CN113018450B - 一种具有肿瘤细胞和肿瘤相关成纤维细胞双靶向功能的药物载体、制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医药技术领域，尤其是涉及一种具有肿瘤细胞和肿瘤相关成纤维细胞双靶向功能的药物载体、制备方法及应用。本发明提供的具有肿瘤细胞和肿瘤相关成纤维细胞双靶向功能的药物载体含有通过酰基相连的透明质酸和Z‑甘氨酸‑脯氨酸，其中透明质酸能够靶向肿瘤细胞表面的CD44受体，当所述药物载体装载抗肿瘤组分时，能够促进抗肿瘤组分向肿瘤中心的快速迁移；而双肽Z‑甘氨酸‑脯氨酸能够靶向肿瘤相关成纤维细胞表面的FAPα受体，使得当肿瘤组织纤维化后，肿瘤细胞被成纤维细胞阻碍时，药物载体仍然能够精准靶向肿瘤中心。

Description

一种具有肿瘤细胞和肿瘤相关成纤维细胞双靶向功能的药物 载体、制备方法及应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其是涉及一种具有肿瘤细胞和肿瘤相关成纤维细胞双靶向功能的药物载体、制备方法及应用。
背景技术
肿瘤微环境（TEM），主要包括细胞外基质(ECM)、肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)、肿瘤相关免疫细胞、肿瘤血管系统以及低氧和酸性环境，这创造了一个物理屏障，阻碍了药物向肿瘤中心传递。化疗是目前临床上治疗肿瘤的主要方法之一，但由于很多极具治疗潜力的化学药物和基因药物对肿瘤组织和细胞选择性低、疗效低、毒性大、不良反应多、转移灶难以控制等诸多问题，导致部分患者用药效果不佳，虽然也会杀死部分癌周组织，但很难从根源上抑制肿瘤复发。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种同时具有肿瘤细胞靶向和肿瘤相关成纤维细胞靶向的药物载体，从而提高化学药物或基因药物对肿瘤组织和细胞的选择性，促进药物向肿瘤中心转移，从根本上实现对病灶的控制。
本发明的另一个目的在于，提供上述药物载体的制备方法，通过简单、快捷的合成方法，对具有肿瘤细胞靶向和肿瘤相关成纤维细胞靶向的组分进行整合，实现具有双靶向药物载体的高效制备，适宜推广应用。
本发明还有一个目的在于，提供上述具有双靶向作用的药物载体的在抗肿瘤组分装载中的应用，使用具有双靶向的药物载体对抗肿瘤组分进行装载，使得抗肿瘤组分能够快速向肿瘤中心迁移。
本发明的最后一个目的在于，提供采用双靶向药物载体装载抗肿瘤组分制备得到抗肿瘤药物的制备方法，以实现上述双靶向药物载体的推广应用，同时得到具有双靶向功能的抗肿瘤药物。
为了解决上述技术问题，实现上述目的，本发明提供了一下技术方案：
第一方面，本发明提供一种具有肿瘤细胞和肿瘤相关成纤维细胞双靶向功能的药物载体，所述药物载体含有通过酰基相连的透明质酸和Z-甘氨酸-脯氨酸；所述透明质酸的侧链上通过酯基连有硫缩酮；所述硫缩酮通过酯基连有姜缩酮。
第二方面，本发明提供一种具有肿瘤细胞和肿瘤相关成纤维细胞双靶向功能的药物载体的制备方法，所述制备方法包括通过酰化反应将Z-甘氨酸-脯氨酸连接于透明质酸侧链上；
所述酰化反应的温度为30℃；
酰化反应之后，还包括酰化产物的除杂步骤；
所述除杂步骤依次包括酰化产物的透析步骤和酰化产物的冻干步骤；
所述酰化产物的透析步骤采用截留分子量为2000~3000Da的透析袋。
在可选的实施方式中，进行酰化反应之前，在EDC/DMAP催化酯化反应体系中通过第一酯化反应与缩合物硫缩酮-姜缩酮中的硫缩酮相连；
所述第一酯化反应温度为50℃；
所述第一酯化反应之后、酰化反应之前，还包括第一酯化反应产物的纯化步骤；
所述纯化步骤依次包括第一酯化反应产物的透析和第一酯化反应产物的冻干；
所述第一酯化反应产物的透析采用2000~3000Da的透析袋；
所述透析的时间为24h，更换透析液的频率为1次/2h。
在可选的实施方式中，所述第一酯化反应中缩合物硫缩酮-姜缩酮、透明质酸、催化剂EDC和DMAP的摩尔比为1：1：1：1。
在可选的实施方式中，所述缩合物硫缩酮-姜缩酮由姜缩酮与硫缩酮经第二酯化反应制备得到；
所述第二酯化反应包括取等摩尔的姜缩酮和硫缩酮在EDC/DMAP催化酯化反应体系中进行；
所述第二酯化反应温度为45℃。
在可选的实施方式中，所述第二酯化反应中姜缩酮、硫缩酮与催化剂EDC和DMAP的摩尔比为1:1:1:1。
第三方面，本发明提供前述实施方式任一项所述的药物载体或采用前述实施方式任一项所述制备方法制备得到的药物载体在抗肿瘤组分装载中的应用。
第四方面，本发明提供一种抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物包括前述实施方式任一项所述的药物载体和紫杉醇；或者，所述抗肿瘤药物包括采用前述实施方式任一项所述制备方法制备得到的药物载体和紫杉醇。
第五方面，本发明提供一种抗肿瘤药物的制备方法，所述制备方法包括，前述实施方式任一项所述的药物载体或采用前述实施方式任一项所述制备方法制备得到的药物载体和紫杉醇在水溶液中，经自组装形成载药胶束。
在可选实施方式中，本发明采用前述实施方式所述的制备方法得到载药胶束，所述载药胶束粒径为100~300nm，电位为-20~-40mV。
本发明提供的具有肿瘤细胞靶向和肿瘤相关成纤维细胞靶向的药物载体含有通过酰基相连的透明质酸和Z-甘氨酸-脯氨酸，其中透明质酸能够靶向肿瘤细胞表面的CD44受体，当所述药物载体装载抗肿瘤组分时，能够促进抗肿瘤组分向肿瘤中心的快速迁移；而双肽Z-甘氨酸-脯氨酸能够靶向肿瘤相关成纤维细胞表面的FAPα受体，使得当肿瘤组织纤维化后，肿瘤细胞被成纤维细胞阻碍时，药物载体仍然能够精准靶向肿瘤中心。
本发明提供了经过酰化反应，制备上述双靶向药物载体的制备方法，该方法简单易行，适宜工业推广。本发明进而在此基础上提供了得到的药物载体在装载抗肿瘤组分中的应用，以及采用上述双靶向药物载体装载紫杉醇得到抗肿瘤药物的制备方法，所述抗肿瘤药物的制备经过简单易行的自组装过程即可实现，尤其适于工业推广。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的药物载体的合成路线；
图2为本发明实施例1提供的药物载体的红外检测结果；
图3为本发明实施例1提供的药物载体的核磁检测结果；
图4为本发明实施例2得到的载药胶束的SEM扫描结果；
图5为本发明实施例2得到的载药胶束的粒径统计结果；
图6为本发明实施例2得到的载药胶束的电位检测结果；
图7为本发明对比例1得到的载药胶束的SEM扫描结果；
图8为本发明对比例1得到的载药胶束的粒径统计结果；
图9为本发明对比例1得到的载药胶束的电位检测结果；
图10为本发明实验例1中GHSO@PTX和HSO@PTX对SMMC-7721和CAFs两种细胞的毒性检测结果；
图11为本发明实验例1中载药胶束对SMMC-7721细胞的浓度依赖和时间依赖实验结果；
图12为本发明实验例1中载药胶束对CAFs细胞的浓度依赖和时间依赖实验结果；
图13为本发明实验例1中细胞定位实验结果；
图14为本发明实验例2中荷瘤裸鼠活体成像结果；
图15为本发明实验例2中体内抑瘤效果评价结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。
在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，或者是该发明产品使用时惯常摆放的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
第一方面，本发明提供一种具有肿瘤细胞和肿瘤相关成纤维细胞双靶向功能的药物载体，所述药物载体含有通过酰基相连的透明质酸和Z-甘氨酸-脯氨酸；所述透明质酸的侧链上通过酯基连有硫缩酮；所述硫缩酮通过酯基连有姜缩酮。
其中，透明质酸作为靶分子可以与肿瘤细胞表面的CD44受体特异性结合，而靶分子双肽Z-甘氨酸-脯氨酸可以与肿瘤相关成纤维细胞表面的FAPα受体结合。肿瘤组织存在广泛纤维化，纤维化后的成纤维细胞对肿瘤细胞起到阻隔作用的情况下，由于本发明提供的药物载体中存在能够靶向肿瘤相关成纤维细胞表面的FAPα受体的双肽Z-甘氨酸-脯氨酸，因此，对于存在广泛纤维化的肿瘤组织，本发明提供的药物载体仍能够快速靶向肿瘤中心。
硫缩酮具有ROS响应特性，具体表现为，在肿瘤细胞的微环境中，ROS水平增加，本发明提供的药物载体中引入硫缩酮，在高活性ROS水平下，硫缩酮键被氧化断裂，药物载体被破坏，使得药物快速释放，在肿瘤部位蓄积。姜缩酮具有pH敏感特性，具体表现为，肿瘤细胞的微环境为低pH的酸性环境，本发明提供的药物载体在抵达肿瘤微环境后，由于姜缩酮引对pH的敏感性，导致药物载体构象发生改变，从而实现药物的加速释放，与ROS响应的硫缩酮共同作用，促进药物在肿瘤部位的快速蓄积。
第二方面，本发明提供一种具有肿瘤细胞和肿瘤相关成纤维细胞双靶向功能的药物载体的制备方法，所述制备方法包括通过酰化反应将Z-甘氨酸-脯氨酸连接于透明质酸侧链上；
所述酰化反应的温度为30℃；
酰化反应之后，还包括酰化产物的除杂步骤；
所述除杂步骤依次包括酰化产物的透析步骤和酰化产物的冻干步骤；
所述酰化产物的透析步骤采用截留分子量为2000~3000Da的透析袋。
在可选的实施方式中，进行酰化反应之前，透明质酸在EDC/DMAP催化酯化反应体系中通过第一酯化反应与缩合物硫缩酮-姜缩酮相连；
所述第一酯化反应温度为50℃；
所述第一酯化反应之后、酰化反应之前，还包括第一酯化反应产物的纯化步骤；
所述纯化步骤依次包括第一酯化反应产物的透析和第一酯化反应产物的冻干；
所述第一酯化反应产物的透析采用2000~3000Da的透析袋；
所述透析的时间为24h，更换透析液的频率为1次/2h。
在可选的实施方式中，所述第一酯化反应中缩合物硫缩酮-姜缩酮、透明质酸、催化剂EDC和DMAP的摩尔比为1：1：1：1。
在可选的实施方式中，所述缩合物硫缩酮-姜缩酮由姜缩酮与硫缩酮经第二酯化反应制备得到；
优选地，所述第二酯化反应包括取等摩尔的姜缩酮和硫缩酮EDC/DMAP催化酯化反应体系中进行；
所述第二酯化反应温度为45℃。
在可选的实施方式中，所述第二酯化反应中姜缩酮、硫缩酮与催化剂EDC和DMAP的摩尔比为1:1:1:1。
第三方面，本发明提供前述实施方式任一项所述的药物载体或采用前述实施方式任一项所述制备方法制备得到的药物载体在抗肿瘤组分装载中的应用。
第四方面，本发明提供一种抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物包括前述实施方式任一项所述的药物载体和紫杉醇；或者，所述抗肿瘤药物包括采用前述实施方式任一项所述制备方法制备得到的药物载体和紫杉醇。
第五方面，本发明提供一种抗肿瘤药物的制备方法，前述实施方式任一项所述的药物载体或采用前述实施方式任一项所述制备方法制备得到的药物载体和紫杉醇在水溶液中，经自组装形成载药胶束。
在可选实施方式中，本发明采用前述实施方式所述的制备方法得到载药胶束，所述载药胶束粒径为100~300nm，电位为-20~-40mV。
下面结合附图，对本发明的一些实施方式作详细说明。在不冲突的情况下，下述的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例1
本实施例以FAPα受体和CD44受体为主要靶点，构建具有肿瘤细胞和肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）双靶向性的药物载体，提高载体靶向性，同时引入了硫缩酮键和缩酮键，使得该载体同时具有ROS响应和pH敏感，合成路线如图1所示。具体合成步骤如下：
1.1 透明质酸-硫缩酮-姜缩酮（HSO）材料的合成
（1）参考中国专利CN110054608A制备姜缩酮的方法制备姜缩酮，具体步骤为：选取姜酮（ZZ）与甘油三醇反应合成引入具有pH敏感的缩酮结构的姜缩酮（ZO）。
（2）缩合物硫缩酮-姜缩酮（SO）的制备，具体步骤为：
硫缩酮（TKL）在EDC/DMAP的催化下与上述步骤（1）合成的姜缩酮（ZO）进行酯化反应，合成产物硫缩酮-姜缩酮（SO）。其中酯化反应温度为45℃，反应时间24 h，反应物ZO、TKL与催化剂EDC、DMAP的摩尔比为1:1:1:1。
（3）缩合物透明质酸-硫缩酮-姜缩酮（HSO）的制备，具体步骤为：
将上述步骤（2）合成的产物SO与透明质酸（HA）在EDC/DMAP的催化下发生酯化反应，合成透明质酸-硫缩酮-姜缩酮（HSO），其中反应温度为50℃，反应时间24 h，SO、HA、EDC、DMAP的摩尔比为1：1：1：1。反应完成之后转移到截留分子量为2000~3000 Da的透析袋中进行透析提纯，每2 h换一次水，透析24 h后转移到冻干皿中冻干得絮状产物HSO。
1.2 二肽-透明质酸-硫缩酮-姜缩酮（ZGP-HA-SS-SO）材料的合成与表征
选取具有CAFs靶向性的二肽Z-甘氨酸-脯氨酸（ZGP）与上述步骤1.1合成的缩合物HSO通过酰化反应进行连接，形成具有两亲性的药物载体材料GHSO，其中酰化反应温度为30℃，反应时间为24 h，之后转移到截留分子量为2000~3000 Da的透析袋中，除去未反应完的ZGP，每2 h换一次水，透析24 h后转移到冻干皿中得到冻干产物GHSO，并对其进行FT-IR和1H-NMR表征，表征结果如图2和图3所示，由图2可以看出，A所指为硫缩酮上偕二甲基，振动耦合，在1375cm-1附近耦合分裂成两个特殊形状谱带，B和C所指为芳环的骨架振动峰，D所指为缩酮的振动偶合峰。由图3可以看出，1H-NMR中ZO出现的4.77 ppm处甘油羟基上的H峰，3.98 ppm左右甘油碳上的氢峰被HA所出的峰所掩盖，因此选用6.75 ppm处的苯环所出的峰（如图3中C所示）来作为其特征峰。在1.5 ppm左右为TKL的-CH3上的H的特征峰（如图3中B所示），在GHSO的7.1 ppm左右又出现的特有的特征峰（如图3中A所示）为最后连接的二肽ZGP苯环的特征峰。
实施例2
本实施例采用实施例1得到的药物载体（GHSO）装载紫杉醇（PTX）制备了载药胶束（GHSO@PTX），具体步骤如下：
准确称量药物载体（GHSO）10 mg，用3 mL甲酰胺完全溶解，紫杉醇（PTX）1mg，用1mL甲酰胺完全溶解，GHSO溶液与PTX溶液完全混合后装于2000 Da的透析袋中，将透析袋放于装有800 mL的去离子水中透析，每2 h换一次水，将有机溶剂完全透出即可。采用场发射电子扫描显微镜对得到的载药胶束进行扫描，结果如图4所示，可以看出本实施例得到的载药胶束大小均匀，继而对扫描结果中载药胶束的粒径进行统计，统计结果如图5所示，测得得到的载药胶束粒径为100~300 nm，平均粒径为159.4nm，可以穿过肿瘤EPR效应，更易到达肿瘤部位。经过电极电位检测，得到的载药胶束的电极电位为-24.99mV，电极电位绝对值大于20，证明载药胶束的稳定性，如图6所示。
而后，根据以下公式分别计算得到的载药胶束的载药量和包封率：
载药量(%) = ( 胶束中所包载药物的含量/胶束总质量) × 100%；
包封率(%) = ( 胶束中所包载药物含量/药物的初始加入量) × 100%。
其中，胶束中所包载药物的含量=药物的初始加入量-剩余药物量，所述胶束总质量经过最初称量药物载体质量与最初称量药物紫杉醇质量相加方法获得，所述剩余药物量经过高效液相色谱法测量药物浓度方法获得。
经计算，本实施例得到的载药胶束的载药量为4.72±0.39%，包封率为49.61±3.52%。
对比例1
本对比例采用实施例1中步骤1.1得到的HSO作为药物载体，依据实施例2提供的药物装载方法，对紫杉醇PTX进行装载，得到第二种载药胶束HSO@PTX。采用场发射电子扫描显微镜对本对比例得到的载药胶束进行扫描，结果如图7所示，可以看出本对比例得到的载药胶束大小均匀，呈球形，继而对扫描结果中载药胶束HSO@PTX的粒径进行统计，统计结果如图8所示，测得得到的载药胶束粒径为100~300 nm，平均粒径为143.3nm，经过电极电位检测，得到的载药胶束HSO@PTX的电极电位为-23.76mV，如图9所示。
实验例1
本实验例考察了实施例2和对比例1得到的两种载药胶束的细胞学机制和抗肿瘤机理。
1.1载药胶束的细胞毒性评价
采用MTT法，测定载药胶束及其降解产物的细胞毒性；以原料药，空白胶束的培养基溶液为对照，评价实施例2得到的载药胶束GHSO@PTX和对比例得到的载药胶束HSO@PTX对SMMC-7721和CAFs两种细胞的细胞毒性，结果如图10所示。图10中， A和B分别24 h和48 h后，载药胶束GHSO@PTX和载药胶束HSO@PTX对CAFs的毒性考察结果， C和D分别为24 h和48h后，载药胶束GHSO@PTX和载药胶束HSO@PTX对SMMC-7721的毒性考察结果， E为空白胶束对SMMC-7721和CAFs两种细胞的毒性考察结果。由A-D可以看出，随着PTX浓度的增加，载药胶束GHSO@PTX和载药胶束HSO@PTX对两种细胞的毒性均有不同程度的增强，当PTX浓度大于10mg/mL之后，载药胶束GHSO@PTX和载药胶束HSO@PTX的细胞毒性明显大于原料药的细胞毒性，由E可以看出，空白胶束组毒性非常小。
1.2 纳米胶束细胞摄取及分布研究
胶束进入细胞后，胶束会在肿瘤细胞质的高活性ROS和低pH环境作用下分别裂解硫缩酮键和姜缩酮键，发挥ROS敏感特性和pH敏感特性，从而释放药物，使药物发挥直接的杀伤肿瘤的作用。另外，当GHSO@PTX被CAFs吞噬后，药物释放杀死CAFs，打开物理屏障，为进一步杀伤肿瘤细胞打下基础。此外，我们拟采用细胞核染色法对细胞核进行特异性染色，利用激光共聚焦显微镜观察胶束被细胞内吞后在细胞内的分布，通过比较在细胞内的分布，分析细胞的摄取情况。
在本部分实验中，选用肝癌细胞SMMC-7721细胞和CAFs细胞作为研究对象，姜黄素（Cur）作为制剂荧光探针，采用实施例2的方法分别使用实施例1得到的纳米载体GHSO和纳米载体HSO将Cur装载为纳米胶束GHSO@Cur和HSO@Cur来模拟载药胶束，使用Hoechst 33342作为细胞核染料，来研究载药胶束对两种细胞的摄取及定位情况。
浓度依赖性考察中，取对数生长的SMMC-7721细胞，接种于12孔板中，继续培养12h至细胞贴壁，弃去培养基，分别加入不同浓度的Free Cur，HSO@Cur，GHSO@Cur，（其中Cur的浓度分别为5μg/mL，10μg/mL，20μg/mL和40 μg/mL），培养4 h后去除培养基，用PBS清洗3遍，用多聚甲醛固定半小时后移除，再用PBS清洗，置于倒置荧光显微镜下观察。CAFs细胞的浓度依赖性考察实验方法同SMMC-7721细胞的实验方法。
时间依赖性考察中，取对数生长的SMMC-7721细胞，接种于12孔板中，继续培养12h至细胞贴壁，弃去培养基，加入Free Cur，HSO@Cur，GHSO@Cur（其中含Cur的浓度为20 μg/mL），各给药组分别培养0.5 h，1 h，2 h和4 h，之后弃去培养基，用PBS清洗3遍，用多聚甲醛固定半小时后移除，再用PBS清洗，置于倒置荧光显微镜下观察。CAFs细胞的时间依赖性考察实验方法同SMMC-7721细胞的实验方法。
细胞定位考察中，分别取对数生长的SMMC-7721细胞和CAFs细胞，接种于12孔板中，培养贴壁后，分别加入GHSO@Cur（其中含Cur的浓度为20 μg/mL），培养4 h后，弃去培养基，用PBS清洗，多聚甲醛固定，再加入Hoechst 33342细胞核染料，染色后清洗，置于倒置荧光显微镜下观察。
图11为载药胶束对SMMC-7721细胞的浓度依赖和时间依赖实验结果，图12为载药胶束对CAFs细胞的浓度依赖和时间依赖实验结果，图13为细胞定位实验结果（A和B分别为GHSO@Cur在SMMC-7721细胞和CAFs细胞中的定位情况）。结果表明，随着时间的增加，两种细胞对两种载药胶束的摄取量均有所增加，表现出时间依赖性；随着Cur浓度的增加，两种细胞对两种载药胶束的摄取量均有所增加，表现出浓度依赖性；而且两种细胞对于两种载药胶束的摄取明显优于对游离原料药的摄取。细胞定位实验中可以发现，在SMMC-7721细胞中，GHSO@Cur主要被细胞质摄取，而在CAFs细胞中，细胞质和细胞核均有摄取。
实验例2
2.1 抗肿瘤功效体内评价研究
（1）荷瘤裸鼠活体成像研究
本部分实验以SMMC-7721肝癌小鼠为模型，利用DiR作为荧光物质，考察DiR、HSO@DiR和GHSO@DiR（两种胶束的制备方法参考实施例1）不同时间在体内的分布及肿瘤靶向能力。
无菌条件下进行裸鼠饲养，待体重达到20 g左右进行接瘤，在裸鼠腋下注射肿瘤细胞。随机分为3组，每组3只，分别尾静脉Free DiR、HSO@DiR和GHSO@DiR。然后分别在2h、4h、8h、12h和24h利用近红外成像技术拍摄记录裸鼠荧光成像图片，观察DiR的分布情况。并在12 h对部分荷瘤裸鼠进行解剖处理，取心、肝、脾、肺、肾及肿瘤进行离体组织成像研究，结果如图14所示。
由图14可以看出，HSO@DiR组和GHSO@DiR组可以到达肿瘤组织且积聚时间较长；GHSO@DiR组可以更好地将DiR运送到肿瘤部位并进行蓄积，离体组织实验也证明了这一点。
（2）体内抑瘤效果评价
本部分以SMMC-7721肝癌小鼠为模型，考察PTX、HSO@PTX、GHSO@PTX对肿瘤的抑制作用。
在小鼠腋下注射肿瘤细胞，培养一段时间之后，随机分为6组，每组3只，6组分别为生理盐水，Free PTX、低浓度HSO@PTX（-）、高浓度HSO@PTX（+）、低浓度GHSO@PTX（-）和高浓度GHSO@PTX（+），其中高浓度组PTX浓度为0.5 mg/mL，低浓度组PTX浓度为0.25 mg/mL。每3天给药一次，共给药9次，每次给药时对裸鼠体重及肿瘤体积进行记录，停止给药3天后，将裸鼠安乐死，并进行解剖，肿瘤组织放于多聚甲醛中固定备用。
用以下方程计算其体积和肿瘤抑制率：
Figure M_210521143051866_866503001
Figure M_210521143051897_897753001
其中，方程中的L和W分别是肿瘤的长度和宽度。在方程中，WControl为对照组肿瘤重量，Wtest为实验组肿瘤重量，结果如图15所示。
由图15可以看出，各制剂组小鼠体重均未发现明显地下降变化，说明载药胶束具有较低毒副作用；从肿瘤图、肿瘤体积和抑瘤率结果可以看出，高浓度的GHSO@PTX组抑瘤效果最强。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种具有肿瘤细胞和肿瘤相关成纤维细胞双靶向功能的药物载体，其特征在于，所述药物载体含有通过酰基相连的透明质酸和Z-甘氨酸-脯氨酸；所述透明质酸的侧链上通过酯基连有硫缩酮；所述硫缩酮通过酯基连有姜缩酮。
2.权利要求1所述具有肿瘤细胞和肿瘤相关成纤维细胞双靶向功能的药物载体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括通过酰化反应将Z-甘氨酸-脯氨酸连接于透明质酸侧链上；
所述酰化反应的温度为30℃；
酰化反应之后，还包括酰化产物的除杂步骤；
所述除杂步骤依次包括酰化产物的透析步骤和酰化产物的冻干步骤；
所述酰化产物的透析步骤采用截留分子量为2000~3000Da的透析袋。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，进行酰化反应之前，透明质酸在EDC/DMAP催化酯化反应体系中通过第一酯化反应与缩合物硫缩酮-姜缩酮中的硫缩酮相连；
所述第一酯化反应的温度为50℃；
所述第一酯化反应之后、酰化反应之前，还包括第一酯化反应产物的纯化步骤；
所述纯化步骤依次包括第一酯化反应产物的透析和第一酯化反应产物的冻干；
所述第一酯化反应产物的透析采用2000~3000Da的透析袋；
所述透析的时间为24h，更换透析液的频率为1次/2h。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述第一酯化反应中缩合物硫缩酮-姜缩酮、透明质酸、催化剂EDC和DMAP的摩尔比为1：1：1：1。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述缩合物硫缩酮-姜缩酮由姜缩酮与硫缩酮经第二酯化反应制备得到；
所述第二酯化反应包括取等摩尔的姜缩酮和硫缩酮在EDC/DMAP催化酯化反应体系中进行；
所述第二酯化反应的温度为45℃。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述第二酯化反应中姜缩酮、硫缩酮与催化剂EDC和DMAP的摩尔比为1:1:1:1。
7.权利要求1所述的药物载体或采用权利要求2~6任一项所述制备方法制备得到的药物载体在制备抗肿瘤药物中的应用。
8.一种抗肿瘤药物，其特征在于，所述抗肿瘤药物包括权利要求1所述的药物载体和紫杉醇；或者，所述抗肿瘤药物包括采用权利要求2~6任一项所述制备方法制备得到的药物载体和紫杉醇。
9.一种抗肿瘤药物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括，权利要求1所述的药物载体或采用权利要求2~6任一项所述制备方法制备得到的药物载体和紫杉醇在水溶液中，经自组装形成载药胶束。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述载药胶束的粒径为100~300nm，电位为-20~-40mV。
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