CN106729749B - 一种能够实现基因和药物共载的传递系统及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种能够实现基因和药物共载的传递系统及其制备方法与应用，属于纳米药物制剂技术领域。所述能够实现基因和药物共载的传递系统由环境响应型脂质前药自组装形成的阳离子药质体和基因复合构成。所述脂质前药由环境敏感键连接亲水性树状分子头部和疏水性抗肿瘤药物或其前药构成。所述环境敏感键能够在特定的环境条件之下发生断裂，使所述疏水性抗肿瘤药物或其前药与亲水性树状分子分离，使所述阳离子药质体发生解组装而释放基因。所述药质体在提高包封率和载药量的同时，还能够压缩基因形成共传输递药系统。能够实现基因与药物协同治疗或者顺序治疗效果。

Description

一种能够实现基因和药物共载的传递系统及其制备方法与 应用
技术领域
本发明属于纳米药物制剂技术领域，涉及一种能够实现基因和药物共载的传递系统及其制备方法与应用。
技术背景
由于肿瘤细胞所具有的无限增殖、可转化和易转移三大特点，使得肿瘤的治疗一直是困扰人类健康的重大问题。但是随着肿瘤治疗研究的深入，已经证实了单一的化疗手段很难达到较好的治疗效果。越来越多的证据表明药物和基因联用比独立使用药物或者基因对抑制肿瘤的增殖和迁移的效果更佳。同时，为了获得最大的共赢效果，治疗剂的最佳释放顺序是先释放基因完成转染，再释放药物，从而避免药物毒性对基因转染的阻碍。
在现有公开的技术中，已有部分药物与基因共载的纳米传递系统的报道。但是，绝大多数载体主要以药物与基因协同作用为主，并未考虑两者释放顺序对治疗效果的影响。
发明内容
本发明针对上述问题提供了一种环境响应型脂质前药并提供了所述的脂质前药制备成的药质体。此药质体在提高包封率和载药量的同时，还能够压缩基因形成共传输递药系统。能够实现基因与药物协同治疗或者顺序治疗效果。
本发明通过以下技术方案来实现：
一种环境响应型脂质前药,所述脂质前药由环境敏感键连接亲水性树状分子头部和疏水性抗肿瘤药物或其前药构成。所述环境敏感键能够在特定的环境条件之下发生断裂，使所述疏水性抗肿瘤药物或其前药与亲水性树状分子分离。
作为可选方式，在上述环境响应型脂质前药中，所述环境敏感键与疏水性抗肿瘤药物或其前药之间还连接有酯键、酰胺键、缩醛键、其它pH敏感键、其它酶敏感键中的至少一种形成第二重环境敏感连接。该结构的脂质前药中当所述环境敏感键断裂后，所得疏水性抗肿瘤药物或其前药仍然还含有第二重环境敏感连接，药物分子尚未被活化，只有带第二重环境敏感连接断裂或降解后才会使药物分子活化生效，使得所述脂质前药具有延迟活化生效功能。通过所述调整环境敏感键和所述第二重环境敏感连接的种类和断裂条件可以获得一系列双重环境响应型抗肿瘤药脂质前药。
作为可选方式，在上述环境响应型脂质前药中，所述环境敏感键为氧化还原敏感键、pH敏感键、酶敏感键中的至少一种。
作为可选方式，在上述环境响应型脂质前药中，所述亲水性树状分子为外围含氨基和\或胍基的具有生物降解能力的树状分子。
作为可选方式，在上述环境响应型脂质前药中，所述树状分子为球形树状分子或扇形树状分子，优选扇形树状分子。采用扇形树状分子时，在其核心接枝疏水基团即可。
所述树状分子为二代以上的肽类树状分子，其重复单元为官能度大于等于3的氨基酸。更高代数的树状分子有利于提供更多的官能团，有利于提高压缩基因的能力。进一步的，所述树状分子的重复单元为赖氨酸或精氨酸中的至少一种，采用这类氨基酸作为重复单元，所得的树状分子外围本身就具备大量的氨基或胍基，无需进行进一步的接枝改性。优选为精氨酸。
作为可选方式，在上述环境响应型脂质前药中，其结构式如下：
其中，R为疏水性抗肿瘤药物或其前药，X为环境敏感键，K为树状分子的重复单元，G1和Gn分别表示一代和n代氨基酸树状分子。
作为可选方式，在上述环境响应型脂质前药中，所述亲水基团与疏水基团可以通过还原敏感键、pH敏感键、酶敏感键中的任意一种连接，所述的环境响应功能通过还原敏感键、pH敏感键、酶敏感键等对肿瘤微环境的响应实现基因的释放和前药的激活。优选为二硫键。
作为可选方式，在上述环境响应型脂质前药中，所述脂质前药的主体为外围含氨基和\或胍基的树状分子，所述树状分子的一端通过二硫键连接有疏水基团，其疏水基团则是抗肿瘤药物或其前药。在上述抗肿瘤药脂质前药中同时含有疏水基团和亲水性基团是为两亲性分子，有利于在合适介质中自组成药质体。所述的药质体由于树状分子外围的氨基和\或胍基而具有正电性，便于压缩基因组成中性的或正电的具有还原响应能力的共传输递药系统。该共传输递药系统可以在肿瘤组织外正常生理环境下保持稳定，同时还可以保护基因不被血清中的脱氧核糖核酸酶(DNase)或核糖核酸酶(RNase)降解。同时，所述药质体含有的二硫键，能够在肿瘤细胞内高谷胱甘肽浓度的作用下快速断裂。当该共传输递药系统进入细胞后，利用外围氨基的质子缓冲能力或者胍基的透膜能力逃出溶酶体，在高浓度的谷胱甘肽作用下，二硫键快速断裂，释放荷载在树状分子上的基因，完成转染过程。而余下的前药分子在胞内水解酶或者其他微环境的作用下，激活药物活性。其中由于激活过程的存在，延缓了药物对细胞的杀伤速度，给基因的转染预留了足够的时间。
作为可选方式，所述脂质前药的结构式为：
其中，R为疏水性抗肿瘤药物，K为树状分子的重复单元，G1和Gn分别表示一代和n代树状分子。
作为可选方式，在上述环境响应型脂质前药中，所述抗肿瘤药物通过酯键、酰胺键、缩醛键、其它pH敏感键、其它酶敏感键中的一种修饰成前药分子。总之，以使抑制药物活性为目的，具体的修饰方式灵活可选。
作为可选方式，在上述环境响应型脂质前药中，作为疏水基团的抗肿瘤药物可以是喜树碱、10-羟基喜树碱、紫杉醇、多西他赛、阿霉素、坎地沙坦、替米沙坦、氯沙坦、厄贝沙坦、缬沙坦和伊贝沙坦中的一种。优选为喜树碱。
作为可选方式，所述环境响应型脂质前药为白色至黄色粉末，可溶于二甲基亚砜，可以在水中可自行组装成纳米尺寸的药质体。
作为可选方式，所述环境响应型脂质前药的包封率为100％，载药量为5％～50％。
本发明还提供了一种制备上述的抗肿瘤药脂质前药的方法，所述方法包括外围含氨基和\或胍基的树状分子的制备；然后在所得所述树状分子的一端接枝环境敏感键并连接疏水性抗肿瘤药物或其前药。
作为可选方式，所述外围含氨基和\或胍基的树状分子的制备步骤中，所述树状分子可以采用发散法或收敛法或发散-收敛相结合的方法合成，也可以采用市售的树状分子，然后根据需要对树状分子进行端基改性在其外围接枝大量氨基和\或胍基。当选择赖氨酸或精氨酸或组氨酸作为树状分子的重复单元时，则无需进行上述端基改性步骤。
作为可选方式，在所述树状分子的一端接枝疏水基团的步骤可以通过二硫键直接将抗肿瘤药物或其前药分子作为疏水基团连接在树状分子的一端，也可以采用其他还原敏感键、pH敏感键、酶敏感键将抗肿瘤药物或其前药分子连接到树状分子的一端。
本发明还提供了一种阳离子药质体，其是上述任意一种的脂质前药通过自组装形成的纳米自组装体。
作为可选方式，所述是阳离子药质体由所述脂质前药与脂质小分子和\或其他双亲性分子混合，通过混合自组装形成的脂质体或胶束或囊泡。作为可选，所述其他双亲性分子为将所述脂质前药中的疏水基团替换成烷烃链得到的双亲性分子。进一步的，所述脂质小分子为DOPE、DSPE、胆固醇等。所述脂质小分子和\或其他双亲性分子加入量与所述脂质前药的质量比为0-1:1。
作为可选方式，在上述阳离子药质体中，还可以包载其他脂溶性或水溶性药物。进一步的，所述药物可以包裹在所述脂质前药形成的药质体中，实现多重药物联合应用。
作为可选方式，在上述阳离子药质体中，还含有磁性纳米颗粒。通过复合磁纳米颗粒还可以实现磁靶向。
作为可选方式，在上述阳离子药质体中，还含有阳性/阴性显影剂，所述显影剂可以包裹在所述药质体中，实现诊疗一体化。
所述阳离子药质体的制备方法为：将所述环境响应型脂质前药在合适的介质中自由分散并通过亲疏水作用自组装或与其它亲疏水分子物质混合组装成的阳离子药质体。
本发明还提供了一种上述的药质体的应用，将其用作基因载体实现药物和基因的共传递。
本发明还提供了一种能够实现基因和药物共载的传递系统，其特征在于，由阴离子基因与上述任意一种阳离子药质体通过静电作用结合而成。
作为可选方式，在上述能够实现基因和药物共载的传递系统中，所述基因可以为质粒DNA，siRNA，shRNA，microRNA，反义RNA和寡聚核苷酸。优选为siRNA。
作为可选方式，在上述能够实现基因和药物共载的传递系统中，作为可选方式，在上述共传输递药系统中，所述药质体与基因的质量比例为0.1～50:1。
作为可选方式，所述能够实现基因和药物共载的传递系统能够通过注射的方式给药。
作为可选方式，在上述能够实现基因和药物共载的传递系统中，还含有磁性纳米颗粒。通过复合磁纳米颗粒还可以实现磁靶向。
作为可选方式，在上述能够实现基因和药物共载的传递系统中，还含有阳性/阴性显影剂，所述显影剂可以包裹在所述药质体中，实现诊疗一体化。
本发明还提供了一种上述能够实现基因和药物共载的传递系统的制备方法：将基因溶液与所述阳离子药质体溶液混合均匀，室温静置20-60min，即得。
作为可选方式，其具体步骤包括：
1)将siRNA溶于无菌的DEPC水(0.1％焦碳酸二乙酯)中，配制成20μM的siRNA溶液；将上述脂质前药用溶剂注入法加入HBG缓冲溶液中，配制成0.1～10mg/mL的溶液A。
2)将上述步骤中得到的溶液A与siRNA溶液混合，在室温下孵育20分钟后，得到共传输递药系统。
本发明还提供了上述基因载体系统的应用：将其用于体外基因转染、肿瘤、哮喘或心血管疾病的基因治疗、基因与化学药物联合治疗、疾病诊疗一体化。
本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
本发明的有益效果：
1.本发明所公开的是一种双重环境响应型脂质前药及其药质体与基因形成的共传输递药系统，利用疏水性抗肿瘤药具有的苯环之间的π-π共轭效应，成功形成药质体，并大大提高了抗肿瘤药物的包封率和载药量。
2.本发明所公开的药质体，由于外围所含有的氨基或/和胍基是的表面电荷为正，采用静电相吸的原理与基因形成共传输递药系统。
3.本发明所公开的共传输递药系统，将抗肿瘤药物和基因同时传输到肿瘤细胞内，利用外围氨基的质子缓冲能力或者胍基的透膜能力逃出溶酶体，在高谷胱甘肽浓度的环境下，二硫键断裂而释放基因，完成转染过程；之后利用胞内酶(酯酶、酰胺酶等)水解或者其他微环境响应能力而释放出活性药物，有效延缓了药物对肿瘤细胞的作用，避免了细胞损伤对转染的不利，从而完成与基因协同治疗或者顺序治疗，增加了药物和基因联用的治疗效果。
4.本发明所公开的共传输递药系统的制备方法操作简单、重复性好、便于大规模生产。
附图说明：
图1为所公开的药质体的粒径和电位。
图2为所公开的药质体的透射电镜照片。
图3为所公开的药质体对Hela细胞处理后的细胞存活率图4为所公开的共传输递药系统的凝胶阻滞电泳。
图5为所公开的共传输递药系统对稳定表达GFP荧光的Hela细胞的沉默效果。
具体实施方式：
以下通过实施例的具体实施方式再对本发明的上述内容作进一步的详细说明。下面实例选用以二代精氨酸为头部，用二硫键连接喜树碱的药质体作为范例，本领域技术人员很容易将其推广到其他材料。应当理解，此处所描述的具体实例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。在不脱离本发明的精神和原则之内做的任何修改，以及根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的等同替换或者改进，均应包括在本发明的保护范围内。
实施例1
(1)采用发散法或收敛法或发散-收敛相结合的方法合成二代以上的树状分子(可参考公开号为CN 103554923A的专利文献所述的方法)，也可以采用市售的树状分子；
(2)对所得的外围含氨基和\或胍基的树状分子的外围官能团进行保护，仅裸露其一端的一个或两个官能团，然后通过该裸露的官能团在所述树状分子的一端接枝还原敏感键；
(3)对还原敏感键裸露的另一端接枝疏水性抗肿瘤药物或其前药；
(4)脱除树状分子外围的氨基和\或胍基的保护基团，得到双重响应型脂质前药。
作为可选方式，在上述步骤(3)中，可以通过化学键直接将具有合适活性基团的疏水性抗肿瘤药物连接在树状分子的一端。如果抗肿瘤药物上的活性基团不适宜连接或不好连接，也可以先在抗肿瘤药物上修饰合适的活性基团来连接到树状分子的一端，如采用丁二酸酐通过酯键修饰喜树碱的羟基。
通过上述方法，成功制得双重响应型脂质前药。所得的双重响应型脂质前药在水溶液中可自组装形成纳米尺寸的药质体。当将溶液在还原条件下孵育后，其粒径增大，证实了所述脂质前药具有还原响应性。
实施例2
(1)将质粒DNA或RNA溶于无菌的DEPC水(0.1％焦碳酸二乙酯)中，配制成合适浓度的基因溶液；或将实施例1中制备的脂质前药和市售脂质分子(DOPE、DSPE、胆固醇等)或者将脂质前药的疏水基团替换成烷烃链的双亲性分子按1:0～1:1比例混合用溶液分散法加入HBG缓冲溶液中，配制成0.1～10mg/mL的溶液A。
(2)将上述步骤中得到的溶液A与基因溶液混合，在室温下孵育20分钟后，得到共传输递药系统。
作为可选，所述脂质前药与基因的质量比例为0.1:1～50:1。
作为可选，还可在上述步骤(2)中加入其他药物或磁性纳米粒子制得三元或四元化合物。
实验表明，所得共传输递药系统可在生理条件下稳定存在，将所得共传输递药系统干燥后重新分散于去离子水或pH7.4的磷酸缓冲溶液(PBS)中，浸提24小时后所述去离子水或PBS中仍未见游离的基因。当在溶液中加入还原性物质时，所得共传输递药系统可发生解组装，荷载基因的阳离子头部和前药尾部分离。当在溶液中加入相应的水解酶或者调节环境pH后，前药被激活。
实施例3：二代精氨酸-胱胺-丁二酸酐-喜树碱(Arg(G2)-SS-SUC-CPT)的制备取喜树碱(CPT)1mmol，丁二酸酐(SUC)3mmol在0℃，氮气保护条件下，加入二氯甲烷溶剂，缓慢滴加3mmol缩合剂(1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU))；然后室温反应4小时，反应结束后，加入水终止反应。所得溶液用1％HCl溶液沉淀。所的沉淀依次用1％HCl溶液、水洗涤，得到丁二酸酐-喜树碱。
取丁二酸酐-喜树碱，单保护的胱胺，缩合剂(如：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC，催化剂1-羟基苯并三唑(HOBt)、碱(N，N-二异丙基乙胺DIPEA)按照1:1:2:2:4的摩尔比，在0℃，氮气保护条件下，加入二氯甲烷溶剂，反应0.5小时；然后室温反应24小时，反应结束后，所得溶液依次用碳酸氢钠溶液、硫酸氢钠溶液和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥12小时，减压浓缩，以二氯甲烷：甲醇＝20:1(体积比)做洗脱剂，柱层析分离得到带二硫键的喜树碱前药(胱胺-丁二酸酐-喜树碱)。
取1代重复单元为赖氨酸，2代重复单元为精氨酸的扇形树状分子，上述脱除Boc保护的喜树碱前药，缩合剂(如：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC，催化剂1-羟基苯并三唑(HOBt)、碱(N，N-二异丙基乙胺DIPEA)按照1:1:2:2:4的摩尔比，在0℃，氮气保护条件下，加入二氯甲烷溶剂，反应0.5小时；然后室温反应24小时，反应结束后，所得溶液依次用碳酸氢钠溶液、硫酸氢钠溶液和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥12小时，减压浓缩，以二氯甲烷：甲醇＝10:1(体积比)做洗脱剂，柱层析分离得到二代精氨酸-胱胺-丁二酸酐-喜树碱(56％)。其核磁图谱分析结果如下：1H-NMR(DMSO，400MHz，ppm)：0.85(t,3H,-CH2CH3),1.25(t,6H,-NHCH2CH2-),1.53(q,8H,-NHCH2CH2-(lysine),-NHCH2CH2-(arginine)),2.25(q,2H,-CH2CH3),2.65(s,8H,-SHCH2-,-COCH2CH2CO-),3.22(s,6H,-NHCH2-),4.42(s,3H,-NHCH-),5.28(s,2H,-NCH2-),5.56(s,2H,-OCH2-),7.20(s,1H,-NCCH-),7.61-8.21(q,4H,-CHCHCHCH-),8.74(s,1H,-CCHC-)。MS：[M+H+]＝1023。
所得的脂质前药在中性溶液中可自组装形成纳米尺寸的药质体。当加入还原剂时，所述药质体发生解组装，证实了所述脂质前药具有还原响应特性。
实施例4：三代精氨酸-胱胺-丁二酸酐-喜树碱(Arg(G3)-SS-SUC-CPT)的制备按照实施例3中所述方法合成带二硫键的喜树碱前药(胱胺-丁二酸酐-喜树碱)。
取1，2代重复单元为赖氨酸，3代重复单元为精氨酸的扇形树状分子，上述脱除Boc保护的喜树碱前药，缩合剂(如：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC，催化剂1-羟基苯并三唑(HOBt)、碱(N，N-二异丙基乙胺DIPEA)按照1:1:2:2:4的摩尔比，在0℃，氮气保护条件下，加入二氯甲烷溶剂，反应0.5小时；然后室温反应24小时，反应结束后，所得溶液依次用碳酸氢钠溶液、硫酸氢钠溶液和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥12小时，减压浓缩，以二氯甲烷：甲醇＝10:1(体积比)做洗脱剂，柱层析分离得到三代精氨酸-胱胺-丁二酸酐-喜树碱(43％)。其核磁图谱分析结果如下：1H-NMR(DMSO，400MHz，ppm)：0.85(t,3H,-CH2CH3),1.23(t,10H,-NHCH2CH2-),1.55(q,14H,-NHCH2CH2-(lysine),-NHCH2CH2-(arginine)),2.20(q,2H,-CH2CH3),2.63(s,8H,-SHCH2-,-COCH2CH2CO-),3.20(s,14H,-NHCH2-),4.44(s,7H,-NHCH-),5.28(s,2H,-NCH2-),5.55(s,2H,-OCH2-),7.22(s,1H,-NCCH-),7.61-8.21(q,4H,-CHCHCHCH-),8.74(s,1H,-CCHC-)。MS：[M+H+]＝1592。
所得的脂质前药在中性溶液中可自组装形成纳米尺寸的药质体。当加入还原剂时，所述药质体发生解组装，证实了所述脂质前药具有还原响应特性。
实施例5：二代精氨酸-胱胺-坎地沙坦(Arg(G2)-SS-CD)的制备取坎地沙坦，单保护的胱胺，缩合剂(如：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC，催化剂1-羟基苯并三唑(HOBt)、碱(N，N-二异丙基乙胺DIPEA)按照1:1:2:2:4的摩尔比，在0℃，氮气保护条件下，加入二氯甲烷溶剂，反应0.5小时；然后室温反应24小时，反应结束后，所得溶液依次用碳酸氢钠溶液、硫酸氢钠溶液和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥12小时，减压浓缩，以二氯甲烷：甲醇＝20:1(体积比)做洗脱剂，柱层析分离得到带二硫键的坎地沙坦前药(胱胺-坎地沙坦)。
取1代重复单元为赖氨酸，2代重复单元为精氨酸的扇形树状分子，上述脱除Boc保护的坎地沙坦前药，缩合剂(如：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC，催化剂1-羟基苯并三唑(HOBt)、碱(N，N-二异丙基乙胺DIPEA)按照1:1:2:2:4的摩尔比，在0℃，氮气保护条件下，加入二氯甲烷溶剂，反应0.5小时；然后室温反应24小时，反应结束后，所得溶液依次用碳酸氢钠溶液、硫酸氢钠溶液和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥12小时，减压浓缩，以二氯甲烷：甲醇＝10:1(体积比)做洗脱剂，柱层析分离得到二代精氨酸-胱胺-丁二酸酐-坎地沙坦(69％)。其核磁图谱分析结果如下：1H-NMR(DMSO，400MHz，ppm)：1.12(t,2H,-CH2CH3),1.35-1.66(s,6H,-NHCH2CH2-),1.75(s,6H,-NHCHCH2-),2.65(q,4H,-SHCH2-),3.13(s,4H,,-NHCH-,-NHCH2-),3.47(q,4H,-SHCH2CH2-),3.65(s,2H,-CH2CH3-),4.51(s,1H,-NHCH-(lysine)),5.48(s,2H,-NCH2-)。
MS：[M+H+]＝1015。
实施例6：三代精氨酸-胱胺-坎地沙坦(Arg(G3)-SS-CD)的制备按照实施例3中所述方法合成带二硫键的坎地沙坦前药(胱胺-坎地沙坦)。
取1，2代重复单元为赖氨酸，3代重复单元为精氨酸的扇形树状分子，上述脱除Boc保护的坎地沙坦前药，缩合剂(如：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC，催化剂1-羟基苯并三唑(HOBt)、碱(N，N-二异丙基乙胺DIPEA)按照1:1:2:2:4的摩尔比，在0℃，氮气保护条件下，加入二氯甲烷溶剂，反应0.5小时；然后室温反应24小时，反应结束后，所得溶液依次用碳酸氢钠溶液、硫酸氢钠溶液和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥12小时，减压浓缩，以二氯甲烷：甲醇＝10:1(体积比)做洗脱剂，柱层析分离得到三代精氨酸-胱胺-丁二酸酐-坎地沙坦(57％)。其核磁图谱分析结果如下：1H-NMR(DMSO，400MHz，ppm)：1.12(t,2H,-CH2CH3),1.35-1.66(s,14H,-NHCH2CH2-),1.65(s,14H,-NHCHCH2-),2.63(q,4H,-SHCH2-),3.13(s,9H,,-NHCH-,-NHCH2-),3.47(q,4H,-SHCH2CH2-),3.72(s,2H,-CH2CH3-),4.77(s,3H,-NHCH-(lysine)),5.48(s,2H,-NCH2-)。MS：[M+H+]＝1583。
实施例7：双重响应型药质体的制备将制备的脂质前药和市售脂质分子(DOPE、DSPE、胆固醇等)或者将脂质前药的疏水集团替换成烷烃链的双亲性分子按1:0～1:1比例混合用溶液分散法加入HBG缓冲溶液中，配制成0.1～10mg/mL的溶液A。
制备得到的药质体，对其进行下述几方面的检测：
细胞存活率的检测
Hela细胞的培养：取人宫颈癌Hela细胞，在含有10％(质量/体积百分数)的胎牛血清的DMEM培养基中，在含5％(体积分数)CO2，温度为37℃的培养箱中培养24小时。
加入药质体前24小时内，在Hela细胞处于对数生长期时，用胰酶消化后用DMEM培养基稀释，按每孔1×104的细胞密度接种于96孔培养板中，置于含5％(体积分数)CO2，温度为37℃的培养箱中继续培养至80-90％融合。转染时，先吸去细胞培养板中前一天所加的培养基，并用PBS洗涤两次后，加入0.1ml含有10％(质量/体积百分数)的胎牛血清的DMEM培养基以及药物至终浓度为1μM，继续培养24、48、36、72小时；
然后吸去含有药物的培养基，并用PBS洗涤两次，加入含有10％(体积分数)CCK-8(2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐)的DMEM培养基在37℃孵育2小时，之后使用酶标仪(Bio-Rad)测试每孔的吸光度值A，测试波长选用450nm。细胞存活率按下公式计算：
细胞存活率(％)＝(Asample-Ablank)/(Acontrol-Ablank)×100
Asample是含有加入复合物转染后的细胞样品孔的吸光度值，Acontrol是不加入转染复合物的细胞对照孔的吸光度值，Ablank是既没有细胞也不含有药物的细胞空白孔的吸光度值，每组实验重复六次。结果如图3所示。
有益结果：本发明所述药质体在孵育48h以上时，细胞毒性弱于喜树碱，说明了制备成前药的喜树碱可以延缓药物毒性的出现，有利于基因的转染。
实施例8：还原响应型药物-基因共传输递药系统的制备将siRNA溶于无菌的DEPC水(0.1％焦碳酸二乙酯)中，配制成20μM的siRNA溶液。将上实施例7中得到的溶液A与siRNA溶液混合，在室温下孵育20分钟后，得到双重响应型药物-基因共传输递药系统。
制备得到的双重响应型药物-基因共传输递药系统，对其进行下述的检测：
体外沉默效率的测定
稳定表达GFP的Hela细胞的培养：取稳定表达GFP的Hela细胞，在含有10％(质量/体积百分数)的胎牛血清的DMEM培养基中，在含5％(体积分数)CO2，温度为37℃的培养箱中培养24小时。
沉默前24小时内，取对数生长期Hela细胞，胰酶消化后用DMEM稀释，按每孔4×105细胞的密度接种于6孔培养板，置于含5％(体积百分数)的CO2，温度为37℃的孵箱中继续培养至80-90％融合，沉默时，吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液，用PBS洗涤两次后，将荷载siRNA基因组的复合物颗粒用无血清或者含有10％(质量/体积百分数)的小牛血清的DMEM培养基至终体积2mL，继续培养48小时；
体外转染效率的测定：取出培养板，用倒置荧光显微镜照相，如图5所示的不同复合物(lipofectamine 2000/RNA，Arg(G2)-SS-SUC-CPT/RNA)的沉默效果。
有益结果：用本发明所述双重响应型药物-基因共传输递药系统的沉默效果远超过商品化lipofectamine 2000，在有血清条件下转染优势更为突出。
以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种环境响应型脂质前药，其特征在于，所述脂质前药由氧化还原环境敏感的二硫键连接亲水性树状分子头部和疏水性抗肿瘤药物喜树碱或坎地沙坦构成；所述树状分子外围具有氨基和\或胍基而使所述环境响应型脂质前药具有正电性；所述喜树碱与二硫键之间还连接有酯键，所述坎地沙坦与二硫键之间通过酰胺键连接，所述酯键或酰胺键构成第二重环境敏感连接，当所述二硫键断裂后，疏水性抗肿瘤药物上仍然还含有第二重环境敏感连接，药物分子尚未被活化，只有当第二重环境敏感连接断裂或降解后才会使药物分子活化生效，使得所述脂质前药具有延迟活化生效功能；利用所述脂质前药能够实现基因和药物共载，所述脂质前药的主体为外围含氨基和\或胍基的树状分子，所述树状分子的一端通过二硫键和第二重环境敏感键连接抗肿瘤药物，其具体结构式如下：
或
其中，R为通过酰胺键连接的坎地沙坦或含有酯键的喜树碱前药，X为二硫键，K为树状分子的重复单元，G1和Gn分别表示一代和n代氨基酸树状分子。
2.一种阳离子药质体，其特征在于，是由权利要求1中所述的脂质前药通过自组装形成的纳米自组装体。
3.根据权利要求2所述的阳离子药质体，其特征在于，是由所述脂质前药与脂质小分子和\或其他双亲性分子混合，通过混合自组装形成的脂质体或胶束或囊泡。
4.根据权利要求3所述的阳离子药质体，其特征在于，所述其他双亲性分子为将所述脂质前药中的疏水基团替换成烷烃链得到的双亲性分子。
5.一种能够实现基因和药物共载的传递系统，其特征在于，由阴离子基因与权利要求2所述的阳离子药质体通过静电作用结合而成。
6.一种如权利要求5所述的能够实现基因和药物共载的传递系统的制备方法，其特征在于，包括以下制备步骤：
（1）环境响应型脂质前药的制备：首先制备外围含氨基和\或胍基的树状分子，然后在所得所述树状分子的一端接枝环境敏感键并通过酯键连接喜树碱或通过酰胺键连接坎地沙坦；
（2）阳离子药质体的制备:将所述环境响应型脂质前药在合适的介质中自由分散并通过亲疏水作用自组装或与其它亲疏水分子物质混合组装成的阳离子药质体；
（3）将基因溶液与药质体溶液混合均匀，室温静置20-60min，即得。
7.一种如权利要1所述的环境响应型脂质前药的应用，其特征在于，将其用于制备体外基因转染制剂，或将其用于制备肿瘤、哮喘或心血管疾病的基因治疗体系或将其用于制备基因与化学药物联合治疗体系，或将其用于制备疾病诊疗一体化材料。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111481679B (zh) * 2020-04-21 2022-02-01 河南大学 siRNA纳米胶囊及其制备方法和应用
CN115634294A (zh) * 2022-10-28 2023-01-24 南京鼓楼医院 一种氧化还原环境响应释放的聚合物前药及其制备与应用

Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101039620A (zh) * 2004-08-25 2007-09-19 密执安州立大学董事会 基于树枝状大分子的组合物及其使用方法
CN101461946A (zh) * 2008-08-20 2009-06-24 刘湖 抗肿瘤的树状多肽大分子药物载体系统
CN102604130A (zh) * 2012-02-20 2012-07-25 四川大学 环境响应的基因载体材料及合成方法
CN102911252A (zh) * 2012-10-25 2013-02-06 四川大学 含肽类树状分子的阳离子脂质、转基因载体及其制备方法和应用
CN103305549A (zh) * 2013-06-19 2013-09-18 四川大学 具有多重氧化还原刺激响应的纳米粒子基因载体系统及其制备方法和应用
CN103554923A (zh) * 2013-10-18 2014-02-05 四川大学 一种肽类树状大分子自组装体及其制备方法和应用
CN103768612A (zh) * 2013-10-25 2014-05-07 四川大学 负载阿霉素的peg化肽类树状大分子靶向给药系统及其制备方法
CN104288779A (zh) * 2013-10-25 2015-01-21 四川大学 负载吉西他滨的peg化肽类树状大分子靶向给药系统及其制备方法
CN104910252A (zh) * 2015-06-16 2015-09-16 四川大学 一种基于树状分子的pH响应型脂质及其制备方法与应用
CN104906076A (zh) * 2015-07-03 2015-09-16 四川大学 程序化多重靶向的树状大分子组装体药物递送系统及其制备方法和应用
CN105056251A (zh) * 2015-09-16 2015-11-18 四川大学 环境响应型含肽类树状分子脂质材料及其制备方法和应用
CN105833294A (zh) * 2016-04-29 2016-08-10 四川大学 一种生物响应型诊疗一体化的肽类树状大分子组装体及其制备方法和应用

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101039620A (zh) * 2004-08-25 2007-09-19 密执安州立大学董事会 基于树枝状大分子的组合物及其使用方法
CN101461946A (zh) * 2008-08-20 2009-06-24 刘湖 抗肿瘤的树状多肽大分子药物载体系统
CN102604130A (zh) * 2012-02-20 2012-07-25 四川大学 环境响应的基因载体材料及合成方法
CN102911252A (zh) * 2012-10-25 2013-02-06 四川大学 含肽类树状分子的阳离子脂质、转基因载体及其制备方法和应用
CN103305549A (zh) * 2013-06-19 2013-09-18 四川大学 具有多重氧化还原刺激响应的纳米粒子基因载体系统及其制备方法和应用
CN103554923A (zh) * 2013-10-18 2014-02-05 四川大学 一种肽类树状大分子自组装体及其制备方法和应用
CN103768612A (zh) * 2013-10-25 2014-05-07 四川大学 负载阿霉素的peg化肽类树状大分子靶向给药系统及其制备方法
CN104288779A (zh) * 2013-10-25 2015-01-21 四川大学 负载吉西他滨的peg化肽类树状大分子靶向给药系统及其制备方法
CN104910252A (zh) * 2015-06-16 2015-09-16 四川大学 一种基于树状分子的pH响应型脂质及其制备方法与应用
CN104906076A (zh) * 2015-07-03 2015-09-16 四川大学 程序化多重靶向的树状大分子组装体药物递送系统及其制备方法和应用
CN105056251A (zh) * 2015-09-16 2015-11-18 四川大学 环境响应型含肽类树状分子脂质材料及其制备方法和应用
CN105833294A (zh) * 2016-04-29 2016-08-10 四川大学 一种生物响应型诊疗一体化的肽类树状大分子组装体及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
新型生物医用材料:肽类树枝状大分子及其生物医学应用;顾忠伟等;《中国科学:化学》;20101231;第40卷(第3期);第210-236页 *
肽类树状大分子及其生物医学应用;佘汶川等;《中国材料进展》;20120531;第31卷(第5期);第20-28页 *

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