CN115518165A - 一种crgd序列肽修饰壳聚糖负载的pad4抑制剂在制备抗肿瘤转移药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂在制备抗肿瘤转移药物中的应用，属于医药技术领域。本发明提供了CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂在制备抗肿瘤转移药物中的应用，所述CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂包括CRGD序列肽修饰壳聚糖载体和负载于所述CRGD序列肽修饰壳聚糖载体表面的PAD4抑制剂，所述CRGD序列肽修饰壳聚糖载体中CRGD序列肽的半胱氨酸通过丙烯酰氯连接到壳聚糖表面。本发明所述CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂具有良好的主动靶向性和抗肿瘤活性，尤其是还具有良好的抗肿瘤转移活性，可以用于制备抗肿瘤转移药物。

Description

一种CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂在制备抗肿瘤 转移药物中的应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂在制备抗肿瘤转移药物中的应用。
背景技术
世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)发布了2021年全球最新癌症负担数据，该数据显示，2021年全球新发癌症病例1929万例，其中全球癌症死亡病例高达996万例。目前癌症的主要治疗手段是手术、放疗和化疗等传统治疗方法，具有一定局限性，如化疗的主要缺点是生物利用度差、治疗指数低以及任何补偿剂量增加都会显着增加正常细胞的细胞毒性。
多肽精氨酸脱亚胺酶4(Peptidylarginine deiminase 4，PAD4)是癌症的重要靶点之一。在大量人类患者样本的病理学研究中，PAD4在各种组织来源的大多数癌症中显著过度表达，表明PAD4可能在肿瘤发生中发挥作用。目前已有许多报道采用可逆和不可逆抑制剂来抑制PAD4的活性，并且治疗相关肿瘤疾病。
肿瘤转移是肿瘤治疗的主要障碍之一，是导致临床治疗失败、影响肿瘤患者长期生存的主要因素。如何阻断肿瘤的转移是提高肿瘤治疗水平及治愈肿瘤的关键。
发明内容
本发明的目的在于提供一种CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂在制备抗肿瘤转移药物中的应用，本发明所述CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂具有抗肿瘤转移活性，可以用于制备抗肿瘤转移药物。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂在制备抗肿瘤转移药物中的应用，所述CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂包括CRGD序列肽修饰壳聚糖载体和负载于所述CRGD序列肽修饰壳聚糖载体表面的PAD4抑制剂，所述CRGD序列肽修饰壳聚糖载体中CRGD序列肽的半胱氨酸通过丙烯酰氯连接到壳聚糖表面。
优选地，所述肿瘤为肺癌或乳腺癌。
优选地，所述抗肿瘤转移药物包括活性成分以及药学上可接受的辅料，所述活性成分为所述CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂；所述抗肿瘤转移药物中活性成分的含量为4～18wt％。
优选地，所述CRGD序列肽包括CRGDV、CRGDS和CRGDF中的一种或几种，所述CRGDV为半胱氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-缬氨酸，所述CRGDF为半胱氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸，所述CRGDS为半胱氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸。
优选地，所述PAD4抑制剂包括PAD4抑制剂4B、PAD4抑制剂3B、PAD4抑制剂3B-OH中的一种或几种；
所述PAD4抑制剂4B具有式1所示结构：
Figure BDA0003886797820000021
PAD4抑制剂3B具有式2所示结构：
Figure BDA0003886797820000022
所述PAD4抑制剂3B-OH具有式3所示结构：
Figure BDA0003886797820000023
优选地，所述CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂中PAD4抑制剂的负载量为4～18wt％。
本发明提供了一种CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂在制备抗肿瘤转移药物中的应用，所述CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂包括CRGD序列肽修饰壳聚糖载体和负载于所述CRGD序列肽修饰壳聚糖载体表面的PAD4抑制剂，所述CRGD序列肽修饰壳聚糖载体中CRGD序列肽的半胱氨酸通过丙烯酰氯连接到壳聚糖表面。本发明所述CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂具有良好的主动靶向性和抗肿瘤活性，尤其是还具有良好的抗肿瘤转移活性，可以用于制备抗肿瘤转移药物。
附图说明
图1为壳聚糖-CRGDV-4B的结构示意图；
图2为PAD4抑制剂4B(4B)、壳聚糖-CRGDV(K-CRGDV)及壳聚糖-CRGDV-4B(K-CRGDV-4B)的紫外光谱图；
图3为PAD4抑制剂4B的标准曲线图；
图4为肺部NS、壳聚糖-CRGDV-4B和PAD4抑制剂4B蛋白印迹结果图；
图5为肿瘤部位NS、壳聚糖-CRGDV-4B和PAD4抑制剂4B蛋白印迹结果图；
图6为Westernblot条带灰度值统计图
图7为不同受试组小鼠生长曲线；
图8为不同受试组小鼠瘤体积增长曲线；
图9为不同受试组小鼠脏体比统计图；
图10为不同受试组小鼠生化功能统计图；
图11为小鼠肺切片HE染色情况图。
具体实施方式
本发明提供了一种CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂在制备抗肿瘤转移药物中的应用，所述CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂包括CRGD序列肽修饰壳聚糖载体和负载于所述CRGD序列肽修饰壳聚糖载体表面的PAD4抑制剂，所述CRGD序列肽修饰壳聚糖载体中CRGD序列肽的半胱氨酸通过丙烯酰氯连接到壳聚糖表面。
在本发明中，所述CRGD序列肽优选包括CRGDV、CRGDS和CRGDF中的一种或几种，所述CRGDV具体为半胱氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-缬氨酸，所述CRGDF具体为半胱氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸，所述CRGDS具体为半胱氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸。
在本发明中，所述PAD4抑制剂优选包括PAD4抑制剂4B、PAD4抑制剂3B、PAD4抑制剂3B-OH中的一种或几种；
所述PAD4抑制剂4B具有式1所示结构：
Figure BDA0003886797820000041
PAD4抑制剂3B具有式2所示结构：
Figure BDA0003886797820000042
所述PAD4抑制剂3B-OH具有式3所示结构：
Figure BDA0003886797820000043
在本发明中，所述CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂中PAD4抑制剂的负载量优选为4～18wt％，更优选为8.9～11.9wt％。
本发明对所述CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂的来源没有特殊限定，具体可以采用专利CN 113350296A中方法制备得到。
在本发明中，所述CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂具有抗肿瘤转移活性，可以用于制备抗肿瘤转移药物。在本发明中，所述肿瘤优选为肺癌或乳腺癌。
在本发明中，所述抗肿瘤转移药物优选包括活性成分以及药学上可接受的辅料，所述活性成分为所述CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂；所述抗肿瘤转移药物中活性成分的含量优选为0.1～99.9wt％，更优选为1～99wt％，进一步优选为50～90wt％。本发明对所述药学上可接受的辅料的具体种类没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知种类的药学上可接受的辅料即可。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
按照专利CN 113350296 A中方法制备壳聚糖-CRGDV-PAD4抑制剂：
(一)CRGDV的固相合成
1)溶胀：在固相合成管中，用10mL无水DMF对300mg Fmoc-Val-Wang resin浸泡3h，使其溶胀。
2)脱保护：减压抽滤除去无水DMF，并加入8～10mL脱保护剂(按体积比计，无水DMF：六氢吡啶＝4：1)，振荡反应3min后，减压抽滤除去脱保护剂，再加入8～10mL脱保护剂，振荡反应8min。
3)洗涤：减压抽滤除去脱保护剂，依次用无水DMF、CH2Cl2和无水DMF洗涤，每种溶液洗两次。
4)显色：茚三酮法检测树脂(检测-NH2)，显深紫色。
5)偶联：称量Fmoc-Asp(OtBu)和缩合剂HBTU，用偶联剂(按体积比计，无水DMF：N-甲基吗啉＝95：5)溶解，加入到固相合成管中，振荡反应45min。
6)洗涤：减压抽滤除去偶联剂，依次用无水DMF、CH2Cl2、无水DMF洗涤，每种溶液洗两次。
7)显色：茚三酮法检测树脂，显无色透明。
重复2)～7)步骤直至合成到最后一个氨基酸后脱保护。
8)甲醇收缩：向固相合成管中加入甲醇，减压抽滤除去甲醇，重复三次，将树脂转移到10mL的试剂瓶中。
9)裂解：将3mL裂解液(按体积比计，三氟乙酸：水：三异丙基硅烷：1,2-乙二硫醇＝92.5：2.5：2.5：2.5)加入到试剂瓶中，冰水浴下搅拌反应2.5h；反应结束后过滤，将滤液中的三氟乙酸用氮气吹干；然后加入冰乙醚洗涤，洗涤三次，离心弃上清得到CRGDV(半胱氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-缬氨酸)。
(二)PAD4抑制剂的合成
(1)PAD4抑制剂4B(4-羧基苯硼酸-Orn(Cl)-NBzl)的合成
1)Boc-Orn(Cbz)-NBzl的制备：
将Boc-Orn(Cbz)-OH 10mmol溶于20mL无水四氢呋喃(THF)中，冰浴条件下加入N-羟基苯并三氮唑(HOBt)12mmol，并使完全溶解，缓慢加入二环己基羰二亚胺(DCC)12mmol，搅拌30min，得到反应液A；冰浴条件下将12mmol苄胺溶于20mL无水THF中加至反应液A中，加入1mL N-甲基吗啉(NMM)，调pH值至8～9，冰浴搅拌1h，再室温搅拌48h，TLC(按体积比计，氯仿:甲醇＝20:1)显示Boc-Orn(Cbz)-OH消失，滤除二环己基脲(DCU)，减压蒸去THF，残留物用50mL乙酸乙酯(EA)溶解，所得溶液依次用饱和NaHCO3水溶液、饱和NaCl水溶液、5％KHSO4水溶液、饱和NaCl水溶液、饱和NaHCO3水溶液、饱和NaCl水溶液各洗涤三次，乙酸乙酯层用无水Na2SO4干燥，减压抽滤除干燥剂，滤液减压浓缩至干，得到化合物Boc-Orn(Cbz)-NBzl。
2)HCl·H-Orn(Cbz)-NBzl的制备：
将Boc-Orn(Cbz)-NBzl(10mmol)用少量干燥乙酸乙酯溶解，冰浴搅拌下加入HCl浓度为4mol/L的HCl/EtOAc溶液，TLC(按体积比计，EA：H2O：HAc＝4：1：0.1)显示原料点消失，溶液用水泵抽干，加入无水乙醚，再次用水泵将反应液抽干，反复三次，得到HCl·H-Orn(Cbz)-NBzl。
3)4-羧基苯硼酸-Orn(Cbz)-NBzl的制备：
将4-羧基苯硼酸10mmol溶于20mL无水四氢呋喃(THF)中，冰浴条件下加入N-羟基苯并三氮唑(HOBt)12mmol，并使完全溶解，缓慢加入二环己基羰二亚胺(DCC)12mmol，搅拌30min，得到反应液A；冰浴条件下将12mmol HCl·H-Orn(Cbz)-NBzl溶于20mL无水THF中加至反应液A中，加入1mLN-甲基吗啉(NMM)，调pH值至8～9，冰浴搅拌1h，再于室温搅拌反应48h，TLC(按体积比计，氯仿:甲醇＝20：1)显示4-羧基苯硼酸消失，滤除二环己基脲(DCU)，减压蒸去THF，残留物用50mL乙酸乙酯(EA)溶解，所得溶液依次用饱和NaHCO3水溶液、饱和NaCl水溶液、5％KHSO4水溶液、饱和NaCl水溶液、饱和NaHCO3水溶液、饱和NaCl水溶液各洗涤三次，乙酸乙酯层用无水Na2SO4干燥，减压抽滤除干燥剂，滤液减压浓缩至干，得到4-羧基苯硼酸-Orn(Cbz)-NBzl。
4)4-羧基苯硼酸-Orn-NBzl的制备：
将4-羧基苯硼酸-Orn(Cbz)-NBzl 10mmol用适量甲醇搅拌溶解，加入Pd/C适量，反应体系保持密闭，用三通抽出空气，通入装在气袋内的氢气，再用三通抽气，如此反复置换反应体系中的空气，三通最终停留在通氢气状态下，保持氢气环境，室温搅拌反应直至原料点消失，TLC监测反应进程；反应毕，减压过滤去除Pd/C，滤液减压浓缩至干，得到4-羧基苯硼酸-Orn-NBzl。
5)PAD4抑制剂4B(4-羧基苯硼酸-Orn(Cl)-NBzl)的制备：
将4-羧基苯硼酸-Orn-NBzl 1mmol用适量无水甲醇搅拌溶解，冰水浴下，加入5mmol 2-氯乙酰亚氨酸乙酯盐酸盐，并用N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)调pH值至10，室温搅拌12h，TLC(按体积比计，EA：H2O：HAc＝4：1：0.1)显示4-羧基苯硼酸-Orn-NBzl消失，减压浓缩至干，C18柱层析纯化，得到PAD4抑制剂4B(4-羧基苯硼酸-Orn(Cl)-NBzl)。
(2)PAD4抑制剂3B(3-羧基苯硼酸-Orn(Cl)-NBzl)的合成
采用与PAD4抑制剂4B(4-羧基苯硼酸-Orn(Cl)-NBzl)相同的制备方法，以3-羧基苯硼酸为原料制备得到PAD4抑制剂3B(3-羧基苯硼酸-Orn(Cl)-NBzl)。
(三)壳聚糖-CRGDV-PAD4抑制剂的合成
(1)壳聚糖-丙烯酰氯的合成
首先，将壳聚糖(0.6g，0.20mmol)和三乙胺(Et3N，50μL，0.36mmol)溶解在20mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，0℃冷却后，将在8mL二氯甲烷溶液中的丙烯酰氯(8μL，0.10mmol)滴加到搅拌的溶液中，在室温条件下反应24h，然后用蒸馏水透析(截留分子量为700～1000Da)48h，冻干后获得淡黄色固体，即为壳聚糖-丙烯酰氯。
(2)壳聚糖-CRGDV的合成
将壳聚糖-丙烯酰氯(0.3g，0.10mmol)和CRGDV(98mg，0.18mmol)溶于5mL二甲基亚砜中，并在室温条件下添加Et3N(10μL，0.07mmol)，然后在室温条件下搅拌反应12h，并用蒸馏水透析(截留分子量为700～1000Da)48h，冻干后得到淡黄色固体，即为壳聚糖-CRGDV。
(3)壳聚糖-CRGDV-4B的合成
将PAD4抑制剂4B(5mg，10μmol)与壳聚糖-CRGDV(16mg，5μmol)溶解在5mL无水DMSO中，在室温条件下搅拌反应8h，然后将反应混合物用蒸馏水透析(截留分子量为1000Da)24h，将所得溶液冻干以获得PAD4抑制剂4B：壳聚糖-CRGDV＝4：1的壳聚糖-CRGDV-4B(结构示意图如图1所示)。
图2为PAD4抑制剂4B、壳聚糖-CRGDV及壳聚糖-CRGDV-4B的紫外光谱图，通过紫外光谱可以看出，PAD4抑制剂4B在285nm处有特征吸收峰，壳聚糖-CRGDV在285nm处没有特征紫外吸收，而壳聚糖-CRGDV-4B在285nm处有特征吸收峰，证明PAD4抑制剂4B连接到壳聚糖-CRGDV上。
(4)壳聚糖-CRGDV-3B的合成
将PAD4抑制剂3B(5mg，10μmol)与壳聚糖-CRGDV(10.56mg，3.3μmol)溶解在5mL无水DMSO中，在室温条件下搅拌反应8h，然后将反应混合物用蒸馏水透析(截留分子量为1000Da)24h，将所得溶液冻干以获得PAD4抑制剂3B：壳聚糖-CRGDV＝3：1的壳聚糖-CRGDV-3B。
纳米性状表征以及性能测试
(一)纳米性状表征，具体结果见表1。
表1不同结构化合物的Zeta电位与粒径
化合物种类 Zeta(mV) 粒径(nm)
壳聚糖 27.3±5.77 233.2±23.36
壳聚糖-CRGDV 36.0±4.01 458.3±81.38
壳聚糖-CRGDV-4B(1:4) 27.8±2.67 201.2±26.89
壳聚糖-CRGDV-3B(1:3) 12.7±2.79 202.3±58.8
(二)壳聚糖-CRGDV-4B(壳聚糖-CRGDV：PAD4抑制剂4B＝1：4)载药量的测试
使用分析天平称取600μg的PAD4抑制剂4B(4-羧基苯硼酸-Orn(Cl)-NBzl)后，取4mL超纯水进行溶解，使PAD4抑制剂4B浓度最终为150μg/mL，作为储备液；依次稀释，得到浓度分别为9.38μg/mL、18.75μg/mL、37.5μg/mL、75μg/mL、150μg/mL浓度梯度的PAD4抑制剂4B标准溶液，再分别测定紫外吸收光谱图，得到标准曲线，如图3所示。
PAD4抑制剂4B的标准曲线线性拟合方程为y＝0.026x+0.0694，R2＝0.9982。称取CRGDV-壳聚糖-4B(壳聚糖-CRGDV：PAD4抑制剂4B＝1：4)800μg，取4mL超纯水进行溶解，使CRGDV-壳聚糖-4B浓度最终为200μg/mL，测得吸光度为0.688，计算得PAD4抑制剂4B浓度为23.8μg/mL，则CRGDV-壳聚糖-4B中，PAD4抑制剂4B的载药量＝23.8/200＝11.9％。
同理测得壳聚糖-CRGDV-3B(壳聚糖-CRGDV：PAD4抑制剂3B＝1：3)中PAD4抑制剂3B的载药量为8.9％。
(三)体外肿瘤细胞增殖活性
以不同的受试药物对小鼠lewis肺癌细胞LLC及人肺癌细胞A549两株细胞的体外抗细胞增殖活性进行评价，具体方法为：1)接种细胞：将生长状况良好且处于对数生长期的细胞用培养基稀释至细胞浓度为(3～5)×104个/mL，均匀接种于96孔板中，每孔100μL(外围各孔用100μLPBS缓冲液液封)，将接种后的96孔板置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中孵育8～12h。2)给药：观察细胞生长及贴壁情况，当贴壁率达50％以上时，按照预设复孔给25μL不同化合物或不同浓度的受试样品溶液，每板均设置阴性对照组、阳性对照组以及Blank组，轻轻拍打使其样品液分散均匀，置于细胞培养箱中孵育48h。3)后处理：每孔加入事先配制好的浓度为5mg/mL的MTT溶液25μL，继续孵育2～4h后取出，弃去上清液后，每孔加入150μL DMSO，于细胞摇床上震荡15min，使甲臜充分溶解后，酶标仪测定各孔在570nm波长下的OD值(理想范围在0.3～1.4之间)；按照以下公式计算抑制率：
抑制率＝[(阴性对照组的平均OD值-受试化合物组的平均OD值)/阴性对照组的平均OD值-Blank组的平均OD值]×100％
以抑制率对所测受试化合物的浓度进行统计分析，使用SPSS中回归分析-概率统计的方法，计算出阳性药及纳米载药体系的IC50值，其结果见表2。
表2受试药物体外抗细胞增殖活性的IC50值
Figure BDA0003886797820000091
Figure BDA0003886797820000101
注：ND表示测不到，n＝9，单位μM。
由表2可以看出，本发明提供的CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂具有良好的体外生物活性，对小鼠lewis肺癌细胞LLC以及人肺癌细胞A549有良好的抑制增殖的作用。
(四)WesternBlot法检测肿瘤及肺部PAD4酶及瓜氨酸化的H3组蛋白(H3cit)的表达
从接受NS、壳聚糖K-CRGDV-4B和PAD4抑制剂4B治疗的荷瘤小鼠中解剖肿瘤和肺，每个治疗组取三只小鼠解剖肿瘤和肺，然后用MinuteTM Total Protein Extraction Kit(Invent Biotechnologies,Inc.)提取总蛋白，使用Bradford蛋白浓度测定试剂盒(Beyotime Biotechnology，Inc)检测蛋白质的总浓度，并调节各蛋白浓度总量一致；样品用12％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAA)凝胶纯化，然后将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，再用5％脱脂牛奶封闭，之后与anti-PADI4 RabbitPolyclonal antibody、兔Anti-Histone H3 citrulline R2 antibody或兔Anti-GAPDH antibody一起孵育，将膜与GoatAnti-RabbitIgG H&L一起孵育，并且使用增强型化学发光试测量蛋白质复合物，GAPDH是内部对照。图4为肺部NS、壳聚糖-CRGDV-4B和PAD4抑制剂4B蛋白印迹结果图，图5为肿瘤部位NS、壳聚糖-CRGDV-4B和PAD4抑制剂4B蛋白印迹结果图，图6为Westernblot条带灰度值统计图。通过对蛋白的相对灰度值进行分析，发现PAD4抑制剂4B及壳聚糖-CRGDV-4B治疗的荷瘤小鼠，其肿瘤部位及肺部瓜氨酸化的H3组蛋白水平以及PAD4酶表达水平与NS组相比，都明显降低。提示化合物通过抑制PAD4酶的表达以及抑制组蛋白的瓜氨酸化抑制肿瘤细胞的生长。
(五)体外抗小鼠lewis肺癌LLC细胞及小鼠乳腺癌4T1细胞迁移活性CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂对癌细胞迁移的影响通过Transwell迁移试验进行评估，方法如下：
将100μL含有LLC细胞或4T1细胞(5×105cells/mL)的DMEM不完全培养基添加到上室中，将600μL含有10％FBS的DMEM完全培养基置于下室中。再向上室中加入25μL药物，所述药物分别是NS、RGDS(20μM)，壳聚糖-CRGDV-4B(1μM、0.5μM、0.1μM)和PAD4抑制剂4B(10μM)，然后在37℃、5％CO2条件下孵育8h；之后用棉签去除上腔室中的剩余细胞，然后将膜底面上的LLC细胞用多聚甲醛固定30min，并用0.5％结晶紫染色15min；膜上染色的细胞用超纯水洗涤，干燥后在光学显微镜下拍照。在至少9个随机显微镜视野中对细胞进行计数，并按照以下公式计算抗迁移率：
抗迁移率＝(NS迁移数-受试药物迁移数)/NS迁移数。
表3受试药物体外抗癌细胞迁移活性
Figure BDA0003886797820000111
注：ND表示测不到，n＝9，经t检验，a：与NS相比，P<0.01；b：与PAD4抑制剂4B(10μM)相比，P<0.01；c：与PAD4抑制剂4B(10μM)相比，P<0.05。
由表3可以看出，本发明提供的CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂具有良好的体外抗癌细胞迁移活性。与PAD4抑制剂4B相比(10μM)，壳聚糖-CRGDV-4B(1μM)抗LLC及4T1细胞迁移活性显著提高，且剂量减少了10倍，壳聚糖-CRGDV-4B的抗LLC及4T1细胞迁移活性有剂量依赖性。
(六)体内C57小鼠LLC肺癌转移实验
移植性小鼠Lweis肺癌转移模型所用的瘤源为LLC小鼠肺癌细胞，购自北京大学医学部动物实验中心，自行传代维持。将LLC小鼠肺癌细胞接种于SPF级雄性C57小鼠右侧腋下，自行传代，将传代两周后的小鼠，用适量乙醚麻醉后，脱颈处死，将小鼠置于75％的酒精中浸泡消毒1min，然后剖开小鼠腋下，取肿瘤组织，碾碎成瘤液，将瘤液以1000rpm离心10min，弃去上清，用生理盐水洗涤沉淀物去除非细胞碎片、组织以及浮血，将其充分混合，得到LLC细胞悬液，稀释至一定倍数后与新鲜配制的0.2wt％台盼蓝以9:1的体积比混匀染色，其中，活细胞不会被染成蓝色，而死细胞会被染成淡蓝色。用红细胞计数板计数，按以下公式计算细胞浓度和细胞存活率：
细胞浓度(细胞数/mL)＝4个大方格内活细胞数/4×104×稀释倍数细胞存活率＝活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100％。
用生理盐水将存活率大于90％的细胞悬液稀释至2×107个/mL，此时应当尽快完成实验的接种，接种时，左手抓取小鼠进行固定，右手持注射器刺入小鼠右侧腋下至皮下约2mm深，使用针头钝性分离出一个小空腔，注射0.2mL制备好的细胞悬液，每次注射前应将细胞悬液混合均匀，至此动物模型建立完成。模型建立后每日观察小鼠，待大部分小鼠腋下可见黄豆粒大小的实体瘤后进行分组，本实验在接种后第5天进行随机分组，使每组小鼠肿瘤大小平均分布，当天开始给药，给药组别及浓度见表4，每天1次，给药14天，每两天称体重并量瘤体积，结果见图7和图8。最后一次给药24h后取出小鼠，各组小鼠进行称重，乙醚麻醉后摘除眼球进行取血，离心取血清备用，之后脱颈处死，左手用镊子固定小鼠腋下实体瘤生长部位，右手用剪刀剪开皮肤，充分暴露肿瘤组织，沿皮肤、上肢进行钝性分离，取出肿瘤组织，进行称重。再依次解剖取出小鼠的心、肝、脾、肾、脑等脏器组织进行称重，取出肺部数转移瘤结数。
表4受试药物组别、浓度及给药方式
组别 剂量(μmol/kg) 浓度(mg/mL) 动物数
Vehicle /，ip / 12
Dox 2，ip 0.115996 12
RGDS 20，ip 0.86684 12
壳聚糖-CRGDV-4B 1，ip 0.32 12
壳聚糖-CRGDV-4B 0.2，ip 0.064 12
PAD4抑制剂4B 5，ip 0.22225 12
注：ip为腹腔注射。
实验结果与分析：
1)原位肿瘤组织质量以均值±SD g表示，经t检验进行组间统计学比较；抑制率按如下公式计算：抑制率＝[(阴性对照组瘤重平均值-受试化合物瘤重平均值)/(阴性对照组瘤重平均值)/]×100％。
小鼠Lweis肺癌转移模型评价受试药物体内抑制肿瘤增殖活性的结果如表5。
表5受试药物体内抑制肿瘤增殖活性评价
受试药物 瘤重(g) 抑制率(％)
Vehicle 1.749±0.420 /
Dox(2μM) 0.767±0.205<sup>a</sup> 46.8％
RGDS(20μM) 1.808±0.650 ND
壳聚糖-CRGDV-4B(1μM) 1.049±0.151<sup>a</sup> 40.1％
壳聚糖-CRGDV-4B(0.2μM) 1.550±0.234 11.4％
PAD4抑制剂4B(5μM) 1.269±0.456<sup>b</sup> 27.5％
注：n＝12，经t检验，a：与NS相比，P<0.01；b：与NS相比，P<0.05。
由表5可以看出，本发明所述CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂具有良好的体内抑制肿瘤增殖活性。
2)肺部瘤结数以均值±SD个表示，经t检验进行组间统计学比较；抑制率按如下公式计算：抑制率＝[(阴性对照组肺部瘤结数-受试化合物肺部瘤结数)/(阴性对照组肺部瘤结数)/]×100％。
小鼠Lweis肺癌转移模型评价受试药物体内抑制肿瘤转移活性的结果如表6。
表6受试药物体内抑制肿瘤转移活性评价
受试药物 瘤结数/个 抑制率(％)
Vehicle 28.6±7.3 /
Dox(2μM) 6.3±2.2<sup>a</sup> 77.9％
RGDS(20μM) 6.0±2.4<sup>a</sup> 79.1％
壳聚糖-CRGDV-4B(1μM) 7.5±2.3<sup>a</sup> 73.8％
壳聚糖-CRGDV-4B(0.2μM) 13.5±2.3<sup>a</sup> 52.9％
PAD4抑制剂4B(5μM) 18.3±4.0<sup>b</sup> 36.0％
注：n＝12，经t检验，a：与NS相比，P<0.01；b：与NS相比，P<0.05。
由表6可以看出，本发明所述CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂具有良好的体内抑制肿瘤转移活性。
3)小鼠脏器指数统计
进一步分析各受试化合物对各脏器之间影响的差异。图9为不同受试组小鼠脏器指数统计图，经t检验进行组间统计学比较。其中，脏器指数＝脏器重量/小鼠体重×100％(注：n＝12，经t检验，各受试化合物的脏器指数与NS相比，无显著性差异)。
4)血清生化指标分析
为了衡量各化合物的毒副作用，通过生化分析仪检测其对小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、肌酐(CREA-S)、尿素(UREA)等指标含量的影响，其中，ALT和AST是肝脏生化指标，CREA-S和UREA是肾脏生化指标。从移植性小鼠Lweis肺癌转移模型中获得的小鼠血清，通过血清生化指标分析仪测定，结果见图10(注：n＝12，经t检验，各受试化合物的脏器指数与NS相比，无显著性差异)，实验结果表明，各受试化合物对ALT、AST、CREA-S和UREA等各项血清指标的影响，与NS组相比无差异，说明化合物并未发现明显的肝肾毒性。
(七)HE染色研究各受试化合物对C57荷LLC瘤小鼠肺转移的影响
荷瘤小鼠每组选取3只小鼠，摘取肺组织，用4％多聚甲醛固定，24h后，石蜡包埋，切片备用，HE染色。图11为小鼠肺切片HE染色情况图，肺切片HE染色结果表明，NS组出现明显瘤结，而壳聚糖-CRGDV-4B组未出现明显瘤结，说明壳聚糖-CRGDV-4B对小鼠LLC细胞的肺转移有明显抑制作用，并且没有炎症副作用。
(八)体内C57小鼠LLC肺癌转移实验(壳聚糖-CRGDV-3B)
参照“(六)体内C57小鼠LLC肺癌转移实验”中方法进行实验，具体结果见表7。
表7壳聚糖-CRGDV-3B体内抑制LLC增殖及转移活性评价
Figure BDA0003886797820000141
Figure BDA0003886797820000151
注：n＝12，经t检验，a：与NS相比，P<0.01；b：与NS相比，P<0.05。
由表7可以看出，本发明所述CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂具有良好的体内抑制肿瘤增殖活性以及体内抑制肿瘤转移活性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂在制备抗肿瘤转移药物中的应用，所述CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂包括CRGD序列肽修饰壳聚糖载体和负载于所述CRGD序列肽修饰壳聚糖载体表面的PAD4抑制剂，所述CRGD序列肽修饰壳聚糖载体中CRGD序列肽的半胱氨酸通过丙烯酰氯连接到壳聚糖表面。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为肺癌或乳腺癌。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤转移药物包括活性成分以及药学上可接受的辅料，所述活性成分为所述CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂；所述抗肿瘤转移药物中活性成分的含量为0.1～99.9wt％。
4.根据权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于，所述CRGD序列肽包括CRGDV、CRGDS和CRGDF中的一种或几种，所述CRGDV为半胱氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-缬氨酸，所述CRGDF为半胱氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸，所述CRGDS为半胱氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述PAD4抑制剂包括PAD4抑制剂4B、PAD4抑制剂3B、PAD4抑制剂3B-OH中的一种或几种；
所述PAD4抑制剂4B具有式1所示结构：
Figure FDA0003886797810000011
PAD4抑制剂3B具有式2所示结构：
Figure FDA0003886797810000012
所述PAD4抑制剂3B-OH具有式3所示结构：
Figure FDA0003886797810000021
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述CRGD序列肽修饰壳聚糖负载的PAD4抑制剂中PAD4抑制剂的负载量为4～18wt％。
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