CN114790224A - 一种微环境响应型树状多肽及其蛋白药物纳米载体与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公布了一种微环境响应型树状多肽及其蛋白药物纳米载体与应用，该树状多肽的R1为树状多肽的亲水端，所述R1为天然碱性氨基酸或天然酸性氨基酸中的一种或几种；R3为树状多肽的疏水端。该树状多肽具有在水中可自组装的两亲性分子结构，R2为树状多肽的电荷屏蔽层，可在肿瘤组织细胞外特异性生理信号的刺激下脱去屏蔽层，具有抗蛋白吸附的作用。本发明制备的蛋白药物纳米载体可抵抗非特异性蛋白吸附，深度肿瘤组织渗透以及肿瘤细胞外特异性生理环境刺激下定点控释。
Description
技术领域
本发明属于药物载体技术领域，具体涉及一种微环境响应型树状多肽及其蛋白药物纳米载体与应用。
背景技术
由于蛋白、抗体和疫苗等生物大分子药物的高生物活性、高特异性和较低的毒副作用，生物大分子药物逐渐在医药市场中占据主要位置。目前，已有大量生物大分子药物被用于临床疾病治疗，其中抗肿瘤治疗的蛋白和抗体类药物备受关注。但是，生物大分子药物在临床应用时依然面临稳定性差、生物相容性低和疗效有限的困境。同时，蛋白药物生物利用度低等问题也会导致肿瘤产生严重的获得性耐药。因此，如何提体内治疗效果，是生物大分子药物面临的重大挑战。
大量临床肿瘤治疗结果表明，纳米药物可显著降低小分子药物毒副作用，人们也开发出了各种功能化的纳米材料，用于克服多重生理屏障，并提高药物的生物利用度。其中，蛋白药物递送系统也被广泛关注和发展，如功能化的脂质体、聚合物、树状分子和无机纳米粒子可用于负载蛋白药物，提高蛋白药物的细胞摄取。然而，目前的蛋白递送系统仍然无法克服系统屏障、组织屏障和细胞屏障等复杂生理屏障，也难以实现蛋白定点释放。此外，生物大分子药物分子尺寸远大于小分子药物，因此生物大分子药物更加难以穿过组织屏障，到达组织深处。近年来，人们广泛关注于小分子药物的组织渗透，并发展了一系列功能纳米粒子用于增强小分子药物的组织渗透，逆转多药耐药。然而，生物大分子药物的组织渗透常被忽略，用于促进生物大分子药物渗透的纳米粒子更加有限。因此，发展可系统递送、深度组织渗透和定点释放的高效蛋白递送系统对提高蛋白药物体内治疗活性和生物利用度具有重要意义。
发明内容
为了克服现有技术中的问题，本申请提供一种微环境响应型树状多肽及其蛋白药物纳米载体与应用，该树状多肽在水中可自组装的两亲性分子结构；该分子具有抗蛋白吸附的外围屏蔽层，可在肿瘤组织细胞外特异性生理信号的刺激下脱去屏蔽层。
为了实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：
本发明第一方面提供一种微环境响应型树状多肽，其特征在于，所述树状多肽的结构通式如下式(1)所示：
式(1)中，R1为树状多肽的亲水端，所述R1为天然碱性氨基酸或天然酸性氨基酸中的一种或几种；
R3为树状多肽的疏水端，所述树状多肽的亲水端和疏水端通过亲疏水作用自组装成纳米载体；
R2为树状多肽的电荷屏蔽层，所述R2为酸敏感基团、酶敏感底物肽或还原敏感基团中的一种或几种，所述R2在酸性环境、酶环境或氧化还原环境中发生断裂，使纳米载体的表面电荷发生翻转。
作为一种可选的实施方式，在本发明提供的微环境响应型树状多肽中，所述R3为油酸、油胺、或胆固醇。
作为一种可选的实施方式，在本发明提供的微环境响应型树状多肽中，所述酸敏感基团为
所述酶敏感底物肽为金属机制蛋白酶底物或菠萝蛋白酶底物，所述还原敏感基团为
本发明第二方面提供一种微环境响应型树状多肽的制备方法，包括以下步骤：
S1、将天然碱性氨基酸或天然酸性氨基酸通过缩合反应得到第一代树状多肽；
S2、将步骤S1得到的第一代树状多肽通过脱保护反应后再次进行缩合反应和脱保护反应后，得到第二代树状多肽；
S3、重复步骤S2的过程制备得到不同代数的树状多肽；
S4、将步骤S3中得到的树状多肽内核中R1脱保护后，通过缩合反应或点击反应，偶联疏水基团R3，得到具有亲水端和疏水端的树状多肽；
S5、将酸敏感基团、酶敏感底物肽或还原敏感基团中的一种或几种通过动态化学键与步骤S4中得到的树状多肽偶联，获得环境响应型树状多肽。
本发明第三方面提供一种纳米载体，将上述的微环境响应型树状多肽在水溶液或缓冲溶液中自组装形成。
本发明第四方面提供一种蛋白药物纳米载体，包括上述的纳米载体，所述纳米载体的R2基团上通过静电作用吸附有蛋白药物和肿瘤组织靶向的聚合物衍生物。
本发明第五方面提供一种蛋白药物纳米载体的制备方法，包括以下步骤：
a、将微环境响应型树状多肽在水溶液或缓冲溶液中自组装形成纳米载体；
b、将蛋白药物溶液与步骤a制备的纳米载体接触反应，将蛋白药物吸附于纳米载体上，形成蛋白/纳米载体复合物；
c、将肿瘤组织靶向的聚合物衍生物与步骤b得到的蛋白/纳米载体复合物接触反应，将肿瘤组织靶向的复合物衍生物吸附于蛋白/纳米载体复合物上，得到蛋白药物纳米载体。
作为一种可选的实施方式，在本发明提供的蛋白药物纳米载体或其制备方法中，步骤S3中的肿瘤组织靶向的聚合物衍生物的电性与式(1)中R1的电性相同，其结构通式如下式(2)所示：
其中，式(2)中含有链状聚合物骨架结构，R4为肿瘤靶向基团，所述肿瘤靶向基团与骨架结构之间通过酰胺键连接，或巯烯点击反应连接。
作为一种可选的实施方式，在本发明提供的蛋白药物纳米载体，所述肿瘤靶向基团为天然多糖，或人工合成的聚合物。所述天然多糖为聚糖或透明质酸，所述人工合成的聚合物为聚赖氨酸或聚谷氨酸。
作为一种可选的实施方式，在本发明提供的蛋白药物纳米载体或其制备方法中中，以所制备的蛋白药物纳米载体表面电位为标准，步骤S3中的聚合物衍生物的加入量为控制蛋白药物纳米载体表面电位为弱负电荷。
作为一种可选的实施方式，在本发明提供的蛋白药物纳米载体的制备方法中，步骤b和步骤c中的接触反应的pH值为7.4-8.0，接触温度为室温，接触时间为0.5-24h。
作为一种可选的实施方式，在本发明提供的蛋白药物纳米载体的制备方法中，步骤b中的蛋白药物为碱性蛋白药物或酸性蛋白药物。
本发明第六方面提供述的蛋白药物纳米载体在体外缓冲溶液中研究蛋白药物控释、纳米粒子稳定性，肿瘤微环境生理信号响应性中的应用。
本发明中微环境响应型树状多肽制备原理：
本发明中利用氨基和羧基保护的氨基酸，即天然碱性氨基酸或天然酸性氨基酸通过缩合反应得到第一代树状多肽，第一代树状多肽通过脱保护反应后在此进行缩合反应和脱保护反应后，得到第二代树状多肽，重复上述过程得到不同代数的树状多肽；本发明的反应过程如下所示，具体为利用不同保护的氨基酸，在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)、1-羟基苯并三唑(HOBT)和N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)缩合体系中进行缩合反应，然后在三氟乙酸的作用下脱去保护基团，获得一代树状多肽；重复缩合和脱保护过程，获得不同代数的树状多肽。
本发明的蛋白药物纳米载体工作原理：
本发明中公布的环境相应性的纳米载体，在其中负载蛋白药物，并吸附肿瘤靶向聚合物衍生物可形成蛋白药物纳米载体，当所述蛋白药物纳米载体进入肿瘤特异性酸性环境、高浓度酶环境或高浓度活性氧环境时，敏感键断裂，纳米载体表面电荷发生翻转，即由正电转变为负电或由负电转变为正电，将蛋白药物排斥开，并释放在肿瘤微环境中。
当本发明中的树状多肽的电荷屏蔽层，即R2为酸敏感基团时，蛋白药物纳米载体进入肿瘤特异性酸性环境，化学键发生断裂；当R2为还原敏感基团时，蛋白药物纳米载体在肿瘤高浓度活性氧的环境中，化学键断裂；当R2为酶敏感底物肽时，蛋白药物纳米载体进入高浓度酶环境中，以金属基质蛋白酶为例，肿瘤组织中高表达金属基质蛋白酶，可以特异性降解多肽片段，例如GALGLPG、GPLGVRGKGG等序列。因此，可以用这些序列作为linker，将纳米载体表面修饰为带异种电荷的基团。
本发明有益效果如下：
(1)本发明公开的树状多肽为含有疏水端和亲水端的两亲性树状多肽，在水中可以通过亲疏水作用进行自组装，具有抗蛋白吸附的外围屏蔽层，可在肿瘤组织细胞外特异性生理信号的刺激下脱去屏蔽层。自组装后形成的纳米载体的外围同时具有正电荷和负电荷，形成混合电荷，制备成蛋白药物纳米载体后将电荷调控在弱负电性，有利于纳米载体抵抗蛋白吸附。
(2)本发明中制备的蛋白药物纳米载体可抵抗非特异性蛋白吸附，深度肿瘤组织渗透，以及肿瘤细胞外特异性生理环境刺激下定点控释。
(3)本发明中制备的蛋白药物纳米载体在体外缓冲溶液中研究蛋白药物控释、纳米载体稳定性，肿瘤微环境生理信号响应性具有重要作用。
附图说明
图1为实施例1中Boc-K2K-OMe的核磁氢谱图；
图2为实施例1中K2K-OMe的质谱图；
图3为实施例1中(Boc-Pbf)4-R4K2K-Ome的核磁氢谱图；
图4为实施例1中(Boc-Pbf)4-R4K2K-OH的质谱图；
图5为实施例1中(Boc-Pbf)4-R4K2K-LA的核磁氢谱图；
图6为实施例1中R4K2K-LA的质谱图；
图7为ACs、P-ACs和P-VMNs的粒径分布；
图8为ACs、P-ACs和P-VMNs的表面电位；
图9为P-VMNs的TEM照片；
图10为Den、ACs、P-ACs和P-VMNs与FBS孵育后的蛋白吸附曲线；
图11为P-VMNs在pH7.4和pH6.5条件下的释放曲线；
图12为TRAIL和P-VMNs与耐药结肠癌细胞孵育后的激光共聚焦照片；
图13为TRAIL和P-VMNs在pH7.4和pH6.5条件下的细胞毒性；
图14为TRAIL、P-VMNs和P-VMNs(-T)在肿瘤细胞球中的渗透；
图15为Lovo/R荷瘤小鼠注射生理盐水、P-VMNs、P-VMNs(-T)、DOX.HCl后的肿瘤体积变化曲线；
图16为Lovo/R荷瘤小鼠注射P-VMNs和P-VMNs(-T)后的小动物活体成像照片；
图17为Lovo/R荷瘤小鼠治疗后的H&E染色、CD31和Ki67免疫组化染色、以及TUNEL免疫荧光染色照片。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本公开的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
实施例1环境响应型树状多肽的合成
(1)H-K2K-OMe的合成
精准称取7.13g Boc-Lys(Boc)-OH，2.00g H-Lys-OMe，3.95g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)和2.78g 1-羟基苯并三唑(HOBT)于带有支管的单口瓶中，在氮气保护下加入二氯甲烷溶解，冰浴下加入9.0mL N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)，室温反应24小时后，纯化得到Boc-K2K-OMe，其核磁氢谱图如图1所示。
将Boc-K2K-OMe溶于二氯甲烷，加入TFA(Boc:TFA＝1:10,mol/mol)反应12h，脱去叔丁氧羰基(Boc)。去除溶剂后，用乙醚沉淀，得到H-K2K-OMe。
(2)(Boc-Pbf)4-R4K2K-OH的合成
精准称取1.50g H-K2K-OMe，9.11g Boc-Arg(Pbf)-OH，6.56g O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)和2.14g HOBT至支口瓶，氮气保护下加入N,N-二甲基甲酰胺溶解，冰浴下加入10.0mL DIPEA。室温反应48小时后，纯化得到(Boc-Pbf)4-R4K2K-OH。
(Boc-Pbf)4-R4K2K-OMe用NaOH甲醇溶液(1M，甲基：NaOH＝1:10,mol/mol)处理12h，去除MeOH，得到(Boc-Pbf)4-R4K2K-OH。反应过程如下：
其中，K2K-OMe的质谱图如图2所示，(Boc-Pbf)4-R4K2K-Ome的核磁氢谱图如图3所示，(Boc-Pbf)4-R4K2K-OH的质谱图如图4所示。
(3)NH2-C6-LA的合成
精准称取1.23g N-(叔丁氧羰基)-1,6-己二胺，1.00g硫辛酸，1.11g EDC.HCl和0.79g HOBT至支口瓶中。氮气保护下加入二氯甲烷，冰浴下加入5.1mL DIPEA，室温反应24小时后，纯化后得到Boc-C6-LA。
将Boc-C6-LA溶于二氯甲烷，加入TFA(Boc:TFA＝1:10,mol/mol)反应12h。去除溶剂后，用乙醚沉淀，得到NH2-C6-LA。反应过程如下：
(4)R4K2K-LA的合成
精准称取1.00g(Boc-Pbf)4-R4K2K-OH，0.15g NH2-C6-LA，0.43g六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)和0.07g HOBT至支口瓶中。氮气保护下加入N,N-二甲基甲酰胺溶解，冰浴下加入0.4mL DIPEA。室温反应48小时后，纯化得到(Boc-Pbf)4-R4K2K-LA，其核磁氢谱图如图5所示。
将(Boc-Pbf)4-R4K2K-LA溶于二氯甲烷，加入TFA(Boc:TFA＝1:10,mol/mol)反应18h。去除溶剂后，用乙醚沉淀，得到R4K2K-LA，其质谱图
如图6所示。反应过程如下：
(5)DR4K2K-LA的合成
将R4K2K-LA和二甲基马来酸酐(DMA)溶于磷酸缓冲溶液，在pH为8左右的条件下反应48小时，用截留分子量1000Da的透析袋在水中透析后冷冻干燥得到DR4K2K-LA。
实施例2树状多肽的组装和负载
(1)组装：DR4K2K-LA溶于DMSO形成20mg/mL的母液，在超声条件下将10μL母液滴入1mL水中。
(2)交联：将100mg DR4K2K-LA溶于20mL水中。在溶液中加入1％二硫键当量的DTT，使pH保持在8左右，反应过程如下所示。用截留分子量1000Da的透析袋在水中透析，冷冻干燥得到的纳米载体记为ACs。
(3)负载：将TRAIL与ACs溶液(200μg mL-1)在室温下孵育15min，得到的纳米载体记为P-ACs。再将P-ACs溶液加入50μg/mL的RGD-CSO溶液中，得到的蛋白药物纳米载体粒子即为P-VMNs；对比例设置为将ACs溶液加入50μg/mL的CSO溶液中，得到的纳米粒子即为P-VMNs(-T)。同时利用利用动态光散射激光粒度仪测定制备过程中ACs、P-ACs和P-VMNs的粒径和电位变化。结果如图7和8所示，其中图7为ACs、P-ACs和P-VMNs的粒径分布结果，图8为ACs、P-ACs和P-VMNs的表面电位结果。
(二)性能检测
(1)P-VMNs的形貌
将铜网浸没于P-VMNs水溶液中5min，然后再将铜网浸没于磷钨酸负染溶液中3min。用滤纸吸掉度多余液体，并将铜网放置于室温干燥。通过透射电子显微镜(TEM)观察纳米粒子P-VMNs，结果如图9所示。
(2)蛋白吸附实验
300μg/mL的R4K2K-LA(Den)、ACs、P-ACs和P-VMNs与FBS(200μg/mL)在37℃轻度振荡下孵育。在一定时间后，将样品在8000g下离心15min，上清液中未被吸收的蛋白用Nanodrop在280nm处定量。用标准校准曲线计算FBS的浓度。结果如图10所示，由图10可知，P-VMNs组中上清液中未被吸收的蛋白两最少，说明P-VMNs的蛋白吸附能力最强。
(3)TRAIL的体外释放实验
装载20μg/mL TRAIL的P-VMNs分别在pH 6.5和pH 7.4的PBS缓冲液中孵育不同时间。释放的TRAIL用截留分子量为50kD超滤管进行超滤收集。用BCA蛋白测定试剂盒测定TRAIL的浓度。结果如图11所示，表明P-VMNs在pH 7.4的PBS缓冲液中TRAIL的释放量较多。
(4)TRAIL的细胞膜结合实验
装载有10μg/mL TRAIL的P-VMNs分别与LoVo/R细胞在pH 7.4和pH 6.5条件下孵育1h,PBS缓冲液洗涤2次。用1μg/mL的细胞膜红色荧光染料(DiD)染色细胞膜20min,PBS洗涤细胞，激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)显像。结果如图12所示。
(5)细胞存活率分析
将LoVo/R细胞接种于96孔平板上，每孔8000个细胞，培养过夜。然后在pH 7.4和pH6.5的条件下，用TRAIL和P-VMNs孵育细胞24h。然后去掉培养基，加入含有10％CCK8的新鲜培养基。细胞于37℃与CCK8共孵育1.5h。测定450nm处的OD值。细胞活力计算公式如下：
细胞活力＝(OD样品-OD空白)/(OD对照-OD空白)×100
实验结果如图13所示。
(6)P-VMNs的体内肿瘤渗透性实验
在BALB/c小鼠右侧皮下注射1×106个LoVo/R细胞。当肿瘤体积达到约100mm3时对小鼠进行体内研究。
使用cy5标记的TRAIL进行体内研究。将cy5标记的P-VMNs(-T)和装载cy5标记的TRAIL的P-VMNs静脉注射LoVo荷瘤BALB/c小鼠。注射后12h处死小鼠。将肿瘤组织切片，用CD31抗体染色肿瘤血管和4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色细胞核。用CLSM观察这些切片。结果如图14所示。
(7)P-VMNs的体内抗肿瘤研究
每三天给肿瘤小鼠静脉注射生理盐水、DOX.HCl、P-VMNs、P-VMNs(-T)(TRAIL:10μg/kg),共4次。每3天用游标卡尺记录肿瘤体积，直至24天。肿瘤体积计算公式为:体积＝(L×W2)/2，其中L为肿瘤较长直径，W为肿瘤较短直径。最后切除肿瘤进行病理分析。结果如图15-17所示，其图15为为Lovo/R荷瘤小鼠注射生理盐水、P-VMNs、P-VMNs(-T)、DOX.HCl后的肿瘤体积变化曲线，图16为Lovo/R荷瘤小鼠注射P-VMNs和P-VMNs(-T)后的小动物活体成像照片，图17为Lovo/R荷瘤小鼠治疗后的H&E染色、CD31和Ki67免疫组化染色、以及TUNEL免疫荧光染色照片。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只限于这些说明。对于本发明所属领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种微环境响应型树状多肽，其特征在于，所述树状多肽的结构通式如下式(1)所示：
式(1)中，R1为树状多肽的亲水端，所述R1为天然碱性氨基酸或天然酸性氨基酸中的一种或几种；
R3为树状多肽的疏水端，所述两亲性树状多肽的亲水端和疏水端通过亲疏水作用自组装成纳米载体；
R2为树状多肽的电荷屏蔽层，所述R2为酸敏感基团、酶敏感底物肽或还原敏感基团中的一种或几种，所述R2在酸性环境、酶环境或氧化还原环境中发生断裂，使纳米载体的表面电荷发生翻转。
2.根据权利要求1所述的微环境响应型树状多肽，其特征在于，所述酸敏感基团为
所述酶敏感底物肽为金属机制蛋白酶底物或菠萝蛋白酶底物，所述还原敏感基团为
3.根据权利要求1或2所述的微环境响应型树状多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将天然碱性氨基酸或天然酸性氨基酸通过缩合反应得到第一代树状多肽；
S2、将步骤S1得到的第一代树状多肽通过脱保护反应后再次进行缩合反应和脱保护反应后，得到第二代树状多肽；
S3、重复步骤S2的过程制备得到不同代数的树状多肽；
S4、将步骤S3中得到的树状多肽内核中R1脱保护后，通过缩合反应或点击反应，偶联疏水基团R3，得到具有亲水端和疏水端的树状多肽；
S5、将酸敏感基团、酶敏感底物肽或还原敏感基团中的一种或几种通过动态化学键与步骤S4中得到的树状多肽偶联，获得环境响应型树状多肽。
4.一种纳米载体，其特征在于，将权利要求1或2所述的微环境响应型树状多肽在水溶液或缓冲溶液中自组装得到。
5.一种蛋白药物纳米载体，其特征在于，包括权利要求4中所述的纳米载体，所述纳米载体的R2基团上通过静电作用吸附有蛋白药物和肿瘤组织靶向的聚合物衍生物。
6.根据权利要求5所述的蛋白药物纳米载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、将微环境响应型树状多肽在水溶液或缓冲溶液中自组装形成纳米载体；
b、将蛋白药物溶液与步骤a制备的纳米载体接触反应，将蛋白药物吸附于纳米载体上，形成蛋白/纳米载体复合物；
c、将肿瘤组织靶向的聚合物衍生物与步骤b得到的蛋白/纳米载体复合物接触反应，将肿瘤组织靶向的复合物衍生物吸附于蛋白/纳米载体复合物上，得到蛋白药物纳米载体。
7.根据权利要求5所述的蛋白药物纳米载体或权利要求6所述的蛋白药物纳米载体的制备方法，其特征在于，肿瘤组织靶向的聚合物衍生物的电性与式(1)中R1的电性相同，其结构通式如下式(2)所示：
其中，式(2)中含有链状聚合物骨架结构，R4为肿瘤靶向基团，所述肿瘤靶向基团与骨架结构之间通过酰胺键连接，或巯烯点击反应连接。
8.根据权利要求7所述的蛋白药物纳米载体或蛋白药物纳米载体的制备方法，其特征在于，以所制备的蛋白药物纳米载体表面电位为标准，聚合物衍生物的加入量为控制蛋白药物纳米载体表面电位为弱负电荷。
9.根据权利要求6所述的蛋白药物纳米载体的制备方法，其特征在于，
步骤b和步骤c中的接触反应的pH值为7.4-8.0，接触温度为室温，接触时间为0.5-24h；
步骤b中的蛋白药物为碱性蛋白药物或酸性蛋白药物。
10.根据权利要求5所述的蛋白药物纳米载体在体外缓冲溶液中研究蛋白药物控释、纳米粒子稳定性，肿瘤微环境生理信号响应性中的应用。
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114790224B (zh) | 2024-07-30 |
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