,-CH2CH2-(stearyl),-CHCH2CH2-(lysine)),1.46(q,6H,-NHCH2CH2-(lysine)),1.75(q,6H,-CHCH2CH2-(lysine)),1.93(s,4H,-CHCH2CH2-(glutamic)),2.00(t,8H,-CH2CHCHCH2-),3.11(t,2H,-NHCH-(glutamic)),3.16(t,8H,-NHCH-),3.32(s,24H,-CCH3),4.41(s,4H,-NHCH-)。MS：[M+H+]＝1534。
所得的pH响应型脂质材料在中性或碱性水溶液中可自组装形成纳米尺寸的脂质体或胶束或囊泡。当改变溶液的pH值至6.8以下时，所述自组装体发生解组装，证实了所述脂质材料具有pH响应特性。
实施例7：六氢邻苯二甲酸酐基团-二代赖氨酸-胆固醇酰胺(HHPA-Lys(G2)-Glu-Chol,HLG2Chlo)的制备
取1代和2代重复单元均为赖氨酸的扇形树状分子(二代氨基Pbf/Boc保护)，胆固醇酰胺，缩合剂(如：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC，催化剂1-羟基苯并三唑(HOBt)、碱(N，N-二异丙基乙胺DIPEA)按照1:1:2:2:4的摩尔比，在0℃，氮气保护条件下，加入二氯甲烷溶剂，反应0.5小时；然后室温反应24小时，反应结束后，所得溶液依次用碳酸氢钠溶液、硫酸氢钠溶液和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥12小时，减压浓缩，以乙酸乙酯：石油醚＝1:1(体积比)做洗脱剂，柱层析分离得到带疏水尾部的树状分子(二代赖氨酸-胆固醇酰胺)。
取上述带疏水尾部的树状分子(二代赖氨酸-胆固醇酰胺)1mmol，脱除二代氨基的Pbf/Boc保护，在氮气的保护下溶于无水的吡啶，在冰水浴中加入等量的无水三乙胺，搅拌30分钟。加入六氢邻苯二甲酸酐(1.54g，10mmol)，加热至30℃搅拌48h。反应结束后，旋干有机溶剂，用甲醇将固体初产物重溶，在乙醚中沉淀，得到浅黄色粉末状固体，六氢邻苯二甲酸酐基团-二代赖氨酸-胆固醇酰胺(1.30g，0.84mmol，84％)。其核磁图谱分析结果如下：
1H-NMR(CD2Cl2，400MHz，ppm)：0.90(t,12H,-CH2CH3),2.22(d,1H,-CHCH2C-),2.64(d,10H,-COCHCHCO-,-NHCH2CH2-),3.35(q,6H,-NHCH2CH2-),3.51(s,2H,-NHCH2CO-),4.46(t,3H,-NHCH-)。MS：[M+H+]＝1544。
所得的pH响应型脂质材料在中性或碱性水溶液中可自组装形成纳米尺寸的脂质体或胶束或囊泡。当改变溶液的pH值至5.5以下时，所述自组装体发生解组装，证实了所述脂质材料具有pH响应特性。
实施例8：顺式乌头酸酐-二代精氨酸-胆固醇酰胺(ACO-Lys(G2)-Glu-Chol,ALG2Chlo)的制备
取1代重复单元为赖氨酸，2代重复单元为精氨酸的扇形树状分子，参照实施例7中所述的方法制备带疏水尾部的树状分子(二代精氨酸-胆固醇酰胺)。
取上述带疏水尾部的树状分子(二代精氨酸-胆固醇酰胺)1mmol，脱除二代氨基的Pbf/Boc，在氮气的保护下溶于无水的吡啶，在冰水浴中加入等量的无水三乙胺，搅拌30分钟。加入顺式乌头酸酐(1.56g，10mmol)，室温搅拌48h。反应结束后，旋干有机溶剂，用甲醇将固体初产物重溶，在乙醚中沉淀，得到黄色粉末状固体，二顺式乌头酸酐-二代精氨酸-胆固醇酰胺(1.25g，0.81mmol，81％)。其核磁图谱分析结果如下：
1H-NMR(CD2Cl2，400MHz，ppm)：0.92(t,12H,-CH2CH3),2.22(d,1H,-CHCH2C-),2.67(t,2H,-NHCH2CH2-),3.35(q,6H,-NHCH2CH2-),3.53(d,10H,-COCHCHCO-,-NHCH2CO-),4.44(t,3H,-NHCH-)。MS：[M+H+]＝1551。
所得的pH响应型脂质材料在中性或碱性水溶液中可自组装形成纳米尺寸的脂质体或胶束或囊泡。当改变溶液的pH值至5.5以下时，所述自组装体发生解组装，证实了所述脂质材料具有pH响应特性。
实施例9：柠康酸酐-二代赖氨酸-谷氨酸-油胺和二甲基马来酸酐-二代赖氨酸-谷氨酸-油胺两种pH响应型组装体的响应性能测试
将两种pH响应型组装体配成浓度为10mg/mL的溶液，之后分别用pH为7.4、6.8、5.4的HEPES缓冲液稀释至2mg/mL。之后，将它们置于37℃水浴中。取样后一部分用pH 9.1的磷酸盐缓冲溶液稀释至0.5mg/mL，以分别测定其表面电位变化以及氨基暴露率以测试脂质体的响应性能。取其中1mL使用Zetasizer Nano-ZS检测其表面电位的变化；另取90μL与10μL配置为2mg/mL的荧光氨丙酮溶液混合，在黑暗中孵育10min，检测其荧光。
图1和图2是两种pH响应型脂质体在不同pH条件下表面电荷和氨基暴露率的变化。其中图1是柠康酸酐-二代赖氨酸-谷氨酸-油胺在pH 7.4、6.8、5.5时表面电荷变化和所暴露氨基数目的改变，在pH 7.4时，其表面电荷均为负值，而暴露出的氨基则低于30％，当pH降至6.8时，柠康酸酐-二代赖氨酸-谷氨酸-油胺的电荷则有所上升但依然为负值，相对的氨基则暴露也在50％以下。而随着pH进一步的降低，其电荷则彻底变为正值。图2是关于二甲基马来酸酐-二代赖氨酸-谷氨酸-油胺的实验结果说明了二甲基马来酸酐基团比柠康酸酐基团对pH变化更加敏感，因而无论是表面电荷的变化还是氨基暴露的改变均表明了当pH为6.8就可以完成电荷翻转。由此可见，本发明所公开的两种pH响应型脂质体确实能够随pH环境的变化做出不同程度的响应。
实施例10：具有一重或者多重pH响应型基因载体的制备
将质粒DNA溶于无菌的HBG缓冲溶液(4-羟乙基哌嗪乙磺酸20毫摩尔，5％葡萄糖)中，配制成0.1mg/mL的DNA溶液；将阳离子材料溶于HBG缓冲溶液中，配制成0.1～10mg/mL的溶液A；将不同配比的pH响应型脂质用乙醇注入法分别加入HBG缓冲溶液中，配制成0.1～10mg/mL的溶液B。
将上述步骤中得到的溶液A与DNA溶液混合，在室温下孵育20分钟后，得到二元复合物，在按比例加入溶液B，在室温下孵育20分钟后，得到三元复合物。
制备得到的转基因载体，对其进行下述几方面的检测：
(1)体外转染效率的测定
HepG2细胞的培养：取人的肝肿瘤细胞HepG2细胞，在含有10％(质量/体积百分数)的胎牛血清的DMEM培养基中，在含5％(体积分数)CO2，温度为37℃的培养箱中培养24小时。
转染前24小时内，取对数生长期HepG2细胞，胰酶消化后用DMEM稀释，按每孔4×105细胞的密度接种于6孔培养板，置于含5％(体积百分数)的CO2，温度为37℃的孵箱中继续培养至80-90％融合，转染时，吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液，用PBS洗涤两次后，将荷载pEGFP基因组的复合物颗粒用无血清或者含有10％(质量/体积百分数)的小牛血清的DMEM培养基(pH用1M HCl调至6.8)至终体积2mL，继续培养48小时；
体外转染效率的测定：取出培养板，用倒置荧光显微镜照相，如图3所示的不同复合物(PEI、CLG2C18、DLG2C18、D/CLG2C18。
有益结果：用本发明所述转多重pH响应型基因载体与pEGFP质粒形成的复合物的转染能力最好，其次为一重pH响应型基因复合物。而其均在优化转染条件下转染能力超过商品化PEI25k,在有血清条件下转染优势更为突出。
(2)细胞存活率的检测
转染前24小时内，在HepG2细胞处于对数生长期时，用胰酶消化后用DMEM培养基稀释，按每孔1×104的细胞密度接种于96孔培养板中，置于含5％(体积分数)CO2，温度为37℃的培养箱中继续培养至80-90％融合。转染时，先吸去细胞培养板中前一天所加的培养基，并用PBS洗涤两次后，加入含有或者不含有10％(质量/体积百分数)的胎牛血清的DMEM培养基(pH用1M HCl调至6.8)以及转染复合颗粒至终体积0.1ml，继续培养24小时；
然后吸去含有转染颗粒的培养基，并用PBS洗涤两次，加入含有10％(体积分数)CCK-8(2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐)的DMEM培养基在37℃孵育2小时，之后使用酶标仪(Bio-Rad)测试每孔的吸光度值A，测试波长选用450nm。细胞存活率按下公式计算：
细胞存活率(％)＝(Asample-Ablank)/(Acontrol-Ablank)×100
Asample是含有加入复合物转染后的细胞样品孔的吸光度值，Acontrol是不加入转染复合物的细胞对照孔的吸光度值，Ablank是既没有细胞也不含有转染复合物的细胞空白孔的吸光度值，每组实验重复六次。结果如图4所示。
有益结果：转染浓度条件下，本发明所述的转基因载体在人肝癌细胞HepG2转染4小时后的细胞存活率大于90％，可见本发明的转染系统具有几可忽略的细胞毒性，比商品化PEI25k更加安全。
实施例11：双载磁性纳米粒和pEGFP质粒具有一重或者多重pH响应型基因载体的制备
将油溶性磁性纳米粒与一重或者多重pH响应型脂质溶于氯仿，利用乙醇注入法制备荷载磁性纳米粒的一重或者多重pH响应型基因载体，为溶液C。将实例8中得到的溶液A与Cy5标记的pGL3溶液混合，在室温下孵育20分钟后，得到二元复合物，在按比例加入溶液C，在室温下孵育20分钟后，得到双载磁性纳米粒和pEGFP质粒具有一重或者多重pH响应型基因载体。制备得到的基因载体，对其进行下述几方面的检测：
(1)利用透射电镜(TEM)检测观察载体的大小、粒径分布情况，图5显示结果，得到的载体粒径约在100nm左右，大小均一，分散性良好。
2)体内成像实验
建立肿瘤模型：雄性近交系裸小鼠，4～5周龄，体重15g～17g，在无特定病原体SPF级动物合格环境下饲养，自由摄取水分和食物，各实验均在无菌超净工作台中进行，无菌条件下，取对数生长期人肝癌细胞HepG2，制备细胞悬液，浓度为2×106个/ml，裸鼠右腋下接种0.1ml/只，建立人肝癌细胞HepG2裸鼠移植瘤模型。
待裸鼠皮下包块长至约100mm3时，通过尾静脉注射的方式将包含50μg Cy5标记的DNA的双载pH响应型基因载体注射入裸鼠体内，并在其肿瘤处加上磁场。
静脉注射8小时后，于小鼠腹腔注射100μL 5％水合氯醛进行麻醉，利用小动物成像系统中进行图像采集。采用卤素灯进行荧光照片采集，激发光滤光片波长为607nm，发射光滤光片波长为670nm。活体图像采集完毕后，小鼠立即被断颈处死，摘除肿瘤和主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)，进行各组织的图像采集，结果如图6。
有益结果：在小鼠体内转染8h后，再外加磁场的诱导下，给予磁性纳米粒组(D/C/M+MF)的小鼠肿瘤部位发现了明显的近红外荧光信号，证明了包含磁性纳米粒的基因复合物能够在磁场诱导于肿瘤部位累积。而予PEI25k/DNA复合物的小鼠肿瘤部位没有发现任何高于背景的荧光信号。离体组织的结果则相似。
Claims (10)
1.一种基于树状分子的pH响应型脂质材料，其特征在于，所述脂质材料的主体为外围含氨基和\或胍基的树状分子，所述树状分子的一端连接有疏水基团，另一端连接有多个具有pH响应功能的亲水性基团，所述具有pH响应功能的亲水性基团为与所述树状分子末端的氨基或胍基相连的A类基团或B类基团中的至少一种，其中A类基团在环境pH为6.8以下时能够断裂脱落，B类基团在环境pH为5.5以下时能够断裂脱落。
2.根据权利要求1所述的基于树状分子的pH响应型脂质材料，其特征在于，所述疏水基团为饱和或不饱和烃基或胆固醇衍生物。
3.根据权利要求1所述的基于树状分子的pH响应型脂质材料，其特征在于，所述疏水基团依靠具有多官能度的分子作为桥接单元来连接到树状分子的一端；进一步的，可采用具有2个相同氨基或者羧基的氨基酸（如谷氨酸、赖氨酸）作为桥接单元通过肽键将疏水基团连接到树状分子的一端。
4.根据权利要求1所述的基于树状分子的pH响应型脂质材料，其特征在于，所述树状分子为二代以上的肽类树状分子，其重复单元为氨基酸。
5.根据权利要求1所述的基于树状分子的pH响应型脂质材料，其特征在于，其结构式如下：
，
其中， K为树状分子的重复单元，G1和Gn分别表示一代和n代树状分子，n为2或3或4或5，R1为具有pH响应功能的亲水性基团，R2为疏水基团。
6.根据权利要求1所述的基于树状分子的pH响应型脂质材料，其特征在于，所述脂质材料通过自组装形成脂质体或胶束或囊泡。
7.根据权利要求1所述的基于树状分子的pH响应型脂质材料，其特征在于，所述pH响应型脂质分子结构中50%以上的氨基上修饰pH响应型基团。
8.一种如权利要求1-7中任意一个所述的基于树状分子的pH响应型脂质材料的制备方法，其特征在于，包括pH响应功能基团接枝步骤：将外围含氨基和\或胍基的树状分子，在氮气的保护下溶于无水的吡啶与三乙胺的混合有机溶剂中，搅拌混匀，然后加入与A类基团或B类基团对应的酸酐室温或加热搅拌反应，对产物进行分离纯化。
9.一种如权利要求1-7中任意一个所述的基于树状分子的pH响应型脂质材料的应用，将其用作药物载体或基因载体。
10.一种基因载体系统，其特征在于，包括基因、阳离子载体和如权利要求1-7中任意一个所述的基于树状分子的pH响应型脂质材料，所述阳离子载体和基因复合形成二元复合物颗粒，所述pH响应型脂质材料通过静电作用结合到所述二元复合物外围，形成三元复合物。
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