CN107261112A - 一种手性树状肽类大分子作为自噬诱导肽类药物的应用 - Google Patents

一种手性树状肽类大分子作为自噬诱导肽类药物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种手性树状肽类大分子作为自噬诱导肽类药物的应用；所述药物包括官能度大于等于2的核心分子和手性氨基酸支化单元；本发明药物具有诱导自噬作用，诱导的自噬为时间依赖性、浓度依赖性和代数依赖性；为手性树状肽类大分子药物的发展提供了全新的方向，并且有助于人工合成具有生理活性的手性肽类大分子药物用于以后的临床治疗。

Description

一种手性树状肽类大分子作为自噬诱导肽类药物的应用
技术领域
本发明属于肽类大分子药物领域，具体涉及一种手性树状肽类大分子作为自噬诱导肽类药物的应用。
背景技术
肽类药物因其高的生物学活性、低的毒副作用而备受新药创制与开发领域的关注，然而经典线型和环状肽类药物存在诸多问题(如溶解性差、摄取率低等)限制了其医学转化与临床应用；最新研究进展表明，开发新型树枝状结构的肽类药物有望解决现有肽类药物的缺陷、创造出高生物活性分子；例如我们报道的首例树状大分子抗肿瘤药物(Zhang,X.；Zhang,Z.；Xu,X.；Li,Y.；Li,Y.；Jian,Y.；Gu,Z.,Bioinspired therapeuticdendrimers as efficient peptide drugsbased on supramolecular interactions fortumor inhibition.Angew.Chem.Int.Ed.2015,54,4289-4294.)；另一方面，现有肽类药物的药理作用和活性都有待拓展和提升；例如目前临床应用肽类自噬诱导剂往往来源于天然活性蛋白(如Beclin-1)，缺乏人工设计与合成的肽类自噬诱导实体药物；调控细胞自噬成为了多种疾病治疗的重要策略(如神经退行性疾病、代谢异常和恶性肿瘤等)；因而，研制易于合成制备、生物活性高的新型肽类自噬诱导剂具有重要意义。
细胞内蛋白质或细胞器的受损与蓄积是驱动细胞自噬的重要诱因；基于这一生命现象的启迪，以手性D-氨基酸为基元、以树状结构为分子骨架，我们设计与开发了一类仿天然蛋白的肽类自噬诱导剂；该新型肽类自噬诱导剂分子结构精确可控、溶解性/稳定性优越、易于细胞摄取和利用，是一种广谱性的自噬诱导剂，具有广阔的医学转化与临床应用前景。
发明内容
本发明提供一种利用纯手性树状肽类大分子精确的分子结构，立体化学结构和三维纳米结构模拟天然蛋白结构的具有自噬诱导效果的手性肽类大分子作为自噬诱导肽类药物的应用。
本发明采用的技术方案是：一种手性树状肽类大分子作为自噬诱导肽类药物的应用，所述手性树状肽类大分子结构如下：
其中：A代表手性氨基酸树枝单元即手性氨基酸支化单元，为D-氨基酸或L-氨基酸。
进一步的，所述手性树状肽类大分子具有诱导肿瘤自噬的作用
进一步的，所述手性树状肽类大分子中的D型树状肽类大分子在胰蛋白混合酶溶液中具有生物稳定性。
进一步的，所述手性树状肽类大分子可引起自噬流。
进一步的，所述手性树状肽类大分子中的D型树状肽类大分子可在自噬溶酶体内富集。
进一步的，所述手性树状肽类大分子中的D型树状肽类大分子可促进化疗药物对肿瘤细胞的作用。
进一步的，所述手性树状肽类大分子中的D型树状肽类大分子可克服肿瘤多药耐药性。
进一步的，所述手性树状肽类大分子可诱导HepG2细胞，HeLa细胞，A549细胞，4T1细胞，B16细胞，MCF-7细胞，SKOV3细胞自噬。
进一步的，所述手性树状肽类大分子引起的自噬流机制为手性依赖性的。
进一步的，所述手性树状肽类大分子引起的自噬流机制为时间依赖性、浓度依赖性和代数依赖性的。本发明的有益效果是：
(1)本发明利用纯手性树状肽类大分子精确的分子结构，立体化学结构和三维纳米结构来模拟天然蛋白结构作为一种自噬诱导肽类药物；
(2)本发明对不同的肿瘤细胞系，都能起到有效的诱导自噬；
(3)本发明为纯手性树状肽类大分子药物在治疗相关疾病方面的应用开辟了新的方向。
附图说明
图1是本发明实施例1中所述纯手性树状肽类大分子的细胞摄取速率图。
图2是本发明实施例1中所述纯手性树状肽类大分子与胰蛋白酶溶液孵育不同时间的荧光强度变化图。
图3是本发明实施例1中所述纯手性树状肽类大分子与胰蛋白酶溶液孵育不同时间的荧光成像图。
图4是本发明实施例1中所述纯手性树状肽类大分子与胰蛋白酶溶液孵育不同时间的荧光成像图的定量图。
图5是本发明实施例1中所述不同代数的纯手性树状肽类大分子处理HepG2细胞的MDC染色图。
图6是本发明实施例1中所述纯手性树状肽类大分子处理HepG2细胞的MDC染色图。
图7是本发明实施例1中所述纯手性树状肽类大分子处理HepG2细胞的MDC荧光流式统计图。
图8是本发明实施例1中所述纯手性树枝状肽类大分子处理HepG2细胞的AO染色图。
图9是本发明实施例1中所述纯手性树状肽类大分子处理HepG2细胞的AO流式统计图。
图10是本发明实施例1中所述纯手性树枝状肽类大分子处理HepG2细胞的TEM图。
图11是本发明实施例1中所述纯手性树枝状肽类大分子处理HepG2细胞的蛋白电泳图。
图12是本发明实施例1中所述纯手性树枝状肽类大分子处理HepG2细胞的蛋白电泳定量图。
图13是本发明实施例1中所述纯手性树枝状肽类大分子与自噬抑制剂共处理HepG2细胞的蛋白电泳图。
图14是本发明实施例1中所述纯手性树状肽类大分子对HepG2肿瘤裸鼠处理的冰冻切片图。
图15是本发明实施例1中所述纯手性树状肽类大分子处理HepG2细胞的mRFP-GFP-LC3图。
图16是本发明实施例1中空白组HepG2细胞的mRFP-GFP-LC3图。
图17是本发明实施例1中空白组HepG2细胞的mRFP-GFP-LC3点数统计图。
图18是本发明实施例1中所述纯手性(G4L-DPs)树状肽类大分子处理HepG2细胞的mRFP-GFP-LC3图。
图19是本发明实施例1中所述纯手性(G4L-DPs)树状肽类大分子处理HepG2细胞的mRFP-GFP-LC3点数统计图。
图20是本发明实施例1中所述纯手性(G4D-DPs)树状肽类大分子处理HepG2细胞的mRFP-GFP-LC3图。
图21是本发明实施例1中所述纯手性(G4D-DPs)树状肽类大分子处理HepG2细胞的mRFP-GFP-LC3点数统计图。
图22是本发明实施例1中所述纯手性树状肽类大分子处理表达mRFP-LC3的HepG2细胞溶酶体共定位图。
图23是本发明实施例1中所述纯手性树状肽类大分子处理多种肿瘤细胞的MDC染色图。
图24是本发明实施例1中所述纯手性树状肽类大分子处理MCF-7细胞的MDC荧光强度定量图。
图25是本发明实施例1中所述纯手性树状肽类大分子处理MCF-7/R细胞的MDC荧光强度定量图。
图26是本发明实施例1中所述纯手性树枝状肽类大分子结合化疗药物治疗MCF-7肿瘤细胞的细胞毒性图。
图27是本发明实施例1中所述纯手性树枝状肽类大分子结合化疗药物治疗MCF-7/R肿瘤细胞的细胞毒性图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。
一种手性树状肽类大分子作为自噬诱导肽类药物的应用，所述手性树状肽类大分子结构如下：
其中：A代表手性氨基酸树枝单元即手性氨基酸支化单元，为D-氨基酸或L-氨基酸。
进一步的，所述手性树状肽类大分子具有诱导肿瘤自噬的作用
进一步的，所述手性树状肽类大分子中的D型树状肽类大分子在胰蛋白混合酶溶液中具有生物稳定性。
进一步的，所述手性树状肽类大分子可引起自噬流；所述手性树状肽类大分子药物中的L型树状肽类大分子药物在细胞内因被降解，只能引起微弱的自噬流；而D型树状肽类大分子药物在细胞内具有优良的生物稳定性可引起持续强烈的自噬流。
进一步的，所述手性树状肽类大分子中的D型树状肽类大分子可在自噬溶酶体内富集。
进一步的，所述手性树状肽类大分子中的D型树状肽类大分子可促进化疗药物对肿瘤细胞的作用。
进一步的，所述手性树状肽类大分子中的D型树状肽类大分子可克服肿瘤多药耐药性。
进一步的，所述手性树状肽类大分子可诱导HepG2细胞，HeLa细胞，A549细胞，4T1细胞，B16细胞，MCF-7细胞，SKOV3细胞自噬。
进一步的，所述手性树状肽类大分子引起的自噬流机制为手性依赖性的。
进一步的，所述手性树状肽类大分子引起的自噬流机制为时间依赖性、浓度依赖性和代数依赖性的。
上述手性树状肽类大分子药物遵循以下是原则设计合成：
(1)手性树状肽类大分子药物具有多官能度(至少为2)的核心分子和纯手性氨基酸树枝单元；
(2)纯手性氨基酸树枝单元为碱性氨基酸中的一种；
(3)手性树状肽类大分子代数不低于三代，手性氨基酸数量不低于16个。
本发明中的手性树状肽类大分子药物，采用液相发散法合成；通过质谱和核磁共振氢谱证实合成的手性树状肽类大分子的分子量，并证实合成产物是目的肽类大分子。
具体制备方法如下：
制备手性树状肽类大分子的原料必须为纯手性氨基酸，且手性纯度须达到99.9％以上；
1)一代纯手性树状肽类大分子(G1L-DPs)的合成
1a)、缩合反应
精密称取10.0g原料Boc-lys(Boc)-OH,11.2g缩合剂0-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)和4.9g催化剂1-羟基苯并三唑(HOBT)加入到100mL支管瓶中，抽真空，通氮气；用注射器加入约40mL的DMF溶剂，冰浴搅拌下加入19.8mL有机碱N,N-二异丙基乙胺(DIPEA),然后用注射器缓慢加入1mL的三(2-氨基乙基)胺，在冰浴、搅拌、避光的条件下进行脱水缩合反应48h；减压除去溶剂后，加入氯仿溶解，依次用饱和食盐水，碳酸氢钠饱和溶液，稀盐酸在低温、避光条件下分别洗涤三次，收集有机相至锥形瓶中；向其中加入适量无水硫酸钠干燥过夜后抽滤，将滤液中的溶剂旋干后在低温、避光条件下过柱，分离得到纯产物为G1L-DPs(Boc)6；
1b)脱保护步骤
准确称取4.0g G1L-DPs(Boc)6，抽真空，通氮气，注入适量重蒸二氯甲烷溶解后，缓慢逐滴加入17.32mL三氟乙酸(TFA)，在冰浴、避光、搅拌、氮气保护的条件下反应12h，脱除保护，减压浓缩，加入乙醚搅拌过夜，静置，倾去上清液后将剩余的乙醚使用旋蒸旋干得到的白色固体即为G1L-DPs，无需提纯，直接用于下步反应；
2)二代纯手性树状肽类大分子(G2L-DPs)的合成
精密称取8.4g原料Boc-lys(Boc)-OH,12.1g缩合剂0-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU),4.0g G1L-DPs和4.3g催化剂1-羟基苯并三唑(HOBT)加入到100mL支管瓶中，抽真空，通氮气；用注射器加入约40mL的DMF溶剂，冰浴搅拌下加入17.5mL有机碱N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)；在冰浴、搅拌、避光的条件下进行脱水缩合反应48h；减压除去溶剂后，加入氯仿溶解，依次用饱和食盐水，碳酸氢钠饱和溶液，稀盐酸在低温、避光条件下分别洗涤三次，收集有机相至锥形瓶中；向其中加入适量无水硫酸钠干燥过夜后抽滤，将滤液中的溶剂旋干后在低温、避光条件下过柱，分离得到纯产物为G2L-DPs(Boc)12；
1b)、脱保护步骤
准确称取3.3g G2L-DPs(Boc)12，抽真空，通氮气，注入适量重蒸二氯甲烷溶解后，缓慢逐滴加入12.9mL三氟乙酸(TFA)，在冰浴、避光、搅拌、氮气保护的条件下反应12h，脱除保护，减压浓缩，加入乙醚搅拌过夜，静置，倾去上清液后将剩余的乙醚使用旋蒸旋干得到的白色固体即为G2L-DPs，无需提纯，直接用于下步反应；
3)、三代纯手性树状肽类大分子(G3L-DPs)的合成
精密称取7.0g原料Boc-lys(Boc)-OH,8.2g缩合剂0-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU),3.3g G2L-DPs和2.9g催化剂1-羟基苯并三唑(HOBT)加入到100mL支管瓶中，抽真空，通氮气；用注射器加入约40mL的DMF溶剂，冰浴搅拌下加入11.8mL有机碱N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)；在冰浴、搅拌、避光的条件下进行脱水缩合反应72h；减压除去溶剂后，加入氯仿溶解，依次用饱和食盐水，碳酸氢钠饱和溶液，稀盐酸在低温、避光条件下分别洗涤三次，收集有机相至锥形瓶中；向其中加入适量无水硫酸钠干燥过夜后抽滤，将滤液中的溶剂旋干后在低温、避光条件下过柱，分离得到纯产物为G3L-DPs(Boc)24；
1b)、脱保护步骤
准确称取0.7g G3L-DPs(Boc)24，抽真空，通氮气，注入适量重蒸二氯甲烷溶解后，缓慢逐滴加入2.5mL三氟乙酸(TFA)，在冰浴、避光、搅拌、氮气保护的条件下反应14h，脱除保护，减压浓缩，加入乙醚搅拌过夜，静置，倾去上清液后将剩余的乙醚使用旋蒸旋干得到的白色固体即为G3L-DPs，无需提纯，直接用于下步反应；
4)四代纯手性树状肽类大分子(G4L-DPs)的合成
精密称取2.1g原料Boc-lys(Boc)-OH,2.4g缩合剂0-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)，0.7g G3L-DPs和0.7g催化剂1-羟基苯并三唑(HOBT)加入到50mL支管瓶中，抽真空，通氮气；用注射器加入约20mL的DMF溶剂，冰浴搅拌下加入2.6mL有机碱N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)；在冰浴、搅拌、避光的条件下进行脱水缩合反应72h；减压除去溶剂后，加入氯仿溶解，依次用饱和食盐水，碳酸氢钠饱和溶液，稀盐酸在低温、避光条件下分别洗涤三次，收集有机相至锥形瓶中；向其中加入适量无水硫酸钠干燥过夜后抽滤，将滤液中的溶剂旋干后在低温、避光条件下过柱，分离得到纯产物为G4L-DPs(Boc)48；
1b)、脱保护步骤
准确称取0.4g G4L-DPs(Boc)48，抽真空，通氮气，注入适量重蒸二氯甲烷溶解后，缓慢逐滴加入1.5mL三氟乙酸(TFA)，在冰浴、避光、搅拌、氮气保护的条件下反应18h，脱除保护，减压浓缩，加入乙醚搅拌过夜，静置，倾去上清液后将剩余的乙醚使用旋蒸旋干得到的白色固体即为G4L-DPs，无需提纯，直接用于下步反应；
将脱保护得到的一代、二代、三代、四代纯手性树状肽类大分子(L)溶于去离子水中，在低温、避光条件下透析三天，冷冻干燥备用；
11)一代纯手性树状肽类大分子(G1D-DPs)的合成
11a)、缩合反应
精密称取11.2g原料Boc-D-Lys(Boc)-OH,12.3g缩合剂0-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)和4.9g催化剂1-羟基苯并三唑(HOBT)加入到100mL支管瓶中，抽真空，通氮气；用注射器加入约40mL的DMF溶剂，冰浴搅拌下加入22.2mL有机碱N,N-二异丙基乙胺(DIPEA),然后用注射器缓慢加入1.1mL的三(2-氨基乙基)胺，在冰浴、搅拌、避光的条件下进行脱水缩合反应48h；减压除去溶剂后，加入氯仿溶解，依次用饱和食盐水，碳酸氢钠饱和溶液，稀盐酸在低温、避光条件下分别洗涤三次，收集有机相至锥形瓶中；向其中加入适量无水硫酸钠干燥过夜后抽滤，将滤液中的溶剂旋干后在低温、避光条件下过柱，分离得到纯产物为G1D-DPs(Boc)6；
11b)、脱保护步骤
准确称取5.4g G1D-DPs(Boc)6，抽真空，通氮气，注入适量重蒸二氯甲烷溶解后，缓慢逐滴加入23.38mL三氟乙酸(TFA)，在冰浴、避光、搅拌、氮气保护的条件下反应12h，脱除保护，减压浓缩，加入乙醚搅拌过夜，静置，倾去上清液后将剩余的乙醚使用旋蒸旋干得到的白色固体即为G1D-DPs，无需提纯，直接用于下步反应；
22)二代纯手性树状肽类大分子(G2D-DPs)的合成
精密称取11.3g原料Boc-D-lys(Boc)-OH,16.3g缩合剂0-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)，5.4g G1D-DPs和5.8g催化剂1-羟基苯并三唑(HOBT)加入到100mL支管瓶中，抽真空，通氮气；用注射器加入约40mL的DMF溶剂，冰浴搅拌下加入23.6mL有机碱N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)；在冰浴、搅拌、避光的条件下进行脱水缩合反应48h；减压除去溶剂后，加入氯仿溶解，依次用饱和食盐水，碳酸氢钠饱和溶液，稀盐酸在低温、避光条件下分别洗涤三次，收集有机相至锥形瓶中；向其中加入适量无水硫酸钠干燥过夜后抽滤，将滤液中的溶剂旋干后在低温、避光条件下过柱，分离得到纯产物为G2D-DPs(Boc)12；
1b)、脱保护步骤
准确称取4.3g G2D-DPs(Boc)12，抽真空，通氮气，注入适量重蒸二氯甲烷溶解后，缓慢逐滴加入17.1mL三氟乙酸(TFA)，在冰浴、避光、搅拌、氮气保护的条件下反应12h，脱除保护，减压浓缩，加入乙醚搅拌过夜，静置，倾去上清液后将剩余的乙醚使用旋蒸旋干得到的白色固体即为G2D-DPs，无需提纯，直接用于下步反应；
33)三代纯手性树状肽类大分子(G3D-DPs)的合成
精密称取8.4g原料Boc-D-lys(Boc)-OH,15.8g缩合剂0-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)，4.3g G2D-DPs和5.6g催化剂1-羟基苯并三唑(HOBT)加入到100mL支管瓶中，抽真空，通氮气；用注射器加入约40mL的DMF溶剂，冰浴搅拌下加入17.3mL有机碱N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)；在冰浴、搅拌、避光的条件下进行脱水缩合反应72h；减压除去溶剂后，加入氯仿溶解，依次用饱和食盐水，碳酸氢钠饱和溶液，稀盐酸在低温、避光条件下分别洗涤三次，收集有机相至锥形瓶中；向其中加入适量无水硫酸钠干燥过夜后抽滤，将滤液中的溶剂旋干后在低温、避光条件下过柱，分离得到纯产物为G3D-DPs(Boc)24；
1b)、脱保护步骤
准确称取1.0g G3D-DPs(Boc)24，抽真空，通氮气，注入适量重蒸二氯甲烷溶解后，缓慢逐滴加入3.7mL三氟乙酸(TFA)，在冰浴、避光、搅拌、氮气保护的条件下反应14h，脱除保护，减压浓缩，加入乙醚搅拌过夜，静置，倾去上清液后将剩余的乙醚使用旋蒸旋干得到的白色固体即为G3D-DPs，无需提纯，直接用于下步反应；
44)四代纯手性树状肽类大分子(G4D-DPs)的合成
精密称取4.8g原料Boc-D-lys(Boc)-OH,5.2g缩合剂0-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)，1.0g G3D-DPs和1.9g催化剂1-羟基苯并三唑(HOBT)加入到100mL支管瓶中，抽真空，通氮气；用注射器加入约40mL的DMF溶剂，冰浴搅拌下加入3.8mL有机碱N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)；在冰浴、搅拌、避光的条件下进行脱水缩合反应72h；减压除去溶剂后，加入氯仿溶解，依次用饱和食盐水，碳酸氢钠饱和溶液，稀盐酸在低温、避光条件下分别洗涤三次，收集有机相至锥形瓶中；向其中加入适量无水硫酸钠干燥过夜后抽滤，将滤液中的溶剂旋干后在低温、避光条件下过柱，分离得到纯产物为G4D-DPs(Boc)48；
1b)脱保护步骤
准确称取0.7g G4D-DPs(Boc)48，抽真空，通氮气，注入适量重蒸二氯甲烷溶解后，缓慢逐滴加入2.4mL三氟乙酸(TFA)，在冰浴、避光、搅拌、氮气保护的条件下反应18h，脱除保护，减压浓缩，加入乙醚搅拌过夜，静置，倾去上清液后将剩余的乙醚使用旋蒸旋干得到的白色固体即为G4D-DPs，无需提纯，直接用于下步反应；
将脱保护得到的一代、二代、三代、四代纯手性树状肽类大分子(D)溶于去离子水中，在低温、避光条件下透析三天，冷冻干燥备用；
所述催化剂HBTU、缩合剂HOBT、有机碱DIPEA、溶剂DMF、三(2-氨基乙基)胺以及三氟乙酸TFA均为色谱纯。
手性树状肽类大分子药物利用高效液相色谱法(HPLC)纯化，纯度分别都大于99.9％；手性树状肽类大分子药物利用圆二色谱技术进行肽类药物结构分析证实合成的手性肽类药物为一对对映异构体。
采用本发明制备的手性树状肽类大分子药物分别处理不同的肿瘤细胞系，HepG2细胞，HeLa细胞，A549细胞，4T1细胞，B16细胞，MCF-7细胞，SKOV3细胞，结果表明D型树状肽类大分子药物在各种肿瘤细胞中比起L型树状肽类大分子药物都能有效的诱导自噬；其中HepG2细胞为人肝癌细胞，HeLa细胞为人宫颈癌细胞，A549细胞为人肺癌细胞，4T1细胞为小鼠乳腺癌细胞，B16细胞为小鼠黑色素瘤细胞，MCF-7细胞为人乳腺癌细胞，SKOV3细胞为卵巢癌细胞。
手性树状肽类大分子药物分别处理HepG2细胞，结果表明，孵育时间越长，剂量越大，代数越高，D型树状肽类大分子药物比起L型树状肽类大分子药物能诱导更强烈的自噬；用手性树状肽类大分子药物和自噬抑制剂一起处理HepG2细胞，结果表明，手性树状肽类大分子药物引起自噬流过程；用D型树状肽类大分子药物和L型树状肽类大分子药物分别处理HepG2细胞，结构表明，随着孵育时间的延长，D型树状肽类大分子药物在体内外具有生物稳定性可引起持续强烈的自噬流，而L型树状肽类大分子药物因被降解循环利用，只能引起微弱的自噬流；本发明中纯手性树状肽类大分子工作原理如下：G4L-DPs或G4D-DPs有效的进入细胞之后，在细胞质内聚集，形成蛋白聚集体，然后激起细胞产生吞噬泡，将G4L-DPs或G4D-DPs和一些其他蛋白聚集体包裹在吞噬泡内，形成自噬小体，后者与溶酶体融合形成自噬溶酶体，自噬溶酶体会将G4L-DPs和一些其他蛋白聚集体降解成氨基酸等循环利用，而G4D-DPs在自噬溶酶体内不能被降解而富集，最后从自噬溶酶体内逃逸出再一次激起自噬，形成持续的自噬诱导。
具体实验过程如下：
荧光分子标记实验：
称取10.0mg G4L-DPs溶解于10mL的饱和碳酸氢钠溶液中，2.0mg的FITC(异硫氰酸荧光素)溶解于1mL的二甲基亚砜溶液中。将1％FITC(FITC的用量按照G4L-DPs分子外围氨基数目计算得到)加入到G4L-DPs溶液中，室温避光搅拌反应12h；将反应混合液在透析袋中透析两天，冻干可得到G4L-FITC-DPs，按照同样的方法可以得到G4D-FITC-DPs。
称取10.0mg G4L-DPs溶解于10mL的饱和碳酸氢钠溶液中，将1％Cy5.5(Cy5.5的用量按照G4L-DPs分子外围氨基数目计算得到)加入到G4L-DPs溶液中，室温避光搅拌反应12h。将反应混合液在透析袋中透析两天，冻干可得到G4L-Cy5.5-DPs，按照同样的方法可以得到G4D-Cy5.5-DPs。
构建荧光共振能量转移实验模型：
称取1.0mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)，0.6mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)和2.5mg G4L-FITC-DPs于25mL支管瓶中，抽真空，充氮气，加入15mL二甲基亚砜使其充分溶解，最后加入2％BHQ-1(BHQ-1的用量按照G4L-DPs分子外围氨基数目计算得到)，室温避光搅拌反应48h。将反应混合液在透析袋中透析两天，冻干可得到G4L-FITC-DPs-BHQ-1，按照同样的方法可以得到G4D-FITC-DPs-BHQ-1；纯手性树状肽类大分子荧光共振能量转移设计原理：G4L-DPs或G4D-DPs先标记上FITC荧光分子之后，会在激发波长为488nm下，有荧光信号出现，但是继续标记上BHQ-1荧光淬灭剂后，会将FITC的荧光有效的淬灭，即在激发波长为488nm下，无荧光信号出现，但是当G4L-DPs或G4D-DPs的分子结构遭到破坏之后，BHQ-1和FITC分离开，则BHQ-1不能有效的淬灭FITC荧光，此时FITC又能在波长为488nm激发下，有荧光信号出现。
细胞摄取实验：
将HepG2细胞以8×103个/每孔的密度均匀接种于黑色96孔板中，在培养箱中培养24h；用DMEM高糖培养基稀释G4L-FITC-DPs或G4D-FITC-DPs(10μg/mL)，然后分别加入100μL的G4L-FITC-DPs或G4D-FITC-DPs(10μg/mL)；分别孵育0.5h、1h、2h、3h、4h、6h、8h、12h、24h；上清液被收集在另外一块黑色96孔板，细胞用PBS洗三遍之后加入裂解液裂解一小时；然后用酶标仪检测上清液和细胞裂解液的荧光值，激发波长为488nm，发射波长为520nm；结果如图1所示，表明手性树状肽类大分子药物能够快速有效的入胞。
胰蛋白混合酶降解实验：
称取适量的胰蛋白酶，用PBS缓冲液配制最后得到1μg/mL的水溶液，配制标记好的G4L-FITC-DPs-BHQ-1和G4D-FITC-DPs-BHQ-1的浓度为100μg/mL；先取50μL胰酶溶液在37℃下孵育30min，再加入50μL的材料溶液，在37℃下缓慢振摇，分别孵育30min，1h，3h，6h，12h，24h，48h，用F-7000荧光分光光度计以激发波长为480nm，发射波长为500nm到650nm检测溶液荧光强度；结果如图2所示，结果表明随着孵育时间的增长，G4L-FITC-DPs-BHQ-1在胰蛋白混合酶溶液中被不断降解，导致FITC的荧光强度越来越大，而G4D-FITC-DPs-BHQ-1在胰蛋白混合酶溶液中有良好的生物稳定性，使FITC一直处于淬灭状态；同样，如图3和图4所示，荧光成像结果和其定量结果也表明在胰蛋白混合酶溶液中，G4L-FITC-DPs-BHQ-1的FITC荧光越来越强，而G4D-FITC-DPs-BHQ-1的FITC一直处于淬灭状态。
MDC染色：
将HepG2细胞，HeLa细胞，A549细胞，4T1细胞，B16细胞，MCF-7细胞，SKOV3细胞接种于玻底皿，大约为5×103个，在培养箱中培养24h；将G4L-DPs和G4D-DPs用培养基稀释使其浓度为100μg/mL，加入到玻底皿中；使用雷帕霉素(Rapa，50nM)为阳性对照组，同时加入到波底皿中，培养24h后用MDC(50μM)染色15min，用PBS洗三遍以激发波长405nm，发射波长530nm在激光共聚焦下观察荧光情况；结果如图5所示，手性树状肽类大分子药物诱导自噬为代数依赖性的过程，即代数越高，自噬诱导能力越强；如图6所示，手性树状肽类大分子药物诱导自噬为时间依赖性，浓度依赖性和手性依赖性过程，即时间越长，浓度越高，自噬诱导能力越强，并且G4D-DPs比G4L-DPs能有效的诱导自噬，表现为自噬阳性点数更多；如图23所示，表明G4D-DPs在多种肿瘤细胞内(HepG2细胞，HeLa细胞，A549细胞，4T1细胞，B16细胞，MCF-7细胞，SKOV3细胞)都能有效的诱导自噬；如图24所示，通过对MCF-7细胞MDC染色荧光强度定量分析表明，G4D-DPs对MCF-7细胞能有效的诱导自噬；如图25所示，通过对MCF-7/R细胞MDC染色荧光强度定量分析表明，G4D-DPs能有效的诱导MCF-7/R细胞自噬。
MDC流式：
将HepG2细胞接种于六孔板，大约为5×105个，在培养箱中培养24h，将G4L-DPs和G4D-DPs用培养基稀释使其浓度为100μg/mL，加入到六孔板中，培养24h后用MDC(50μM)染色15min，用胰酶将细胞收集于EP管中以1000rpm离心5min，用PBS洗三遍之后用流式细胞仪检测；结果如图7所示，表明G4D-DPs比G4L-DPs能有效的诱导自噬，表现为荧光强度更高。
AO染色：
将HepG2细胞接种于玻底皿，大约为5×103个，在培养箱中培养24h，将G4L-DPs和G4D-DPs用培养基稀释使其浓度为100μg/mL，加入到玻底皿中；使用雷帕霉素(50nM)为阳性对照组，同时加入波底皿中；培养24h后用吖啶橙(1μM)染色15min，用PBS洗三遍以激发波长488nm，发射波长530nm和640nm在激光共聚焦下观察荧光情况；结果如图8所示，表明G4D-DPs比G4L-DPs能有效的诱导自噬，表现为红色点更多，荧光强度更强。
AO流式：
将HepG2细胞接种于六孔板，大约为5×105个，在培养箱中培养24h，将G4L-DPs和G4D-DPs用培养基稀释使其浓度为100μg/mL，加入到六孔板中，培养24h后用AO(1μM)染色15min，用胰酶将细胞收集于EP管中以1000rpm离心5min，用PBS洗三遍之后用流式细胞仪检测；结果如图9所示，表明G4D-DPs比G4L-DPs能有效的诱导自噬，表现为红色荧光强度与绿色荧光强度的比例更高。
细胞透射电子显微镜(TEM)：
将HepG2细胞接种于六孔板，大约为5×105个，在培养箱中培养24h，将G4L-DPs和G4D-DPs用培养基稀释使其浓度为100μg/mL，加入到六孔板中，培养24h后用胰酶将细胞收集于EP管中以1500rpm离心15min，弃去上清液，缓慢加入0.5％戊二醛固定液，在四度静置15min。然后10000rpm离心15min，弃去上清液，缓慢加入3％的戊二醛固定液；结果如图10所示，表明G4D-DPs比G4L-DPs能有效的诱导自噬，表现为自噬小体和自噬溶酶体个数更多。
蛋白电泳(Western blot)：
Western blot检测步骤如下：细胞培养24h后，收集细胞用细胞裂解液(购自碧云天公司)裂解细胞，金属浴99度加热10min后，15％SDS-PAGE电泳后湿转法将蛋白转移到PVDF膜上；以LC3B antibody(购自Novus公司)(LC3B抗体)为一抗，β-actin antibody(购自Abcam公司)(β-actin抗体)为内参，anti-rabbit(购自Santa Cruz Biotechnology公司)为二抗进行蛋白电泳；结果如图11和12所示，结果表明G4D-DPs比G4L-DPs能有效的诱导自噬，表现为LC3-II/β-actin比例更高；同时如图13所示，手性树状肽类大分子药物与自噬抑制剂联用，表明手性树状肽类大分子药物诱导了一个自噬流。
冰冻切片分析：
小鼠的肿瘤组织被剥离，在冷冻机里(-20度)冻成硬块，制成5μm厚的切片；切片用带荧光的LC3一抗孵育之后用来评价体内的自噬水平；染色后的组织切片用倒置荧光显微镜成像；结果如图14所示，结果表明G4D-DPs比G4L-DPs能更有效的诱导自噬，表现为自噬体标记物LC3个数更多，荧光强度更强。
mRFP-GFP-LC3腺病毒转染：
将HepG2细胞接种于六孔板，大约为5×105个，在培养箱中培养24h，严格按照说明书的要求操作mRFP-GFP-LC3腺病毒转染细胞实验；36h后可得到稳定表达的mRFP-GFP-LC3的细胞，然后将HepG2细胞接种于玻底皿，大约为5×103个；在培养箱中培养24h，加入样品处理后用PBS洗三遍以激发波长488nm，发射波长530nm在激光共聚焦下观察GFP，激发波长584nm，发射波长640nm观察mRFP；结果如图15-21所示，实验结果表明G4D-DPs比G4L-DPs能引起更多的自噬，并且G4D-DPs能引起持续强烈的自噬流，而G4L-DPs伴随着时间的延长，在自噬流过程中被降解循环利用，导致自噬诱导能力降低；mRFP-GFP-LC3为双荧光自噬指示体系。
溶酶体共定位：
将稳定表达mRFP-GFP-LC3的HepG2细胞接种于玻底皿，大约为5×103个，在培养箱中培养24h；将G4L-Cy5.5-DPs和G4D-Cy5.5-DPs用培养基稀释使其浓度为100μg/mL，加入到波底皿中，分别培养1h和24h；用PBS洗三遍以激发波长405nm，发射波长422nm在激光共聚焦下观察Lyso-Tracker Blue，激发波长584nm，发射波长640nm观察mRFP，激发波长633nm，发射波长692nm观察G4L-Cy5.5-DPs和G4D-Cy5.5-DPs；结果如图22所示，结果表明随着孵育时间的延长，G4D-DPs和G4L-DPs能逐渐聚集到自噬溶酶体内，而G4L-DPs会逐渐被自噬溶酶体降解弥散到细胞质内，G4D-DPs不能被降解会在自噬溶酶体内富集。
细胞毒性实验：
MCF-7细胞，MCF-7耐药细胞培养在10％血清和1％双抗的DMEM高糖培养基中，并在37度条件下含5％的CO2的培养箱中贴壁生长；收集对数期生长的细胞用培养基稀释成8×104cell/mL，每孔100μL接种到96孔板中并孵育24h；吸走培养基，分别加入100μg/mL的G4L-DPs和G4D-DPs，孵育24h，然后在MCF-7细胞加入0.1μg/mL DOX.HCl；MCF-7耐药细胞加入5μg/mL DOX.HCl继续孵育24h；每孔用PBS洗涤三次，紧接着每孔加入含10μL的CCK-8试剂的无血清、双抗的100μL培养基，避光条件下在培养箱中孵育2h；每孔的吸光度在450nm处进行测定；相对细胞存活率根据一下公式来计算：细胞存活率＝(OD实验组-OD背景)/(OD对照组-OD背景)×100；结果如图26所示，，结果表明D型树状肽类大分子药物通过诱导自噬促进化疗药物对肿瘤细胞的治疗，并且如图27所示，表明D型树状肽类大分子药物通过诱导自噬还可逆转肿瘤多药耐药性。
本发明提供一种化学合成的纯手性树状肽类大分子药物，可作为一种自噬诱导肽的应用；作为第一例报道相关自噬诱导纯手性树状肽类大分子药物，这项工作不仅证实了纯手性树状肽类大分子可作为生物启发性的自噬诱导肽类药物的设想，也深入细致的研究了纯手性树状肽类大分子诱导自噬的过程和机制，而且为纯手性树状肽类大分子药物在治疗相关疾病方面开辟了一个全新的方向。

Claims (10)

1.一种手性树状肽类大分子作为自噬诱导肽类药物的应用，所述手性树状肽类大分子结构如下：
其中：A代表手性氨基酸树枝单元即手性氨基酸支化单元，为D-氨基酸或L-氨基酸。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述手性树状肽类大分子具有诱导肿瘤自噬的作用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述手性树状肽类大分子中的D型树状肽类大分子在胰蛋白混合酶溶液中具有生物稳定性。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述手性树状肽类大分子可引起自噬流。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述手性树状肽类大分子中的D型树状肽类大分子可在自噬溶酶体内富集。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述手性树状肽类大分子中的D型树状肽类大分子可促进化疗药物对肿瘤细胞的作用。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述手性树状肽类大分子中的D型树状肽类大分子可克服肿瘤多药耐药性。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述手性树状肽类大分子可诱导HepG2细胞，HeLa细胞，A549细胞，4T1细胞，B16细胞，MCF-7细胞，SKOV3细胞自噬。
9.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述手性树状肽类大分子引起的自噬流机制为手性依赖性的。
10.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述手性树状肽类大分子引起的自噬流机制为时间依赖性、浓度依赖性和代数依赖性的。
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