CN115093434B - 一种藤黄酸纳米制剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种藤黄酸纳米制剂及其制备方法，属于制药领域。本发明构建了一种肝癌细胞靶向的还原敏感载体GA‑PEG2k‑SS‑PCL5k用于藤黄酸二聚体前药的有效递送，使藤黄酸二聚体前药结构更容易被药物载体通过疏水相互作用包裹进入内核。该药物载体GA‑PEG2k‑SS‑PCL5k与藤黄酸二聚体能够形成稳定的GA‑PEG2k‑SS‑PCL5k/藤黄酸二聚体纳米制剂，该纳米制剂的包封率高达95.97％，载药量高达30.45％，应用前景广阔。

Description

一种藤黄酸纳米制剂及其制备方法
技术领域
本发明属于制药领域，具体涉及一种藤黄酸纳米制剂及其制备方法。
背景技术
藤黄酸(Gambogic acid，简称GBA)是从藤黄分泌的干燥树脂中提取得到的有效成分，具有广泛的生物活性，常被用于抗炎、抗氧化、抗病毒及抗肿瘤等。藤黄酸化学结构骨架中的“氧杂蒽酮”，是藤黄类化合物具有生物活性的特征结构。藤黄酸可以选择性地诱导肿瘤细胞凋亡，在体内外都展现出了广泛的较强的抗肿瘤作用，而对正常的造血系统和免疫功能无明显抑制效果。藤黄酸对多数肿瘤细胞都具有较强的活性，其对肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、胶质瘤细胞株体内外均有较强的抑制作用。研究发现，藤黄酸可通过诱导细胞凋亡、诱导细胞周期阻滞、抑制肿瘤血管新生等作用机制实现疗效确切的肝癌治疗。但是，藤黄酸具有在水中溶解度极小、稳定性差、体内非特异性分布等缺点，限制了其临床应用。此外，藤黄酸具有氧杂蒽酮环结构，因其小分子之间的π–π相互作用使得藤黄酸易发生快速聚集，其纳米制剂也面临载药量低、包封率低等缺点，这为藤黄酸的制剂开发带来了阻碍。
公开号为CN108619094A的中国专利申请公开了一种藤黄酸的纳米制剂，该纳米制剂包含甲氧基聚乙二醇-聚己内酯聚合物(mPEG-PCL)和藤黄酸，并由mPEG-PCL以胶束形式包载藤黄酸形成，其中，所述藤黄酸与mPEG-PCL的质量比为1∶5-300。该纳米制剂能够提高藤黄酸溶解度及药效释放稳定性，从而显著提高藤黄酸抗肿瘤效果，降低毒副作用。但是，该纳米制剂对藤黄酸的载药量仅为5.96％，包封率仅为65.52％，载药量和包封率都有待进一步提高。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种藤黄酸二聚体小分子前药及其制备方法；本发明的第二个在于提供一种高载药量和高包封率的藤黄酸纳米制剂及其制备方法和用途。
本发明提供了一种藤黄酸二聚体小分子前药，它的结构如式II或式III所示：
Figure BDA0003706126350000011
Figure BDA0003706126350000021
本发明还提供了上述藤黄酸二聚体小分子前药的制备方法，所述方法包括以下步骤：
将藤磺酸、胱胺或其盐在有机溶剂中反应，得到式II所示藤黄酸二聚体小分子前药；优选地，所述有机溶剂为二氯甲烷，所述反应是在1-羟基苯并三唑、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和三乙胺的作下进行的，所述反应的温度为室温，反应的时间为20～28小时，所述胱胺的盐为胱胺二盐酸盐，藤磺酸、胱胺或其盐、1-羟基苯并三唑、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、三乙胺的摩尔比为1:0.4:0.8:0.9:1.4；
或者，所述方法包括以下步骤：将藤磺酸在有机溶剂中反应，得到式III所示藤黄酸二聚体小分子前药；优选地，所述有机溶剂为二氯甲烷，所述反应是在4-二甲氨基吡啶、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺的作下进行的，所述反应的温度为室温，反应的时间为20～28小时，所述藤磺酸、4-二甲氨基吡啶、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺的摩尔比为1:1.5:1.5。
本发明还提供了一种藤黄酸纳米制剂，它是以式I所示聚合物载体包载上述藤黄酸二聚体小分子前药后得到的；
Figure BDA0003706126350000022
其中，m选自20-70，n选自20-70。
进一步地，所述m选自43-45，优选为44；n选自44-46，优选为45。
进一步地，所述聚合物载体的制备方法包括以下步骤：PCL-SS-PEG-NH2和甘草次酸在有机溶剂中于30～60℃下反应8～24h，反应结束后，将反应液用透析袋透析，收集透析液，冷冻干燥，即得聚合物载体；PCL-SS-PEG-NH2的结构如下所示：
Figure BDA0003706126350000031
进一步地，所述有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺；所述反应是在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶的存在下进行的；所述PCL-SS-PEG-NH2、甘草次酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1:1.2:2:0.1。
本发明还提供了一种制备上述藤黄酸纳米制剂的方法，所述方法包括以下步骤：将聚合物载体和藤黄酸二聚体小分子前药在有机溶剂中溶解，然后将所得溶液滴入水中，搅拌，再除去有机溶剂，过滤，得到藤黄酸纳米制剂。
进一步地，所述有机溶剂为丙酮、甲醇、乙腈中的一种或两种以上的混合物；
所述聚合物载体和藤黄酸二聚体小分子前药的质量比为(1-3):1；
所述搅拌的温度为室温，时间为2～6小时。
进一步地，所述有机溶剂为丙酮；
所述聚合物载体和藤黄酸二聚体小分子前药的质量比为2:1；
所述搅拌的时间为4小时。
本发明还提供了上述藤黄酸纳米制剂在制备预防和/或治疗肝癌的药物中的用途。
本发明将藤黄酸药物制成二聚体形式后，相当于在药物分子中引入“缺陷结构”，使得药物分子刚性减弱，堆积效率随之降低，阻止了分子的长程有序堆积，通过调节分子结构的灵活性以促进藤黄酸二聚体前药自组装形成纳米粒。
此外，本发明构建了一种肝癌细胞靶向的还原敏感载体GA-PEG2k-SS-PCL5k用于藤黄酸二聚体前药的有效递送，使藤黄酸二聚体前药结构更容易被药物载体通过疏水相互作用包裹进入内核。该药物载体GA-PEG2k-SS-PCL5k与藤黄酸二聚体能够形成稳定的GA-PEG2k-SS-PCL5k/藤黄酸二聚体纳米制剂，该纳米制剂的包封率高达95.97％，载药量高达30.45％。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1：GBA-SS-GBA的合成路线。
图2：GBA-SS-GBA在正离子模式下的质谱图。
图3：GBA-GBA在正、负离子模式下的质谱图。
图4：GA-PEG2k-SS-PCL5k的1H NMR图。
图5：GA-PEG2k-SS-PCL5k/GSG胶束的粒径(A)、电位(B)、TEM(C)图。
图6：GA-PEG2k-SS-PCL5k/G-G胶束的粒径(A)、电位(B)、TEM(C)图。
图7：GA-PEG2k-SS-PCL5k胶束的丁达尔现象。S1:1.20mg/ml；S2:0.60mg/ml；S3:0.30mg/ml；S4:0.15mg/ml；S5:0.07mg/ml；S6:37.53*10-3mg/ml；S7:18.77*10-3mg/ml；S8:9.38*10-3mg/ml；S9:4.69*10-3mg/ml；S10:2.35*10-3mg/ml；S11:1.17*10-3mg/ml；S12:0.59*10-3mg/ml；S13:0.29*10-3mg/ml；H2O。
图8：(A)GBA-SS-GBA纳米溶液与(B)GBA溶液过滤(0.45μm)前后对比图。
图9：GBA-SS-GBA纳米溶液的粒径与电位图。
图10：GA-PEG2k-SS-PCL5k/GSG胶束21天稳定性实验。
图11：定量分析HepG2细胞对GA-PEG2k-SS-PCL5k/C6的摄取效率。A为不同时间点(0h、1h、2h、3h、4h)HepG2细胞对100ng/mL GA-PEG2k-SS-PCL5k/C6摄取的定量测定，B为HepG2细胞对不同浓度0、12.5、25、50、100ng/mL GA-PEG2k-SS-PCL5k/C6摄取的定量测定，数据以平均值±标准差(n＝3)表示。图12：定性分析HepG2细胞对GA-PEG2k-SS-PCL5k/C6的摄取效率。
具体实施方式
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
实施例1：合成GA-PEG2k-SS-PCL5k聚合物
第一步：
称取1g Boc-NH-PEG2K-SS-NH2、2.5g 6-己内酯和催化量辛酸亚锡溶于15ml无水甲苯中，于氮气保护下130℃反应20h，随后将反应液倒入冰乙醚中沉淀，过滤收集产物，真空干燥即得PCL5K-SS-PEG2k-NH-Boc产物。
第二步：
称取1g PCL5K-SS-PEG2k-NH-Boc溶于6ml二氯甲烷中，冰浴下加入2ml三氟乙酸，反应2h后，将反应液倒入冰乙醚中沉淀，过滤收集产物，真空干燥即得PCL5K-SS-PEG2k-NH2产物。
第三步：
称取0.5g PCL5K-SS-PEG2k-NH2(1.0eq)溶于6ml DMF中，加入GA(甘草次酸，1.2eq)、EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，2.0eq)和DMAP(4-二甲氨基吡啶，0.1eq)溶解完全，40℃下反应过夜，将反应液用透析袋(1000Da)透析24h，收集透析液，冷冻干燥即得PCL5K-SS-PEG2K-GA产物，又称为GA-PEG2k-SS-PCL5k。
GA-PEG2k-SS-PCL5k的结构如下：
Figure BDA0003706126350000041
实施例2：合成藤黄酸二聚体：GBA-SS-GBA
称取藤磺酸(GBA)0.61mmol，胱胺二盐酸盐0.25mmol，HOBT(1-羟基苯并三唑)0.50mmol，EDC 0.52mmol，于5ml反应瓶中，加入3mL二氯甲烷(DCM)，搅拌溶解，再加入0.86mmol三乙胺，室温反应，反应24h终止反应。样品减压浓缩，用VLC柱层析分离纯化，洗脱剂为DCM(v):MeOH(v)＝100:1，分离得到黄色固体藤磺酸二聚体GBA-SS-GBA，简称GSG。合成路线详见图1。
GBA-SS-GBA的结构如下：
Figure BDA0003706126350000051
实施例3：制备GA-PEG2k-SS-PCL5k/GBA-SS-GBA纳米制剂
采用溶剂挥发法制备GA-PEG2k-SS-PCL5k/GBA-SS-GBA纳米制剂，具体操作为：取2mg实施例2制得的GBA-SS-GBA与4mg实施例1制得的GA-PEG2k-SS-PCL5k(GA-PEG2k-SS-PCL5k与GBA-SS-GBA质量比为2：1)共溶于1ml丙酮中，超声至完全溶解，将溶解好的有机溶液逐滴入水相中，室温条件下，在磁力搅拌器上搅拌4小时，得到胶束溶液。将该胶束溶液中的残余有机溶剂用旋转蒸发仪减压除尽后，用0.45μm的微孔滤膜过滤，得最终的GA-PEG2k-SS-PCL5k/GBA-SS-GBA纳米制剂，简称GA-PEG2k-SS-PCL5k/GSG纳米制剂。
实施例4：合成藤黄酸二聚体：GBA-GBA
称取GBA(1.0eq)，EDC(1.5eq)，DMAP(1.5eq)于4mL的DCM中，常温避光反应24h，TLC监控进程，原料消失即终止反应，蒸干多余DCM。用硅胶柱纯化固体(洗脱条件：DCM(v):MeOH(v)＝15：1)，过程监控，待EDCI、DMAP刚洗脱出即停止，浓缩，TLC(展开条件：DCM(v):MeOH(v)＝10:1)确认，得到黄色纯产物GBA-GBA，简称G-G。
GBA-GBA的结构如下：
Figure BDA0003706126350000061
实施例5：制备GA-PEG2k-SS-PCL5k/GBA-GBA纳米制剂
参照实施例3的方法，区别仅在于将GBA-SS-GBA替换为实施例4制得的GBA-GBA，得到GA-PEG2k-SS-PCL5k/GBA-GBA纳米制剂，简称GA-PEG2k-SS-PCL5k/G-G纳米制剂。
以下为对照样品的制备方法。
对照例1：制备PEG2K-PCL5K/GBA纳米制剂
采用溶剂挥发法制备PEG2K-PCL5K/GBA纳米制剂，具体操作为：取藤黄酸(GBA)4mg，PEG2K-PCL5K 5mg，紧密称定，共溶于1ml乙腈中，超声至完全溶解，将溶解好的有机溶液逐滴入10ml水相中，室温条件下，在磁力搅拌器上搅拌4小时。将该胶束溶液中的残余有机溶剂用旋转蒸发仪减压除尽后，用0.45μm的微孔滤膜过滤，得最终的PEG2K-PCL5K/GBA纳米制剂。
按照对照例1的方法制备PEG2K-PCL5K/GBA纳米制剂，重复两次，得到两个样品：PEG2K-PCL5K/GBA胶束-1，PEG2K-PCL5K/GBA胶束-2。
测试样品的粒径、PDI和Zeta电位。
包封率和载药量测定：移取1mL胶束溶液与等体积的机溶剂甲醇混匀，超声数分钟，破乳后过0.45μm微孔滤膜，滤液按HPLC色谱条件测定GBA药物浓度，分别计算药物的包封率和载药量。其中，HPLC色谱条件如下：流动相：0.1％醋酸水：甲醇＝10：90；柱温：30℃；流速：1.0ml/min；检测波长：360nm。
表1.PEG2K-PCL5K/GBA纳米制剂的粒径、PDI和Zeta电位
Figure BDA0003706126350000062
表2.PEG2K-PCL5K/GBA纳米制剂的包封率和载药量
Figure BDA0003706126350000071
从表2可以看出，PEG2K-PCL5K/GBA纳米制剂的包封率和载药量都较低。与下文表5的数据对比可以看出，PEG2K-PCL5K/GBA纳米制剂的包封率和载药量都远低于本发明的GA-PEG2k-SS-PCL5k/GBA-SS-GBA纳米制剂。
以下通过实验例证明本发明的有益效果。
实验例1：结构表征
(1)MALDI-TOF/TOF-MS质谱对藤黄酸二聚体的结构表征
MALDI-TOF/TOF-MS质谱图使用Bruker ultraflextreme MALDI-TOF/TOF仪器，在正、负离子模式下分别进行采集，基质DCTB。将浓度为2.5mg/ml的产品水悬浮液(1μl)点在MALDI靶上，并立即与1μl浓度为20mg/ml的2，5-二羟基苯甲酸(Sigma-Aldrich)在50％乙腈/0.1％(体积比)三氟乙酸中混合，待液滴干燥后用激光轰击，使用Bruker公司自带的多肽标准品进行质量轴校正，数据使用flexanalysis软件进行处理。
由图2可知，采用MALDI-TOF/TOF-MS测定GBA-SS-GBA相对分子质量时，正离子模式下，主峰质荷比(m/z)为1373.6365，而GBA-SS-GBA的理论质荷比(m/z)为1372，与测定结果基本一致，说明GBA-SS-GBA合成成功。
由图3可知，采用MALDI-TOF/TOF-MS测定GBA-GBA相对分子质量时，正离子模式下，主峰质荷比(m/z)为1261.5846，负离子模式下，主峰质荷比(m/z)为1237.5901，而GBA-GBA的理论质荷比(m/z)为1238，与测定结果基本一致，说明GBA-GBA合成成功。
(2)GA-PEG2k-SS-PCL5k聚合物的表征
根据1H NMR的表征结果(图4)，判断GA-PEG2k-SS-PCL5k合成成功。
实验例2：制备GA-PEG2k-SS-PCL5k/GBA-SS-GBA纳米制剂的工艺筛选实验
对GA-PEG2k-SS-PCL5k/GBA-SS-GBA纳米制剂的制备方法、有机溶剂种类、药物/载体质量比进行考察，以筛选出最佳制剂工艺。
(1)胶束制备方法考察
考察溶剂挥发法、透析法制备GA-PEG2k-SS-PCL5k/GBA-SS-GBA胶束。
溶剂挥发法：取1mg GBA-SS-GBA与10mg GA-PEG2k-SS-PCL5k聚合物共溶于1ml丙酮中，超声至完全溶解，将溶解好的有机溶液逐滴入水相中，室温条件下，在磁力搅拌器上搅拌4小时。然后将该胶束溶液中的残余有机溶剂用旋转蒸发仪减压除尽后，用0.45μm滤膜过滤，即得。
透析法：取GA-PEG2k-SS-PCL5k 10mg，GBA-SS-GBA 1mg，精密称定，加入DMSO 1ml超声使溶解。取上述DMSO溶液，逐滴加入水相中，恒速搅拌15min。溶液转移至MWCO 3500的透析袋中，以水为透析介质，每隔一定时间更换透析介质，透析完全后过0.45μm滤膜，即得。
表3.不同制剂方法制备的GA-PEG2k-SS-PCL5k/GBA-SS-GBA胶束表征
Figure BDA0003706126350000081
由表3可知，透析法制备的胶束粒径大小、分布均不佳，且胶束过滤后溶液几乎无色，说明药物几乎没有被载体有效包载。而溶剂挥发法制得的胶束澄清透明、粒径大小、分布均较好，故选择溶剂挥发法进行进一步的考察。
(2)胶束制备溶剂考察
按照上述溶剂挥发法，区别仅在于将丙酮分别替换为甲醇或乙腈，考察丙酮、甲醇、乙腈制备GA-PEG2k-SS-PCL5k/GBA-SS-GBA胶束的情况。
表4.不同制备溶剂制备的GA-PEG2k-SS-PCL5k/GBA-SS-GBA胶束的表征
Figure BDA0003706126350000082
由表4可知，聚合物材料及药物在甲醇、乙腈中的溶解性较差，无法制备胶束，而在丙酮中，溶解性较好，可制备粒径大小、分布均较好的胶束，故选择丙酮作为胶束的制备溶剂。
(3)聚合物材料与药物质量比考察
按照上述溶剂挥发法，区别仅在于将GBA-SS-GBA与GA-PEG2k-SS-PCL5k聚合物材料的投料量进行修改，考察聚合物材料/药物质量比为1：1、2：1、3：1时载药胶束的性质。
聚合物材料/药物质量比为1：1时，GA-PEG2k-SS-PCL5k投料量为2mg，GBA-SS-GBA投料量为2mg；
聚合物材料/药物质量比为2：1时，GA-PEG2k-SS-PCL5k投料量为4mg，GBA-SS-GBA投料量为2mg；
聚合物材料/药物质量比为3：1时，GA-PEG2k-SS-PCL5k投料量为6mg，GBA-SS-GBA投料量为2mg。
包封率和载药量测定方法如下：移取1mL胶束溶液与等体积的机溶剂甲醇混匀，超声数分钟，破乳后过0.45μm微孔滤膜，滤液按UPLC色谱条件测定GBA-SS-GBA药物浓度，分别计算药物的平均包封率和载药量。其中，UPLC色谱条件如下：Waters ACQUITY BEH C18色谱柱；流动相：含0.1％甲酸的甲醇等度洗脱；柱温：30℃；流速：0.5ml/min；检测波长：360nm。包封率和载药量的计算公式如下：
包封率＝Wa/Wb×100％
载药量＝Wa/(Wb+Wc)×100％
Wa表示包载的药物含量；Wb表示药物投药量；Wc表示聚合物载体的投入量。
表5.不同聚合物材料与药物质量比的GA-PEG2k-SS-PCL5k/GBA-SS-GBA胶束的表征
Figure BDA0003706126350000091
结合胶束的粒径大小、分布、电位、包封率、载药量综合考虑(表5)，选择聚合物材料与药物质量比为2：1为最佳制备工艺。
综上，GA-PEG2k-SS-PCL5k/藤黄酸二聚体胶束的最佳制备工艺为：采用溶剂挥发法制备GA-PEG2k-SS-PCL5k/GBA-SS-GBA纳米制剂，具体操作为：取2mg GBA-SS-GBA与4mg GA-PEG2k-SS-PCL5k(GA-PEG2k-SS-PCL5k与GBA-SS-GBA质量比为2：1)共溶于1ml丙酮中，超声至完全溶解，将溶解好的有机溶液逐滴入水相中，室温条件下，在磁力搅拌器上搅拌4小时，得到胶束溶液。将该胶束溶液中的残余有机溶剂用旋转蒸发仪减压除尽后，用0.45μm的微孔滤膜过滤，得最终的GA-PEG2k-SS-PCL5k/GBA-SS-GBA纳米制剂。
在上述工艺下制得的GA-PEG2k-SS-PCL5k/GBA-SS-GBA纳米制剂的包封率高达95.97％，载药量高达30.45％。
实验例3：GA-PEG2k-SS-PCL5k/藤黄酸二聚体纳米制剂的表征
以实施例3制得的GA-PEG2k-SS-PCL5k/GSG纳米制剂、实施例5制得的GA-PEG2k-SS-PCL5k/G-G纳米制剂为测试样品，表征GA-PEG2k-SS-PCL5k/藤黄酸二聚体纳米制剂。
(1)GA-PEG2k-SS-PCL5k/藤黄酸二聚体胶束的表征
GA-PEG2k-SS-PCL5k/藤黄酸二聚体聚合物胶束的尺寸大小，粒径分布和Zeta电位可用DLS测定，测试温度为25℃。TEM可用于表征GA-PEG2k-SS-PCL5k/藤黄酸二聚体载药胶束的外观形态。方法：取少量的胶束溶液滴在铜网表面，常温干燥后，再滴加磷钨酸溶液进行负染，常温负染数分钟后吸走残夜，在空气中晾干，然后用透射电子显微镜进行观测。
由图5、图6可知，GA-PEG2k-SS-PCL5k/GSG与GA-PEG2k-SS-PCL5k/G-G的藤黄酸二聚体胶束粒径分布良好，呈均匀的球形结构，无黏连和聚集现象。
(2)丁达尔现象观察
丁达尔现象的实验可以用来预估GA-PEG2k-SS-PCL5k胶束的稳定性。将GA-PEG2k-SS-PCL5k胶束稀释一系列不同浓度(胶束浓度从0.29×10-3mg/mL至1.20mg/mL)，然后用红色激光光束水平照射这些不同浓度的胶束溶液，观察每组胶束溶液中呈现出的光路情况。
丁达尔现象是指当一束光线透过均一胶体溶液后可在入射光的垂直方向上观察到胶体溶液中会出现一明显的光路，本发明拟通过观察红色激光光束穿过胶束后是否会表现出明显的光路来判断胶束是否形成。首先制备起始浓度为1.20mg/ml的GA-PEG2k-SS-PCL5k胶束，然后逐步稀释一系列胶束溶液至最低浓度为0.29*10-3mg/ml。如图7所示，这13组GA-PEG2k-SS-PCL5k胶束溶液的浓度由高至低分别为S1:1.20mg/ml；S2:0.60mg/ml；S3:0.30mg/ml；S4:0.15mg/ml；S5:0.07mg/ml；S6:37.53*10-3mg/ml；S7:18.77*10-3mg/ml；S8:9.38*10-3mg/ml；S9:4.69*10-3mg/ml；S10:2.35*10-3mg/ml；S11:1.17*10-3mg/ml；S12:0.59*10-3mg/ml；S13:0.29*10-3mg/ml。S1～S8这8组GA-PEG2k-SS-PCL5k胶束溶液可看见明显的红色光束，且随着胶束浓度的降低，红色光束的亮度也越来越弱。从S9这组胶束溶液开始，红色光束不再清晰可见，比S8表现出更暗的光线亮度，且越来越接近红色光束穿过水后所呈现的状态。
(3)藤黄酸二聚体纳米制剂的稳定性研究
藤黄酸以二聚体的形式与聚合物材料形成胶束后的稳定性是评价二聚体形式是否影响制剂性质的重要指标之一。在本发明研究过程中发现，采用溶剂挥发法，藤黄酸二聚体GSG可自身形成纳米尺寸的溶液，并具有良好的粒径及分布，且过滤后仍能以纳米溶液的形式存在，藤黄酸二聚体前药能较稳定的分散于水溶液中(图8、图9)。而藤黄酸原药溶液则以混悬溶液的形式存在，一定时间后明显出现沉降聚集的情况，较易析出，且过滤后溶液呈无色状态，说明藤黄酸在水溶液中溶解度较低，不易稳定分散。较原药藤黄酸而言，其二聚体溶液以更稳定的形式存在于水溶液中，不易聚集析出，实现了藤黄酸药物的“纳米化”。
(4)GA-PEG2k-SS-PCL5k/藤黄酸二聚体纳米制剂的稳定性研究
为进一步研究藤黄酸二聚体与聚合物载体共同形成胶束后的稳定性情况，按实施例3的方法制备GA-PEG2k-SS-PCL5k/GSG胶束，并于4℃保存。以粒径和电位为评价指标，分别于第1天、3天、7天、14天、21天测定胶束稳定性。
GA-PEG2k-SS-PCL5k/GSG载药胶束室温放置21天，用DLS测定不同时间点胶束粒径大小和Zeta电位值变化情况。如图10所示，GA-PEG2k-SS-PCL5k/GSG载药胶束21天内粒径、电位变化不大。待该载药胶束放置至21天后，GA-PEG2k-SS-PCL5k/GSG胶束仍旧呈现均一、澄清透明的外观状态，表明该载药胶束的稳定性良好，这可能与藤黄酸二聚体形式有助于维持胶束性质的稳定有关。
实验例4：GA-PEG2k-SS-PCL5k/C6制剂的入胞实验
(1)实验溶液的配制
1)GA-PEG2k-SS-PCL5k/C6的制备
参照实施例3的方法，用GA-PEG2k-SS-PCL5k包载香豆素C6，制备得到GA-PEG2k-SS-PCL5k/C6胶束。再用DMEM低血清培养基稀释至100、50、25、12.5ng/mL，待用。
2)C6溶液的制备
用DMSO溶解C6，制备浓度为1mg/mL的母液，再用DMEM低血清培养基稀释至100ng/mL，待用。
(2)细胞摄取率定量分析
1)时间依赖
将HepG2细胞以25×104/孔接种于6孔板内，置于细胞培养箱37℃，5％CO2中培养。培养24h后，去除旧的培养液。除空白组外，每个孔加入2ml100ng/mL的GA-PEG2k-SS-PCL5k/C6溶液，空白组加入同体积配置药液所用培养基，每组设置3个复孔，培养箱中孵育相应时间((0h、1h、2h、3h、4h))后移走培养基，用1mL PBS清洗1次，加入0.5mL 0.25％胰酶消化各组细胞，置于培养箱中培养3min后，加入1mL正常血清培养基终止消化，反复吹打至细胞完全悬浮，收集细胞悬浮液于离心管中，离心(1900rpm，5min)后，弃上清，用0.5mL冷PBS复悬，离心(1900rpm，5min)后，继续洗涤2～3次，最后将细胞分散于0.5mL的冰PBS中形成单细胞悬浮液，置于冰盒中保存，使用FACS检测。
2)浓度依赖
将HepG2细胞以25×104/孔接种于6孔板内，置于细胞培养箱37℃，5％CO2中培养。培养24h后，去除旧的培养液。除空白组外，每个孔分别加入2mL不同浓度(100、50、25、12.5、0ng/mL)的GA-PEG2k-SS-PCL5k/C6溶液，空白组加入同体积配置药液所用培养基，培养箱中孵育240min后，每组设置3个复孔，移走培养基，用1mL PBS清洗1次，加入0.5mL 0.25％胰酶消化各组细胞，置于培养箱中培养3min后，加入1mL正常血清培养基终止消化，反复吹打至细胞完全悬浮，收集细胞悬浮液于离心管中，离心(1900rpm，5min)后，弃上清，用0.5mL冷PBS复悬，离心(1900rpm，5min)后，继续洗涤2～3次，最后将细胞分散于0.5mL的冰PBS中形成单细胞悬浮液，置于冰盒中保存，使用FACS检测。
(3)细胞摄取率定性分析
将20×104个肝癌细胞HepG2接种于共聚焦皿中，置于37℃孵箱中，在5％CO2条件下孵育过夜。第二天去掉培养基，每个孔加入2mL 100ng/mL的GA-PEG2k-SS-PCL5k/C6溶液，共同培养4h后，终止给药，吸出药液，加入1mL冰PBS清洗后再用1mL 4％多聚甲醛溶液固定细胞10min，用1mL冰PBS清洗1～2次。用1mL DAPI对细胞进行染色15～20min，常温、避光。用1mL PBS洗去多余染料，洗3～4次，加入抗荧光淬灭剂，每盘滴一滴即可。封片后用共聚焦激光扫描显微镜观察细胞的摄取情况。
(4)结果
1)细胞摄取率定量分析
有效的细胞摄取是药物治疗主要需求，本发明以载有香豆素-6的GA-PEG2k-SS-PCL5k(GA-PEG2k-SS-PCL5k/C6)为探针，采用激光共聚焦观察HepG2细胞的摄取行为。FCM结果表明了HepG2细胞对于GA-PEG2k-SS-PCL5k/C6的摄取具有浓度和时间依赖性。如图11所示，在四个不同的时间节点上，HepG2细胞摄取随时间的增加而增强，表现出时间依赖性。如图所示，对照组的细胞未经过药物处理，荧光强度几乎为零。随着GA-PEG2k-SS-PCL5k/C6中C6浓度从12.5ng/mL增加到100ng/mL，HepG2细胞摄取C6随之增加，荧光强度增强，呈现出浓度依赖性。
2)细胞摄取率定性分析
如图12所示，C6在HepG2细胞中出现少量的荧光信号，而在经GA-PEG2k-SS-PCL5k/C6处理的HepG2细胞中检测到更高的荧光强度。
综上，体外细胞的定量和定性分析都证实GA-PEG2k-SS-PCL5k/C6比游离C6更容易被HepG2细胞摄取。表明GA-PEG2k-SS-PCL5k可以促进C6穿透HepG2细胞膜，促进HepG2细胞的摄取。
综上，本发明构建了一种肝癌细胞靶向的还原敏感载体GA-PEG2k-SS-PCL5k用于藤黄酸二聚体前药的有效递送，使藤黄酸二聚体前药结构更容易被药物载体通过疏水相互作用包裹进入内核。该药物载体GA-PEG2k-SS-PCL5k与藤黄酸二聚体能够形成稳定的GA-PEG2k-SS-PCL5k/藤黄酸二聚体纳米制剂，该纳米制剂的包封率高达95.97％，载药量高达30.45％，应用前景广阔。

Claims (11)

1.一种藤黄酸二聚体小分子前药，其特征在于：结构如式II或式III所示：
Figure QLYQS_1
式II
Figure QLYQS_2
式III。
2.权利要求1所述藤黄酸二聚体小分子前药的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：
将藤黄酸、胱胺或胱胺盐在有机溶剂中反应，得到式II所示藤黄酸二聚体小分子前药；所述有机溶剂为二氯甲烷，所述反应是在1-羟基苯并三唑 、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和三乙胺的作用下进行的，所述反应的温度为室温，反应的时间为20~28小时，所述胱胺盐为胱胺二盐酸盐，藤黄酸、胱胺或胱胺盐、1-羟基苯并三唑 、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、三乙胺的摩尔比为1:0.4:0.8:0.9:1.4；
或者，所述方法包括以下步骤：将藤黄酸在有机溶剂中反应，得到式III所示藤黄酸二聚体小分子前药；所述有机溶剂为二氯甲烷，所述反应是在4-二甲氨基吡啶 、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺的作用下进行的，所述反应的温度为室温，反应的时间为20~28小时，所述藤黄酸、4-二甲氨基吡啶、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺的摩尔比为1:1.5:1.5。
3.一种藤黄酸纳米制剂，其特征在于：它是以式I所示聚合物载体包载权利要求1所述藤黄酸二聚体小分子前药后得到的；
Figure QLYQS_3
式I
其中，m选自20-70，n选自20-70。
4.根据权利要求3所述的藤黄酸纳米制剂，其特征在于：所述m选自43-45；n选自44-46。
5.根据权利要求4所述的藤黄酸纳米制剂，其特征在于：m为44；n为45。
6.根据权利要求3-5任一项所述的藤黄酸纳米制剂，其特征在于：所述聚合物载体的制备方法包括以下步骤：PCL-SS-PEG-NH2和甘草次酸在有机溶剂中于30~60 °C下反应8~24h，反应结束后，将反应液用透析袋透析，收集透析液，冷冻干燥，即得聚合物载体；PCL-SS-PEG-NH2的结构如下所示：
Figure QLYQS_4
。
7.根据权利要求6所述的藤黄酸纳米制剂，其特征在于：所述有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺；所述反应是在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶的存在下进行的；所述PCL-SS-PEG-NH2、甘草次酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1:1.2:2:0.1。
8.一种制备权利要求3-7任一项所述藤黄酸纳米制剂的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：将式I所示的聚合物载体和式II或式III所示的藤黄酸二聚体小分子前药在有机溶剂中溶解，然后将所得溶液滴入水中，搅拌，再除去有机溶剂，过滤，得到藤黄酸纳米制剂。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述有机溶剂为丙酮、甲醇、乙腈中的一种或两种以上的混合物；
所述聚合物载体和藤黄酸二聚体小分子前药的质量比为(1-3):1；
所述搅拌的温度为室温，时间为2~6小时。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述有机溶剂为丙酮；
所述聚合物载体和藤黄酸二聚体小分子前药的质量比为2:1；
所述搅拌的时间为4小时。
11.权利要求3-7任一项所述藤黄酸纳米制剂在制备预防和/或治疗肝癌的药物中的用途。
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