CN104721831A - 一种透明质酸共价连接靶向性穿膜肽和活性药物的水溶性前药及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种透明质酸共价连接靶向性穿膜肽和活性药物的水溶性前药及其制备方法，它是由以下重量份比例的原料所制成：1份活性药物、7.5-15份透明质酸、0.375-0.75份靶向性穿膜肽。与现有技术相比，本发明所得的靶向性水溶性前药，由于采用透明质酸作为主要载体材料、采用靶向性穿膜肽修饰、连接活性药物成前药：(1)载体材料生物相容性好；(2)水溶性好，且溶液中更加稳定；(3)冷冻干燥不需要添加冻干保护剂，所得冻干粉，再溶解后，与冷冻干燥前相比，溶解性、载药量变化很小；(4)具有对于肿瘤细胞的靶向性，且穿透细胞膜的能力增强。

Description

一种透明质酸共价连接靶向性穿膜肽和活性药物的水溶性前药及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种靶向性水溶性前药及其制备方法，尤其涉及一种透明质酸共价连接靶向性穿膜肽和活性药物的水溶性前药及其制备方法，属于药物制剂领域。

背景技术

水溶性前药应用具有生物降解性的高分子材料，通过共价键连接疏水部分和亲水部分，由于水溶性部分比例较大，且能够将疏水药物分子物理包裹在载体中，使得整体具有良好亲水性。肿瘤血管通透性高又缺乏有效的淋巴引流，大分子结构能够进入肿瘤组织，又被肿瘤组织截留。这种使大分子在肿瘤组织增强渗透和滞留的效应称为EPR效应(enhanced permeability and retention effect)。自组装形成的药物递送系统能够利用高分子载体的EPR效应达到被动靶向的作用。

透明质酸(hyaluronic acid，HA)是一种大分子糖胺聚糖，是构成细胞外基质(ECM)和细胞间质(ICM)的主要成分，尘物相容性好。HA基本上为化学惰性物质，同大多数化学物质具有相容性。且细胞膜HA结合蛋白(膜表面受体)CD44在肿瘤细胞表面的含量比正常细胞高出多倍，因此HA有一定的靶向肿瘤细胞的功能。HA作为载体材料，能够控制药物释放速度，起到缓释的效果。

穿膜肽(cell-penetrating peptides，CPPs)是一类具有高效穿过细胞膜而不损伤细胞膜结构和功能特点的多肽。一般具有水溶性，故性质比较稳定。多数研究证明CPPs在常规的用量范围内基本没有毒性。CPPs可以携带多种活性物质进入细胞，已经在介导基因、蛋白质、多肽、小分子、纳米颗粒和脂质体等穿透各种细胞膜方面发挥了巨大作用。tLyP-1为水溶性穿膜肽，具有良好的穿透细胞膜的能力，在介导载药脂质体、纳米粒等穿透细胞膜治疗疾病方面均有相关研究应用。其序列为CGNKRTR。

发明内容

本发明提供了一种透明质酸共价连接靶向性穿膜肽和活性药物的水溶性前药，它主要是由以下重量份比例的原料所制成：

1份活性药物、7.5-15份透明质酸、0.375-0.75份靶向性穿膜肽。

优选地，上述靶向性水溶性前药主要是由以下重量份比例的原料所制成：

1份活性药物、7.5-15份透明质酸、0.375-0.75份靶向性穿膜肽。

优选地，所述的活性药物为紫杉醇。

优选地，所述的靶向性穿膜肽为tLyP-1。

优选地，所述的透明质酸为分子量为5000、9000、12000透明质酸中的一种。

本发明还提供了上述靶向性水溶性前药的制备方法，它主要是由如下步骤所组成：

(1)用甲酰胺溶液溶解透明质酸，加入4-二甲氨基吡啶催化，加入用N，N-二甲基甲酰胺溶解的活性药物，55-60℃下反应6h；

(2)透析除去杂质；冻干后水复溶，加入靶向性穿膜肽，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺催化，25℃反应4h；

(3)透析，过滤；冻干，即得。

相对于现有技术，本发明所得的靶向性水溶性前药，由于采用透明质酸作为主要载体材料、采用靶向性穿膜肽修饰、连接活性药物成前药：(1)载体材料生物相容性好；(2)水溶性好，结构更加稳定；(3)冷冻干燥不需要添加冻干保护剂，所得冻干粉，再溶解后，与冷冻干燥前相比，溶解性、载药量变化很小；(4)具有对于肿瘤细胞的靶向性，且穿透细胞膜的能力增强。

附图说明

图1透明质酸的核磁共振氢谱图；

图2水溶性前药的核磁共振氢谱图；

图3透明质酸的红外光谱图；

图4不含有靶向穿膜肽的水溶性前药的红外光谱图；

图5连接靶向穿膜肽的水溶性前药的红外光谱图

具体实施方案：

实施例1

处方：1mg紫杉醇、15mg分子量9000透明质酸、0.75mg tLyP-1。

制备工艺： 

(1)用3ml甲酰胺溶液溶解透明质酸，加入5mg 4-二甲氨基吡啶催化，加入用50ul N，N-二甲基甲酰胺溶解的活性药物，55-60℃下反应6h；

(2)透析除去杂质；冻干后水复溶，加入1.5mg tLyP-1，加入6mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1.2mg N-羟基琥珀酰亚胺催化，25℃反应4h；

(3)透析，0.22um微孔滤膜过滤；冻干，即得。

实施例2

处方：1mg紫杉醇、7.5mg分子量9000透明质酸、0.75mg tLyP-1。

制备工艺： 

(1)用3ml甲酰胺溶液溶解透明质酸，加入5mg 4-二甲氨基吡啶催化，加入用50ul N，N-二甲基甲酰胺溶解的活性药物，55-60℃下反应6h；

(2)透析除去杂质；冻干后水复溶，加入1.5mg tLyP-1，加入6mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1.2mg N-羟基琥珀酰亚胺催化，25℃反应4h；

(3)透析，0.22um微孔滤膜过滤；冻干，即得。

实施例3

处方：1mg紫杉醇、7.5mg分子量9000透明质酸、0.325mg tLyP-1。

制备工艺： 

(1)用3ml甲酰胺溶液溶解透明质酸，加入5mg 4-二甲氨基吡啶催化，加入用50ul N，N-二甲基甲酰胺溶解的活性药物，55-60℃下反应6h；

(2)透析除去杂质；冻干后水复溶，加入1.5mg tLyP-1，加入6mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1.2mg N-羟基琥珀酰亚胺催化，25℃反应4h；

(3)透析，0.22um微孔滤膜过滤；冻干，即得。

实施例4

处方：1mg紫杉醇、15mg分子量5000透明质酸、0.75mg tLyP-1。

制备工艺： 

(1)用3ml甲酰胺溶液溶解透明质酸，加入5mg 4-二甲氨基吡啶催化，加入用50ul N，N-二甲基甲酰胺溶解的活性药物，55-60℃下反应6h；

(2)透析除去杂质；冻干后水复溶，加入1.5mg tLyP-1，加入6mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1.2mg N-羟基琥珀酰亚胺催化，25℃反应4h；

(3)透析，0.22um微孔滤膜过滤；冻干，即得。

实施例5

处方：1mg紫杉醇、15mg分子量12000透明质酸、0.75mg tLyP-1。

制备工艺： 

(1)用3ml甲酰胺溶液溶解透明质酸，加入5mg 4-二甲氨基吡啶催化，加入用50ul N，N-二甲基甲酰胺溶解的活性药物，55-60℃下反应6h；

(2)透析除去杂质；冻干后水复溶，加入1.5mg tLyP-1，加入6mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1.2mg N-羟基琥珀酰亚胺催化，25℃反应4h；

(3)透析，0.22um微孔滤膜过滤；冻干，即得。

实验例

按照市售紫杉醇注射剂制备方法制备紫杉醇注射液，设为市售对照组；按照本发明处方和制备方法制备不含有靶向穿膜肽的水溶性前药，即除不含有靶向穿膜肽，所有处方和制备方法均按照本发明所记载，所得纳米粒设为无穿膜肽对照组；取市售制剂、无穿膜肽水溶性前药和水溶性前药制剂配置成PTX浓度为1mg/ml的5％葡萄糖溶液。

1、结构表征 

1.1核磁共振氢谱表征¹H-NMR

分别取适量透明质酸、不含有靶向穿膜肽的水溶性前药溶于D₂O，500MHz频率照射，20℃下Bruker(AVACE)AV-500型核磁共振仪记录图谱。以12000分子量透明质酸为例，其核磁共振氢谱图如图2和图3所示：透明质酸(D₂O)的特征峰出现在2.01ppm和3.28～4.75ppm，与透明质酸图谱相比，不含有靶向穿膜肽的水溶性前药(D2O)氢谱中，在7.0～8.2ppm处出现的紫杉醇苯环特征峰，说明HA-PTX偶联物水溶性前药的形成。

1.2、红外光谱表征FT-IR

分别取透明质酸、不含有靶向穿膜肽的水溶性前药、水溶性前药适量，采用KBr压片法，用FT-IR Nicolet 2000型红外光谱仪记录红外光谱。以12000分子量透明质酸tLyP-1为例，其红外谱图如图3、图4和图5所示：

当PTX通过酯键与HA偶联后，1690cm^-1处出现新的伸缩振动峰，这是山于引入的紫杉醇中PTX的2’-OH同HA之间生成酯键(-(CO)-O-)的原因；另外，1415和709cm^-1处出现特征峰为PTX的苯环上双键(-C＝C-)的伸缩振动所致。所有结果说明PTX成功偶合到HA骨架上。

当穿膜肽通过酰胺键与HA偶联后，HA羧基的伸缩振动峰(COO-，1613cm^-1)消失，而在1654cm^-1处出现一个新的吸收峰，这是由于新形成了酰胺键(-NHCO-)的结构；而1690cm^-1处出现新的伸缩振动峰，这是由于引入的紫杉醇中PTX的2’-OH同HA之间生成酯键(-(CO)-O-)的原因；另外，1415和709cm^-1处出现特征峰为PTX的苯环上双键(-C＝C-)的伸缩振动所致。所有结果说明穿膜肽成功偶合到HA骨架上。

2、稳定性比较结果见表1

放置条件：4℃冷藏放置。 

表1 本发明所得水溶性前药在溶液中稳定性考察

由上表1可以得知，市售对照组，放置7天后即出现絮状析出，15天以后形成絮状沉淀，稳定性较差；而无穿膜肽对照组和本发明各实施例所得的水溶性前药，放置2个月仍无絮状析出，也无沉淀，稳定性大大提高。

3、肿瘤靶向性 

选用荷瘤小鼠，进行活体成像实验，小鼠尾静脉注射无穿膜肽对照组水溶性前药和本发明实施例所得水溶性前药，荧光结果显示，注射无穿膜肽对照组水溶性前药的小鼠和注射水本发明实施例所得的水溶性前药的小鼠，荧光均集中在肿瘤部位，而注射的水溶性前药，荧光强度更强，因此本发明所得的水溶性前药对于肿瘤均具有一定的靶向性，且穿膜肽进一步提高了前药进入肿瘤部位的能力。

4、抗肿瘤药效试验

4.1方法

取HepG2细胞置于37℃，5％CO2细胞培养箱培养3天，用培养液调整细胞浓度为

1×10⁷mL^-1，取0.2mL注入小鼠腹腔内。7天后将小鼠颈椎脱臼处死，于75％乙醇浸泡1～2min后抽取腹水，用生理盐水稀释，混合均匀，1000r/min离心5min，取上清液，加生理盐水稀释成1×107mL-1的腹水瘤细胞液，置冰水浴中存放。

取小鼠50只，皮下接种0.2mL上述腹水瘤细胞液(2×10⁶个细胞)。随机分为5组，每组10只，分别设为空白组、对照组和实验组，实验组包括低、中、高剂量组。

空白组腹腔注射尘理盐水；

对照组腹腔注射紫杉醇注射制剂，是以聚氧乙烯蓖麻油和无水乙醇(体积比为50∶50)作为混合溶媒所制成的制剂；给药剂量为以紫杉醇量计0.2mg/20g(小鼠体重)。

实验组腹腔注射本发明实施例2所得水溶性前药，低、中、高剂量组的剂量(以水溶性前药中紫杉醇量计)分别为0.1mg/20g(小鼠体重)、0.2mg/20g(小鼠体重)、0.3mg/20g(小鼠体重)。

每组每日给药1次，共给药7天，7天后处死各组小鼠，完整剥离肿瘤并称重，计算对照组和实验组抑瘤率：

抑瘤率(％)＝[1-(平均瘤重/空白组平均瘤重)]×100

4.2 结果 见表2

表2 本发明水溶性前药对荷瘤小鼠的抑瘤作用

与空白组相比较，*P＜0.05。

由上表可知，实验组随着给药剂量增加，抑瘤率增加；相比较空白组，对照组和实验组的平均瘤重均显著降低，实验组低、中、高剂量组的抑瘤率分别达到29.19％、35.68％和52.43％，证明本发明所得的纳米粒制剂对于肿瘤生长具有明显的抑制作用。

Claims (7)

1.一种透明质酸共价连接靶向性穿膜肽和活性药物的水溶性前药，其特征在于，其分子结构式如下：

2.根据权利要求1所述的靶向性水溶性前药，其特征在于，它的分子结构式中，紫杉醇与透明质酸通过酯键相连，透明质酸与穿膜肽通过酰胺键相连。

3.根据权利要求1所述的靶向性水溶性前药，其特征在于，它主要是由以下重量份比例的原料所制成：

1份活性药物、7.5-15份透明质酸、0.375-0.75份靶向性穿膜肽。

4.根据权利要求1所述的靶向性水溶性前药，其特征在于，所述的活性药物为紫杉醇。

5.根据权利要求1所述的靶向性水溶性前药，其特征在于，所述的靶向性穿膜肽为tLyP-1。

6.根据权利要求1所述的靶向性水溶性前药，其特征在于，所述的透明质酸为分子量为5000、9000、12000透明质酸中的一种。

7.权利要求1-5任一项所述靶向性水溶性前药的制备方法，其特征在于，它主要是由如下步骤所组成：

(1)用甲酰胺溶液溶解透明质酸，加入4-二甲氨基吡啶催化，加入用N，N-二甲基甲酰胺溶解的活性药物，55-60℃下反应6h；

(2)透析除去杂质；冻干后水复溶，加入靶向性穿膜肽，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺催化，25℃反应4h；

(3)透析，过滤；冻干，即得。