CN111053740B - 紫杉醇口服聚合物胶束及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种紫杉醇口服聚合物胶束，以紫杉醇为模型药物，以GA‑CS‑TPGS共聚物作为口服给药的载体，所述GA‑CS‑TPGS共聚物的临界胶束浓度为0.0109～0.0203mg/mL，控制紫杉醇口服聚合物胶束粒径在98～182nm，其中，GA‑CS‑TPGS共聚物的分子结构式如式(1)所示：

本发明还公开了一种紫杉醇口服聚合物胶束的制备方法及应用。本发明具有较好的粘附性及体肠吸收，提高了紫杉醇的生物利用度，能够满足紫杉醇口服给药的要求。

Description

紫杉醇口服聚合物胶束及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及药物合成与应用。更具体地说，本发明涉及一种紫杉醇口服聚合物胶束及其制备方法与应用。

背景技术

紫杉醇(Paclitaxel,PTX)，别名红豆杉醇、泰素、紫素、特素，是从红豆杉中提取的一种抗癌物质。紫杉醇为白色结晶体粉末，无臭，无味，难溶于水，易溶于甲醇、乙腈、氯仿、丙酮等有机溶剂。紫杉醇临床上用于卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌等恶性肿瘤的治疗，促进及诱导肿瘤细胞的微管蛋白聚合并稳定微管，使分裂期纺锤体的装配受到影响，阻断肿瘤细胞的有丝分裂，从而达到抗肿瘤目的。但紫杉醇水溶性差，口服吸收差，使其临床应用受到限制，临床上常将紫杉醇溶解于以一定比例混合的聚氧乙烯蓖麻油和无水乙醇溶剂中，人体易对聚氧乙烯蓖麻油不耐受，易出现过敏反应，严重者可能导致呼吸困难、骨髓抑制等。因此，新型口服紫杉醇递药系统的研究对其临床应用具有重要意义。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种紫杉醇口服聚合物胶束及其制备方法与应用，其具有较好的粘附性及体肠吸收，提高了紫杉醇的生物利用度，能够满足紫杉醇口服给药的要求。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种紫杉醇口服聚合物胶束，以紫杉醇为模型药物，以GA-CS-TPGS共聚物作为口服给药的载体，所述GA-CS-TPGS共聚物的临界胶束浓度为0.0109～0.0203mg/mL，控制紫杉醇口服聚合物胶束粒径在98～182nm，其中，GA-CS-TPGS共聚物的分子结构式如式(1)所示：

优选的是，包括：

步骤1)按照比1:(0.5～10)mg/mL将所述GA-CS-TPGS共聚物溶解于水中；

步骤2)按照油水比1:(5～15)将紫杉醇溶解于有机溶剂中；

步骤3)将步骤2)得到的溶液与步骤1)得到的溶液混合，使所述GA-CS-TPGS共聚物、紫杉醇的质量比为30:(1～5)，超声破碎，搅拌，挥干有机溶剂，除杂，加入冻干保护剂，冷冻干燥，即得紫杉醇口服聚合物胶束。

优选的是，所述冻干保护剂为8％(W/V)的海藻糖。

优选的是，将维生素E琥珀酸酯-聚乙二醇2000、没食子酸甲酯接枝于壳聚糖分子形成所述GA-CS-TPGS共聚物。

优选的是，将没食子酸甲酯接枝于壳聚糖分子上，得到GA-CS，以琥珀酸酐、4-二甲氨基吡啶对维生素E琥珀酸酯-聚乙二醇2000进行端羟基羧基化，再在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺的缩合作用下使羧基反应活性增强，通过与GA-CS中壳聚糖的自由氨基发生酰胺化反应而接枝，制备出所述GA-CS-TPGS共聚物。

优选的是，所述GA-CS-TPGS共聚物的制备方法包括：

步骤a)向壳聚糖水混悬液中加入无机酸溶液，调节pH至3～6，搅拌使其溶解，加入4-二甲氨基吡啶的乙醇溶液、没食子酸甲酯的乙醇溶液，其中4-二甲氨基吡啶的乙醇溶液、没食子酸甲酯的乙醇溶液的乙醇含量均为5～15％体积的壳聚糖水混悬液，在氮气保护下，80℃水浴反应24h，停止加热，冷至室温，离心，取上清液透析，减压浓缩除乙醇，冷冻干燥得GA-CS；

步骤b)将干燥好的维生素E琥珀酸酯-聚乙二醇2000、琥珀酸酐、4-二甲氨基吡啶用有机溶剂溶解，加入三乙胺，在氮气保护下加热回流，减压蒸发除去有机溶剂，得到黄色油状物体，再次溶解到0～5℃的二氯甲烷中，除杂滤除去白色沉淀，溶液过硅胶柱除杂，湿法上样，洗脱剂为二氯甲烷：乙酸乙酯：甲醇的体积比为9:2:2，TLC监测，收集中间含有维生素E琥珀酸酯-聚乙二醇2000琥珀单酯的洗脱液，旋转蒸发得到黏稠液体，得到 TPGS-COOH，TPGS-COOH溶于pH为5的吗啉乙磺酸缓冲液中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，冰浴下磁力搅拌，加入N-羟基琥珀酰亚胺，常温反应6h，得到TPGS-NHS；

步骤c)将步骤a)得到的GA-CS溶解于水中，将步骤b)得到的TPGS-NHS滴加到 GA-CS中，搅拌24h，然后将反应物装入透析袋中，透析48h，收集袋内的透析产物，冷冻干燥得到所述GA-CS-TPGS共聚物。

紫杉醇口服聚合物胶束在制备抑制p-gp、CYP3A酶及肿瘤生长的药物中的应用，所述的紫杉醇口服聚合物胶束为口服制剂。

本发明至少包括以下有益效果：

第一、本发明制备的紫杉醇口服共聚物胶束，粒径在98～182nm左右，Zeta电位呈正电，胶束形态良好，大小较均一，呈圆形或椭圆形，无明显粘连。紫杉醇口服共聚物胶束平均包封率为80％，平均载药量为8.2％，GA-CS-TPGS临界胶束浓度为0.0109～0.0203 mg/mL，热力学稳定性良好。

第二、本发明制得的紫杉醇口服聚合物胶束，水溶性好，具有较好的粘附性，提高药物的生物利用度，体肠吸收性好，且对Caco-2细胞没有明显的毒性，对p-gp、CYP3A酶及肿瘤有一定的抑制作用。同时克服了注射剂临床使用时不良反应，使其在临床使用时比现有制剂更加方便、安全，并保证了其有效性，临床上可用于卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌等恶性肿瘤的治疗。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为GA-CS-TPGS共聚物(a)、紫杉醇(b)、GA-CS-TPGS载药胶束(c)的X射线衍射图谱；

图2为紫杉醇口服聚合物胶束的TEM图；

图3为肠吸收机制图；

图4为制备紫杉醇口服聚合物胶束的反应路线。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

所述的三氯甲烷、无水乙醇、氯化钠、三聚磷酸钠、海藻糖、甘露醇、丁二酸酐、4-二甲氨基吡啶、吗啉乙磺酸、N-羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐、三乙胺、二氯甲烷、无水乙醚、二甲基亚砜、乙酸乙酯、氢氧化钠、冰醋酸均为分析纯，甲醇有分析纯和色谱纯，整个实验用水均为去离子超纯水。

<实例1>

紫杉醇口服聚合物胶束的制备方法：

(1)称取3.4g CS于圆底烧瓶中，加入100mL水悬浮，稀盐酸溶液调pH 3～6，磁力搅拌使其溶解；

(2)加入0.028g 4-二甲氨基吡啶和7mL乙醇的溶液，0.049g没食子酸甲酯的乙醇溶液，在氮气保护下，80℃水浴反应24h，停止加热，冷至室温；

(3)离心，取上清液，分别用水透析和50％乙醇体积溶液透析3次，减压浓缩除乙醇，冻干得GA-CS样品，分子结构式如式(2)所示；

(4)取真空干燥好的0.5g聚乙二醇1000-维生素-E-琥珀酸酯(TPGS)、0.66g琥珀酸酐(SA)、0.04g 4-二甲氨基吡啶(DMAP)混合，用适量纯化后的10mL二氯甲烷将原料全部溶解；

(5)加入1mL三乙胺，在氮气保护下加热回流，反应完毕；

(6)将溶液在40℃下减压蒸发除去溶剂，得到黄色油状物体，将其溶解到少量0～5℃冰的二氯甲烷中，0.45μm微孔滤膜过滤去白色沉淀(未反应的琥珀酸酐)；

(7)产物过硅胶柱除杂，湿法上样，洗脱剂包括体积比为二氯甲烷：乙酸乙酯：甲醇＝9:2:2；用硅胶薄层板监控过柱情况，收集所需成份的洗脱液，旋转蒸发得到黏稠液体TPGS丁二酸单酯(TPGS-COOH)，分子结构式如式(3)所示：

(8)TPGS-COOH溶于pH为5.0的吗啉乙磺酸缓冲液中，加入EDC，冰浴下磁力搅拌反应10min后加入NHS(按摩尔比TPGS-COOH:EDC:NHS＝1:1.2:1)，继续常温反应6h，即得活化好的TPGS-NHS样品；

(9)将步骤(3)得到的GA-CS样品在水溶液中搅拌至完全溶解，将步骤(9)得到的TPGS-NHS样品滴加到GA-CS中(按摩尔比TPGS-NHS:GA-CS＝1:1.2)，搅拌24h使其充分反应，然后将反应物装入透析袋中，透析48h，除去未反应完的EDC及其他水溶性副产物，收集袋内的透析产物，冷冻干燥得到所述GA-CS-TPGS共聚物，分子结构式如式(4)所示：

(10)精密称取GA-CS-TPGS共聚物材料30mg，加入15mL纯净水搅拌溶解，使其浓度为2mg/mL；

(11)称取3mg紫杉醇用适量氯仿溶解(油水比为1:10)，用注射器将其注入到步骤(11)的GA-CS-TPGS溶液中；

(12)适当搅拌后用超声细胞破碎仪超声10min(功率170W，工作3s，间歇2s)，随后磁力搅拌，挥干氯仿，得到的液体过0.45μm的微孔滤膜，加入8％(W/V)的海藻糖，冷冻干燥，即得紫杉醇口服聚合物胶束，分子结构式如式(1)所示：

<实例2>

紫杉醇口服聚合物胶束的制备方法：

(1)称取3.8g CS于圆底烧瓶中，加入100mL水悬浮，稀盐酸溶液调pH 3～6，磁力搅拌使其溶解；

(2)加入0.032g 4-二甲氨基吡啶和7mL乙醇的溶液，0.046g没食子酸甲酯的乙醇溶液，在氮气保护下，80℃水浴反应24h，停止加热，冷至室温；

(3)离心，取上清液，分别用水透析和50％乙醇体积溶液透析3次，减压浓缩除乙醇，冻干得GA-CS样品，分子结构式如式(2)所示；

(4)取真空干燥好的0.5g聚乙二醇1000-维生素-E-琥珀酸酯(TPGS)、0.48g琥珀酸酐(SA)、0.02g 4-二甲氨基吡啶(DMAP)混合，用适量纯化后的10mL二氯甲烷将原料全部溶解；

(5)加入1mL三乙胺，在氮气保护下加热回流，反应完毕；

(6)将溶液在40℃下减压蒸发除去溶剂，得到黄色油状物体，将其溶解到少量0～5℃冰的二氯甲烷中，0.45μm微孔滤膜过滤去白色沉淀(未反应的琥珀酸酐)；

(7)产物过硅胶柱除杂，湿法上样，洗脱剂包括体积比为二氯甲烷：乙酸乙酯：甲醇＝9:2:2；用硅胶薄层板监控过柱情况，收集所需成份的洗脱液，旋转蒸发得到黏稠液体TPGS丁二酸单酯(TPGS-COOH)，分子结构式如式(3)所示：

(8)TPGS-COOH溶于pH为5.0的吗啉乙磺酸缓冲液中，加入EDC，冰浴下磁力搅拌反应10min后加入NHS(按摩尔比TPGS-COOH:EDC:NHS＝1:1.2:1.2)，继续常温反应 6h，即得活化好的TPGS-NHS样品；

(9)将步骤(3)得到的GA-CS样品在水溶液中搅拌至完全溶解，将步骤(9)得到的TPGS-NHS样品滴加到GA-CS中(按摩尔比TPGS-NHS:GA-CS＝1:1.2)，搅拌24h使其充分反应，然后将反应物装入透析袋中，透析48h，除去未反应完的EDC及其他水溶性副产物，收集袋内的透析产物，冷冻干燥得到所述GA-CS-TPGS共聚物，分子结构式如式(4)所示：

(10)精密称取GA-CS-TPGS共聚物材料30mg，加入150mL纯净水搅拌溶解，使其浓度为2mg/mL；

(11)称取1mg紫杉醇用适量氯仿溶解(油水比为1:5)，用注射器将其注入到步骤(11)的GA-CS-TPGS溶液中；

(12)适当搅拌后用超声细胞破碎仪超声10min(功率170W，工作3s，间歇2s)，随后磁力搅拌，挥干氯仿，得到的液体过0.45μm的微孔滤膜，加入8％(W/V)的海藻糖，冷冻干燥，即得紫杉醇口服聚合物胶束，分子结构式如式(1)所示：

<实例3>

紫杉醇口服聚合物胶束的制备方法：

(1)称取3.6g CS于圆底烧瓶中，加入100mL水悬浮，稀盐酸溶液调pH 3～6，磁力搅拌使其溶解；

(2)加入0.025g 4-二甲氨基吡啶和7mL乙醇的溶液，0.055g没食子酸甲酯的乙醇溶液，在氮气保护下，80℃水浴反应24h，停止加热，冷至室温；

(3)离心，取上清液，分别用水透析和50％乙醇体积溶液透析3次，减压浓缩除乙醇，冻干得GA-CS样品，分子结构式如式(2)所示；

(4)取真空干燥好的0.5g聚乙二醇1000-维生素-E-琥珀酸酯(TPGS)、0.75g琥珀酸酐(SA)、0.06g 4-二甲氨基吡啶(DMAP)混合，用适量纯化后的10mL二氯甲烷将原料全部溶解；

(5)加入1mL三乙胺，在氮气保护下加热回流，反应完毕；

(6)将溶液在40℃下减压蒸发除去溶剂，得到黄色油状物体，将其溶解到少量0～5℃冰的二氯甲烷中，0.45μm微孔滤膜过滤去白色沉淀(未反应的琥珀酸酐)；

(7)产物过硅胶柱除杂，湿法上样，洗脱剂包括体积比为二氯甲烷：乙酸乙酯：甲醇＝9:2:2；用硅胶薄层板监控过柱情况，收集所需成份的洗脱液，旋转蒸发得到黏稠液体TPGS丁二酸单酯(TPGS-COOH)，分子结构式如式(3)所示：

(8)TPGS-COOH溶于pH为5.0的吗啉乙磺酸缓冲液中，加入EDC，冰浴下磁力搅拌反应10min后加入NHS(按摩尔比TPGS-COOH:EDC:NHS＝1:2:2)，继续常温反应6h，即得活化好的TPGS-NHS样品；

(9)将步骤(3)得到的GA-CS样品在水溶液中搅拌至完全溶解，将步骤(9)得到的TPGS-NHS样品滴加到GA-CS中(按摩尔比TPGS-NHS:GA-CS＝1:1.5)，搅拌24h使其充分反应，然后将反应物装入透析袋中，透析48h，除去未反应完的EDC及其他水溶性副产物，收集袋内的透析产物，冷冻干燥得到所述GA-CS-TPGS共聚物，分子结构式如式(4)所示：

(10)精密称取GA-CS-TPGS共聚物材料30mg，加入300mL纯净水搅拌溶解，使其浓度为2mg/mL；

(11)称取5mg紫杉醇用适量氯仿溶解(油水比为1:5)，用注射器将其注入到步骤(11)的GA-CS-TPGS溶液中；

(12)适当搅拌后用超声细胞破碎仪超声10min(功率170W，工作3s，间歇2s)，随后磁力搅拌，挥干氯仿，得到的液体过0.45μm的微孔滤膜，加入8％(W/V)的海藻糖，冷冻干燥，即得紫杉醇口服聚合物胶束，分子结构式如式(1)所示：

对实施例1-3得到的紫杉醇口服聚合物胶束，加蒸馏水稀释至适宜浓度，用马尔文激光粒度分析仪测定载药胶束的粒径、粒度分布及zeta电位。结果表明紫杉醇口服胶束粒径在98～182nm，zeta电位呈正电，胶束形态良好，大小较均一，呈圆形或椭圆形，无明显粘连。采用芘荧光探针法来测定胶束的临界胶束浓度(CMC)值，测得GA-CS-TPGS的临界胶束浓度为0.0109～0.0203mg/mL。该结果表明，临界胶束浓度低，热力学稳定性良好，即溶液被稀释成低浓度也能保持胶束结构。采用高效液相色谱法(HPLC)测定 GA-CS-TPGS载药胶束中的紫杉醇(PTX)平均载药量为8.2％和平均包封率为80％。采用X射线衍射法观察药物是否被包裹在胶束中，如图1所示，a曲线代表GA-CS-TPGS 共聚物、b曲线代表紫杉醇粉末、c曲线代表载药胶束冻干粉的X射线衍射图谱。从图中可以看到，b中的紫杉醇在2θ为5°，8°和12°时出现的三个特征衍射峰及其他小的衍射峰都没有在c的紫杉醇载药胶束中出现，说明紫杉醇以无定形形式存在于聚合物胶束中。采用透射电镜分析，得到GA-CS-TPGS载药胶束的TEM图，如图2所示，观察到的胶束形态比较均一，呈圆形或椭圆形，粒径在140nm左右，与粒度仪测得的粒径基本一致。

通过考察不同浓度的不同冻干保护剂对胶束冻干产物的影响，如表1所示，结果表明 8％的海藻糖作为冻干保护剂，可改善冻干过程中胶束的聚集情况，得到的溶液澄清透明，再分散性好。

表1

以下均以实例1制备的紫杉醇口服共聚物载药胶束进行实验。

<紫杉醇口服共聚物载药胶束药代动力学评价>

(1)实验材料

紫杉醇(99％，西安天宝生物科技有限公司)、多烯紫杉醇(98％，阿拉丁工业公司)、甲醇(HPLC级，安徽天地高纯溶剂有限公司)、无水乙醇(AR，西陇化工股份有限公司)、聚氧乙烯氢化蓖麻油(CP，源叶生物科技有限公司)、肝素钠(99％，索莱宝生物科技有限公司)健康雄性SD大鼠，体重250±10g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK(湘)2016-0002。

(2)方法

血浆样品的预处理：大鼠尾静脉取全血0.3mL于肝素钠润洗过的1.5mL EP管中，4000 rpm离心15min，精密吸取上层清液(血浆)50μL，加入甲醇10μL，内标溶液20μL，加入1mL无水乙醚，涡旋混合2min，10000rpm离心3min，吸取上层清液置于另外一个EP管中，用氮气吹扫仪将乙醚挥干，残渣用100μL流动相溶液复溶，涡旋震荡3min， 10000rpm下离心3min，取2μL上清液进样。

采用超高压液相质谱仪测定血浆中的紫杉醇在大鼠血浆中的浓度，采用内标法。并进行方法学考察。

测定方法：色谱分析柱：ACQUITY色谱柱(BEH C18,1.7μm,2.1×50mm)；

流动相：甲醇-水(70:30,v/v)；柱温：40℃；流速：0.35mL/min；进样量：2μL。

质谱条件：检测器：TQD(三重四级杆)；离子源：ESI源；检测方式：正离子检测；毛细管电压：3kV；锥孔电压：28V；碰撞能量：22eV；离子源温度：120℃；去溶剂温度：350℃；去溶剂气流量：600L/h；锥孔气流量：150L/h；扫描方式：多反应离子检测 (MRM)方式；

扫描时间：0.2s；定量离子：m/z 876.36→308.07(紫杉醇)；m/z 830.37→549.24(多西紫杉醇)。

(3)结果

根据加标准溶液血浆、为血浆样品的LC-MS图，空白血浆、加标准溶液血浆、给药后血浆经处理后进样，空白血浆中的成分在紫杉醇出峰时间处没有干扰，药物与血浆样品杂质基线分离，测定方法专属性良好。典型的线性回归方程为：Y＝0.0016X-0.0263，r＝0.998，表明在5-2000ng/mL线性范围内，线性良好，定量下限是5ng/mL。该方法精密度良好(表 2)、提取回收率和基质效应(表3)、稳定性(表4)较好，均符合方法学研究要求。从紫杉醇参比制剂和GA-CS-TPGS/PTX载药胶束在大鼠体内的药动学曲线可知，GA-CS-TPGS/PTX胶束与紫杉醇参比制剂相比，药-时曲线下面积(AUC)由0.957μg/mL ·h升高至了2.653μg/mL·h。胶束制剂无论是平均滞留时间MRT还是平均滞留时间的方差VRT都比参比注射制剂低，显示出胶束制剂具有更低的药物蓄积性，生物利用度提高 (表5-6)。

表2 日内及日间精密度(n＝3)

表3 提取回收率(n＝3)和基质效应(n＝3)

表4 稳定性研究(n＝3)

表5 房室模型药动参数(n＝5)

表6 统计矩计算的药动参数(n＝5)

<紫杉醇口服聚合物胶束生物粘附与在体肠吸收研究>

(1)实验材料

紫杉醇(99％，西安天宝生物科技有限公司)；甲醇(HPLC级，安徽天地高纯溶剂有限公司)；酚红、Kerbs-Ringer试剂、PBS缓冲液、Schiff试剂，均购自北京索莱宝科技有限公司；生理盐水(广西裕源药业有限公司)；无水乙醇(AR，西陇化工股份有限公司)；聚氧乙烯氢化蓖麻油(EL-40，源叶生物科技有限公司)；猪黏蛋白(Ⅲ)(Sigma-Aldrich 公司)；高碘酸、碱性品红(北京百灵威科技有限公司)；醋酸(AR，阿拉丁公司)。健康雌性SD大鼠，体重180～220g，由桂林医学院动物房提供，许可证号：SCXK(桂)2013-001。

(2)方法

聚合物胶束粘蛋白吸附试验：取载体材料溶液1mL(2mg/mL)，与粘蛋白溶液1mL(0.5、 1、2mg/mL)涡旋混匀后，于37℃水浴中进行孵育。分别于1h后，取出混合溶液，离心(10000rpm，10min)，取上清液0.5mL与0.5mL高碘酸溶液混合，37℃水浴中孵育2h，放至室温。加入0.5mL显色剂Schiff Reagent，混合后室温放置30min，之后在560nm处测定吸光度值。粘蛋白标准溶液的显色过程除不加载体材料外其他同上。根据标准曲线计算每2mg纳米粒子吸附的粘蛋白含量。

大鼠在体肠吸收实验：大鼠禁食12h，不禁水。调节恒温水浴锅水浴温度为(37.0±0.5)℃。将供试液和生理盐水置恒温水浴中预热至(37.0±0.5)℃，备用。打开保暖设备，取SD大鼠，按1.0g/kg体重质量腹腔注射20％乌拉坦溶液，麻醉后固定于手术台上。沿大鼠腹部中线打开腹腔(约3～4cm)，在十二指肠、空肠、回肠或结肠上下部各切一小口，插入直径约0.3cm的橡胶管，用线扎紧。用注射器将预热的生理盐水缓缓注入肠管，将肠管清洗干净。将肠管两端的橡胶管分别插入盛有75mL供试液的锥形瓶中，打开蠕动泵，以5mL/min的体积流量循环10min后，将流速调整为2.5mL/min，立即自锥形瓶中取样2份(各1mL)，分别作为供试液和酚红液零时间样本，立即向锥形瓶中补加酚红 Krebs-Ringer溶液2mL，之后每隔15min按同法操作，2h后停止循环。分别测定紫杉醇和酚红的质量浓度。

样品预处理：12000r/min转速离心5min，取上清液进行实验。

分光光度法测定酚红含量：取酚红约25mg，精密称定，加水溶解配制成0.1mg/mL的溶液，精密量取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL置10mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，分别量取0.5mL，置10mL具塞试管中，加0.2mol/L的氢氧化钠溶液5mL，在 555nm波长处测定吸光度(A)值，即得酚红标准曲线方程y＝0.0204x+0.0572，r²＝0.9992。取预处理的样品溶液0.5mL，同法操作，测定A值，计算酚红含量。

HPLC法测定紫杉醇含量：色谱条件同本载药量和包封率项下。

取紫杉醇配制成2.0、5.0、10.0、15.0、20.0g/mL的溶液，注入液相色谱仪，计算在此范围内质量浓度和峰面积线性方程为y＝1987.3x+4.5151，r²＝1。表明在此浓度范围内，线性关系良好。

酚红法计算药物吸收速率常数(Ka)以紫杉醇剩余药量的对数对相应的时间作图，可得一条直线，由直线的斜率求出Ka，计算公式如下：

lnX＝lnX₀－K_at

其中，X、X₀分别为剩余药量和循环前的药量，t为取样时间；

大鼠在体肠吸收机制研究：取禁食12h不禁水的SD大鼠，称重，按1.0g/kg体重用20％乌拉坦溶液腹腔注射麻醉，将其固定在手术台上，用取暖器进行保湿。沿腹中线打开腹腔，将十二指肠部分周边的脂肪剥离，剪下置培养皿中，用生理盐水洗去粪便，并外翻。将其剪成小段(每段约为50-90mg)，置24孔板中，用37℃预热过的Krebs-Ringer试剂清洗。加入各抑制剂后，在空气振荡器(37℃，50rpm)中孵育45min，弃去抑制剂，用 Krebs-Ringer试剂清洗2遍，加入GA-CS-TPGS/PTX溶液，继续在空气振荡器(37℃，50 rpm)中孵育45min，弃去含药溶液，取4℃的Krebs-Ringer试剂清洗3遍。弃去Krebs-Ringer 试剂，用300μL Krebs-Ringer试剂进行匀浆，-20℃保存待测。取两组肠段，不加抑制剂，一组同法操作作为阳性对照组，另一组置4℃作为阴性对照。考察吸收情况。

样品处理：吸取匀浆后的样品100μL，加甲醇100μL，涡旋3min，加入甲醇200μL，涡旋3min，12000rpm离心10min，吸取上清液，用HPLC方法，量取20μL注入液相色谱仪，色谱条件同本载药量和包封率项下。

(3)结果

粘蛋白吸附实验：以粘蛋白浓度作为横坐标、以其吸收值作为纵坐标作图，得标准曲线，曲线方程为：Y＝0.3261X+0.1945(R²＝0.9996)，拟合曲线在0.1-2mg/mL的浓度范围内具有良好的线性。GA-CS-TPGS/PTX与粘蛋白吸附性强，能很好地起到生物黏附性作用。当粘蛋白浓度为1mg/mL时，聚合物胶束的吸附量最大，粘蛋白浓度为0.5mg/mL时有一定的吸附性，结果见表7。在体肠实验结果表明，说明GA-CS-TPGS/PTX能有效提高PTX 在体肠吸收情况，结果见表8。肠吸收机制实验中，阴性对照胶束溶液的摄取在8％左右，叠氮化钠(能量抑制剂)和吲哚美辛(小窝蛋白抑制剂)存在时，摄取量明显降低，说明胶束溶液进入细胞的过程为主动转运过程，需要供给能量；小窝蛋白介导的内吞途径为主。秋水仙碱(巨胞饮抑制剂)、氯丙嗪(网格蛋白抑制剂)和槲皮素(非网格蛋白抑制剂) 的摄取量依次增加，但均在50％以上，表明本实验中胶束溶液的内吞过程复杂，各种蛋白均有参与，如图3所示。

表7 粘蛋白吸附结果(n＝3)

表8 GA-CS-TPGS/PTX和对照制剂Ka值(x±s，n＝3)

<紫杉醇口服聚合物胶束细胞机制研究>

(1)实验材料

Caco-2细胞株(中科院干细胞库，上海)；DMEM培养基(Dulbecco’sModifiedEagle’s medium，GIBCO，赛默飞世尔(苏州)仪器有限公司)；胰蛋白酶、青-链霉素、PBS缓冲液均购自北京索莱宝科技有限公司；胎牛血清(Fetal Bovine Serum，ExCell Bio有限公司)；香豆素(Sigma公司，美国)BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术有限公司)； CCK-8(Cell Counting Kit-8,MedChemExpress USA)。

细胞的培养：将买回的细胞悬液转移到新的培养瓶中，加入4mL新鲜培养液，放入培养箱中培养(5％CO₂，37℃)，当培养液颜色变黄时换液，当细胞贴壁在达到80％左右时，弃去旧的培养基，PBS缓冲液2mL冲洗，弃去缓冲液，冲洗2次，加入1mL胰酶溶液进行消化，加入2mL含血清培养基中止消化，离心，弃去液体，用新鲜培养基将细胞混悬，计数，分装不同的新的培养瓶中，加入新鲜培养基继续培养或将其转入冻存管中，用冻存液冻存。

接种：将细胞浓度为1×10⁵个/mL接种到96孔板中，用于毒性试验；将细胞浓度1×10⁵个/孔接种到6孔板中，用于取摄取试验；将细胞浓度1×10⁵个/孔接种到24孔板中，用于摄取试验；将细胞浓度2×10⁵个/mL接种到细胞小室内，用于转运试验。

(2)方法

细胞毒性试验：取细胞悬液100μL，加入96孔板中，最外面一圈加PBS溶液，放入培养箱中培养至贴壁。弃去培养液，取各受试液100μL加入96孔板中，每个浓度至少平行3份。放入培养箱中培养24h，每孔加入10μL CCK-8，摇匀，放入培养箱孵育2h后，取出，用酶标仪在450nm处测吸光度值。计算半数抑制浓度(IC₅₀值)细胞活力％＝(_加药-A _空白)/(A_0加药-A_空白)×100

其中，A_加药：具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的吸光度，A_空白：具有培养基和CCK-8溶液而没有细胞的孔的吸光度，A_0加药：具有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度；

细胞摄取试验：定性摄取将接种到底部有玻片的6孔板的细胞放入培养箱中，培养至 7天，弃去培养液，用HBSS溶液冲洗3次，弃去清洗液，加入游离的香豆素-6溶液和载香豆素的GA-CS-TPGS溶液各2mL，37℃孵育3h，弃去溶液，用冷的PBS终止摄取并清洗3次，弃去清洗液，加入罗丹明室温染色1h，用PBS清洗3次，加入DAPI染色5min，弃去溶液，用PBS清洗3次，吹干溶液，用抗荧光淬灭剂进行封片，4℃保存待测。定量摄取将接种到底部有玻片的6孔板的细胞放入培养箱中，培养至15天，弃去培养液，用 HBSS溶液冲洗3次，弃去清洗液，加入GA-CS-TPGS/PTX 2mL，摇床上孵育3h(50rpm)，弃去药液，用冷的PBS终止摄取，清洗3次，加胰酶消化，培养基终止消化，离心，PBS 清洗2次，弃去，加裂解液200μL，静置裂解10min，振荡，超声裂解至澄清，静置6min，离心，取上清液，用BCA蛋白宣测定试剂盒，采用酶标仪测定蛋白含量。

P-gp抑制剂对细胞摄取的影响：将接种到24孔板的细胞培养15d后，弃去培养液，用HBSS溶液清洗3次，弃去溶液，分别加入1mL 0.1％吐温溶液、0.1％EL溶液、100μM 维拉帕米溶液，摇床(37℃，50rpm)孵育45min，弃去各溶液，加入空白GA-CS-TPGS 胶束溶液紫杉醇对照溶液和GA-CS-TPGS/PTX胶束溶液，37℃孵育3h，快速弃去药物溶液，加入冰冷的PBS溶液终止摄取，清洗3次。照定量摄取项下用胰酶消化起操作，测定蛋白总量。

细胞膜渗透性试验：Caco-2细胞单层膜完整性采用测跨膜电阻测定膜的完整性，当培养至21天时，选用跨膜电阻值(transepithelial electric resistance，TEER)大于250Ω·cm²的膜用于试验。从第3天起，隔天测定电阻值，根据以下公式测定跨膜电阻值：

TEER＝(R_t-R₀)×A

R_t为含细胞小室的跨膜电阻值，R₀为不含细胞小室的跨膜电阻值，A为小室的膜面积 (本实验的膜面积为0.33cm²)

Caco-2细胞转运试验：AP→BL转运：取处理好的小室，在AP侧加入供试液0.3mL，在BL侧加入HBSS溶液0.6mL作为接受液。将24孔板放入摇床(37℃，50rpm)，分别于0.5、1、1.5、2、2.5、3h时于BL侧取样0.2mL，同时补加0.2mL HBSS溶液。将样品于-20℃条件下保存，待测。采用UPLC-MS/MS方法检测PTX含量。

BL→AP转运：取处理好的小室，在AP侧加入HBSS溶液0.3mL，在BL侧加入供试液0.6mL作为接受液。将24孔板放入摇床(37℃，50rpm)，分别于0.5、1、1.5、2、 2.5、3h时于AP侧取样0.2mL，同时补加0.2mL HBSS溶液。将样品于-20℃条件下保存，待测。

含P-gp及内吞抑制剂AP→BL转运：取处理好的小室，在AP侧加入供试液(氯丙嗪、维拉帕米、吲哚美辛、GA-CS-TPGS溶液)0.3mL，在BL侧加入HBSS溶液0.6mL作为接受液。将24孔板放入摇床(37℃，50rpm)，45min后，弃去两侧溶液，在AP侧加入紫杉醇对照溶液和GA-CS-TPGS/PTX供试液0.3mL，在BL侧加入0.6mL HBSS溶液作为接受液。其他步骤同前。

含P-gp抑制剂BL→AP转运：取处理好的小室，在AP侧加入HBSS，在BL侧加入维拉帕米溶液0.3mL，将24孔板放入摇床(37℃，50rpm)，45min后，弃去两侧溶液，在AP侧加入0.3mLHBSS溶液作为接受液，在BL侧加入紫杉醇对照溶液和 GA-CS-TPGS/PTX供试液0.6mL。其他步骤同前。

(3)结果

细胞毒性：考察了EL-40与无水乙醇、GA-CS-TPGS及载药胶束对Caco-2细胞的毒性，结果空白载体材料在100μg/mL时，没有表现出明显的细胞毒性，细胞存活率均在 85％以上，IC₅₀大于100μg/mL。EL-40与无水乙醇的IC₅₀为1.43μg/mL，GA-CS-TPGS/PTX 的IC₅₀为5.7μg/mL，紫杉醇对照溶液的IC₅₀为3.2μg/mL。表明材料比较安全。

细胞摄取：定性摄取和定量摄取：采用激光共聚焦观察细胞摄取情况，香豆素成功进入细胞胞浆内，载香豆素-6的聚合物胶束显色更深，这可能是因为胶束溶液借助非特异性内吞进入细胞内，使其更容易进入细胞内。采用酶标仪测得PTX对照溶液的摄取量为177.1 μg/mg protein，GA-CS-TPGS/PTX胶束的摄取量为246.0μg/mg protein。表明聚合物胶束组的细胞摄取量高于紫杉醇对照溶液组。P-gp抑制试验表明，GA-CS-TPGS具有P-gp抑制作用，作为聚合物胶束材料，包载药物，抑制肠道P-gp外排作用。结果见表9。

细胞膜渗透性：随着培养天数的增加，细胞的跨膜电阻值也增加，15天后基本稳定。说明15天后细胞融合成致密的单层。电阻值在600Ω·cm²左右，大于250Ω·cm²，表明已经形成致密的单层，可用于转运实验。GA-CS-TPGS聚合物胶束对紫杉醇溶液在细胞膜方面的影响为：当PTX单独孵育时，A→B的渗透率较低，而B→A的渗透率较高，当对照制剂与其他抑制剂共孵育时，A→B的渗透率提高，B→A的渗透率降低，表明P-gp 抑制作用在增加细胞转运方面有一定的作用。

表9 加p-gp抑制剂后细胞摄取量(x±s，n＝3)

<聚合物胶束对大鼠CYP 3A酶活性的体外抑制作用>

(1)实验材料

混合SD大鼠肝微粒体、咪达唑仑、1’-羟基咪达唑仑、NADPH再生系统、0.1M磷酸钾缓冲盐均购自北京汇智泰康医药技术有限公司；氯雷他定购自阿拉丁试剂公司，GA-CS-TPGS实验室自制；甲醇、乙腈为色谱纯，购自安徽天地高纯溶剂有限公司；其余试剂为分析纯，购自西陇化工股份有限公司。

(2)方法

超高压液相质谱测定色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×50mm，1.7μm)；流动相：甲醇-水，梯度洗脱，流速0.4mL/min。流动相比例见表11；质谱条件：检测器：TQD (三重四级杆)，离子源：ESI源，扫描方式：多反应监测(MRM)，扫描时间3min。检测方式：正离子检测；毛细管电压：3kV；锥孔电压：30V；碰撞能量：30eV；离子源温度：150℃；去溶剂温度：450℃；去溶剂气流量：650L/h；锥孔气流量：150L/h；定量离子：m/z 383.300→266.975(氯雷他定)；m/z 342.200→202.917(1’-羟基咪达唑仑)； m/z 326.200→291.056(咪达唑仑)。

表11 流动相比例变化

供试液的配制：在冰浴中进行样品处理，精密吸取大鼠肝微粒体8μL(20mg/mL)，加入探针底物咪达唑仑对照品溶液2μL(2 500ng/mL)，并同时加入系列GA-CS-TPGS溶液(0.5、1、5mg/mL)20μL，加入0.1M磷酸钾缓冲盐170μL，混匀。量取30μL置离心管中，37℃预孵育5min，加入15μL NADPH溶液启动反应，并开始记时；继续孵育 45min后，加入155μL冰冷的内标溶液沉淀蛋白，终止反应，涡旋1min，16000r/min 离心20min，取上清液2μL，测定咪达唑仑代谢产物1’-咪达唑仑质量浓度。

阳性溶液的配制：在冰浴中进行样品处理，精密吸取大鼠肝微粒体8μL(20mg/mL)，加入探针底物咪达唑仑对照品溶液2μL(2500ng/mL)，加入0.1M磷酸钾缓冲盐190μL，混匀。量取30μl置离心管中，37℃预孵育5min，加入15μLNADPH溶液启动反应，并开始记时；继续孵育45min，加入155μL冰冷的内标溶液沉淀蛋白，终止反应，涡旋1min， 16000r/min离心20min，取上清液2μL，测定咪达唑仑代谢产物1’-咪达唑仑质量浓度。

空白溶液的配制：在冰浴中进行样品处理，精密吸取大鼠肝微粒体8μL(20mg/mL)，加入甲醇2μL，并同时加入GA-CS-TPGS溶液(1mg/mL)20μL，加入0.1M磷酸钾缓冲盐170μL，混匀。量取30μL置离心管中，37℃预孵育5min，加入15μL NADPH溶液启动反应，并开始记时；继续孵育45min后，加入155μL冰冷的内标溶液沉淀蛋白，终止反应，涡旋1min，16000r/min离心20min，取上清液2μL，测定。

方法学考察

专属性：取空白溶液、各对照品进样检测，观察是否干扰测定。

标准曲线和线性范围：取灭活肝微粒体蛋白悬液8μL，GA-CS-TPGS溶液(0.5mg/mL)20μL，1’-羟基咪达唑仑对照品溶液(19.53、39.06、78.13、156.25、312.5、625.0、1250、2500、5000ng/mL)2μL，0.1M磷酸钾缓冲盐170μL，制成系列溶液，按溶液配制项下处理后，取样进行检测。以1’-羟基咪达唑仑质量浓度为横坐标，1’-羟基咪达唑仑与内标物峰面积，比值为纵坐标，进行线性回归，得线性回归方程。

精密度和稳定性：取标准曲线项下的1’-羟基咪达唑仑对照品溶液，取样进行检测，计算日内精密度和日间精密度。取样品溶液，在不同时间进样，考察其稳定性。

基质效应和回收率：取灭活肝微粒体蛋白悬液8μL，按标准曲线项下的方法制备1’- 羟基咪达唑仑对照品溶液浓度为78.13、625、2500ng/mL的低、中、高浓度血样各3份。另取系列1’-羟基咪达唑仑对照品溶液贮备液，用甲醇配制成系列对照品溶液。量取各试样2μL注入色谱仪，记录峰面积。用线性项下方法处理的对照品与样品的峰面积比值用于计算提取回收率；取本项处理的方法对照品与样品的峰面积比值来计算基质效应。

抑制率及半数抑制浓度的计算：GA-CS-TPGS对CYP3A的抑制作用采用1’-羟基咪达唑仑生成速率的降低表示，计算公式为：

抑制率＝(m₀-m₁)/m₀×100％

其中，m₀未加GA-CS-TPGS样品时探针代谢物(1’-羟基咪达唑仑)的生成量；m₁加GA-CS-TPGS样品后探针代谢物(1’-羟基咪达唑仑)的生成量，用抑制率表示GA-CS-TPGS 对酶代谢抑制作用的强弱，数值越高表示抑制作用越强。

(3)结果

方法学考察结果：各组分LC-MS/MS图谱(A：1-羟基咪达唑仑、B：咪达唑仑、C：氯雷他定、D：供试液、E：空白肝微粒体)表明，空白中的成分在1’-羟基咪达唑仑出峰时间处没有干扰，测定方法专属性良好，线性方程为y＝8.08×10^-5x+1.9×10^-4，r为0.98999。表明在19.53到5000ng/mL范围内，线性关系良好。精密度、稳定性及回收率符合分析检测要求，可用于肝微粒体CYP3A的相关分析。当GA-CS-TPGS浓度为0.5、1、5mg/mL 时，其酶活性抑制率分别为52.04％、83.76％和89.94％。IC₅₀为2.977mg/mL。表明本材料对CYP3A酶有一定的抑制作用。

<聚合物胶束对裸鼠抗肿瘤作用研究>

(1)实验材料

A549细胞(上海中科院干细胞库)；MEM培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’smedium， GIBCO，赛默飞世尔仪器有限公司)；胰蛋白酶、青-链霉素、PBS缓冲液均购自北京索莱宝科技有限公司；胎牛血清(Fetal Bovine Serum，ExCell Bio有限公司)；GA-CS-TPGS/PTX 胶束及PTX对照制剂实验室自制；氯化钠注射液(河北天成药业股份有限公司)；雌性小鼠(BALB/c-nu，许可证号：SCXK(湘)2016-0002)、饲料、垫料均购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。

(2)方法

细胞：A549细胞培养在含10％胎牛血清的MEM培养基中。收集指数生长期的A549细胞，用不含血清的培养基重悬至适合浓度(2.5×10⁶)后，用于小鼠皮下肿瘤接种。

动物造模和分组：6只雌性小鼠右侧皮下接种2.5×10⁶A549细胞。待肿瘤平均体积200-300mm³时，取接种于裸鼠腋下处于快速增殖期的A549(3代)瘤块，将其切成1mm× 1mm×1mm的瘤块，无菌条件下用套管针于裸鼠右肢皮下接种。待肿瘤增殖至300-400 mm³时分组。根据肿瘤大小随机分组(见表12)，分成模型组、对照组、实验级(低、中、高浓度)。分组后给药八周，测量瘤块的长径(a)、短径(b)，每周2～3次。肿瘤体积计算公式为：1/2×长径L×短径W²。

受试药品配制：取6mg的紫杉醇，用1mL无水乙醇与EL(1:1，v/v)的混合液溶解后，生理盐水稀释至6mL(1mg/mL)，作为对照药物；另取GA-CS-TPGS/PTX胶束溶液 (取TPGS-GA-CS/PTX，用生理盐水溶解稀释并制成0.5、1、2mg/mL的溶液)，作为实验用药；模型组用药为已上市氯化钠溶液。

实验观察：肿瘤接种后，常规监测主要包括肿瘤生长及治疗对动物体重增加或降低(体重每周测量2次)情况。

结果判断标准：相对肿瘤抑制率TGI(％)：TGI＝1-T/C(％)。T/C％为相对肿瘤增值率，即在某一时间点，治疗组和对照组相对肿瘤体积或瘤重的百分比值。T和C分别为治疗组和对照组在某一特定时间点的相对肿瘤体积(RTV)或瘤重(TW)。

计算公式如下：

T/C％＝TRTV/CRTV×100％(TRTV：治疗组平均RTV；CRTV：溶媒对照组平均RTV；RTV＝V_t/V₀，V₀为分组时该动物的瘤体积，V_t为治疗后该动物的瘤体积)。或 T/C％＝TTW/CTW×100％(TTW：治疗组实验终结时平均瘤重；CTW：溶媒对照组实验终结时平均瘤重)。

实验终点：给药四周后，按组结束实验，取瘤，称瘤重，拍照。

统计分析：所有实验结果以平均值±标准误(x±s)表示，对照组与各治疗组或各治疗组之间用单因素方差分析(one-way ANOVA)比较相对肿瘤体积有无显著性差异。随后用Games-Howell(数据方差不齐)比较对照组与各治疗组及各治疗组之间相对肿瘤体积的显著性差异，P<0.05为差异显著。

(3)结果

与生理盐水空白组小鼠相比，上市的紫杉醇组及载药聚合物胶束组在体重和肿瘤体积大小均有显著性差异(P<0.05)，载药聚合物胶束与上市的紫杉醇组比较没有显著性差异 (P>0.05)，具体数值见表12。已上市紫杉醇组、低、中、高浓度载药聚合物胶束组相对肿瘤抑制率TGI(％)分别为48.15％、40.74％、51.85％、66.67％(瘤重)；41.56％、27.88％、51.86％、72.05％(肿瘤体积大小)。载药胶束20mg/kg组药效明显优于其他组，但体重降低为最多；载药胶束10mg/kg组药效比紫杉醇组稍好一点(51.85％和48.15％)；载药胶束5mg/kg药效比紫杉醇组差一点(40.74％和48.15％)。详细数值见表13。结果表明聚合物胶束对肿瘤具有一定的抑制作用。

表12 在人肺癌A-549细胞株模型中各组小鼠肿瘤体积(mm³)和体重(g)

表13 小鼠肿瘤相对肿瘤抑制率

这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (4)

1.紫杉醇口服聚合物胶束的制备方法，其特征在于，以紫杉醇为模型药物，以GA-CS-TPGS共聚物作为口服给药的载体，所述GA-CS-TPGS共聚物的临界胶束浓度为0.0109～0.0203mg/mL，控制紫杉醇口服聚合物胶束粒径在98～182nm，其中，GA-CS-TPGS共聚物的分子结构式如式(1)所示：

所述制备方法包括：

步骤1)按照比1:(0.5～10)mg/mL将所述GA-CS-TPGS共聚物溶解于水中；

将没食子酸甲酯接枝于壳聚糖分子上，得到GA-CS，以琥珀酸酐、4-二甲氨基吡啶对维生素E琥珀酸酯-聚乙二醇1000进行端羟基羧基化，再在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺的缩合作用下使羧基反应活性增强，通过与GA-CS中壳聚糖的自由氨基发生酰胺化反应而接枝，制备出所述GA-CS-TPGS共聚物；

步骤2)按照油水比1:(5～15)将紫杉醇溶解于有机溶剂中；

步骤3)将步骤2)得到的溶液与步骤1)得到的溶液混合，使所述GA-CS-TPGS共聚物、紫杉醇的质量比为30:(1～5)，超声破碎，搅拌，挥干有机溶剂，除杂，加入冻干保护剂，冷冻干燥，即得紫杉醇口服聚合物胶束。

2.如权利要求1所述的紫杉醇口服聚合物胶束的制备方法，其特征在于，所述冻干保护剂为8％(W/V)的海藻糖。

3.如权利要求1所述的紫杉醇口服聚合物胶束的制备方法，其特征在于，所述GA-CS-TPGS共聚物的制备方法包括：

步骤a)向壳聚糖水混悬液中加入无机酸溶液，调节pH至3～6，搅拌使其溶解，加入4-二甲氨基吡啶的乙醇溶液、没食子酸甲酯的乙醇溶液，其中4-二甲氨基吡啶的乙醇溶液、没食子酸甲酯的乙醇溶液的乙醇含量均为5～15％体积的壳聚糖水混悬液，在氮气保护下，80℃水浴反应24h，停止加热，冷至室温，离心，取上清液透析，减压浓缩除乙醇，冷冻干燥得GA-CS；

步骤b)将干燥好的维生素E琥珀酸酯-聚乙二醇1000、琥珀酸酐、4-二甲氨基吡啶用有机溶剂溶解，加入三乙胺，在氮气保护下加热回流，减压蒸发除去有机溶剂，得到黄色油状物体，再次溶解到0～5℃的二氯甲烷中，除杂滤除去白色沉淀，溶液过硅胶柱除杂，湿法上样，洗脱剂为二氯甲烷：乙酸乙酯：甲醇的体积比为9:2:2，TLC监测，收集中间含有维生素E琥珀酸酯-聚乙二醇1000琥珀单酯的洗脱液，旋转蒸发得到黏稠液体，得到TPGS-COOH，TPGS-COOH溶于pH为5的吗啉乙磺酸缓冲液中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，冰浴下磁力搅拌，加入N-羟基琥珀酰亚胺，常温反应6h，得到TPGS-NHS；

步骤c)将步骤a)得到的GA-CS溶解于水中，将步骤b)得到的TPGS-NHS滴加到GA-CS中，搅拌24h，然后将反应物装入透析袋中，透析48h，收集袋内的透析产物，冷冻干燥得到所述GA-CS-TPGS共聚物。

4.如权利要求1所述的紫杉醇口服聚合物胶束在制备抑制p-gp、CYP3A酶及肿瘤生长的药物中的应用，其特征在于，所述的紫杉醇口服聚合物胶束为口服制剂。

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