CN117224697B - cRGD修饰的苍耳亭及其衍生物纳米药物及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及cRGD修饰的苍耳亭及其衍生物纳米药物及制备方法，本发明设计并合成了将靶向基团cRGD高效地修饰于苍耳亭(Xanthatin)、8‑表苍耳亭(8‑epi‑Xanthatin)、苍耳皂素(Xanthinosin)及XTT(1β‑hydroxyl‑5α‑chloro‑8‑epi‑xanthatin)表面，并将它们封装到纳米载体中得到纳米制剂，以此增强天然药物的靶向性，提高药物的作用选择性和生物利用度。特别地，以苍耳亭为例，在动物实验中验证了cRGD‑Xa的抗肿瘤疗效以及安全性考察，为设计和开发用于肿瘤特异性治疗的天然药物活性成分自组装纳米制剂提供了一种有前景的策略。

Description

cRGD修饰的苍耳亭及其衍生物纳米药物及制备方法

技术领域

本发明涉及药物技术领域，尤其涉及cRGD修饰的苍耳亭及其衍生物纳米药物及制备方法。

背景技术

癌症是世界卫生领域的重大性疾病。2020年世界癌症报告指出，2020年全球新增癌症病例达1930万例，并且造成1000万人死亡。预计到2040年，全球癌症病例将达到2840万例。同时，癌症亦是造成中国疾病人口死亡的重要原因(CA Cancer J Clin.2021；71(3):209-49)。目前临床众多抗肿瘤药物直接或间接来源于天然植物。在1981年至2019年FDA批准的185种抗肿瘤药物中，有62种(33.5％)属于天然产物。因此，天然产物在药物研发中占有不可或缺的地位，从天然产物中寻找和开发新药已经成为现代新药研发的主导策略(Nat.Rev.Drug Discovery 2021,20(3):200-216)。

菊科植物苍耳(Xanthium)植物资源丰富药用历史悠久，具有广泛的药理活性，其中最主要的活性物质醛酮类化合物包括苍耳亭(Xanthatin)、8-表苍耳亭(8-epi-Xanthatin)、苍耳皂素(Xanthinosin)及XTT(1β-hydroxyl-5α-chloro-8-epi-xanthatin)等已有研究发现对多种肿瘤细胞具有抑制作用，它们的分子结构式如下：

然而天然产物普遍存在的溶解性差，缺乏靶向性等问题仍然急需解决。cRGDfk(cyclo[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys]，简称cRGD)是一种RGD肽的环状衍生物，其核心序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸可与整合素αvβ3受体特异性结合，靶向至αvβ3过表达的肿瘤细胞及新生血管内皮细胞可以更加精准有效的发挥疗效(Asian J Pharm Sci.2019；14(2):144-53)，本专利将靶向基团cRGDfk(cRGD)高效地修饰于苍耳亭(Xanthatin)、8-表苍耳亭(8-epi-Xanthatin)、苍耳皂素(Xanthinosin)及XTT(1β-hydroxyl-5α-chloro-8-epi-xanthatin)表面，并将它们封装到纳米载体中，以此提高药物的作用选择性和生物利用度。现有技术中，未见报道涉及cRGD修饰的苍耳亭及衍生物纳米药物相关制剂的研究。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，适应现实需要，本发明的首要目的是提供一种cRGD修饰的苍耳亭及其衍生物纳米药物。

为了实现本发明的目的，本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题：

本发明设计并合成了cRGD修饰的苍耳亭纳米药物(cRGD-Xanthatin)，结构式如下所示：

本发明设计并合成了cRGD修饰的8-表苍耳亭纳米药物(cRGD-8-epi-Xanthatin)，结构式如下所示：

本发明设计并合成了cRGD修饰的苍耳皂素纳米药物(cRGD-Xanthinosin)，结构式如下所示：

本发明设计并合成了cRGD修饰的XTT纳米药物(cRGD-XTT)，结构式如下所示：

本发明还提供一种cRGD修饰的苍耳亭及其衍生物纳米药物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将cRGD加入反应瓶中用溶剂进行溶解，同时加入三乙胺，然后置于磁力搅拌器上搅拌混匀；将苍耳的活性成分单体溶解在溶剂后转移到反应瓶中，反应一定时间后，减压蒸馏除去有机溶剂，冻干体系，得到产物；

(2)称取步骤(1)中的产物溶解于溶剂中得到溶液；称取二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺于玻璃瓶中，加入纯水使其溶解并超声，在搅拌条件下吸取得到的溶液并打入二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺中，反应得到纳米药物。

优选地，所述步骤(1)中溶解cRGD用的溶剂为去离子水。

优选地，所述步骤(1)中溶解苍耳亭、8-表苍耳亭、苍耳皂素或XTT用的溶剂为甲醇。

优选地，所述步骤(1)中搅拌的转速为1400rpm；所述步骤(1)中反应时间为8h。

优选地，所述步骤(2)中溶解产物用的溶剂为二甲基亚砜。

优选地，所述步骤(2)中搅拌的转速为1400rpm；所述步骤(2)中反应时间为30min。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1.本发明以苍耳亭、8-表苍耳亭、苍耳皂素及XTT为模型药，cRGD为靶向配体，对药物进行表面修饰，提高药物作用的选择性。

2.本发明将cRGD修饰至苍耳亭、8-表苍耳亭、苍耳皂素及XTT的表面，提高药物的靶向性，同时使用DSPE-PEG2000修饰，改善它们在血液循环中的稳定转运；特别地，本发明所得纳米药物具有合适的尺寸分布，并在体内进行纳米药物的药效学研究证明具有良好的抗肿瘤效果。

附图说明

图1为本发明实施例1的cRGD-Xa的核磁氢谱图；

图2为本发明实施例1的cRGD-Xa的核磁碳谱；

图3为本发明实施例的cRGD-Xa纳米颗粒的透射电镜图(A)；DLS测得cRGD-Xa纳米颗粒的粒径大小(B)；

图4为本发明实施例的cRGD-Xa纳米颗粒药物抑制小鼠肿瘤的生长状况图；动物实验的设计示意图(a)；小鼠肿瘤形态与大小(b)；小鼠肿瘤体积(c)；小鼠肿瘤重量(d)；小鼠体重(e)；

图5为本发明实施例的cRGD-Xa纳米颗粒药物对移植瘤增殖凋亡的影响图；

图6为本发明实施例的cRGD-Xa纳米颗粒药物对小鼠心肝脾肺肾组织HE染色的影响图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明：

本发明中所用原料说明如下：

苍耳亭(货号：ZSU-V-007，纯度≥99.8％，分子量M＝246.0g/mol)购自湖州展舒生物科技有限公司；cRGD(货号：HY-P0122)和DSPE-PEG2000(HY-112760)购于MedChemExpress(MCE)公司；4T1细胞专用培养基RPMI 1640(货号：C3010-0500)和胎牛血清(货号：C04001-500)以及青霉素-链霉素双抗(C3420-0100)均购于Invitrogen公司。甲醇(货号：67-56-1)购于上海苏懿化学试剂公司；三乙胺(Et3N)购自国药控股化学试剂有限公司；PBS(货号：BL601A)购于兰杰柯科技有限公司并按原样使用。

虽然药用植物能为新药设计提供更多的选择，但是植物药中的大多数活性物质存在水溶性差、生物利用率低等问题，同时体内无特异性的分布特性还会增加毒性风险，一些药物使用的溶剂如蓖麻油等，也时常引发患者的过敏反应，这些缺点都限制了天然药物在临床中广泛地应用。cRGDfk(cyclo[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys]，简称cRGD)是一种RGD肽的环状衍生物，其核心序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸可与整合素αvβ3受体特异性结合，靶向至αvβ3过表达的肿瘤细胞及新生血管内皮细胞。用其修饰药物可以提高药物作用的选择性。通过自组装形成纳米颗粒，为难溶性抗癌药物注射给药困难。因此，治疗方法通过化学工程合理设计具有内在生物活性的功能性纳米材料，将活性物质封装到纳米载体中克服了当前化疗的缺点，为设计和开发用于肿瘤特异性治疗的高效纳米前药提供了一种有前景的策略。

本发明将cRGD修饰至苍耳亭、8-表苍耳亭、苍耳皂素及XTT的表面，提高药物的靶向性，同时使用二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺(DSPE-PEG2000)修饰，改善它们在血液循环中的稳定转运。

以下实施例将对本发明作进一步说明，以cRGD修饰的苍耳亭纳米药物(cRGD-Xanthatin)为例，其目的仅在于更好地理解本发明，而不是限制本发明的保护范围。

实施例1

cRGD修饰的苍耳亭纳米药物(cRGD-Xanthatin)的制备方法，包括以下步骤：

(1)称量56.38mg cRGD(1.2eq)溶解于4mL水中，同时加入碱类物质三乙胺(2.4eq)促进其溶解，将上述溶液转移到反应瓶中，置于磁力搅拌器上搅拌混匀，搅拌的转速为1400rpm；称量20mg苍耳亭(1eq)溶解在2.5mL甲醇中，并将其加入反应瓶中，过夜反应，减压蒸馏除去有机溶剂，冻干体系，得到1.42g产物；

(2)cRGD-Xa纳米颗粒的制备：称量1mg cRGD-Xa溶解于100μL DMSO中，同时称取2mg DSPE-PEG2000于玻璃瓶中，加入4.9mL纯水使其溶解并超声，加入转子，在1400rpm转速下吸取cRGD-Xa溶液快速打入DSPE-PEG2000中，反应30min得到cRGD-Xa纳米颗粒。

1、cRGD-Xa的体外表征与性质：

使用核磁共振波谱仪对已合成的cRGD-Xa药物分子的结构进行表征，在25℃条件下，使用氘代氯仿为检测溶剂。如图1所示，根据核磁共振氢谱来确定cRGD-Xa药物分子中¹H的位置，如图2所示，核磁共振碳谱得到cRGD-Xa药物分子中¹³C原子的位置，由此可进一步确定cRGD-Xa药物分子的结构。

2、cRGD-Xa纳米颗粒的形态表征与粒径测定：

如图3所示，使用透射电子显微镜对纳米颗粒进行了形态表征，将cRGD-Xa纳米颗粒溶解于水中，将其吸附到镀碳铜网上，得到待测样品，在JEOL 2010型电子显微镜上进行透射电镜(TEM)测量，加速度电压为200kV。动态激光散射(DLS)测量采用商业ALV/DLS/SLS-5022F系统进行，该系统配备多角度数字时间相关器(ALV5000)和22mW的圆柱形UNIPHASEHe-Ne激光器(λ₀＝632nm)作为光源。以90°的固定角度收集散射光，持续时间约为5分钟。

3、cRGD-Xa纳米颗粒体内抗肿瘤药效实验：

Balb/c小鼠购自于安徽医科大学实验动物中心，均采用4-5周龄，体重17-20g健康体质的雌性小鼠。为了建立小鼠乳腺癌肿瘤模型，将处于对数生长期的小鼠乳腺癌4T1细胞消化处理，将3×10⁶个4T1细胞分散在200μL的PBS中，注射到6周龄的Balb/c小鼠的右后背处。待肿瘤体积生长至约60mm³后(大约为皮下接种后1周左右)，将老鼠随机分配4组：PBS、10mg/kg苍耳亭、10mg/kg cRGD-Xa、10mg/kg cRGD-Xa纳米颗粒组(n＝5)。每隔1天尾静脉注射给药，每隔2天测量肿瘤体积和称量小鼠体重。

经过3次重复给药(第0天、第2天、第4天)和后续的连续观察，发现cRGD-Xa纳米组装药物均具有显著抑制肿瘤作用。与PBS组和苍耳亭组相比，cRGD-Xa组与cRGD-Xa纳米颗粒药物组具有良好的肿瘤生长抑制作用。如图4所示，对小鼠体重的监测结果可以看出，在治疗期间，所有实验组均未观察到明显的体重减轻，表明小鼠在试验剂量下对cRGD-Xa纳米颗粒具有良好的耐受性。

4、cRGD-Xa纳米颗粒对小鼠移植瘤增殖凋亡的影响：

为了进一步验证苍耳亭的体内药理活性，取小鼠肿瘤组织，进行病理组织切片，并进行Ki67染色和TUNEL特异性荧光染色法检测cRGD-Xa纳米颗粒药物对肿瘤增殖凋亡的影响。

如图5所示，Ki-67结果显示，在cRGD-Xa纳米颗粒组小鼠肿瘤切片上可以观察到显著的细胞溶解和核溶解，证实cRGD-Xa纳米组装药物组在体内的治疗效果优于游离药物。

如图5所示的TUNEL结果显示，cRGD-Xa纳米颗粒治疗组细胞凋亡明显高于Xa组和PBS组。

5、cRGD-Xa纳米颗粒安全性考察：

取各组小鼠心、肝、脾、肺、肾等内脏组织，用PBS冲洗后，放入4％多聚甲醛中固定24h，随后进行脱水处理，将处理好的样品浸入提前融化的石蜡中，进行包埋处理，随后切片放置60℃烘箱烘烤1h，冷却至室温。依次将切片放入二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中，并用蒸馏水清洗。将组织切片于苏木素染液中染色；滴加1％盐酸酒精去除非特异性背景染色，提高对比度，分化10s后用流水冲洗；将切片放到95％乙醇浸泡1-2min后，放置伊红中进行复染，通过80％、95％和100％酒精去除所有水迹，并用二甲苯冲洗，使组织透明化并使其完全透明。使用光学显微随机观察得到的结果扫描后进行分析。

如图6所示，对纳米颗粒的安全性进行了评估发现，cRGD-Xa纳米颗粒药物组的小鼠心肝脾肺肾组织切片的HE染色结果未见炎症损伤以及组织异常。总之，cRGD-Xa纳米颗粒显示出更好的抗肿瘤效果。

本发明以苍耳亭、8-表苍耳亭、苍耳皂素及XTT为模型药，cRGD为靶向配体，对药物进行表面修饰，提高药物作用的选择性；同时使用DSPE-PEG2000修饰，改善它们在血液循环中的稳定转运；特别地，本发明所得纳米药物具有合适的尺寸分布，并在体内进行纳米药物的药效学研究证明具有良好的抗肿瘤效果。

本发明实施例公布的是较佳的实施例，但并不局限于此，本领域的普通技术人员，极易根据上述实施例，领会本发明的精神，并做出不同的引申和变化，但只要不脱离本发明的精神，都在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.cRGD修饰的苍耳亭纳米药物，其特征在于，化学结构式如式(A)所示：

2.cRGD修饰的8-表苍耳亭纳米药物，其特征在于，化学结构式如式(B)所示：

3.cRGD修饰的苍耳皂素纳米药物，其特征在于，化学结构式如式(C)所示：

4.cRGD修饰的XTT纳米药物，其特征在于，化学结构式如式(D)所示：

5.一种cRGD修饰的苍耳亭及其衍生物纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将cRGD-fc加入反应瓶中用溶剂进行溶解，同时加入三乙胺，然后置于磁力搅拌器上搅拌混匀；将苍耳的活性成分单体溶解在溶剂后转移到反应瓶中，反应一定时间后，减压蒸馏除去有机溶剂，冻干体系，得到产物；所述苍耳的活性成分单体为苍耳亭、8-表苍耳亭、苍耳皂素或XTT；

所述cRGD-fc的结构式为：

所述XTT的结构式为：

(2)称取步骤(1)中的产物溶解于溶剂中得到溶液；称取二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺于玻璃瓶中，加入纯水使其溶解并超声，在搅拌条件下吸取得到的溶液并打入二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺中，反应得到纳米颗粒。

6.如权利要求5所述的cRGD修饰的苍耳亭及其衍生物纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中溶解cRGD-fc用的溶剂为去离子水。

7.如权利要求5所述的cRGD修饰的苍耳亭及其衍生物纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中溶解苍耳的活性成分单体用的溶剂为甲醇。

8.如权利要求5所述的cRGD修饰的苍耳亭及其衍生物纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中搅拌的转速为1400rpm；所述步骤(1)中反应时间为8h。

9.如权利要求5所述的cRGD修饰的苍耳亭及其衍生物纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中溶解产物用的溶剂为二甲基亚砜。

10.如权利要求5所述的cRGD修饰的苍耳亭及其衍生物纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中搅拌的转速为1400rpm；所述步骤(2)中反应时间为30min。