CN108619094A - 一种抗癌天然产物藤黄酸的纳米制剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医药制剂及高分子材料领域，具体公开了一种抗癌天然产物藤黄酸的纳米制剂，该纳米制剂包含甲氧基聚乙二醇‑聚己内酯聚合物(mPEG‑PCL)和藤黄酸，并由甲氧基聚乙二醇‑聚己内酯以胶束形式包载藤黄酸形成，其中，所述藤黄酸与聚乙二醇‑聚己内酯的质量比为1∶5‑300。实验研究表明，当选用特定的生物相容性材料mPEG‑PCL包裹藤黄酸，并结合两者之间用量关系的优选限定，可显著提高藤黄酸水中分散度，提高药物的生物利用度和成药性，并通过被动靶向作用显著提高滕黄酸的抗肿瘤效果，降低毒副作用，节省治疗成本。

Description

一种抗癌天然产物藤黄酸的纳米制剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及医药制剂及高分子材料领域，具体涉及一种抗癌天然药物藤黄 酸的新型纳米制剂及其制备方法。
背景技术
藤黄酸是从藤黄科植物藤黄中提取的活性成分之一，具有止血、抗炎、解 毒、驱虫等药用价值，在国外还被用作利尿剂，治疗水肿和脑出血时的血压升 高，已被收入《美国药典》第10版。近些年来，国内药理学研究发现藤黄酸在 多种肿瘤中具有强大的抗肿瘤活性，如白血病、肝癌、头颈部肿瘤、乳腺癌、 胃癌、胰腺癌、前列腺癌、宫颈癌和肺癌等，其作用机制主要包括诱导肿瘤细 胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖、抗肿瘤细胞转移、抑制通道蛋白活性、逆转肿瘤 细胞多药耐药性等多方面综合作用。
其中，现有研究表明藤黄酸抗肿瘤作用机制是多方面的，主要有诱导肿瘤 细胞凋亡、抑制细胞周期、影响癌基因和抑癌基因及其相关蛋白的表达等。在 诱导肿瘤细胞凋亡方面，崔国惠等观察不同浓度藤黄酸(0.125～8.0μmol/L)对 K562细胞生长抑制的情况，结果发现藤黄酸能明显抑制K562细胞增殖，其24 h的IC50为(2.637±0.208)μmol/L。洪铁艳等以人MDS-RAEB细胞株MUTZ-1 细胞为研究对象考察藤黄酸的细胞毒性，结果表明，藤黄酸可抑制MUTZ-1细 胞的生长，0.4、0.6、0.8μg/mL的细胞凋亡率分别为(13±0.5)％、(37±0.7)％ 和(56±0.6)％，且凋亡率随着药物浓度增加而增加。藤黄酸还可诱导乳腺癌细 胞T47D的凋亡。在抑制细胞周期方面，舒文秀等研究表明藤黄酸能阻滞U937 细胞于G0/G1期，从而诱导U937细胞凋亡，且抑制作用呈时间剂量依赖关系， 其24h的IC50为(1.019±0.134)mg/L。刘静冰等研究藤黄酸对胰腺癌细胞株 PC-3的抑制作用，流式细胞术分析发现藤黄酸可阻滞细胞周期于S期，且抑制 作用与作用时间有一定的依赖关系，作用时间越长抑制率越高，而药物浓度与 抑制率关系不明显。在影响癌基因和抑癌基因及其相关蛋白的表达方面，卢娜 等采用cDNA基因芯片及RT-PCR技术检测藤黄酸影响SMMC-7721基因表达情 况，结果表明藤黄酸作用于SMMC-7721，24h后，有31个基因改变，48h后有 56个基因改变。黄恺飞等分析藤黄酸对胃癌细胞Survivin基因表达的影响。结 果表明藤黄酸对BGC-803细胞的抑制率与药物浓度和作用时间呈依赖关系，其 可下调Survivin蛋白表达。王勇等发现藤黄酸能明显抑制Raji细胞增殖，推测 可能是通过下调Cyclin D3、Cyclin E和NF-κB蛋白表达，阻滞细胞周期进程， 从而产生抗肿瘤作用。张洪明等采用Western-blotting技术检测不同浓度的藤黄 酸作用肺腺癌SPC-A-1细胞Caspase9、Caspase10及p53蛋白表达的变化，结果表明Caspase9、Caspase10及p53均参与了藤黄酸诱导SPC-A-1细胞凋亡，且随 着藤黄酸浓度的增高，Caspase9、Caspase10及p53蛋白的表达均上调。许晓源 等通过Westernblotting方法检测藤黄酸对A375细胞作用过程中Bcl-2和Bax蛋 白表达情况。结果在给药24、36和48h后，ICs0值分别为(1.57±0.05)、(1.31 ±0.20)和(1.12±0.19)μg/mL，不同浓度藤黄酸(2.5～7.5μg/m L)处理36h 后，早期凋亡细胞数量以剂量依赖性方式增加27.6％～41.9％，同时，可下调Bcl-2 蛋白表达，上调Bax蛋白表达。黄恺飞研究发现藤黄酸对胃癌细胞BGC-803有 明显的生长抑制作用，可显著促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞转移，其机制 与下调Bc1-2、ICAM-1及上调Bax的表达有关。
然而，藤黄酸属于氧杂蒽酮类天然小分子药物，为橙黄色无定型粉末，具 有光学活性。易溶于醇类、酮类等有机溶剂，在水中溶解度很小(＜0.5μg/mL)。 该成分稳定性较差，在生产过程中容易受到温度、湿度、光照、溶剂及pH值等 条件的影响而分解。藤黄酸显弱酸性，其pKa为7.8，只能溶于强碱性水溶液， 在pH值大于12的碱性条件下极其不稳定，很容易发生水解。基于上述理化特 性，藤黄酸作为一味纯天然的中药抗癌药物，在现有临床使用过程中，常出现 药效成分吸收释放时间长、释放不稳定，出现药效成分突释导致急性毒性副作 用等缺陷，却极大限制了其在制备抗癌药物中的利用和及其抗癌药效的发挥。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中所存在的上述不足，结合药物纳米技术， 提供一种能够提高藤黄酸溶解度及药效释放稳定性，从而显著提高藤黄酸抗肿 瘤效果，降低毒副作用的新型纳米制剂及其制备方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
一种抗癌天然产物藤黄酸的新型纳米制剂，该纳米制剂包含甲氧基聚乙二 醇-聚己内酯聚合物和藤黄酸，并由甲氧基聚乙二醇-聚己内酯以胶束形式包载藤 黄酸形成，其中，所述藤黄酸与聚乙二醇-聚己内酯的质量比为1∶5-300。
发明人偶然发现：当选用化学通式如式(I)所示的甲氧基聚乙二醇-聚己内 酯(英文缩写为：mPEG-PCL)这种特定的两亲性高分子聚合物作为载体材料， 将化学结构式如式(II)所示的藤黄酸包载在其疏水性内核中形成的纳米制剂， 不仅能够对藤黄酸的增溶性及药效释放稳定性起到显著改善效果，并且基于藤 黄酸分子结构中羧基及大量处于开环状态的碳碳双键与mPEG-PCL中特定数量 及种类的疏水基团之间的化学键合作用，使藤黄酸在mPEG-PCL中的增溶效果 显著优于藤黄酸与聚乙二醇-b-聚(D，L-乳酸)(PEDLLA)、PEO-PPO(聚环氧乙烷 -聚环氧丙烷)、PEO-PPO-PEO三嵌段聚合物等其他两亲性嵌段共聚物作为两亲 性药物载体的效果，可从原本0.002g/ml水容量显著提高至1.52g/ml。
此外，发明人研究还发现，藤黄酸与mPEG-PCL之间的用量比例不同对藤 黄酸的增溶效果也不相同，当所述藤黄酸与mPEG-PCL之间的质量比例低于1∶5 则因其包载效果不够，增溶效果差，低于0.01g/ml；但若藤黄酸与mPEG-PCL 之间的质量比例高于1∶300，则其增溶效果也不高，低于0.82g/ml。
优选地，所述藤黄酸与聚乙二醇-聚己内酯的质量比为1∶50-200。更优选地， 所述藤黄酸与聚乙二醇-聚己内酯的质量比为1∶100-150。
进一步，所述新型纳米制剂的平均粒径为10-50nm，更优选地，所述新型纳 米制剂的平均粒径可达到27nm-31nm范围内，是一种粒径较小且分布均匀的载 药胶束剂型。
进一步，本发明还公开了一种所述抗癌天然产物藤黄酸的新型纳米制剂的 制备方法，具体包括如下步骤：
S1：按照所述质量比例，称取藤黄酸和甲氧基聚乙二醇-聚己内酯聚合物于 容器中，加入有机溶剂并搅拌至完全溶解；
S2：将步骤S1中所得溶解液，置于40℃-60℃水浴条件下，旋蒸至有机溶 剂挥发，容器内部形成黄色透明水化膜时，停止旋蒸；
S3：接着加入40℃-60℃的温水，快速摇晃均匀，即得藤黄酸新型纳米制剂 的水溶液。其中，温水用量适量即可。
依据上述技术方案，本发明还公开了所述藤黄酸新型纳米制剂的一种制备 方法，可直接通过薄膜水化法，同时完成藤黄酸与mPEG-PCL聚合物之间的装 载及纳米级颗粒化，制备过程简单。其中，经发明人实验研究发现，步骤S2中 对水浴温度40℃-60℃及步骤S3中加入温水温度40℃-60℃的控制，直接关系到 最终制备所得载药胶束的形状、粒径分布及载药大小。具体而言，通过对步骤 S2中水浴温度40℃-60℃的控制，从而控制有机溶剂中藤黄酸与mPEG-PCL聚 合物之间的包载自组装速度，使藤黄酸能够均匀分散并包裹在由mPEG-PCL形 成的壳体的疏水性内部；再进一步结合步骤S3中的温水稀释处理，通过对温水 温度40℃-60℃的控制，从而控制载药胶束在温水中继续组装及包载后胶束中 mPEG-PCL壳体外表面的亲水化学键，及其内表面疏水化学键与藤黄酸分子之 间的键合作用的进一步舒展成型速度，进而控制其成型后载药胶束粒径大小均 匀、胶束形状规则，及各胶束内部化学键与藤黄酸分子化学键之间的充分结合， 防止键合不充分导致减少其载药量现象。
进一步，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷中的一种或几种。 优选地，所述有机溶剂为丙酮。
进一步，本发明还公开了所述抗癌天然产物藤黄酸的新型纳米制剂在制备 抗癌药物中的用途，具体为可通过添加药学上可接受辅料，进一步制成口服剂、 注射剂、粘膜给药剂型、呼吸道给药剂型、直肠给药剂型、体内植入和/或皮肤 给药剂型的抗癌药物。
经发明人实验研究表明，包载藤黄酸的mPEG-PCL聚合物胶束纳米制剂(即 本发明所述藤黄酸的新型纳米制剂)对癌症肿瘤细胞的抑制作用，显著强于同 等含量的游离藤黄酸在相同时间段内对癌症肿瘤细胞的抑制作用，并且经小鼠 体内抗肿瘤活性动物模拟实验研究表明，经藤黄酸纳米胶束治疗后的小鼠体内 肿瘤细胞体积显著小于经相同用量的游离藤黄酸组的肿瘤体积；由此可见，本 发明所述藤黄酸的新型纳米制剂可有效用于制备抗肿瘤药物中使用，并可依据 现有制药工艺，通过添加药学上可接受辅料，进一步制成口服剂、注射剂、粘 膜给药剂型、呼吸道给药剂型、直肠给药剂型、体内植入和/或皮肤给药剂型的 抗癌药物。
进一步，所述抗癌药物为抗癌药物。经发明人体外细胞实验研究结果表明， 具备本发明所述新型纳米剂型的藤黄酸对人类肿瘤细胞具有显著抑制治疗效 果，因此，本发明所述抗癌天然产物藤黄酸的新型纳米制剂，可进一步优选用 于制备抗肺癌、黑色素瘤、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、白血病、肝癌、头颈部肿 瘤、胃癌、胰腺癌、前列腺癌和宫颈癌药物中的使用。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
1、本发明发现将mPEG-PCL包裹藤黄酸，制成载药纳米胶束，可提高对肿 瘤细胞的毒性，降低藤黄酸的ICs0(对肿瘤细胞的半数抑制浓度)，从而可在临 床使用时减少藤黄酸的单药剂量，从而减轻其毒副作用，减少用药量，节省治 疗成本。
2、本发明发现mPEG-PCL包裹藤黄酸，可提高单药诱导肿瘤细胞凋亡的能 力，从而提高抗肿瘤效果。
3、本发明发现生物可降解的聚合物mPEG-PCL包裹藤黄酸，可显著提高藤 黄酸的水中溶解度，使之可以用于静脉注射，或进一步制备成其他水溶性剂型， 并能控制药物释放速度，防止药物突释导致的急性毒性，从而大大提高药物的 生物利用度和成药性
4、本发明发现mPEG-PCL包裹藤黄酸，不仅可避免药物在小鼠血液循环中 被提前，释放和降解还可利用EPR效应被动靶向到肿瘤，从而发挥了更强的体 内抗肿瘤作用。
附图说明：
图1示出了测试例1中包载藤黄酸的mPEG-PCL纳米胶束对藤黄酸的增溶 效果示意图。
图2A为测试例2中包载藤黄酸的mPEG-PCL纳米胶束的透射电镜(TEM) 图。
图2B为测试例2中包载藤黄酸的mPEG-PCL纳米胶束的粒径分布统计图。
图2C为测试例2中包载藤黄酸的mPEG-PCL纳米胶束的电位值检测统计 图。
图3示出了测试例3中包载藤黄酸的mPEG-PCL纳米胶束与游离藤黄酸的 药物释放曲线。
图4A为测试例4中第24小时时间点，包载藤黄酸的mPEG-PCL纳米胶束 (GAMicelles)与游离藤黄酸(Free GA)对细胞的毒性检测结果统计图。
图4B为测试例4中第48小时点时刻内，包载藤黄酸的mPEG-PCL纳米胶 束(GAMicelles)与游离藤黄酸(Free GA)对细胞的毒性检测结果统计图。
图4C为测试例4中空载mPEG-PCL纳米胶束分别在第24小时点和第48 小时点的细胞毒性检测结果统计图。
图5A为测试例5中在实验结束后各组实验小鼠皮下肿瘤实物照片图。
图5B为测试例5中各组实验小鼠的肿瘤体积增长曲线。
图5C为测试例5中各组实验小鼠的体重变化图。
图中标记：NS表示生理盐水对照组；Micelles表示空载mPEG-PCL纳米胶 束(即，空白纳米胶束组)；Free GA表示游离藤黄酸组；GA Micelles表示包 载藤黄酸的mPEG-PCL纳米胶束组(即，藤黄酸纳米胶束组)；
具体实施方式
下面结合试验例及具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。但不应将 此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实 现的技术均属于本发明的范围。
实施例1
采用薄膜水化法，称取20mg藤黄酸标准品、200mg的mPEG-PCL聚合物 置于圆底烧瓶中，再用10ml丙酮中完全溶解藤黄酸标准品和mPEG-PCL聚合物。 待完全溶解后，使用旋转蒸发仪在50℃水浴条件下，旋蒸圆底烧瓶中的丙酮溶 液至完全蒸干，在圆底烧瓶底部形成黄色透明的水化膜；停止旋蒸，加入10mL， 40℃的生理盐水，快速摇晃圆底烧瓶，则得到目标产物藤黄酸纳米胶束溶液。 用HPLC法测定载药量为5.96％，包封率为65.52％。
实施例2
采用薄膜水化法，称取20mg藤黄酸标准品、1g的mPEG-PCL聚合物置于 圆底烧瓶中，再用20ml丙酮中完全溶解藤黄酸标准品和mPEG-PCL聚合物。待 完全溶解后，使用旋转蒸发仪在60℃水浴条件下，旋蒸圆底烧瓶中的丙酮溶液 至完全蒸干，并在圆底烧瓶底部形成黄色透明的水化膜时，停止旋蒸，加入 15mL，60℃的生理盐水，快速摇晃圆底烧瓶，则得到目标产物藤黄酸纳米胶束 溶液。用HPLC法测定载药量为1.88％，包封率为95.78％
实施例3
采用薄膜水化法，称取20mg藤黄酸标准品、2g的mPEG-PCL聚合物置于 圆底烧瓶中，再用25ml丙酮中完全溶解藤黄酸标准品和mPEG-PCL聚合物。待 完全溶解后，使用旋转蒸发仪在80℃条件下旋蒸圆底烧瓶中的丙酮溶液至完全 蒸干，在圆底烧瓶底部形成黄色透明的水化膜；停止旋蒸，加入20mL，50℃的 生理盐水，快速摇晃圆底烧瓶，则得到目标产物藤黄酸纳米胶束溶液。用HPLC 法测定载药量为0.98％，包封率为97.98％
实施例4
采用薄膜水化法，称取1mg藤黄酸标准品、150mg的mPEG-PCL聚合物置 于圆底烧瓶中，再用30ml丙酮中完全溶解藤黄酸标准品和mPEG-PCL聚合物。 待完全溶解后，使用旋转蒸发仪在65℃条件下旋蒸圆底烧瓶中的丙酮溶液至完 全蒸干，在圆底烧瓶底部形成黄色透明的水化膜；停止旋蒸，加入25mL，50℃ 的生理盐水，快速摇晃圆底烧瓶，则得到目标产物藤黄酸纳米胶束溶液。用HPLC 法测定载药量为0.66％，包封率为98.12％
实施例5
采用薄膜水化法，称取20mg藤黄酸标准品、5.6g的mPEG-PCL聚合物置 于圆底烧瓶中，再用50ml丙酮中完全溶解藤黄酸标准品和mPEG-PCL聚合物。 待完全溶解后，使用旋转蒸发仪在70℃条件下旋蒸圆底烧瓶中的丙酮溶液至完 全蒸干，在圆底烧瓶底部形成黄色透明的水化膜；停止旋蒸，加入30mL，60℃ 的生理盐水，快速摇晃圆底烧瓶，则得到目标产物藤黄酸纳米胶束溶液。用HPLC 法测定载药量为0.36％，包封率为98.63％。
测试例1包载藤黄酸的mPEG-PCL纳米胶束对藤黄酸的增溶效果
发明人就藤黄酸与mPEG-PCL之间不同用量比例对藤黄酸溶解度、使用不 同载体材料对藤黄酸溶解度及本发明实施例2中的藤黄酸的mPEG-PCL纳米胶 束(以下简称，藤黄酸纳米胶束)与游离藤黄酸溶解度进行的实验研究，其中 实验研究部分结果数据如表1、表2和图1所示：
表1不同用量比例对藤黄酸溶解度的影响
表2不同载体材料对藤黄酸溶解度的影响(GA∶载体＝1∶20，W/W)
不同载体 mPEG-PCL PEDLLA PEO-PPO PEO-PPO-PEO
溶解度(mg/mL) 2.13-2.79 0.25-0.78 0.52-0.8 0.36-0.6
依据表1可知，当所述藤黄酸与mPEG-PCL之间的质量比例低于1∶5则因 其包载效果不够，增容效果差，低于0.5mg/ml；但若藤黄酸与mPEG-PCL之间 的质量比例高于1∶300，则其增容效果也不高，低于0.5mg/ml。据表2统计结果 可知，选用mPEG-PCL包载藤黄酸的增容效果显著优于藤黄酸与聚乙二醇-b-聚 (D，L-乳酸)(PEDLLA)、PEO-PPO(聚环氧乙烷-聚环氧丙烷)、PEO-PPO-PEO 三嵌段聚合物等其他两亲性嵌段共聚物作为两亲性药物载体后的增溶效果，
将游离藤黄酸标准产品与本发明实施例2中制备的藤黄酸纳米胶束之间的 溶解对比试验结果如图1所示。据图1可知，游离藤黄酸标准品在水中溶解度 很小，溶液呈混悬液状态；而本发明实施例2中的藤黄酸纳米胶束呈自带乳光 的黄色澄清溶液，明显增加藤黄酸的水中分散性。
综合上述检测结果可知，本发明选用mPEG-PCL聚合物与藤黄酸，并依据 本发明所述质量比结合后得到的藤黄酸新型纳米制剂，能够显著提高藤黄酸的 增溶效果。
测试例2包载藤黄酸的mPEG-PCL纳米胶束的体外表征测试
S1：测定包载藤黄酸的mPEG-PCL纳米胶束的胶束形态
通过高分辨透射电镜(TEM，日本Hitachi公司)检测藤黄酸胶束的形态。 通过薄膜水化法制得藤黄酸胶束，将制得的藤黄酸胶束溶液稀释至特定浓度10 μg/mL，采用负染法处理样品，最后使用透射电镜检测胶束形态。
S2：DLS法测定包载藤黄酸的mPEG-PCL纳米胶束粒径大小、多分散系 数(PDI)与电位
利用马尔文激光散射粒度仪及动态光散射原理(DLS)测定实施例1制备的 藤黄酸纳米胶束的粒径与电位值。具体操作为：
吸取制得的藤黄酸纳米胶束稀释至50μg/mL，取1mL左右溶液加入粒径杯 中，放入激光散射粒度仪中，测定藤黄酸纳米胶束的粒径和PDI；在电位器中加 入制得的藤黄酸纳米胶束溶液，测定胶束zeta电位值。
实验检测结果如图2A-图2C所示，其中图2A为藤黄酸纳米胶束的透射电 镜(TEM)图；图2B为通过激光散射粒度仪测定的藤黄酸纳米胶束的粒径分布 统计图；图2C为电位器中测得的藤黄酸纳米胶束的电位值测定统计图。依据图 2A可知，藤黄酸纳米胶束现出均匀的球形结构，分散性良好，粒径大小为30nm 左右，胶束形态均匀。通过激光散射粒度仪测定聚合物胶束的粒径和电位，得 到的结果为：胶束的粒径较小且均一，平均粒径大小为29±2nm(图2B)， PDI为0.118±0.024；电位为-4.36±0.67mV(图2C)，带微弱的负电。
以上结果表明本发明实施例1中制得的藤黄酸纳米胶束为性质稳定、分布 均匀的纳米制剂。
测试例3包载藤黄酸的mPEG-PCL纳米胶束的药物释放行为测试
使用透析法检测藤黄酸胶束与游离藤黄酸的药物释放行为。具体实验步骤 为：
S1：药物溶液配制：1、使用二甲基亚砜(DMSO)溶液在超声条件下溶解 藤黄酸标准品，溶解完全后配置成1mg/mL的游离藤黄酸溶液，作为游离藤黄 酸组测试使用；2、将实施例1中制得的包载藤黄酸的mPEG-PCL纳米胶束(即， 藤黄酸纳米胶束)溶于PBS中，浓度配置成1mg/mL的藤黄酸纳米胶束溶液， 作为藤黄酸纳米胶束组测试使用。
S2：在截留分子量为3.5kDa的透析袋中分别加入步骤S1中配制得两组药 物溶液各1mL，封口后置于15mL BD管中，加入10mL外水相(含0.5wt％吐 温80的PBS溶液)，放置在37℃摇床中，平行设置三组实验，每隔特定的时 间点(0，1，2，4，12，24，48，72，96，120，144，168，192，216，240小 时)，取外水相1mL置于-20℃冰箱待测，并更换10mL外水相。
S3：最终取得所有时间点的样品集中使用HPLC进行分析并定量，计算药 物释放比例，绘制药物释放曲线。
实验检测得到的藤黄酸纳米胶束组与游离藤黄酸组的药物释放曲线如图3 所示：在第24小时的时间点时，游离藤黄酸组中41.62％的藤黄酸已经释放出来， 而藤黄酸纳米胶束组中只有12.24％的藤黄酸释放到透析袋外的水相中；在240 小时内游离藤黄酸组释放速度明显快于藤黄酸纳米胶束组，且在240小时几乎 完全释放(96.66％)；而藤黄酸胶束组释放速度慢，且达到持续释放的目的， 在240小时内仅仅释放33.53％的藤黄酸，达到缓释的目的，可在体内持续释放， 持续发挥药物左右，也避免了药物突释带来的副作用。
由此可知，选用mPEG-PCL包裹藤黄酸后制得的藤黄酸纳米胶束，可有效 控制药物释放速度，防止药物突释导致的急性毒性，从而大大提高药物的生物 利用度和成药性。
测试例4包载藤黄酸的mPEG-PCL纳米胶束对体外人乳腺癌细胞MCF-7 细胞的毒性试验研究
通过包载藤黄酸mPEG-PCL胶束(以下简称，藤黄酸纳米胶束)对体外人 乳腺癌细胞(MCF-7细胞)的细胞毒性实验研究，测定其对体外抗肿瘤细胞活 性大小。具体实验操作步骤为：
S1：人乳腺癌细胞MCF-7细胞培养
人乳腺癌细胞MCF-7细胞从美国模式培养物收藏所(ATCC)购买得到， 使用含有10％的胎牛血清(呼和浩特市草原绿野生物材料有限公司产品)的 DMEM培养基(美国Sigma公司产品)进行培养，细胞在37℃恒温、含有5％ CO2润湿空气条件下的孵箱中进行培养。
S2：藤黄酸纳米胶束与游离藤黄酸对体外肿瘤细胞的细胞毒性测定
通过MTT比色法研究测定藤黄酸纳米胶束与游离藤黄酸对体外肿瘤细胞的 细胞毒性，具体操作为：
在细胞培养皿中培养适宜浓度的MCF-7细胞24小时，当细胞生长状态良 好且细胞密度较大时，在细胞超净台进行细胞实验操作，使用胰酶消化下细胞， 待细胞可轻松吹下时，使用完全培养基终止消化。在离心机中以1200r/min的速 度离心，接着，用新的培养基重新混悬细胞，使用电动移液枪吹匀细胞后获得 均匀的细胞悬液。使用细胞计数板对细胞进行计数，统计好细胞悬液中含有的 细胞数后进行铺96孔板，每孔5000个细胞左右；在孵箱中放置过夜，待细胞 完全贴壁，且细胞状态好的时候，分别加入含有不同浓度的游离藤黄酸(DMSO 溶解)和藤黄酸纳米胶束的培养基；在孵箱中继续培养24小时和48小时后， 在避光条件下加入20μL/孔的MTT溶液，在孵箱中放置4小时后，移除培养基， 使用排枪加入150μL/孔的DMSO溶液；最后在酶标仪上使用570nm波长检测 各个孔中的吸光度值，根据吸光度值计算细胞活性，绘制细胞生存率曲线，进 行三次平行实验取平均值。
通过上述MTT比色法研究统计，藤黄酸纳米胶束和游离藤黄酸在第24小 时时间点对体外肿瘤细胞的细胞毒性测定结果如图4A所示；藤黄酸纳米胶束和 游离藤黄酸在第48小时时间点时对体外肿瘤细胞的细胞毒性测定结果如图4B 所示。其中，从图4A可知，在第24小时的时间点时，游离藤黄酸组的半数抑 制浓度(IC50)为0.35±0.04μg/mL，而藤黄酸纳米胶束组的IC50为0.28±0.02 μg/mL；从图4B可知，在第48小时的时间点时，游离藤黄酸组的IC50为0.37±0.02 μg/mL，而藤黄酸纳米胶束组的IC50为0.26±0.03μg/mL。
由此可知，无论在24小时还是48小时药物作用之后，藤黄酸纳米胶束对 细胞的活性的抑制作用均强于相同浓度的游离藤黄酸。
S3：空载mPEG-PCL纳米胶束对体外肿瘤细胞的细胞毒性测定
同样使用MTT比色法研究空载mPEG-PCL纳米胶束材料对体外肿瘤细胞 的细胞毒性：同步骤S2培养MCF-7细胞进行铺板，96孔板中每孔5000个细胞 左右；在孵箱中放置过夜，待细胞完全贴壁，且细胞状态好的时候，加入不同 浓度的mPEG-PCL聚合物胶束溶液；在孵箱中继续培养24小时和48小时后，
实验测得空载mPEG-PCL纳米胶束溶液在第24小时时间点和48小时时间 点时对MCF-7细胞的细胞毒性测定统计结果如图4C所示。据图可知：即使 mPEG-PCL空载纳米胶束组浓度达到500μg/mL时，在处理24小时之后MCF-7 细胞的细胞活性仍保持在90.17％；在48小时点，细胞活性为85.50％。结果表 明，mPEG-PCL在较高的浓度下，MCF-7细胞仍保持很好的活性，表明 mPEG-PCL聚合物具有低毒性的特点，可安全用作药物载体。
综合上述测定结果可知：选用mPEG-PCL纳米胶束包载藤黄酸后形成的藤 黄酸纳米胶束，相对于游离藤黄酸而言，可有效提高其对肿瘤细胞的毒性，降 低藤黄酸的IC50，从而可在临床使用时减少藤黄酸的单药剂量，从而减轻其毒副 作用，减少用药量，节省治疗成本。
测试例5包载藤黄酸的mPEG-PCL纳米胶束的体内抗肿瘤活性研究
本测试例通过采用20g左右大小的雌性Balb/c裸鼠，6-8周龄，进行体内 建立肿瘤模型以及抗肿瘤治疗的研究测定包载藤黄酸的mPEG-PCL纳米胶束 (以下简称，藤黄酸纳米胶束)的体内抗肿瘤活性。实验小鼠购于北京华阜康 生物科技股份有限公司，在SPF级动物房中适应一周后开始建立肿瘤模型。具 体实验步骤为：
S1：小鼠肿瘤模型的建立
MCF-7细胞进行扩大培养，准备进行下一步的小鼠接种肿瘤。在小鼠适应 环境一周后，收集MCF-7细胞，进行细胞计数，准备5×107/mL的细胞悬液。 收集完细胞后，迅速进行小鼠皮下接种，每只小鼠皮下注射100μLMCF-7细胞 悬液，其中含5×106细胞数。接下来，保持对小鼠生存状态和肿瘤生长情况进行 观察。待小鼠皮下肿瘤长到约100mm3时，平均分成四组：生理盐水组，空白 胶束组，游离藤黄酸组，藤黄酸胶束组，每组6只小鼠。
S2：给药治疗
通过尾静脉注射的方式分别对各组小鼠进行给药治疗肿瘤，其中，对照组 注射生理盐水100μL/只；空白胶束组注射含500μg/mL的空白胶束的生理盐水 100μL/只；游离藤黄酸组注射含8mg/kg游离藤黄酸(精氨酸助溶)的生理盐 水100μL/只；藤黄酸胶束组注射含8mg/kg藤黄酸胶束的生理盐水100μL/只； 各组小鼠每两天给一次药，每三天记录小鼠体重及肿瘤体积。观察并记录小鼠 生存状态和肿瘤生长情况。
S3：实验结果统计分析
使用SPSS 17软件进行t检验完成。数据使用平均值和标准差(SD)表示， 认为双尾检验P值小于0.05时具有统计学意义。
实验检测结果统计如图5A-图5C所示，其中，图5A为实验结束后各组小 鼠皮下肿瘤细胞实物图片；图5B为各组实验小鼠的肿瘤体积增长曲线；图5C 为各组实验小鼠的体重变化图。
如图5A所示，藤黄酸纳米胶束组的小鼠的肿瘤明显小于游离藤黄酸组及其 余实验组；
并且，如图5B所示，在整个治疗过程中，藤黄酸纳米胶束组的肿瘤大小均 小于游离藤黄酸组的肿瘤大小，藤黄酸纳米胶束组明显抑制小鼠肿瘤生长，并 且在给药治疗第19天后，藤黄酸纳米胶束组的肿瘤体积为120.94±101.04mm3， 而游离藤黄酸组的肿瘤体积为619.87±273.38mm3，结果表明藤黄酸纳米胶束组 第19天的肿瘤体积明显小于游离藤黄酸组的肿瘤体积，且具有明显差异(P＜ 0.05)。
此外，据图5C可知：各组小鼠体重在整个治疗期间稳定增长，生理盐水组 第19天的小鼠体重为21.3±1.7g，空白纳米胶束组第19天的小鼠体重为20.7 ±0.5g，游离藤黄酸组第19天的小鼠体重为20.3±0.7g，藤黄酸纳米胶束组第 19天的小鼠体重为19.6±1.2g，各组小鼠体重之间无明显差异，说明藤黄酸纳 米胶束对小鼠本身无明显毒性。
综合上述实验结果可知，选用mPEG-PCL纳米胶束包载藤黄酸后形成的藤 黄酸纳米胶束，不仅可显著提高藤黄酸的水中溶解度，使之可以用于静脉注射， 并控制药物释放速度，避免药物在小鼠血液循环中被提前释放和降解，还可显 著提高游离藤黄酸诱导肿瘤细胞凋亡的能力，并结合其被动靶向作用，从而显 著提高其抗肿瘤效果。并且，本发明所述的藤黄酸新型纳米制剂，有效防止药 物突释导致的急性毒性，用药安全高效，大大提高藤黄酸的生物利用度和成药 性。

Claims (10)

1.一种抗癌天然产物藤黄酸的纳米制剂，其特征在于，该纳米制剂包含甲氧基聚乙二醇-聚己内酯聚合物和藤黄酸，并由甲氧基聚乙二醇-聚己内酯以胶束形式包载藤黄酸形成，其中，所述藤黄酸与甲氧基聚乙二醇-聚己内酯的质量比为1∶5-300。
2.根据权利要求1所述的一种抗癌天然产物藤黄酸的纳米制剂，其特征在于，所述藤黄酸与甲氧基聚乙二醇-聚己内酯的质量比为1∶50-200。
3.根据权利要求1所述的一种抗癌天然产物藤黄酸的纳米制剂，其特征在于，所述藤黄酸与甲氧基聚乙二醇-聚己内酯的质量比为1∶100-150。
4.根据权利要求1所述的一种抗癌天然产物藤黄酸的纳米制剂，其特征在于，所述新型纳米制剂的平均粒径为10-50nm。
5.权利要求1-4任一所述抗癌天然产物藤黄酸的纳米制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：按照所述质量比例，称取藤黄酸和甲氧基聚乙二醇-聚己内酯聚合物于容器中，加入有机溶剂并搅拌至完全溶解；
S2：将步骤S1中所得溶解液，置于40-60℃水浴条件下，旋蒸至有机溶剂挥发，容器内部形成黄色透明水化膜时，停止旋蒸；
S3：接着加入40-60℃的温水，摇晃均匀，即得藤黄酸新型纳米制剂的水溶液。
6.据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、氯仿中的一种或几种。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，有机溶剂为丙酮。
8.权利要求1-4任一所述抗癌天然产物藤黄酸的纳米制剂在制备抗癌药物中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，通过添加药学上可接受辅料，制成口服剂、注射剂、粘膜给药剂型、呼吸道给药剂型、直肠给药剂型、体内植入和/或皮肤给药剂型的抗癌药物。
10.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述抗癌药物为抗肺癌、黑色素瘤、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、白血病、肝癌、头颈部肿瘤、胃癌、胰腺癌、前列腺癌和宫颈癌的药物。
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