CN111494338A - 化疗与光动力治疗协同作用的卵清蛋白纳米胶囊及其制备方法和应用 - Google Patents

化疗与光动力治疗协同作用的卵清蛋白纳米胶囊及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

一种化疗与光动力治疗协同作用的卵清蛋白纳米胶囊及其制备方法和应用，其属于用于癌症治疗的纳米药物领域。这种化疗与光动力治疗协同作用的卵清蛋白纳米胶囊是一种光动力治疗（PDT）与化学疗法相结合的卵清蛋白纳米胶囊，基于增强的类芬顿反应，达到协同增强癌症治疗的目的。在纳米胶囊中，即使在严重的缺氧环境（2% O2）下，光敏剂依靠I型PDT机制和胞内生化反应，高效生成高毒性•OH。由于对细胞内膜系统的有效破坏，PDT过程可以介导顺铂从内体/溶酶体逸出，从而增强药物的靶向递送。此外，顺铂可通过胞内生化反应，加剧•OH的产生。因此，即使在低氧条件下也能达到增强的治疗效果。

Description

化疗与光动力治疗协同作用的卵清蛋白纳米胶囊及其制备方 法和应用
技术领域
本发明涉及癌症治疗领域一类纳米药物及其制备和应用，尤其是一种化疗与光动力治疗协同作用的卵清蛋白纳米胶囊及其制备方法和应用。
技术背景
癌症一直以来是人类生命的主要威胁之一。各种传统的癌症治疗方法包括化学疗法，放疗，以及光动力疗法（PDT），化学动力疗法等新方法已被用于治疗癌症。但是，由于肿瘤的异质性，单一疗法通常显示出有限的治疗效果。因此，结合不同治疗方法的多模式疗法被应用于克服上述问题。特别是，PDT联合化学疗法的策略显示出独特的优势。主要是因为PDT过程中产生的活性氧（ROS）不仅直接破坏肿瘤组织，而且可以破坏胞内的膜系统，从而促进药物被递送到作用位点，例如核，线粒体和微管等。此外，ROS可以克服单纯化疗引起的耐药性问题。
尽管PDT和化学疗法的结合显示出临床应用前景，但是实体瘤微环境的低氧特性仍然限制了它们的治疗效果。因为，传统光敏剂（PS）产生ROS的过程高度依赖于肿瘤局部微环境的氧含量。此外，PDT通过消耗氧气可促进一步的肿瘤缺氧，导致P糖蛋白（P-gp）的表达，从而阻碍细胞摄取抗癌药物。为了克服这些问题，人们已经提出了一些策略来增加肿瘤微环境中的氧气含量，如氧气输送系统（例如人造细胞和全氟化碳纳米系统）和基于生物或化学反应氧气自给系统（过氧化氢酶，MnO2和CaO2）。然而，这些方法只能有限地改善PDT效果，并且通常制备过程复杂。因此，基于PDT/化学疗法的联合疗法开发的低氧需求的PDT系统具有重要意义。
另外，小分子药物或光敏剂由于在血液中短的半衰期，会迅速从血液中清除，而不能有效地积聚在肿瘤部位。而且，小分子药物通常对健康组织显示出严重的毒副作用。另一方面，纳米药物在体内呈现的EPR效应，能够提高药物靶向递送效率。更重要的是，纳米载体为诊断和治疗相结合的药物开发提供了灵活的平台，因而引起研究者广泛的兴趣。尤其是，蛋白质纳米载体由于其固有的生物相容性和可生物降解性引起了越来越多的关注，它们可以从细胞膜上外排泵逃逸，而更易被癌细胞吞噬。例如，在临床上，与溶剂型制剂相比，白蛋白纳米颗粒结合的紫杉醇（nab-紫杉醇）显示出改善的治疗功效。
发明内容
本发明的目的是提供一种化疗与光动力治疗协同作用的卵清蛋白纳米胶囊及其制备方法和应用。
本发明解决现有技术问题所采用的技术方案：一种化疗与光动力治疗协同作用的卵清蛋白纳米胶囊，该纳米胶囊以卵清蛋白为载体，封装了光敏剂，化疗药和类芬顿催化剂三种组分。所述光敏剂为吩噻嗪类阳离子性光敏剂，化疗药物为顺铂，类芬顿催化剂为Fe3O4NPs；光敏剂相对蛋白质的负载量为：（0.5~3）g:10g，催化剂、化疗药和光敏剂的质量比为（0.5~5）:8:8。
优选地，光敏剂相对蛋白质的负载量为(1~3)g:10g，催化剂、化疗药和光敏剂的质量比为(3~5):8:8。
最优选地，光敏剂相对蛋白质的负载量为1g:10g，催化剂、化疗药和光敏剂的质量比为3:8:8。
所述吩噻嗪类阳离子性光敏剂具有如下结构通式：
Figure 920712DEST_PATH_IMAGE001
其中，R1、R2和R3为含有取代基或不含有取代基的C2-60烷基或氢原子，R1、R2和R3可为不同基团；
所述含有取代基或不含有取代基的烷基是碳原子数为2-60的烷基；
所述含有取代基或不含有取代基的烷基中取代基是甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、羟基、巯基、氟原子、氯原子、溴原子、碘原子、氰基、醛基、酯基、硝基、氨基、亚氨基和肼基中的至少一种。
优选地，R1、R2为含有取代基或不含有取代基的碳原子数为1-3的烷基或者氢原子，R3为含有取代基或不含有取代基的碳原子数为2-10的烷基或者氢原子，所述含有取代基或不含有取代基的烷基中取代基优选羟基、巯基、醛基、酯基、硝基、氨基、亚氨基中的至少一种。
一种化疗与光动力治疗协同作用的卵清蛋白纳米胶囊的制备方法，包括如下步骤：
a）在搅拌作用下，将卵清蛋白和NaCl溶解在超纯水中，然后加入类芬顿催化剂Fe3O4NPs，吩噻嗪类阳离子性光敏剂和化疗药顺铂；
b）在搅拌作用下，将表面活性剂溶液倒入步骤a）制得的水溶液中，通过超声处理将乳液均质化，并用70%振幅的冰水冷却；
c）将表面活性剂和固化剂的混合物溶液滴加到步骤b）获得的细乳液中，反应结束后，重复离心，用环己烷除去分散液中过量的表面活性剂；
d）将步骤c）得到的分散液滴加到置于超声浴中的5 mL 0.1 wt％十二烷基硫酸钠水溶液中，搅拌挥发环己烷，离心，用水将上清液替换，去除过量的十二烷基硫酸钠。
所述步骤a）中卵清蛋白和NaCl的质量比为7:1，加入的类芬顿催化剂是Fe3O4 NPs，光敏剂是吩噻嗪类阳离子性光敏剂，化疗药是顺铂，Fe3O4 NPs、顺铂和吩噻嗪类阳离子性光敏剂的质量比为(0~5):8:8。
优选地，所述步骤b）中加入的表面活性剂溶液为乳化剂嵌段共聚物P(E/B)-PEO）的正己烷溶液，表面活性剂与正己烷的质量比为(4~5) mg:1 g。
优选地，步骤c）中加入的表面活性剂为乳化剂嵌段共聚物P(E/B)-PEO），固化剂为2，6－甲苯二异氰酸酯，溶剂为正己烷，表面活性剂，固化剂与正己烷的质量比为(10~11)mg:2 mg:5 g。步骤c)的反应温度为25℃，反应时间为24 h。
优选地，步骤a）的搅拌速率为200 rpm，步骤b）的搅拌速率为500rpm。
优选地，这种化疗与光动力治疗协同作用的卵清蛋白纳米胶囊的制备方法采用以下步骤：
a）在200 rpm的搅拌速度下，将卵清蛋白和NaCl溶解在超纯水中，然后加入Fe3O4 NPs分散水溶液，顺铂和光敏剂的DMSO溶液。
b）将表面活性剂P(E/B)-PEO溶解在环己烷中。在500rpm搅拌速度下，将混合物倒入水相。通过超声处理将乳液均质化，并用70%振幅的冰水冷却。
c）将P(E/B)-PEO）和TDI （2，6－甲苯二异氰酸酯）溶解在环己烷中，在5 min内将该混合物滴加到获得的细乳液中，并在25℃下反应24 h。之后，通过重复离心，用新鲜的环己烷除去分散液中过量的表面活性剂。
h）将来自环己烷的分散液滴加到置于超声浴中的5 mL 0.1 wt％十二烷基硫酸钠SDS水溶液中。随后，将样品搅拌过夜以挥发环己烷。通过四次离心，用水将上清液替换，去除过量的十二烷基硫酸钠SDS。
所述的一种化疗与光动力治疗协同作用的卵清蛋白纳米胶囊的应用，该纳米胶囊能够有效的破坏溶酶体，促进化疗药向细胞核递送，具有高度的化疗敏感性，作为用于癌症治疗的药物。
所述的一种化疗与光动力治疗协同作用的卵清蛋白纳米胶囊的应用，纳米胶囊作为一种通过I型PDT和化学疗法产生丰富的活性氧，再通过超氧化物歧化酶和类芬顿反应将活性氧转变为高毒性•OH的纳米药物，用于常氧或乏氧条件下的抗肿瘤联合治疗药物。
本发明使用可生物降解的卵清蛋白纳米胶囊（OVA-NCs）作为纳米载体，封装了光敏剂，顺铂和Fe3O4 NPs三种组分，开发了一种低氧消耗的PDT/化学疗法系统，用于抗肿瘤联合治疗。光敏剂NBS，即使在严重的低氧环境中（如2% O2环境下），能够在红光（660 nm）下，通过I型PDT机制产生O2−•。同时，顺铂能够与细胞核DNA发生交联作用，从而抑制细胞分裂。此外，在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶（NOX）的参与下，顺铂还可以产生O2−•。丰富的O2−•在超氧化物歧化酶（SOD）作用下转化为H2O2。进一步地，通过Fe3O4介导的类芬顿反应，H2O2转变为高毒性•OH，从而增强诱导细胞凋亡。该纳米胶囊由于对细胞内膜系统的有效破坏，PDT过程可以介导顺铂从内体/溶酶体逸出，从而增强药物的靶向递送。因此，该纳米胶囊是一个多模式的纳米药物，旨在通过在联合I型PDT和化学疗法来提高乏氧条件下的抗癌效果。
所述的化疗和PDT相结合的纳米胶囊，在负载化疗药物顺铂，光敏剂，Fe3O4 NPs后被应用于癌症治疗，特别是用于乳腺癌及其耐药型肿瘤治疗中。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明以生物相容性良好，可降解，廉价易得的卵清蛋白为载体，封装了光敏剂，顺铂和Fe3O4 NP三种组分，达到增强胞内药物递送的目的。在化疗和光动力治疗的协同作用下，增强癌症治疗的效果。本发明具有可观的载药率，并且有很好的缓控释放的能力。通过尾静脉注射，纳米胶囊能够有效地富集到肿瘤组织，有效地抑制肿瘤的增长。
本发明中的纳米胶囊具有易于被溶酶体吞噬、低的氧需求，以及高效的•OH产生能力等优势，能够有效的破坏溶酶体，从而能够有效促进顺铂向细胞核递送，增强化疗的敏感性。
本发明的纳米胶囊的作用机制中，O2−•作为光敏剂和化疗药顺铂共同的中间体ROS，在SOD和Fe3O4的参与下，有效地转化为•OH，从而协同增强癌症治疗的效果。
附图说明
图1 是纳米胶囊的物理化学性质研究图。
图2 是纳米胶囊的荧光共聚焦成像图。
图3是纳米胶囊诱导细胞内产生超氧阴离子的细胞成像图。
图4 是纳米胶囊诱导细胞产生羟基自由基的细胞成像图。
图5是纳米胶囊FePtNBS@OVA在光照下和无光照下对MCF-7和4T1细胞系的毒性图。
图6是纳米胶囊FePtNBS@OVA在光照下，常氧和乏氧条件下对MCF-7细胞系的毒性图。
图7是纳米胶囊FePtNBS@OVA在光照下，常氧和光照乏氧条件下对MCF-7/DPP细胞系的毒性图。
图8是经纳米胶囊注射后小鼠肿瘤体积随时间的变化图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做详细说明，但是实例的作用仅是解释而非限定本发明。
下述实例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：纳米胶囊FePtNBS@OVA的制备
a）在200 rpm的搅拌速度下，将50 mg卵清蛋白和7.2 mg NaCl溶解在500 µL水中。加入250 µL浓度为30 mg mL-1的Fe3O4 NPs分散水溶液，250 µL含有20 mg顺铂和20 mg NBS的DMSO溶液。
b）将35.8 mg表面活性剂P(E/B)-PEO溶解在7.5 g环己烷中。在500 rpm搅拌速度下，将表面活性剂混合物倒入步骤a）得到的水溶液。通过超声处理将乳液均质化180 s（超声每处理30 s，暂停10 s），并以70%的振幅冰水冷却。
c）将10.7 mg P(E/B)-PEO）溶解在5g环己烷中，并将2mg TDI（2，6－甲苯二异氰酸酯）添加到该溶液中。在5 min内将该混合物滴加到步骤b）获得的细乳液中，并使之在25℃下反应24 h。之后，通过重复离心，用新鲜的环己烷从分散液中除去过量的表面活性剂。
d）将来自步骤c）的环己烷的600 µL分散液滴加到置于超声浴中的5 mL 0.1 wt％SDS水溶液中。随后，将样品搅拌过夜以挥发环己烷。通过四次离心，用水将上清液替换，去除过量的SDS，得到纳米胶囊FePtNBS@OVA。
其中，NBS的结构如下：
Figure 58432DEST_PATH_IMAGE002
实施例2：制备卵清蛋白封装Fe3O4 NPs的纳米胶囊Fe@OVA。
a）在200 rpm的搅拌速度下，将50 mg卵清蛋白和7.2 mg NaCl溶解在500 µL水中。加入250 µL浓度为30 mg mL-1的Fe3O4 NPs分散水溶液。
步骤b）、c）和d）同实施例1。
实施例3：制备卵清蛋白封装Fe3O4 NPs和光敏剂NBS的纳米胶囊FeNBS@OVA。
a）在200 rpm的搅拌速度下，将50 mg卵清蛋白和7.2 mg NaCl溶解在500 µL水中。加入250 µL浓度为30 mg mL-1的Fe3O4 NPs分散水溶液，250 µL含有20 mg NBS的DMSO溶液。
步骤b）、c）和d）同实施例1。
实施例4：制备的卵清蛋白封装Fe3O4 NPs和化疗药顺铂的纳米胶囊FePt@OVA。
a）在200 rpm的搅拌速度下，将50 mg卵清蛋白和7.2 mg NaCl溶解在500 µL水中。加入250 µL浓度为30 mg mL-1的Fe3O4 NPs分散水溶液，250 µL含有20 mg顺铂的DMSO溶液。
步骤b）、c）和d）同实施例1。
实施例5：纳米胶囊FePtNBS1@OVA的制备
a）在200 rpm的搅拌速度下，将50 mg卵清蛋白和7.2 mg NaCl溶解在500 µL水中。加入250 µL浓度为30 mg mL-1的Fe3O4 NPs分散水溶液，150 µL含有15 mg顺铂和15 mg NBS1的DMSO溶液。
b）将35.8 mg表面活性剂P(E/B)-PEO溶解在7.5 g环己烷中。在500 rpm搅拌速度下，将表面活性剂混合物倒入步骤a）得到的水溶液。通过超声处理将乳液均质化180 s（超声每处理30 s，暂停10 s），并以70%的振幅冰水冷却。
c）将10.7 mg P(E/B)-PEO）溶解在5g环己烷中，并将2mg TDI（2，6－甲苯二异氰酸酯）添加到该溶液中。在5 min内将该混合物滴加到步骤b）获得的细乳液中，并使之在25℃下反应24 h。之后，通过重复离心，用新鲜的环己烷从分散液中除去过量的表面活性剂。
d）将来自步骤c）的环己烷的600 µL分散液滴加到置于超声浴中的5 mL 0.1 wt％SDS水溶液中。随后，将样品搅拌过夜以挥发环己烷。通过四次离心，用水将上清液替换，去除过量的SDS，得到纳米胶囊FePtNBS@OVA。
其中，NBS1的结构如下：
Figure 786217DEST_PATH_IMAGE003
实施例6：纳米胶囊FePtNBS2@OVA的制备
a）在200 rpm的搅拌速度下，将50 mg卵清蛋白和7.2 mg NaCl溶解在500 µL水中。加入250 µL浓度为30 mg mL-1的Fe3O4 NPs分散水溶液，300 µL含有10 mg顺铂和10mg NBS2的DMSO溶液。
b）将30 mg表面活性剂P(E/B)-PEO溶解在7.5 g环己烷中。在500 rpm搅拌速度下，将表面活性剂混合物倒入步骤a）得到的水溶液。通过超声处理将乳液均质化180 s（超声每处理30 s，暂停10 s），并以70%的振幅冰水冷却。
c）将11 mg P(E/B)-PEO）溶解在5g环己烷中，并将2mg TDI（2，6－甲苯二异氰酸酯）添加到该溶液中。在5 min内将该混合物滴加到步骤b）获得的细乳液中，并使之在25℃下反应24 h。之后，通过重复离心，用新鲜的环己烷从分散液中除去过量的表面活性剂。
d）将来自步骤c）的环己烷的600 µL分散液滴加到置于超声浴中的5 mL 0.1 wt％SDS水溶液中。随后，将样品搅拌过夜以挥发环己烷。通过四次离心，用水将上清液替换，去除过量的SDS，得到纳米胶囊FePtNBS@OVA。
其中，NBS2的结构如下：
Figure 9388DEST_PATH_IMAGE004
实施例7：纳米胶囊FePtNBS3@OVA的制备
a）在200 rpm的搅拌速度下，将50 mg卵清蛋白和7.2 mg NaCl溶解在500 µL水中。加入62.5µL浓度为30 mg mL-1的Fe3O4 NPs分散水溶液，50 µL含有5mg顺铂和5mg NBS3的DMSO溶液。
b）将37.5 mg表面活性剂P(E/B)-PEO溶解在7.5 g环己烷中。在500 rpm搅拌速度下，将表面活性剂混合物倒入步骤a）得到的水溶液。通过超声处理将乳液均质化180 s（超声每处理30 s，暂停10 s），并以70%的振幅冰水冷却。
c）将10.5 mg P(E/B)-PEO）溶解在5g环己烷中，并将2mg TDI（2，6－甲苯二异氰酸酯）添加到该溶液中。在5 min内将该混合物滴加到步骤b）获得的细乳液中，并使之在25℃下反应24 h。之后，通过重复离心，用新鲜的环己烷从分散液中除去过量的表面活性剂。
d）将来自步骤c）的环己烷的600 µL分散液滴加到置于超声浴中的5 mL 0.1 wt％SDS水溶液中。随后，将样品搅拌过夜以挥发环己烷。通过四次离心，用水将上清液替换，去除过量的SDS，得到纳米胶囊FePtNBS@OVA。
其中，NBS3的结构如下：
Figure 169236DEST_PATH_IMAGE005
实施例8：纳米胶囊FePtNBS4@OVA的制备
a）在200 rpm的搅拌速度下，将50 mg卵清蛋白和7.2 mg NaCl溶解在500 µL水中。加入52µL浓度为30 mg mL-1的Fe3O4 NPs分散水溶液，50µL含有2.5mg顺铂和2.5mg NBS4的DMSO溶液。
b）将35.8 mg表面活性剂P(E/B)-PEO溶解在7.5 g环己烷中。在500 rpm搅拌速度下，将表面活性剂混合物倒入步骤a）得到的水溶液。通过超声处理将乳液均质化180 s（超声每处理30 s，暂停10 s），并以70%的振幅冰水冷却。
c）将10 mg P(E/B)-PEO）溶解在5g环己烷中，并将2mg TDI（2，6－甲苯二异氰酸酯）添加到该溶液中。在5 min内将该混合物滴加到步骤b）获得的细乳液中，并使之在25℃下反应24 h。之后，通过重复离心，用新鲜的环己烷从分散液中除去过量的表面活性剂。
d）将来自步骤c）的环己烷的600 µL分散液滴加到置于超声浴中的5 mL 0.1 wt％SDS水溶液中。随后，将样品搅拌过夜以挥发环己烷。通过四次离心，用水将上清液替换，去除过量的SDS，得到纳米胶囊FePtNBS@OVA。
其中，NBS4的结构如下：
Figure 161463DEST_PATH_IMAGE006
实施例9：纳米胶囊FePtNBS5@OVA的制备
a）在200 rpm的搅拌速度下，将50 mg卵清蛋白和7.2 mg NaCl溶解在500 µL水中。加入180µL浓度为30 mg mL-1的Fe3O4 NPs分散水溶液，100 µL含有10mg顺铂和10 mg NBS5的DMSO溶液。
b）将35.8 mg表面活性剂P(E/B)-PEO溶解在7.5 g环己烷中。在500 rpm搅拌速度下，将表面活性剂混合物倒入步骤a）得到的水溶液。通过超声处理将乳液均质化180 s（超声每处理30 s，暂停10 s），并以70%的振幅冰水冷却。
c）将10 mg P(E/B)-PEO）溶解在5g环己烷中，并将2mg TDI（2，6－甲苯二异氰酸酯）添加到该溶液中。在5 min内将该混合物滴加到步骤b）获得的细乳液中，并使之在25℃下反应24 h。之后，通过重复离心，用新鲜的环己烷从分散液中除去过量的表面活性剂。
d）将来自步骤c）的环己烷的600 µL分散液滴加到置于超声浴中的5 mL 0.1 wt％SDS水溶液中。随后，将样品搅拌过夜以挥发环己烷。通过四次离心，用水将上清液替换，去除过量的SDS，得到纳米胶囊FePtNBS@OVA。
其中，NBS5的结构如下：
Figure 325728DEST_PATH_IMAGE007
实施例10：纳米胶囊的物理化学性质研究
通过纳米胶囊分散液与丝氨酸蛋白酶、胰蛋白酶共同孵育来研究卵清蛋白纳米胶囊的降解性质。具体而言，将固体含量为2 wt％的1 mL纳米胶囊分散液与20 mg胰蛋白酶（gibco）在37oC下孵育。将混合物溶液置于截留分子量为14 kDa的透析管中。 然后将透析管浸入20 mL milli-Q水中，并在37oC的振荡培养箱中孵育。在释放实验期间，以给定的时间间隔抽取1 mL透析介质，并添加等体积的水以保持体积恒定。在没有胰蛋白酶的情况下以与对照组相同的方式处理纳米胶囊。通过使用Infinite M1000读板器（Tecan，奥地利）测量NBS在透析介质中的释放，通过测量其在λ= 660 nm处的吸光度来定量。
通过使用动态光散射（DLS，Malvern S90）在25oC和90o的固定散射角下测量纳米胶囊在水中的流体动力学直径。通过DLS研究了包含Fe3O4 NP，顺铂和NBS各种组合的纳米胶囊的胶体稳定性。用Gemini 1530（Carl Zeiss AG，Oberkochem，Germany）在0.35 kV电压下运行的扫描电子显微镜（SEM）和在2000℃下运行的JEOL 1400（Jeol Ltd，Tokyo，Japan）透射电子显微镜（TEM）来观察纳米胶囊的形貌。加速电压为120 kV。纳米胶囊的SEM和TEM样品是通过将稀释后的分散液从环己烷浇铸在硅片和碳层涂覆的铜网上来制备的。使用MalvernZeta分级仪（Malvern Instruments，英国）在25°C下于1×10-3 M氯化钾溶液中测量纳米胶囊的Zeta电位。
图1中（a）是纳米胶囊FePtNBS@OVA的扫描电镜图，（b）是纳米胶囊FePtNBS@OVA的透射电镜图，通过图（a）和图（b）可得，该方法制备的纳米胶囊，尺寸大小合适，能够通过静脉注射用于肿瘤治疗。图1中（c）是纳米胶囊Fe@OVA，FeNBS@OVA，FePt@OVA和FePtNBS@OVA流体动力学直径随时间的变化图，由图可知，4个纳米胶囊在溶液中具有很好的稳定性，能够安全地用于药物递送。图1中（d）是纳米胶囊FeNBS@OVA和FePtNBS@OVA药物释放效率图，由图可知，该纳米胶囊在细胞内能够进行有效的药物释放。
实施例11：评估纳米胶囊对溶酶体完整性影响的实验。
将MCF-7细胞接种到35mm共聚焦皿上，并在37℃，5％CO2下温育24小时。然后将细胞暴露于以下不同处理方式，包括G1：对照组（无纳米胶囊孵育）；G2：加入FePt@OVA；G3：加入FeNBS@OVA；G4：加入FePtNBS@OVA；G5：加入FePtNBS@OVA，光照；G6：加入FePtNBS@OVA，光照、缺氧条件。药物孵育时间为2 h，浓度为 4 μg/mL，该浓度以剂型中卵清蛋白的含量计量，光照条件为35 mW, 3 min，在成像实验之前，所有细胞再用AO（5 μM）染色0.5小时。绿色通道代表OA单体的荧光（λex= 488 nm，λem= 500-550 nm），红色通道代表OA二聚体的荧光（λex= 561 nm，λem= 600-630 nm），比例尺为40μm。图2是纳米胶囊的荧光共聚焦成像图，由图2的结果可知，相对于FePt@OVA，FeNBS@OVA能够更有效地破坏细胞内溶酶体，FePtNBS@OVA+光照的条件在常氧和缺氧环境下均能有力地破坏溶酶体，从而促进顺铂的细胞核递送。
实施例12：纳米胶囊诱导细胞内产生超氧阴离子实验
将MCF-7细胞（大约2×105细胞/ mL）接种到35 mm直径的共聚焦培养皿中。然后将细胞暴露于以下不同处理方式，包括G1：对照组（无纳米胶囊孵育）；G2：用FeNBS@OVA孵育；G3：用FePt@OVA孵育；G4：用FePtNBS@OVA孵育；G5：用FePtNBS@OVA孵育，光照；G6：用FeNBS@OVA孵育，光照。药物孵育时间为2 h，浓度为 4 μg/mL，该浓度以剂型中卵清蛋白的含量计量。药物孵育完成后，用10 μg/mL的Hoechst33342和10μM DHE孵育培养皿中的细胞30 min。之后，用红光LED（660m，35mW/cm2，3 min）照射细胞。使用OLYMPUSFV-1000倒置共聚焦荧光显微镜60×油镜对细胞成像。Hoechst33342选择来自染料库的设置，DHE激发波长为488 nm，接受波长为570-630 nm。比例尺为40μm。图3是纳米胶囊诱导细胞内产生超氧阴离子的细胞成像图，由图3结果可知，纳米胶囊FePt@OVA，FeNBS@OVA+光照的处理方式能够诱导O2−•产生，而且FePtNBS@OVA+光照增强了该活性氧的产生，从而表明了该化疗与PDT相结合的模式可以有效增强治疗效果。
实施例13：纳米胶囊诱导细胞内产生羟基自由基的实验
将MCF-7细胞（大约2×105细胞/ mL）接种到35 mm直径的共聚焦培养皿中。然后将细胞暴露于以下不同处理方式，包括G1：对照（无纳米胶囊孵育）；G2：用FeNBS@OVA孵育；G3：用FePt@OVA孵育；G4：用FePtNBS@OVA孵育；G5：用FePtNBS@OVA孵育，光照；G6：用FeNBS@OVA孵育，光照。药物孵育时间为2 h，浓度为 4 μg/mL，该浓度以剂型中卵清蛋白的含量计量。药物孵育完成后，用10 μg/mL的Hoechst33342和10μM HPF孵育培养皿中的细胞30 min。之后，用红光LED（660m，35mW/cm2，3 min）照射细胞。使用OLYMPUSFV-1000倒置共聚焦荧光显微镜60×油镜对细胞成像。Hoechst33342选择来自染料库的设置，HPF激发波长为488 nm，接受波长为510-550 nm。比例尺：40μm。图4是纳米胶囊诱导细胞产生羟基自由基的细胞成像图，由图4结果可知，用纳米胶囊FePt@OVA孵育，以及用纳米胶囊FeNBS@OVA孵育，光照的处理方式能够诱导细胞内•OH的产生，而且用FePtNBS@OVA孵育，光照的条件增强了该活性氧产生的量。从而表明了，该FePtNBS@OVA纳米胶囊通过化疗与PDT相结合的模式增强了癌症的治疗效果。
实施例14：纳米胶囊的细胞毒性测试
使用线粒体脱氢酶通过MTT（3-（4,5）-二甲基噻唑（-2-基）-3,5-二苯基四唑）评估细胞活力。将MCF-7、4T1和MCF-7/DDP细胞以1×105细胞/mL的密度接种在96孔板中，并在150 μL含10％ FBS的培养基中培养。细胞附着24小时后，然后用150μL/孔的PBS洗涤板。然后将细胞与含有不同浓度的不同剂型的DMEM一起孵育，药物浓度以剂型中卵清蛋白的含量计量。没有光照射的实验组又返回培养箱24小时。将需要光照射的实验组与这些试剂一起孵育2h，然后用660 nm红色LED（35 mW/cm2，4分钟）进行照射。之后，将细胞在培养箱中进一步培养24 h。
低氧实验的细节：将新鲜培养基用氮气鼓泡30分钟，以获得低氧培养基。然后所有用于低氧实验的细胞将在此培养基中孵育。在将细胞用于实验之前，将培养基保存在培养箱中。然后，进行了不同的处理。
为了进行活力测试，将在PBS中制备的10μL MTT （5 mg/mL）加入每个孔中，并将板在5％ CO2湿润的培养箱中于37°C孵育4 h。然后小心除去培养基，并将紫色晶体溶于150μLDMSO中。在酶标仪（Thermo Fisher Scientific）上测量570 nm处的吸光度。细胞存活率＝（OD实验组-OD空白对照）/（OD阴性对照-OD空白对照）×100％，其中阴性和空白对照分别是未用药组和空白培养基组。
图5是纳米胶囊FePtNBS@OVA在光照下和无光照下对MCF-7和4T1细胞系的毒性图，由图5所示的结果可得，在不光照的情况下，胶囊FePtNBS@OVA中的化疗药物顺铂在MCF-7和4T1细胞系中能够诱导一定的细胞毒性。而在光照的条件下，细胞存活率显著下降，通过PDT的引入，能够显著增强治疗效果。图6是纳米胶囊FePtNBS@OVA在光照下，常氧和乏氧条件下对MCF-7细胞系的毒性图，由图6所示结果可知，纳米胶囊FePtNBS@OVA在相同加入量的情况下，常氧和乏氧条件均能对MCF-7细胞系产生显著的毒性，而随着纳米胶囊FePtNBS@OVA用量的增加，细胞存活率明显下降，因此，光照条件下，纳米胶囊FePtNBS@OVA对常氧和乏氧状态下的MCF-7细胞系均产生显著的毒性。图7是纳米胶囊FePtNBS@OVA在光照下，常氧和乏氧条件下对MCF-7/DPP细胞系的毒性图。由图7所示，随着纳米胶囊FePtNBS@OVA加入量的增加，常氧条件下和乏氧条件下的MCF-7/DPP细胞存活率都显著降低，纳米胶囊FePtNBS@OVA在光照下，在常氧和乏氧条件下，均能对MCF-7/DPP细胞系产生显著的毒性。
实施例15：纳米胶囊FePtNBS@OVA对小鼠肿瘤的治疗效果实验
将1×106细胞/mL的4T1细胞皮下注射到选定的腋窝部位，以建立Balb/c小鼠的乳腺癌肿瘤模型。当肿瘤体积达到约100 mm3时，将4T1肿瘤模型中的Balb/c小鼠分为五组，并用以下不同的方法治疗：G1：对照组；G2：注射Fe@OVA；G3：注射Fe/Pt/NBS，光照；G4：注射FePt@OVA；G5：注射FeNBS@OVA；G6：注射FeNBS@OVA，光照；G7：注射FePtNBS@OVA；G8：注射FePtNBS@OVA，光照。注射后6 h，用功率密度为150 mW/cm2的650 nm氙灯照射肿瘤区域20 min。在接受不同处理后，使用游标卡尺测量所有小鼠在14天内的肿瘤体积变化。肿瘤体积＝（宽度×宽度×长度）/2。图8是经纳米胶囊注射后小鼠肿瘤体积随时间的变化图，由图8可以看出，纳米胶囊FePt@OVA和FePtNBS@OVA能够抑制肿瘤的生长。在注射FeNBS@OVA后，通过比较光照和不光照的的治疗效果，光照是产生PDT效果的必要条件。值得注意的是，注射FePtNBS@OVA及光照条件下，小鼠的肿瘤体积没有变化，由此可见，纳米胶囊FePtNBS@OVA通过PDT和化学疗法的结合完全抑制了肿瘤的生长（FePtNBS @ OVA+Light，G8）。

Claims (9)

1.一种化疗与光动力治疗协同作用的卵清蛋白纳米胶囊，其特征在于，该纳米胶囊以卵清蛋白为载体，封装了光敏剂，化疗药和类芬顿催化剂三种组分；所述光敏剂为吩噻嗪类阳离子性光敏剂，化疗药物为顺铂，类芬顿催化剂为Fe3O4 NPs；光敏剂相对蛋白质的负载量为：（0.5~3）g:10g，催化剂、化疗药和光敏剂的质量比为（0.5~5）:8:8。
2.根据权利要求1所述的一种化疗与光动力治疗协同作用的卵清蛋白纳米胶囊，其特征在于，所述吩噻嗪类阳离子性光敏剂相对蛋白质的负载量为：（1~3）g:10g，催化剂、化疗药和光敏剂的质量比为（3~5）:8:8；
所述吩噻嗪类阳离子性光敏剂具有如下结构通式：
Figure 676866DEST_PATH_IMAGE001
其中，R1、R2和R3为含有取代基或不含有取代基的C2-60烷基或氢原子，R1、R2和R3可为不同基团；
所述含有取代基或不含有取代基的烷基是碳原子数为2-60的烷基；
所述含有取代基或不含有取代基的烷基中取代基是甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、羟基、巯基、氟原子、氯原子、溴原子、碘原子、氰基、醛基、酯基、硝基、氨基、亚氨基和肼基中的至少一种。
3.根据权利要求1或2所述的一种化疗与光动力治疗协同作用的卵清蛋白纳米胶囊的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
a）在搅拌作用下，将卵清蛋白和NaCl溶解在超纯水中，然后加入类芬顿催化剂Fe3O4NPs，吩噻嗪类阳离子性光敏剂和化疗药顺铂；
b）在搅拌作用下，将表面活性剂溶液倒入步骤a）制得的水溶液中，通过超声处理将乳液均质化，并用70%振幅的冰水冷却；
c）将表面活性剂和固化剂的混合物溶液滴加到步骤b）获得的细乳液中，反应结束后，重复离心，用环己烷除去分散液中过量的表面活性剂；
d）将步骤c）得到的分散液滴加到置于超声浴中的5 mL 0.1 wt％十二烷基硫酸钠水溶液中，搅拌挥发环己烷，离心，用水将上清液替换，去除过量的十二烷基硫酸钠。
4.根据权利要求3所述的一种化疗与光动力治疗协同作用的卵清蛋白纳米胶囊的制备方法，其特征在于，所述步骤a）中卵清蛋白和NaCl的质量比为7:1，加入的类芬顿催化剂Fe3O4 NPs、化疗药顺铂和吩噻嗪类阳离子性光敏剂的质量比为(0~5):8:8。
5.根据权利要求3所述的一种化疗与光动力治疗协同作用的卵清蛋白纳米胶囊的制备方法，其特征在于，所述步骤b）中加入的表面活性剂溶液为乳化剂嵌段共聚物的正己烷溶液，乳化剂嵌段共聚物与正己烷的质量比为(4~5) mg:1 g。
6.根据权利要求3所述的一种化疗与光动力治疗协同作用的卵清蛋白纳米胶囊的制备方法，其特征在于，步骤c）中将表面活性剂为乳化剂嵌段共聚物和固化剂为2，6－甲苯二异氰酸酯的正己烷溶液在5 min滴加到步骤b）获得的细乳液中，并在25℃下反应24 h，乳化剂嵌段共聚物、固化剂与正己烷的质量比为(10~11) mg:2 mg:5 g。
7.根据权利要求3所述的一种化疗与光动力治疗协同作用的卵清蛋白纳米胶囊的制备方法，其特征在于，步骤a）的搅拌速率为200 rpm，步骤b）的搅拌速率为500rpm。
8.根据权利要求1所述的一种化疗与光动力治疗协同作用的卵清蛋白纳米胶囊的应用，其特征在于，该纳米胶囊能够有效的破坏溶酶体，促进化疗药向细胞核递送，具有高度的化疗敏感性，作为用于癌症治疗的药物。
9.据权利要求1所述的一种化疗与光动力治疗协同作用的卵清蛋白纳米胶囊的应用，其特征在于，该纳米胶囊作为一种通过I型PDT和化学疗法产生丰富的活性氧，再通过超氧化物歧化酶和类芬顿反应将活性氧转变为高毒性•OH的纳米药物，用于常氧或乏氧条件下的抗肿瘤联合治疗药物。
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