CN112156066B - 一种包含胶束的可注射复合水凝胶双载药系统的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药物载体领域，提供了一种包含胶束的可注射复合水凝胶双载药系统的制备方法。所述双载药系统针对载药量、作用时间以及治疗效果等需求，首先采用开环聚合法合成MPEG‑P(CL‑ran‑TMC)聚合物胶束，并在其中包载脂溶性抗癌药物1。然后，使用高碘酸钠氧化HA得到AHA，再将NOCC与AHA交联形成NOCC/AHA水凝胶。最后，将包载抗癌药物1的胶束与抗癌药物2共同包载到NOCC/AHA水凝胶中，得到了一种双载药的水凝胶复合体系抗癌药物1/M+抗癌药物2@gel，其中抗癌药物1与抗癌药物2是不同的。通过本发明的复合水凝胶双载药系统提高了脂溶性抗癌药物的生物利用度，实现了局部缓释给药以及使用多种抗癌药物联合治疗的效果。

Description

一种包含胶束的可注射复合水凝胶双载药系统的制备方法
技术领域
本发明属于药物载体领域，具体涉及一种包含胶束的可注射复合水凝胶双载药系统的制备方法。本发明还涉及使用所述制备方法制备得到的包含胶束的可注射复合水凝胶双载药系统及其用途。
背景技术
面对癌症复杂的发病机制，采用单一药物化疗已经难以取得较高的疗效。两种或更多种药物的联合化疗已广泛应用于临床癌症的治疗。联合用药的优点主要在于多种药物的协同作用使疗效更好，同时降低药物的毒副作用。但是，在临床上药物的联合治疗往往需要几种制剂产品分开应用，药物在靶细胞并不能发挥良好的协同作用，导致患者顺应性差，疗效降低。因此，将两种或更多种药物载入同一递送系统上改善其药物代谢分布、生物利用度及协调两种或更多种不同药物的治疗方式显得尤为重要。
其中，紫杉醇(paclitaxel,PTX)是从红豆杉属植物中提取的一种脂溶性二萜类生物碱类化合物。该药是一种广泛应用于临床的广谱抗癌药物，其常与其他化疗药物联合用于乳腺癌、卵巢癌、肺癌、膀胱癌等癌症的治疗(参见，刘元芬等，“紫杉醇与吉西他滨联合抗肿瘤作用机制及共载给药系统的研究进展”[J]，中国新药杂质，2019年第28卷第9期，第1081-1086页)。但是，因PTX水溶性差，传统PTX制剂采用无水乙醇和聚氧乙烯蓖麻油助溶，却可能导致患者发生严重的超敏反应。
由此可见，研制出一种新型载药系统，解决PTX的溶解性问题，并减轻静脉化疗导致的毒副反应，对癌症治疗具有重要意义。为了解决上述一系列问题，近年来，一些纳米材料如高分子药物偶联物、水凝胶、纳米颗粒、胶束、脂质体以其高生物相容性，以及可提高药物的生物利用度等优势受到越来越多的关注。其中，生物可降解的聚合物胶束可作为化疗药物的载体，并能解决药物的疏水性问题。胶束具有核壳结构，疏水性药物在疏水核和亲水壳中结合，最后形成稳定的溶液。聚合物胶束可有效克服大多化疗药物水溶性差的缺点，并能通过靶向和持续的给药使局部药物浓度增加，改善药物的生物利用度。
其中，MPEG-P(CL-ran-TMC)是一种具有较高的药物负载能力和良好生物相容性的两嵌段聚合物胶束，作为疏水性药物载体具有广阔的应用前景。Gong等人曾制备得到载PTX的MPEG-P(CL-ran-TMC)聚合物胶束(PTX/M)，并发现其不仅能够提高PTX的溶解性，还能增加肿瘤对化疗药的摄取能力，对肺癌、乳腺癌和卵巢癌均显示出良好的抗肿瘤活性(参见Gong C,Xie Y,Wu Q,et al.Improving anti-tumor activity with polymeric micellesentrapping paclitaxel in pulmonary carcinoma[J].Nanoscale,2012,4(19):6004-17)。另外，以透明质酸(HA)、羧甲基壳聚糖(NOCC)为基础的可注射性水凝胶(NOCC/AHA水凝胶)具有生物可降解性，作为药物缓释载体，在药物控释领域备受关注。Li等人此前发现可以将该水凝胶应用于免疫佐剂和防止术后腹膜粘连的用途(参见Li L,Wang N,Jin X,etal.Biodegradable and injectable in situ cross-linking chitosan-hyaluronicacid based hydrogels for postoperative adhesion prevention[J].Biomaterials,2014,35(12):3903-17)。但是，目前尚未将NOCC/AHA水凝胶用于局部输送药物治疗恶性肿瘤。
鉴于目前临床上对治疗癌症给药系统的迫切需求，基于上述理论和实验依据，本发明拟开发一种包含胶束的可注射复合水凝胶双载药系统的制备方法，该方法将脂溶性抗癌药物1/MPEG-P(CL-ran-TMC)聚合物胶束和抗癌药物2共同包载于NOCC/AHA水凝胶中，构建可注射的水凝胶复合体系，并将其用于治疗恶性肿瘤。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的不足，开发了一种包含胶束的可注射复合水凝胶双载药系统的制备方法，该方法将脂溶性抗癌药物1/MPEG-P(CL-ran-TMC)聚合物胶束和抗癌药物2共同包载于NOCC/AHA水凝胶中，构建可注射的水凝胶复合体系，并将其用于治疗恶性肿瘤。
为达到本发明的目的，本发明采用了如下技术方案：
在第一个方面中，本发明提供了一种包含胶束的可注射复合水凝胶双载药系统的制备方法，其特征在于：包括下述步骤：采用开环聚合法合成MPEG-P(CL-ran-TMC)聚合物；再采用固体分散法将脂溶性抗癌药物1包载于MPEG-P(CL-ran-TMC)聚合物胶束中，得到载药聚合物胶束；接下来使用高碘酸钠氧化透明质酸(HA)，得到多醛基的透明质酸(AHA)，并通过希夫碱反应，将NOCC与AHA交联形成NOCC/AHA水凝胶；以NOCC/AHA水凝胶为载体，将载药聚合物胶束和抗癌药物2共同包载到NOCC/AHA水凝胶中，得到共载脂溶性抗癌药物1和抗癌药物2的载双药水凝胶复合体系，其中所述抗癌药物1和抗癌药物2选自下述中的一种或多种：紫杉醇、多西紫杉醇、环磷酰胺、阿霉素、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、卡培他滨、他莫昔芬、顺铂、卡铂、奥沙利铂、萘达铂、四硝基三铂、菲铂、吡铂或赛特铂，且抗癌药物1与抗癌药物2是不同的，所述双载药系统用于局部缓释给药，所述双载药系统提高了脂溶性抗癌药物的生物利用度。
在一个优选的实施方式中，所述脂溶性抗癌药物1为紫杉醇或多西紫杉醇和所述抗癌药物2为吉西他滨，或者所述脂溶性抗癌药物1为紫杉醇或多西紫杉醇和所述抗癌药物2为顺铂、卡铂、奥沙利铂、萘达铂、四硝基三铂、菲铂、吡铂或赛特铂。
在另一个优选的实施方式中，所述制备方法包括下述步骤：
(1)MPEG-P(CL-ran-TMC)聚合物的合成：向干燥的三颈瓶中依次加入MPEG、ε-CL、TMC以及辛酸亚锡，在干燥高纯度氮气条件下，油浴加热，搅拌反应，在真空下，合成的聚合物冷至室温，用二氯甲烷溶解合成的聚合物，然后用过量的石油醚搅拌，去除未反应的单体和小分子，然后，聚合物真空干燥，溶解的聚合物在室温下透析，最后在真空下冷冻干燥，将纯化的MPEG-P(CL-ran-TMC)聚合物保存在干燥器中，以备进一步使用；
(2)载药聚合物胶束的制备：将MPEG-P(CL-ran-TMC)聚合物和脂溶性抗癌药物1在丙酮中搅拌共溶，随后，使用旋转蒸发器除去溶剂丙酮，形成薄膜，将薄膜溶解在预热的生理盐水(NS)中，形成载药聚合物胶束，用注射器过滤器进行过滤，去除未包载于胶束的药物；
(3)NOCC/AHA水凝胶的制备：HA完全溶解于双蒸水(ddH2O)中，将高碘酸钠(NaIO4)溶解在ddH2O中，逐滴加入NaIO4溶液，然后，将混合物在室温下避光搅拌，再加乙二醇搅拌后终止反应，所得溶液放入截留分子量3.5kDa(MWCO3500)透析袋透析纯化3天，外水相为ddH2O，每天更换三次ddH2O，收集得到的产物，经冻干制得AHA，以NS为溶剂，分别配制AHA溶液和NOCC溶液，将两者按比例混合均匀，室温下静置得到NOCC/AHA水凝胶；
(4)共载脂溶性抗癌药物1和抗癌药物2的载双药水凝胶复合体系的构建：以NS为溶剂，配制NOCC溶液、AHA溶液、载药聚合物胶束溶液、抗癌药物2溶液，在冰浴中，充分振荡，均匀混合NOCC溶液、载药聚合物胶束溶液和抗癌药物2溶液，得到共载脂溶性抗癌药物1和抗癌药物2的载双药水凝胶复合体系。
在一个更优选的实施方式中，所述制备方法包括下述步骤：
(1)MPEG-P(CL-ran-TMC)聚合物的合成：向干燥的三颈瓶中依次加入MPEG、ε-CL、TMC以及辛酸亚锡，在干燥高纯度氮气条件下，油浴加热至120℃-150℃，搅拌反应20-28h，在真空下，合成的聚合物冷至室温，用二氯甲烷溶解合成的聚合物，然后用过量的石油醚搅拌，去除未反应的单体和小分子，然后，聚合物在40℃-60℃下真空干燥70-80h，溶解的聚合物在室温下透析70-80h，最后在真空下冷冻干燥70-80h，将纯化的MPEG-P(CL-ran-TMC)聚合物保存在干燥器中，以备进一步使用；
(2)载药聚合物胶束的制备：将MPEG-P(CL-ran-TMC)聚合物和脂溶性抗癌药物1在丙酮中搅拌共溶，随后，使用旋转蒸发器50-70℃下转速80-120rpm除去溶剂丙酮，形成薄膜，将薄膜溶解在预热的适量生理盐水(NS)中，形成载药聚合物胶束，用0.22μm注射器过滤器进行过滤，去除未包载于胶束的药物；
(3)NOCC/AHA水凝胶的制备：HA完全溶解于双蒸水(ddH2O)中，高碘酸钠(NaIO4)溶解在ddH2O中，逐滴加入NaIO4溶液，然后，将混合物在室温下避光搅拌12h，再加乙二醇搅拌1-2h后终止反应，所得溶液放入截留分子量3.5kDa(MWCO3500)透析袋透析纯化3天，外水相为ddH2O，每天更换三次ddH2O，收集得到的产物，经冻干制得AHA，以NS为溶剂，分别配制浓度为30mg/mL的AHA溶液和20mg/mL的NOCC溶液，将两者按照体积1:1的比例混合均匀，室温下静置得到NOCC/AHA水凝胶；
(4)共载脂溶性抗癌药物1和抗癌药物2的载双药水凝胶复合体系的构建：以NS为溶剂，配制NOCC溶液、AHA溶液、载药聚合物胶束溶液、抗癌药物2溶液，在冰浴中，以适当体积比充分振荡，均匀混合NOCC溶液、AHA溶液、载药聚合物胶束溶液和抗癌药物2溶液，得到共载脂溶性抗癌药物1和抗癌药物2的载双药水凝胶复合体系。
在第二个方面中，本发明提供了一种根据上述制备方法制备得到的包含胶束的可注射复合水凝胶双载药系统。
在一个优选的实施方式中，所述双载药系统用于局部缓释给药，所述双载药系统提高了脂溶性抗癌药物的生物利用度。
在一个更优选的实施方式中，所述注射为瘤内注射。
在第三个方面中，本发明提供了上述包含胶束的可注射复合水凝胶双载药系统在制备抗癌药物中的用途。
在一个优选的实施方式中，所述癌症选自下组：子宫内膜癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、输卵管癌、睾丸癌、原发性腹膜癌、结肠癌、结肠直肠癌、小肠癌、肛门生殖器区域的鳞状细胞癌、黑色素瘤、肾细胞癌、肺癌、非小细胞肺癌、肺鳞状细胞癌、胃癌、膀胱癌、胆囊癌、肝癌、甲状腺癌、喉癌、唾液腺癌、食道癌、头颈癌、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌、胰腺癌、间皮瘤、梅克尔细胞癌、肉瘤或胶质母细胞瘤。
在一个更优选的实施方式中，所述癌症选自：乳腺癌、肺癌、胰腺癌或膀胱癌。
为了便于更好地阅读本说明书，下面提供了说明书中使用的主要缩略词。
Figure BDA0002757730280000061
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明成功开发了一种包含胶束的可注射复合水凝胶双载药系统的制备方法，该方法将脂溶性抗癌药物1/MPEG-P(CL-ran-TMC)聚合物胶束和抗癌药物2共同包载于NOCC/AHA水凝胶中，构建可注射的水凝胶复合体系。该水凝胶易于瘤内注射，注射后逐渐成胶，并能稳定保持凝胶状态数天，使抗癌药物缓慢释放出来。此外，该水凝胶还能够提高脂溶性抗癌药物的生物利用度。
附图说明
图1：PTX/M+DDP@gel水凝胶的SEM图。
图2：在37℃下空白水凝胶或载药水凝胶的流变测试：(A)gel；(B)DDP@gel；(C)M@gel；(D)PTX/M@gel；(E)PTX/M+DDP@gel。
图3：活体成像观测Cy5.5@gel水凝胶注射后的局部药物释放。
图4：PTX/M+DDP@gel水凝胶复合体系诱导MCF-7细胞凋亡的流式检测图。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。
实施例1：PTX/M+DDP@gel水凝胶复合体系的构建和表征
1.PTX/M+DDP@gel水凝胶复合体系的构建
(1)MPEG-P(CL-ran-TMC)聚合物的合成：向干燥的三颈瓶中依次加入10g MPEG、8.5gε-CL、2.5g TMC以及辛酸亚锡，在干燥高纯度氮气条件下，油浴加热至130℃，搅拌反应24h，在真空下，合成的聚合物冷至室温，用二氯甲烷溶解合成的聚合物，然后用过量的石油醚搅拌，去除未反应的单体和小分子，然后，聚合物在50℃下真空干燥72h，溶解的聚合物在室温下透析72h，最后在真空下冷冻干燥72h，将纯化的MPEG-P(CL-ran-TMC)聚合物保存在干燥器中，以备进一步使用；
(2)载PTX聚合物胶束的制备：将95mg MPEG-P(CL-ran-TMC)聚合物和5mg PTX在5mL丙酮中搅拌共溶，随后，使用旋转蒸发器60℃下转速100rpm除去溶剂丙酮，形成薄膜，将薄膜溶解在预热的2.5mL生理盐水(NS)中，形成载药聚合物胶束，用0.22μm注射器过滤器进行过滤，去除未包载于胶束的药物；
(3)NOCC/AHA水凝胶的制备：1g HA完全溶解于100mL双蒸水(ddH2O)中，320mg高碘酸钠(NaIO4)溶解在5mL ddH2O中，逐滴加入NaIO4溶液，然后，将混合物在室温下避光搅拌12h，再加500μL乙二醇搅拌1h后终止反应，所得溶液放入截留分子量3.5kDa(MWCO3500)透析袋透析纯化3天，外水相为ddH2O，每天更换三次ddH2O，收集得到的产物，经冻干制得AHA，以NS为溶剂，分别配制浓度为30mg/mL的AHA溶液和20mg/mL的NOCC溶液，将两者按照体积1:1的比例混合均匀，室温下静置得到NOCC/AHA水凝胶；
(4)共载PTX胶束和DDP的载双药水凝胶复合体系的构建：以NS为溶剂，配制NOCC溶液、AHA溶液、DDP溶液，浓度分别为20mg/mL、30mg/mL、2mg/mL，采用步骤(2)中的方法制备空白胶束和PTX/M，在冰浴中，以体积比2∶2∶5∶1充分振荡，均匀混合NOCC溶液、AHA溶液、PTX/M和DDP溶液，得到PTX/M+DDP@gel载药水凝胶制剂，以同样的方法制备载空白胶束的M@gel水凝胶(NOCC溶液、AHA溶液、MPEG-P(CL-ran-TMC)聚合物溶液的体积比为1：1：2)，以及载单药的PTX/M@gel水凝胶(NOCC溶液、AHA溶液、PTX/M的体积比为1：1：2)和DDP@gel水凝胶(NOCC溶液、AHA溶液、DDP溶液的体积比为4.5：4.5：1)。
2.PTX/M+DDP@gel水凝胶复合体系的表征
采用扫描电镜观察PTX/M+DDP@gel水凝胶的形貌。PTX/M+DDP@gel水凝胶冷冻干燥72h，经喷金处理后用扫描电镜观察。采用旋转流变仪(HAAKE Rheostress 6000,Thermoscientific,USA)研究PTX/M+DDP@gel水凝胶复合体系在相转变过程中的流变学行为。将待测样置于检测台上，检测台直径20mm，轴底台距夹具1mm。测试前，样品边缘滴加硅油进行液封，防止测量过程中待测水凝胶中的水分挥发而影响检测。在37℃下观察样品的成凝胶时间，检测水凝胶储能模量(G')和耗散模量(G")随时间变化的曲线。另外，作为对照，对NOCC/AHA水凝胶、M@gel水凝胶以及载单药的PTX/M@gel水凝胶、DDP@gel水凝胶进行流变学检测，方法同上。
结果表明，制备的PTX/M+DDP@gel在SEM下的形貌特征如图1所示，NOCC/AHA水凝胶具有微米级多孔结构，PTX/M和DDP的加入并未影响水凝胶的疏松多孔结构。
采用旋转流变仪研究PTX/M+DDP@gel水凝胶复合体系相转变过程中的流变学行为。从图2中可以看出，在37℃下，几种水凝胶约30～40s内完成溶胶到凝胶化转变过程，成胶时间适中，具有可注射性。此外，载药的NOCC/AHA水凝胶与载有空白胶束的水凝胶的相比性质类似，其流变性均表明载药后水凝胶力学性能没有受到明显影响，在恒温下凝胶化之后水凝胶的机械强度稳定。
实施例2：载药水凝胶在体内的药物释放
为了直观观察NOCC/AHA水凝胶载药在局部注射后的药物缓释情况，使用Cy5.5(小分子荧光探针)作为模型药物包载于NOCC/AHA水凝胶中(Cy5.5@gel)，并采用小动物活体成像技术来观察载药水凝胶的体内药物释放的实时情况。在BALB/c小鼠的右侧背部分别皮下注射100μL的Cy5.5水溶液和Cy5.5@gel水凝胶(Cy5.5浓度均为5μg/mL)。在给药后不同的时间点(t＝2h、24h、48h、168h、336h、504h)将BALB/c小鼠麻醉，使用小动物活体成像系统IVISLumina Series III(Perkin-Elmer,USA)观测Cy5.5(激发波长为673nm,发射波长为692nm)在体内的荧光强度。
如图3所示，结果表明，在小鼠的右侧背部皮下注射相同剂量的Cy5.5荧光探针，在2h后载Cy5.5水凝胶组和Cy5.5水溶液组局部荧光强度很高，随着时间的推移荧光强度逐渐减弱。注射后前24h，两组局部荧光强度相差不大；48h后游离组水溶液的荧光强度略有减弱，随后的观测可看到水凝胶组的荧光强度减少，但仍有强的荧光，与之相比而游离组的荧光强度微弱。实验结果证明NOCC/AHA水凝胶具有一定的缓释能力，载药后能逐步释放药物。
实施例3：PTX/M+DDP@gel水凝胶复合体系体外诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡的作用
采用Annexin V/PI双染法用于凋亡细胞染色，利用流式技术法定量检测M@gel、PTX/M@gel、DDP@gel和PTX/M+DDP@gel诱导细胞凋亡情况。实验结果如图4所示，经24h处理后，PTX/M@gel和DDP@gel组的细胞凋亡率分别为11.49％±0.94％和20％±1.05％。PTX/M+DDP@gel组明显高于NS组(24.97％±2.39％vs 1.5％±0.27％，P<0.01)。
以上结果表明，PTX/M@gel和DDP@gel在一定程度上均能诱导MCF-7细胞凋亡，并且联合给药提高了疗效，说明联合化疗具有一定的优越性。综合体外细胞毒性分析结果，PTX/M+DDP@gel水凝胶复合体系通过诱导部分肿瘤细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用。
综上所述，本发明成功构建了包含胶束的载双药水凝胶复合体系，特别是可注射的脂溶性抗癌药物1/M+抗癌药物2@gel水凝胶复合体系。该水凝胶易于瘤内注射，注射后逐渐成胶，并能稳定保持凝胶状态数天，使抗癌药物缓慢释放出来。此外，该水凝胶还能够提高脂溶性药物的生物利用度。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (3)

1.一种包含胶束的可注射复合水凝胶双载药系统的制备方法，其特征在于：包括下述步骤：
（1）MPEG-P(CL-ran-TMC)聚合物的合成：向干燥的三颈瓶中依次加入MPEG、ε-CL、TMC以及辛酸亚锡，在干燥高纯度氮气条件下，油浴加热至120℃-150℃，搅拌反应20-28 h，在真空下，合成的聚合物冷至室温，用二氯甲烷溶解合成的聚合物，然后用过量的石油醚搅拌，去除未反应的单体和小分子，然后，聚合物在40℃-60℃下真空干燥70-80 h，溶解的聚合物在室温下透析70-80 h，最后在真空下冷冻干燥70-80 h，将纯化的MPEG-P(CL-ran-TMC)聚合物保存在干燥器中，以备进一步使用；
（2）载药聚合物胶束的制备：将MPEG-P(CL-ran-TMC)聚合物和脂溶性抗癌药物1在丙酮中搅拌共溶，随后，使用旋转蒸发器50-70℃下转速80-120 rpm除去溶剂丙酮，形成薄膜，将薄膜溶解在预热的适量生理盐水（NS）中，形成载药聚合物胶束，用0.22 μm注射器过滤器进行过滤，去除未包载于胶束的药物；
（3）NOCC、AHA溶液的制备：HA完全溶解于双蒸水（ddH2O）中，高碘酸钠（NaIO4）溶解在ddH2O中，逐滴加入NaIO4溶液，然后，将混合物在室温下避光搅拌12 h，再加乙二醇搅拌1-2h后终止反应，所得溶液放入截留分子量3.5 kDa（MWCO 3500）透析袋透析纯化3天，外水相为ddH2O，每天更换三次ddH2O，收集得到的产物，经冻干制得AHA，以NS为溶剂，分别配制浓度为30 mg/mL的AHA溶液和20 mg/mL的NOCC溶液；
（4）共载脂溶性抗癌药物1和抗癌药物2的双载药水凝胶复合体系的构建：以NS为溶剂，配制载药聚合物胶束溶液、抗癌药物2溶液；在冰浴中，以适当体积比充分振荡，均匀混合NOCC溶液、AHA溶液、载药聚合物胶束溶液和抗癌药物2溶液，得到共载脂溶性抗癌药物1和抗癌药物2的双载药水凝胶复合体系；
其中所述抗癌药物1为紫杉醇和所述抗癌药物2为吉西他滨，所述注射为瘤内注射，所述双载药系统用于局部缓释给药，所述双载药系统提高了脂溶性抗癌药物的生物利用度。
2.根据权利要求1所述的制备方法制备得到的包含胶束的可注射复合水凝胶双载药系统。
3.根据权利要求2所述的双载药系统在制备抗癌药物中的用途，其特征在于：癌症为乳腺癌。
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