CN103554923A

CN103554923A - 一种肽类树状大分子自组装体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN103554923A
Application number: CN201310491594.6A
Authority: CN
Inventors: 顾忠伟; 徐翔晖; 涂召旭; 李芸焜; 简也挺
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2013-10-18
Filing date: 2013-10-18
Publication date: 2014-02-05
Anticipated expiration: 2033-10-18
Also published as: CN103554923B

Abstract

本发明公开了一种肽类树状大分子自组装体。提供了一种驱动肽类树状大分子自组装的策略，构建了一类新的肽类树状大分子自组装体：通过弱相互作用，在肽类树状大分子外围引入一个可活动的亲疏水片段，亲疏水片段与肽类树状大分子在共溶剂中形成一个非共价结合的两亲性组装单元，并可进一步引导肽类树状大分子的自组装体系的形成。本发明所述的肽类树状大分子自组装体，稳定性、机械强度和功能性俱佳，具有精确的分子结构、丰富的表面官能团，还具有良好的生物相容性、类蛋白结构、容易被细胞内吞等生物学特点，在生物材料领域具有广阔的应用前景。

Description

一种肽类树状大分子自组装体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医学材料领域，具体涉及肽类树状大分子自组装体。

背景技术

自组装是指基本组成单元通过弱相互作用自发形成稳定、有序整体的过程，是一种广泛存在于自然界中的现象。随着超分子自组装的本质规律被逐步认识和揭示，自组装同化学、生物、物理、纳米科学等领域相互融合渗透，促成了许多新的重大研究方向。通过自组装的方式，多种尺度、不同形态结构以及各种性质功能的自组装体已被成功构建；并广泛应用于化学化工、能源材料、生物医药等领域。

近年来，两亲性小分子和线型大分子的自组装都已取得重大进展，并成功构建胶束、聚合物囊泡等一系列组装体系。树状大分子是一类具有单分散性、规整三维结构、高度支化和纳米尺度的高分子材料；肽类树状大分子还具有类球蛋白结构、良好的生物相容性等独特优势，但是高代数的树状大分子合成难度大且容易出现结构缺陷，因此人们期望能够通过将低代数的树状大分子集结在一起，使其具有、甚至超越高代数树状大分子的功能。然而，由于树状大分子单分散性和外围一致的官能团使得树状大分子缺乏自组装驱动力，与线形大分子自组装相比较，树状大分子的自组装研究仍处于初期，自组装策略相对有限。

发明内容

大分子自组装发生需要两个基本条件：自组装的动力以及导向作用。肽类树状大分子区别于嵌段聚合物，不能利用分子内部组成片段性质的不同来驱动自组装行为，不包括两种或多种具有不同物理、化学性质的片段，外围大多是性质完全相同的基团，缺乏自组装的驱动力；且肽类自组装体系需要能够稳定存在于一个适应于生物环境的体系。因此，如何巧妙的为高度单分散的肽类树状大分子创造一个自组装的驱动力是问题关键所在。

针对上述问题，本发明提供了一种驱动肽类树状大分子自组装的策略，构建了一类新的肽类树状大分子自组装体：通过弱相互作用，在肽类树状大分子外围引入一个可活动的亲疏水片段，亲疏水片段与肽类树状大分子在共溶剂中形成一个非共价结合的两亲性组装单元，并可进一步引导肽类树状大分子的自组装体系的形成。

本发明通过以下技术方案来实现：

一种肽类树状大分子自组装体，包括肽类树枝状大分子和端基功能化的短肽，所述短肽包括疏水端和亲水端，所述端基功能化是指让所述短肽的亲水端的表面电荷与所述肽类树枝状大分子表面电荷相反，所述肽类树枝状大分子与端基功能化的短肽通过弱相互作用（如静电吸附、氢键等）形成自组装体。其中肽类树状大分子为组装主体部分，功能化短肽为协同组装部分。通过引入端基功能化的短肽，使肽类树枝状大分子与短肽的亲水端通过静电吸附和\或氢键等弱相互作用形成两亲性的组装单元，使肽类树枝状大分子获得了自组装的驱动力。

作为可选方式，在上述肽类树状大分子自组装体中，所述肽类树枝状大分子是以氨基酸为重复单元的一代、二代、三代或四代肽类树状大分子，优选为二代。所述肽类树状大分子为扇形或球形。作为可选方式，所述肽类树枝状大分子以谷氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸中的一种或几种作为支化单元

作为可选方式，在上述肽类树状大分子自组装体中，所述短肽的主链重复单元为脂肪族和芳香族氨基酸中的至少一种，所述的端基功能化是在所述主链的一端接枝亲水性的基团，所述基团可以是单个氨基酸（G0），也可以是一代（G1）、二代（G2）或三代（G3）的扇形肽类树状大分子。

作为可选方式，在上述肽类树状大分子自组装体中，所述肽类树枝状大分子为球形，所述短肽的亲水端是树枝化的肽类大分子。通过选择球形肽类树枝状大分子作为组装主体部分，和端基树枝化的短肽作为协调组装部分，使得两者之间具有更多的作用位点，增加弱相互作用，使亲疏水片段与肽类树状大分子结合更牢固，提高两者在共溶剂中形成的非共价结合两亲性的组装单元的稳定性，从而保证最终的自组装体的稳定性和机械强度。

作为可选方式，在上述肽类树状大分子自组装体中，所述自组装体为阳离子型肽类树状大分子组装体或阴离子型肽类树状大分子组装体，在所述阳离子型肽类树状大分子组装体中，肽类树状大分子表面带正电荷，短肽的亲水端带负电荷，所述阴离子型肽类树状大分子组装体中，肽类树状大分子表面带负电荷，短肽的亲水端带正电荷。

作为可选方式，在上述肽类树状大分子自组装体中，所述表面带正电荷的肽类树状大分子的结构式如下：

式1；

所述表面带负电荷的肽类树状大分子的结构式如下：

式2；

式1和式2中，Rn代表球形分子的核心分子，n代表核心分子的官能度，核心分子的官能度可以为3、4、6或8；R1、R2、R3、R4为氨基酸，其中R1、R3为一代氨基酸，R2、R4为二代氨基酸。

作为可选方式，在上述肽类树状大分子自组装体中，所述核心分子为：

（n=3）、

（n=4）、

（n=4）、

（n=6）、

（n=8）中的一种。

作为可选方式，在上述肽类树状大分子自组装体中，R1为赖氨酸；R2可为赖氨酸、精氨酸或组氨酸；R3为谷氨酸或天冬氨酸；R4为谷氨酸或天冬氨酸。

作为可选方式，在上述肽类树状大分子自组装体中，所述阳离子型肽类树状大分子自组装体中的短肽为阴离子化疏水短肽，其结构式如下：

------------------式3；

所述阴离子型肽类树状大分子自组装体中的短肽为阳离子化疏水短肽，其结构式如下：

------------------式4；

式3和式4中，Gm 代表m代的树枝状分子，m可以为0、1、2、3或4，其支化单元为氨基酸，式3中为阴离子支化单元，可为谷氨酸或天冬氨酸等，式4中为阳离子型支化单元，可为赖氨酸和精氨酸或组氨酸等；R表示主链氨基酸的侧基，n表示聚合度，(n=10-20),所述主链氨基酸为脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸,为异丙基，仲丁基，异丁基和苯环等。

作为可选方式，在上述肽类树状大分子自组装体中，所述短肽的主链氨基酸为亮氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸中的至少一种。采用这类氨基酸可使所得自组装体具有温敏特性。

本发明还提供了一种制备上述肽类树状大分子自组装体的方法，具体步骤如下：

1) 制备肽类树状大分子；

2）通过N-羧基环内酸酐开环聚合，制备端基功能化短肽；

3）将肽类树状大分子和端基功能化短肽按照一定质量比例溶解在共溶剂中，在超声条件下使两组份充分复合，实现一级自组装，形成两亲性自组装前驱体；

4）在超声的条件下将上述溶液溶缓慢的滴加入极性溶剂（去离子水）中，通过亲疏水作用实现二级自组装，形成自组装体。作为可选方式，在该步骤中也可将极性溶剂加入到步骤3）中所得的溶液中。

作为可选方式，步骤1）中所述肽类树状大分子的制备可以采用发散法或收敛法或发散-收敛相结合的方法。

作为可选方式，步骤1）中所述肽类树状大分子的制备方法具体为：

a）对氨基酸进行官能团保护：根据所要制备的肽类树状大分子的核心分子表面官能团的不同对氨基酸进行保护，如核心分子表面官能团为氨基或羟基则对氨基酸的氨基进行保护，如核心分子表面官能团为羧基则对氨基酸的羧基进行保护；

b）制备一代树状大分子：按比例称取支化核（官能度为n，n>1）、含保护基团的氨基酸（1.5n当量）、缩合剂（1.5n当量）、催化剂（1.5n当量）和有机碱（4n当量），在0℃，氮气保护条件下，加入溶剂进行脱水缩合反应；然后在室温下反应，反应结束后，所得溶液经洗涤，干燥，减压浓缩，以柱层析分离得到带有保护基团第一代肽类树状大分子；

c）脱保护：准确称取第一代肽类树状大分子，脱保护试剂（20n当量），加入溶剂溶解，在氮气保护下室温反应4小时，脱除保护，减压浓缩，通过萃取或沉淀，获得第一代肽类树状大分子；

d）制备二代树状大分子：按比例称取第一代肽类树状大分子（官能度为2n）、含保护基团的氨基酸（3n当量）、缩合剂（3n当量）、催化剂（3n当量）和有机碱（8n当量），在0℃，氮气保护条件下，加入溶剂进行脱水缩合反应；然后在室温下反应，反应结束后，所得溶液经洗涤，干燥，减压浓缩，以柱层析分离得到带有保护基团第二代肽类树状大分子；

重复以上脱保护和缩合反应步骤，可得到第三、第四代树状大分子。

作为可选方式，步骤2）中所述端基功能化短肽的制备方法具体为：

a）中间体N-羧基环内酸酐的合成：可以在以下两种合成方法中任意选择：

方法1：将氨基酸加入支管瓶中，在氮气保护下，加入重蒸四氢呋喃使其溶解后，将体系升温至50℃。加入三光气（较氨基酸摩尔量过量30%）反应（分三次添加），待反应液转为清亮，停止加热，冷却到室温。继续通氮气半小时，旋走溶剂，加入大量石油醚沉淀，在-20℃温度下结晶12小时，得到的粗产品用四氢呋喃重结晶一次，真空干燥，得到氨基酸的N-羧基环内酸酐；

方法2：称取干燥的苄氧羰基-氨基酸，在氮气保护下，加入重蒸的四氢呋喃溶解，体系温度升至40℃，滴加二氯亚砜。反应4小时后，将反应液加入重蒸正己烷中，-20℃静置12小时，过滤得到固体。将得到的固体在无水乙酸乙酯/正己烷反复重结晶，真空干燥得到氨基酸的N-羧基环内酸酐；

b）开环聚合：采用氨基酸或扇形树枝状大分子引发步骤a）中制备的N-羧基环内酸酐开环聚合。

本发明还提供了一种对上述的肽类树状大分子自组装体进行表征的方法，其特征在于，所述肽类树状大分子自组装体的制备过程中，通过检测溶液的粘度来研究肽类树状大分子组装体组装过程，具体为：分别测定肽类树状大分子、端基功能化短肽及其二者在共溶剂中和水中的粘度，通过对比混合溶液的比浓粘度与各组分的比浓粘度的线性加和值判断组分间是否存在弱相互间作用力。

本发明还提供了一种所述的肽类树状大分子自组装体的应用，其特征在于，将其用作基因载体或药物载体。将目标基因和药物包覆于所述肽类树状大分子自组装体中，用于体内基因或药物的传递，还可以在所述肽类树状大分子自组装体接枝靶向基团，实现主动靶向效果。

本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。

本发明的有益效果：

1.本发明提出了一种新的肽类树状大分子自组装体的构建策略，成功解决了肽类树状大分子的自组装驱动力问题，得到了稳定性、机械强度和功能性俱佳的肽类树状大分子自组装体。

2.本发明所述的肽类树状大分子自组装体，具有精确的分子结构、丰富的表面官能团，还具有有良好的生物相容性、类蛋白结构、容易被细胞内吞等生物学特点，在生物材料领域具有广阔的应用前景。

3.在本发明的可选方式中，采用亮氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸中的至少一种作为所述短肽的主链氨基酸可以使所得的自组装体具有良好的温敏特性。

4.本发明所述的制备方法，工艺简单，通过弱相互作用，驱动低代数的肽类树状大分子快速形成一个结构有序和外围官能团丰富的肽类树状大分子自组装体，使其具有类似于蛋白质外壳的一些特征，且能够通过控制各原料的配备来精确控制自组装体的形貌。

5.本发明所述的表征手段，方法简单，能够准确的反应自组装体的形成过程。

6.采用本发明所述肽类树状大分子自组装体作为基因载体或药物载体，在体内能很好地被降解吸收，具有更好的生物相容性和安全性。采用具有温敏特性的自组装体作为基因载体和药物载体可以通过对局部温度的控制实现靶向传递和精确的控制释放。

附图说明

图1是本发明实施例2中所述肽类树状大分子的合成路线图。

图2是本发明实施例4中所述端基功能化短肽的合成路线图。

图3是本发明实施例5中所述端基功能化短肽的合成路线图。

图4是本发明实施例2中制备的一代和二代肽类树状大分子的氢谱。

图5是本发明实施例2中制备的一代和二代肽类树状大分子的碳谱。

图6是本发明实施例4中制备的N-羧基环内酸酐的氢谱。

图7是本发明实施例4中制备的N-羧基环内酸酐的红外图谱。

图8是本发明实施例4中所述的引发剂、重复单元和聚多肽的红外图谱。

图9是本发明实施例7中制备的肽类树状大分子自组装体的透射电镜（TEM）照片。

图10是本发明实施例7中制备的肽类树状大分子自组装体的扫描电镜（SEM）照片。

图11是本发明实施例8中按照不同投料比制备的一系列肽类树状大分子自组装体的粒径分布曲线。

图12是本发明所述肽类树状大分子自组装体的形成原理及制备流程图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。以下实施例中所述原料均为市售。

实施例1：肽类树状大分子的制备

分别选取（n=3）、

（n=4）、

（n=4）、

（n=6）、

（n=8）中的一种作为支化核，以赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸或天冬氨酸中的一种或几种作为支化单元，制得一系列一至四代的肽类树状大分子。其结构式如式1或式2所示。

本实施例中所述缩合剂、催化剂、有机碱、溶剂，可选择现有技术中已知的用于羧基与氨基的脱水缩合的各种缩合剂、催化剂、有机碱、溶剂。

实施例2： 肽类树状大分子的具体合成例(合成路线如图1)

一代肽类树状大分子（G1-Poss-Lys-Boc）的合成

称取2.0g 笼型八聚(3-氨丙基)倍半硅氧烷盐酸（OAS·HCl）(化合物1，本课题组合成)、8.0g HBTU和2.5g HOBT 加入到100ml 单颈瓶中，将5.0gBoc-lys(Boc)-OH加入50ml 恒压滴液漏斗中，抽真空，充氮气。用注射器加入约40ml 重蒸过的DMF 溶剂，冰浴搅拌下加入3ml 的DIEA，继续搅拌半小时后撤去冰浴，改为室温下反应48h。减压除去溶剂后，加入氯仿溶解，依次用饱和NaHCO₃、NaHSO₄、NaCl洗涤。用无水MgSO₄ 干燥后，旋除溶剂，在乙腈中重结晶，得到白色粉状固体G1-Poss-Lys-Boc。1HNMR (400 MHz, DMSO) δ 8.31 (s, 1H), 6.72 (s, 4H),3.80 (t, J= 25.2 Hz, 2H), 3.14 –2.80 (m, 9H), 2.51 (s,1H), 1.45 (d, J= 7.0 Hz, 9H), 1.37 (s, 47H), 0.55 (d, J=5.6 Hz, 5H)。

脱保护

将1.0g的G1-Poss-Lys-Boc 白色粉末，加入6ml的三氟乙酸（TFA），室温反应6h。减压旋去TFA，用油泵抽干，加入无水乙醚搅拌有白色沉淀产生，得到化合物2。产物无需提纯，直接用于下步反应。产物无需提纯，直接用于下步反应。

二代肽类树状大分子（G2-Poss-Lys-Boc）的合成

重复G1-Poss-Lys-Boc 的合成步骤，合成G2-Poss-Lys-Boc。1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.32 (s, 1H), 8.05–7.58 (m, 3H), 6.72 (s, 4H), 4.23 (s, 1H), 3.76 (d, J=57.3 Hz, 2H), 2.88 (s, 9H), 2.51 (s, 1H), 1.49 (d, J= 24.1Hz, 8H), 1.67 –0.81 (m, 63H), 1.67 –0.82 (m, 63H),0.57 (s, 2H)。

脱保护与纯化

将1.0g 的G1-Poss-Lys-Boc 的白色粉末，加入5ml的三氟乙酸，室温反应6h。减压旋除TFA，用油泵抽干，加入无水乙醚搅拌有白色沉淀产生，得到化合物3。将得到的G2 肽类树状大分子溶于去离子水中，用Na₂CO₃ 调节pH 值，透析3d，冷冻干燥备用。

经核磁共振检测（见图4和图5）显示通过该方法成功制备了一代和二代肽类树状大分子。为进一步对所合成的化合物进行确定，还使用质谱仪（美国Waters 公司，Q-TOF premier）对所得化合物的分子量进行了测定。结果也证实所得产物是目标化合物。

实施例3： 端基功能化短肽的制备

a）中间体N-羧基环内酸酐的合成：

通过调整反应原料中氨基酸的种类制备出一系列如式3或式4所示的端基功能化短肽。式3和式4中，Gm 代表m代的树枝状分子，m可以为0、1、2、3或4，其支化单元为氨基酸，式3中为阴离子支化单元，可为谷氨酸或天冬氨酸等，式4中为阳离子型支化单元，可为赖氨酸和精氨酸或组氨酸等；R表示主链氨基酸的侧基，n表示聚合度，所述主链氨基酸为脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸，所述主链氨基酸为亮氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸中的至少一种时，最终制得的自组装体具有温敏特性。

实施例4： 端基功能化短肽的合成例一(合成路线如图2)

中间体N-羧基-L-亮氨酸-环内酸酐(L-Leu-NCA)的合成

称取2.0g 干燥无水的苄氧羰基- 亮氨酸(Cbz-Leu)，加入装有回流冷凝管、恒压滴液漏斗、碱吸收装置的三口瓶中，在氮气保护下溶于20ml 无水THF 中，磁力搅拌并升温至40℃。将4ml 的SOCl₂加入恒压滴液漏斗中，控制滴加速度，恒温下反应4h。把反应液倒入过量的无水正己烷中，在低温静置12h。在干燥的条件下，将得到白色沉淀用无水乙酸乙酯/无水正己烷反复重结晶3 次，真空干燥得到白色针状晶体(化合物4)。核磁共振图谱（图6）和傅里叶-红外光谱分析结果（图7）均证实所得到的产物为N-羧基-L-亮氨酸-环内酸酐。

开环聚合

按照摩尔比1:10 的比例，准确称取干燥处理后的谷氨酸和L-Leu-NCA 投入反应瓶中，抽真空然后通入氮气保护。加入DCM/DMF 的混合溶剂，磁力搅拌，在常温下反应48h。反应液在搅拌下滴加到过量的无水乙醇中得到白色沉淀。沉淀过滤，用乙醚洗涤、干燥得白色固体产物(化合物5)。傅里叶-红外光谱分析结果（图8）证实通过此法成功合成了一种端基功能化的聚亮氨酸短肽。

实施例5：端基功能化短肽的合成例二（合成路线如图3）

将叔丁氧羰基保护的谷氨酸（Boc-Glu-COOH）和过量的苄基保护的谷氨酸（H-Glu(OBzl)-OBzl）在氮气保护下, 通过HOBT/EDC/DIEA 催化缩合,在CH₂Cl₂ 中常温反应24 h. 用饱和NaHCO₃ 溶液、NaHSO₄ 溶液、饱和NaCl 溶液反复洗涤产物. 对产物浓缩后在二氯甲烷/正己烷中重结晶, 过滤干燥后得到谷氨酸二代(G2-Glu)（产物1）；

谷氨酸二代(G2-Glu)在氮气保护下, 用TFA 脱除Boc 保护, 减压除去TFA, 得到产物2. 产物2 在氮气保护下加入到Boc-Glu-COOH 中, 通过HOBT/EDC/DIEA 催化缩合, 常温反应24 h. 用饱和NaHCO₃ 溶液、NaHSO₄溶液、饱和NaCl 溶液反复洗涤数次. 利用硅胶柱过柱分离, 得到聚谷氨酸三代树枝状大分子(G3-Glu)(产物3)；

聚谷氨酸三代树枝状大分子(G3-Glu)在氮气的保护下, 用TFA 脱除Boc 保护, 减压除去TFA 得到产物4. 将产物4 在NaOH 醇溶液中调节pH 值, 充分搅拌, 旋干溶剂, 将固体溶于CH₂Cl₂, 滤除固体, 将滤液旋干待用；

N-羧基-L-苯丙氨酸-环内酸酐(NCA-Phe)的合成：称取无水干燥的苄氧羰基-苯丙氨酸(Cbz-Phe),在氮气保护下溶于20 mL 无水THF 中, 升温至40 ℃，将SOCl₂ 滴入上述反应体系, 反应4 h. 把反应液加入过量无水正己烷中, 低温静置12 h. 将得到的白色沉淀用无水乙酸乙酯/无水正己烷反复重结晶3 次,真空干燥得到白色针状晶体；

按照摩尔比1:10 的比例, 准确称取干燥处理后的大分子引发剂和L-Phe-NCA 投入反应瓶中, 抽真空后通入氮气保护. 加入DCM/DMF 混合溶剂, 室温反应48 h, 得到产物5. 在压力约为0.8 MPa 的高压釜中, 以Pd/C 为催化剂, 加入H₂, 室温反应24 h, 脱去OBzl. 过滤分离, 减压除去溶剂和苄醇。得到端基功能化短肽。通过核磁和傅里叶-红外光谱验证所得产物为目标化合物。

实施例6：肽类树状大分子自组装体的制备

分别将实施例1和实施例3制备的肽类树状大分子和端基功能化短肽按照一定质量比例溶解在共溶剂中（表面带正电荷的肽类树状大分子与阴离子化疏水短肽相混合，表面带负电荷的肽类树状大分子与阳离子化疏水短肽相混合），在超声条件下使两组份充分复合，实现一级自组装，形成两亲性自组装前驱体；

在超声的条件下将上述溶液溶缓慢的滴加入去离子水中，通过亲疏水作用实现二级自组装，形成自组装体。制备出一系列肽类树状大分子自组装体。

实施例7：肽类树状大分子自组装体合成例

首先，称取30mg 实施例4或实施例5中制备的端基功能化短肽，先溶于少量三氟乙酸中，在超声条件下，将预溶解的短肽再溶解于30ml 的DMF 中，配成1mg/ml 的短肽溶液。同时取30mg实施例2中制备的分离纯化后的G2 肽类树状大分子溶于30ml 的DMF 中，配成1mg/ml 的溶液。

在超声条件下，按照不同比例将二组分混合，肽类树状大分子外围氨基和短肽的羧基端在弱相互作用下形成自组装单元。此时，将去离子水缓慢加入，并不断超声，去离子水作为超疏水短肽的不良溶剂，使疏水片段自动向内塌陷形成内核，肽类树状大分子形成自组装体的外壳。

通过透射电镜（TEM）表征肽类树状大自组装体的形成，如图9 所示。控制试样为总质量浓度100μg/ml，肽类树状大分子与功能化短肽的质量比分别为20:1（A）和1:1(B)；图9(A)显示了两组份在20:1 比例下自组装体的形貌，观察到了典型的球形自组装体系，且粒径分布较窄（约100nm），分散性良好。更重要的是，在自组装体外围可以观察到肽类球形树状大分子，其中的一些纳米粒子具有明显的核壳结构。A 图中的局部放大图清晰的显示了形成以疏水短肽密堆积内核、以肽类树状大分子为外壳的大分子自组装系统。图9（B）显示了在两组份比例为1:1 自组装体的形貌，随着疏水短肽比例的增加，短肽形成的内核体积逐渐增大，因此，在TEM 照片中每个肽类树状大分子的自组装体的核-壳结构更加显而易见。

图10为总质量浓度为100μg/ml，肽类树状大分子与短肽质量比为10:1 的SEM 形貌，显示了球形的自组装体和自组装体外围肽类球形树状大分子。结合TEM 和SEM 形貌的表征都直观的证明了肽类树状大分子体系的形成，通过络合作用形成的肽类树状大分子-短肽自组装单元在亲疏水作用的驱动下，形成了疏水的短肽内核，大量的球形树状大分子外壳。通过这种功能化短肽与肽类树状大分子非共价结合的方式，巧妙的驱动了肽类树状大分子的自组装行为；该自组装体的外围功能团的个数将达到单一肽类树状大分子功能团个数的成百上千倍。同时，随着疏水短肽的比例增加，自组装体形态呈现出了由球形向梭形转变的趋势。

实施例8：肽类树状大分子与功能化短肽的比例对自组装体系大小及形态的影响

首先，研究肽类树状大分子与功能化短肽的比例对自组装体系大小及形态的影响，在控制总质量浓度为50μg/ml 的条件下，计算配置30ml 溶液所需的总质量，按照两组分的比例计算出需要量取肽类树状大分子溶液和功能化短肽溶液的体积。将肽类树状大分子的溶液和功能化短肽的溶液依次加入螺口瓶中，然后滴加入短肽的不良溶剂驱动自组装体系形成，直至总质量浓度达到50μg/ml。

接着，控制不同总质量浓度(10μg/ml、100μg/ml)，研究肽类树状大分子和功能化短肽在质量比例一样的情况下，总质量浓度对自组装体系大小及形态的影响。

利用动态光散射(DLS)测定不同样品的粒径，结果如图11 所示。在总质量浓度一定的情况下，自组装体的粒径随着疏水短肽的比例增加而增大，从几十纳米增加到了几百纳米。当肽类树状大分子比例大于短肽时，有足够的肽类树状大分子来稳定超疏水短肽形成的内核，因此形成曲率较大、粒径较小的自组装体；随着超疏水的短肽比例增大时，肽类树状大分子形成的亲水外壳为了能够让更多的疏水短肽塌陷形成核，自组装体趋向于形成曲率较小，粒径较大的纳米粒子；随着短肽比例的继续增大，自组装体的形态可能向梭形过渡，甚至进一步形成棒状结构，SEM 图像也呈现了这一变化。

同时，我们研究了总物质量浓度对自组装体系的影响。从粒径的变化趋势上看，在肽类树状大分子的比例远高于短肽时，总质量浓度对粒径的影响不大，因为此时溶液中有足量的肽类树状大分子来形成自组装体的外壳，甚至还存在多余游离的肽类树状大分子。当肽类树状大分子的比例逐渐降低时，总物质量浓度高的实验组粒径增大较快，因为在二者比例一定情况下，总质量浓度大的组在单位体积内所含的疏水短肽较多，故粒径增大的趋势更大。总质量浓度为100μg/ml 的实验组，当肽类树状大分子与短肽比例为1:10 时，动态光散射DLS 无法表征，溶液的澄清度下降，可能是由于形成的自组装体形态已经偏离球形较远。实验数据也表明，在总物质量浓度一定时，PDI值随着肽类树状大分子比例减小而增大；肽类树状大分子和短肽比例一定时，总质量浓度低的溶液中自组装体的粒径分布较窄，总质量浓度为10μg/ml 的体系，PDI 值在0.2-0.4 之间。

当总物质量100μg/ml 时，肽类树状大分子与短肽比例为10：1，通过原子力显微镜（AFM）形貌表征观察到粒径为250nm 左右的自组装体，自组装体的边缘清晰，形状规则，粒径大小与分布DLS 的结果相映证。

通过TEM、SEM、AFM 及DLS 的形貌表征和实验数据，充分证明了，通过在肽类树状大分子外围引入功能化的疏水短肽为肽类树状大分子，可以成功驱动肽类树状大分子在弱相互作用下形成可调控的大分子自组装体系。

实施例9：粘度法研究自组装单元的弱相互作用和自组装体系的形成。

在实施例6所述的肽类树状大分子自组装体的制备过程中。

在共溶剂中，分别用1mg/ml 的肽类树状大分子溶液和1mg/ml 的短肽溶液，配制肽类树状大分子质量分数为0.1, 0.3, 0.5, 0.7, 0.9 的溶液。利用毛细管粘度计测定并计算各组的比浓粘度。

取总质量分数为50μg/ml 自组装体系，对肽类树状大分子和功能化肽短不同比例的体系进行了比浓粘度的测定。

在共溶剂中，肽类树状大分子外围大量的氨基与功能化短肽端基的羧基之间存在氢键作用、静电作用等弱相互作用，这些弱相互作用驱动两组分单元形成络合分子。对肽类树状大分子进行非共价键合的修饰是解决驱动肽类树状大分子自组装驱动力问题关键性的一步；而且，这种非共价修饰既降低了合成难度，更重要的是在自组装过程中非共价修饰的短肽具有更高的可活动性和可调整性，并且能够驱动自组装为肽类树状大分子自组装体系。整个过程如图12所示。

在质量总浓度为1mg/ml 共溶剂体系中，通过测定肽类树状大分子和功能化短肽的比浓粘度随着组成比例变化而改变，证明两组分通过弱相互作用形成了肽类树状大分子与短肽的络合物（表1）。共溶剂中质量的总浓度远小于两组分各自分子的临界交叠浓度；根据比浓粘度的定义，在总质量浓度一定的情况下，若两组分之间无特殊作用力，比浓粘度值为线性加和值。表1 中的实验测定值均高于两组分线性加和计算值，说明在共溶剂中两组分单元之间的确存在弱相互作用，使体系的比浓粘度增大，证明了两组分之间的确存在非共价作用并形成了络合组装单元。

在总质量浓度为100μg/ml 水溶液中，自组装单元被驱动形成为一个自组装系统，这种自组装体应该能使整个体系的比浓粘度远高于两组份比浓粘度根据质量分数的线性加和值。表2 中的实验数据显示，自组装体系的比浓粘度值均明显高于线性加和值，也进一步证明了自组装单元在水的驱动下形成了大分子自组装体，从而比浓粘度值增大。

在共溶剂体系和水溶液体系中的粘度实验分别证明了肽类树状大分子和端基功能化短肽形成了弱相互作用的络合物，以及在水溶液形成肽类树状大分子自组装体。

实施例10：可见分光光度法测定自组装体系的浊度

取1ml 的短肽溶液（1g/ml），分别加入0，50，100，200，500，800，1000（单位μg）的肽类树状大分子，超声至完全溶解。然后滴加去离子水稀释至10ml，使短肽的浓度为100μg/ml。利用紫外-可见分光光度计，设定可见光波长为500nm，测定可见光的透过率，表征溶液的浊度。

取总质量浓度为100μg/ml，肽类树状大分子和短肽组成比例不同试样进行测试，设定可见光波长为500nm，测定可见光的透过率，表征溶液的浊度。

结果表明 , 当疏水性的短肽与肽类树状大分子形成络合自组装单元并驱动形成自组装体时，由于肽类树状大分子具有良好的水溶性，与其非共价结合的疏水短肽的水溶性就能得到提高。在只含有疏水短肽溶液中，逐渐加入水溶剂，疏水短肽将逐渐析出甚至团聚，可见光的透过率低；加入一定量的肽类树状大分子，增加了疏水短肽的水溶性，使得自组装体系的浊度下降；随着加入肽类树状大分子的量增加，溶液体系的浊度逐渐减小，但在减小的趋势逐渐减小，因为有足量的肽类树状大分子与疏水短肽形成稳定体系，溶液中甚至出现多余游离的肽类树状大分子。

在总质量浓度为100μg/ml 的自组装体系，体系的浊度也随着组成比例的变化而变化。在10:1 至1:10 之间存在突越转变。我们可以分析，二代肽类树状大分子与短肽的分子量之比约为5:1，单位摩尔数的肽类树状大分子与功能化短肽-NH2 和-COOH 比为8:1；所以当肽类树状大分子与短肽的质量比为5:8 时，二者具有当量的官能度。当肽类树状大分子外围络合的疏水短肽增加时，树状大分子的水溶性将降低；当肽类树状大分子外围络合的短肽数目达到完全饱和时，络合单元将失去自组装能力，甚至以沉淀的方式析出。所以，浊度的突越范围应该在二者质量比为5:8 的左右；而且也进一步映证了在DLS 的测试中，总质量浓度为100μg/ml，二组分质量比为1：10 的条件下无法测得粒径数据的合理性。

实施例11：

在实施6所述的肽类树状大分子自组装体的制备过程中，在所述共溶剂中加入一定比例的药物（如阿霉素，紫杉醇，喜树碱，甲氨蝶呤等）或基因，经过自组装后可获得药物载体或基因载体。药物或基因被包裹在所述自组装体的内核中。

实施例12：

在实施11所述的肽类树状大分子药物载体的制备过程中，

分别将实施例1中制备的肽类树状大分子和实施例3制备的主链氨基酸为亮氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸中的至少一种的端基功能化短肽以及阿霉素（DOX）按照一定质量比例溶解在共溶剂中（表面带正电荷的肽类树状大分子与阴离子化疏水短肽相混合，表面带负电荷的肽类树状大分子与阳离子化疏水短肽相混合），在超声条件下使三组份充分复合，实现一级自组装，形成两亲性自组装前驱体；

在超声的条件下将上述溶液缓慢的滴加入去离子水中，通过亲疏水作用实现二级自组装，形成自组装体。获得一系列具有温敏特性的载药粒子。

称取1mg上述载药纳米粒子溶解在1mLPBS（pH=7.4, 0.01M）中，然后将此溶液转移至透析袋（截留分子量=1000）。将透析袋置于装有25mL PBS（pH=7.4,0.01M）的离心管中。将所有离心管分成2组，每组3个平行样。分别将两组的样品置于37 ^oC和20 ^oC的恒温水浴摇床中并且分别在开始和0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h、36 h、48 h时从离心管中取出1mL溶液并立即补加1mLPBS以保证离心管中总的溶液体积不变。最后通过荧光光谱法测定每个时间点所取的溶液中DOX的浓度并以此绘制载药纳米粒子在不同温度条件下的释放曲线。

在37℃条件下，温敏性载体具有缓释效果，12小时的释放量约为40%，24小时的释放量约为75%，48小时的释放量约为90%。

在20 ℃条件下，前期存在微弱的渗透型释放，后期开始基本不释放，48小时的释放量仍然维持在30%左右。

Claims

1.一种肽类树状大分子自组装体，其特征在于：包括肽类树枝状大分子和端基功能化的短肽，所述短肽包括疏水端和亲水端，所述端基功能化是指让所述短肽的亲水端的表面电荷与所述肽类树枝状大分子表面电荷相反，所述肽类树枝状大分子与端基功能化的短肽通过弱相互作用形成自组装体。

2.如权利要求1所述的肽类树状大分子自组装体，其特征在于：所述肽类树枝状大分子为球形，所述短肽的亲水端是树枝化的肽类大分子。

3.如权利要求1所述的肽类树状大分子自组装体，其特征在于：所述自组装体为阳离子型肽类树状大分子组装体或阴离子型肽类树状大分子组装体，在所述阳离子型肽类树状大分子组装体中，肽类树状大分子表面带正电荷，短肽的亲水端带负电荷，所述阴离子型肽类树状大分子组装体中，肽类树状大分子表面带负电荷，短肽的亲水端带正电荷。

4.如权利要求3所述的肽类树状大分子自组装体，其特征在于：所述表面带正电荷的肽类树状大分子的结构式如下：

式1；

所述表面带负电荷的肽类树状大分子的结构式如下：

式2；

其中，Rn代表球形分子的核心分子，n代表核心分子的官能度，核心分子的官能度可以为3、4、6或8；R1、R2、R3、R4为氨基酸，其中R1、R3为一代氨基酸，R2、R4为二代氨基酸。

5.如权利要求4所述的肽类树状大分子自组装体，其特征在于：所述核心分子为

、

Figure 2013104915946100001DEST_PATH_IMAGE004

、

、

Figure 2013104915946100001DEST_PATH_IMAGE006

、

Figure 2013104915946100001DEST_PATH_IMAGE008

中的一种，R1为赖氨酸；R2为赖氨酸、精氨酸或组氨酸；R3为谷氨酸或天冬氨酸；R4为谷氨酸或天冬氨酸。

6.如权利要求3所述的肽类树状大分子自组装体，其特征在于：所述阳离子型肽类树状大分子自组装体中的短肽为阴离子化疏水短肽，其结构式如下：

------------------式3；

Figure 2013104915946100001DEST_PATH_IMAGE010

------------------式4；

其中，Gm 代表m代的树枝状分子，其支化单元为氨基酸； R表示主链氨基酸的侧基，n表示聚合度，所述主链氨基酸为脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸。

7.如权利要求6所述的肽类树状大分子自组装体，其特征在于：所述短肽的主链氨基酸为亮氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸中的至少一种。

8.一种如权利要求1-7中任意一个所述的肽类树状大分子自组装体的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

1) 制备肽类树状大分子；

2）通过N-羧基环内酸酐开环聚合，制备端基功能化短肽；

4）在超声的条件下将上述溶液溶缓慢的滴加入极性溶剂中，通过亲疏水作用实现二级自组装，形成自组装体。

9.一种如权利要求1-7中任意一个所述的肽类树状大分子自组装体的表征方法，其特征在于，在权利要求8所述的制备过程中，通过检测溶液的粘度来研究肽类树状大分子组装体组装过程，具体为：分别测定肽类树状大分子、端基功能化短肽及其二者在共溶剂中和极性溶剂中的粘度，通过对比混合溶液的比浓粘度与各组分的比浓粘度的线性加和值判断组分间是否存在弱相互间作用力。

10.如权利要求1-7中任意一个所述的肽类树状大分子自组装体的应用，其特征在于，将其用作基因载体或药物载体。