CN115501183A - 一种可供口服的紫杉醇-聚合物胶束及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种可供口服的紫杉醇‑聚合物胶束及其制备方法,属于医药制剂技术领域。其中细菌纤维素‑槲皮素聚合物作为口服给药胶束,紫杉醇为模型药物。所述聚合物为细菌纤维素和槲皮素通过琥珀酸酐进行连接获得,具有两亲性,在水中可以自组装成胶束,细菌纤维素为亲水端向外,槲皮素为疏水端向内。所述聚合物具有较低的临界胶束浓度,实现了对紫杉醇的高效负载、递送和释放。本发明所述胶束系统将紫杉醇包裹在疏水内核中,提高了紫杉醇的亲水性,有效的提高肠道粘附性,延长体内循环时间,使其通过EPR效应在肿瘤部位有效积累,从而增加紫杉醇的生物利用度,抗癌活性和体内安全性。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域,具体涉及一种可供口服的紫杉醇-聚合物胶束及其制备方法。
背景技术
紫杉醇是一种天然抗癌药物,是当前国内使用最广泛的广谱、经典抗肿瘤化疗药物,也是国内抗肿瘤领域第一大用药品种,在临床已经广泛用于乳腺癌、卵巢癌和部分头颈癌和肺癌的治疗。虽然紫杉醇抗癌效果好,但水溶性很差,导致口服吸收差。临床上需要使用聚氧乙烯蓖麻油与无水乙醇混合溶媒有机溶剂进行溶解后进行注射,这些助溶剂易引起严重的过敏反应即周围神经的病变等副作用,这些对紫杉醇的临床应用带来较大限制。
P-糖蛋白(P-gp)是一种分子量170KD的跨膜糖蛋白,具有能量依赖性“药泵”功能,既能与药物结合,又能与ATP结合,ATP供能使细胞内药物泵出胞外,降低细胞内的药物浓度使细胞产生抗药性。另外,也是口服药物被肠道吸收的重要障碍之一,尤其是对疏水性药物作用尤为明显,这也为紫杉醇口服制剂的开发增加了困难。目前,黄酮类化合物整合了第三代非药物类P-gp抑制剂的功效,其中一些表现出与经典P-gp抑制剂相媲美的效果,且多数黄酮为我们日常饮食的一部分,如果蔬,具有长期且持续使用的历史,这是它们作为P-gp抑制剂的一个有利特征。
所述的细菌纤维素是一种细菌分泌的胞外多糖,与植物纤维素相比,具有较高的结晶度和纯度,且吸水性能好,目前作为医用材料等被广泛应用,这为本发明选择细菌纤维素作为两性聚合物的亲水端提供了有效的安全证明。
发明内容
为解决紫杉醇制剂目前所面临的问题,能够满足紫杉醇口服给药的要求,本发明提供一种口服紫杉醇聚合物胶束及其制备方法,本发明提供的紫杉醇聚合物胶束口服时能够增加药物在肠道中的粘附性,降低肠道内P-gp对药物的外排作用,在提高药物吸收的同时,减少对身体其他部位的副作用,延长药物在体内的循环时间和增加在肿瘤部位的积累。
为了实现上述目的,本发明提供如下技术方案:
本发明提供了一种可供口服的紫杉醇-聚合物胶束及其制备方法,所述胶束包括细菌纤维素-槲皮素聚合物作为口服给药载体,紫杉醇为模型药物。将细菌纤维素-槲皮素溶于水中,紫杉醇溶于乙醇中,两相混合,超声后,除去乙醇,离心,上清液冻干,即得紫杉醇口服胶束。
聚合物和紫杉醇的质量比为10:0.5~10:3.5,优选的范围是10:1~10:3。
聚合物的浓度为0.05~2.5mg/mL,优选的范围是0.1~2mg/mL。
水和乙醇的比例为10:0.25~10:3,优选的范围是10:0.5~10:2。
超声功率为45~540W,时间为5~35min,优选的范围是120~450W,10-20 min。
离心速度3000-5000rpm,时间为5~15min,优选的范围是3500-5000rpm,时间10-15min。
胶束中紫杉醇的含量为5~28wt%,优选使用的范围是15-25wt%。
胶束的粒径为90~150nm,优选使用的范围是100-120nm。
聚合物胶束的亲水端为细菌纤维素,疏水端为槲皮素,制备方法包括:以琥珀酸酐对槲皮素进行羟基羧基化,按照比例将槲皮素和琥珀酸酐溶解在二甲基亚砜(DMSO)中,40℃水浴反应12h;在通过1-乙基-(3-二甲基氨基丙基) 碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)作用下使羧基反应活性增强,与细菌纤维素的羟基酯化反应;结束后,将反应液滴加入乙醇中,搅拌,离心,获得沉淀物再用乙醇清洗3次,所得固形物溶解于水中,离心除去不溶物,上清液冻干后获得细菌纤维素-槲皮素聚合物。
参与反应的细菌纤维素溶解在四丁基醋酸铵(TBAA)与二甲基亚砜 (DMSO)体系中,TBAA的质量分数为8%-40%,优选的是范围10%-30%。
1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)的比列为摩尔比1:0.5~1:1.5。优选的范围是1:0.8~1:1.2。
细菌纤维素与槲皮素的摩尔比为1:0.5~1:3.5,优选反应范围是1:1~1:3。
附图说明
图1BC、QT和聚合物(BC-QT)的红外光谱图;
图2为紫杉醇-聚合物胶束(BC-QT-PTX)冻干物和复溶后图;
图3(a)聚合物(BC-QT)和(b)紫杉醇-聚合物胶束(BC-QT-PTX)的粒径图;
图4为BC-QT-PTX的原子力显微镜图,扫描电镜图和透射电镜图;
图5为PTX、BC-QT、PTX和BC-QT物理混合物、BC-QT-PTX的X-射线衍射图;
图6为不同浓度BC-QT对斑马鱼胚胎发育的影响;
图7为BC-QT-PTX在人工胃肠液中释放和稳定性;
图8为Caco-2细胞对BC-QT-PTX的摄取和摄取机制:(A)为孵育1h和 4h后,Caco-2细胞中游离NR和BC-QT-NR胶束内化的图像。细胞核被DAPI 染成蓝色,而细胞质被NR染成红色;(B)用流式细胞仪测量游离NR, BC-QT-NR胶束和细胞培养基(空白)预处理的Caco-2细胞中NR的荧光强度; (C)不同内吞途径抑制剂对Caco-2细胞中摄取BC-QT-NR胶束的影响;
图9为BC-QT-PTX在大鼠体内的血药浓度-时间曲线图;
图10为BC-QT-PTX/DiR纳米胶束体内分布图像:(A)雌性C57BL/6小鼠口服BC-QT-PTX/DiR纳米胶束后的体内荧光成像。(B)雌性C57BL/6小鼠口服BC-QT-PTX/DiR纳米胶束2h后离体肠胃的荧光成像。(C)雌性 C57BL/6小鼠口服BC-QT-PTX/DiR纳米胶束2h和24h后离体器官及肿瘤的荧光成像。(D)雌性C57BL/6小鼠口服BC-QT-PTX/DiR纳米胶束24h内全身整体荧光强度。(E)雌性C57BL/6小鼠口服BC-QT-PTX/DiR纳米胶束 BC-QT-PTX/DiR解剖后内脏器官荧光强度。游离DiR做为对照;
图11为PTX、PTX+VRP和BC-QT-PTX与LLC细胞共孵育24h后细胞凋亡情况;
图12为荷瘤小鼠接受不同配方给药21天后的肿瘤体积变化:(A)在给小鼠各种配方后荷瘤小鼠的肿瘤体积变化曲线(B)治疗结束后离体的肿瘤图。(1) 生理盐水组;(2)BC-QT空白胶束组;(3)PTX低剂量+VRP(PTX/L+VRP, 5mg/kg PTX+25mg/kg VRP);(4)PTX低剂量组(PTX/L,5mg/kg PTX);(5) PTX高剂量组(PTX/H 20mg/kg PTX);(6)载有PTX的BC-QT-PTX胶束低剂量组(BC-QT-PTX/L,5mg/kg PTX);(7)载有PTX的BC-QT-PTX胶束高剂量组(BC-QT-PTX/H,20mg/kg PTX);
图13为3口服生理盐水,空白BC-QT,PTX/L,PTX/H,PTX/L+VRP, BC-QT-PTX/L和BC-QT-PTX/H 21天后,从小鼠体内分离出的肿瘤切片HE染色的代表性图像;
图14为荷瘤小鼠接受不同配方给药21天后的体重变化。(1)生理盐水组; (2)BC-QT空白胶束组;(3)PTX低剂量+VRP(PTX/L+VRP,5mg/kg PTX+25 mg/kg VRP);(4)PTX低剂量组(PTX/L,5mg/kg PTX);(5)PTX高剂量组 (PTX/H,20mg/kg PTX);(6)载有PTX的BC-QT-PTX胶束低剂量组 (BC-QT-PTX/L,5mg/kg PTX);(7)载有PTX的BC-QT-PTX胶束高剂量组(BC-QT-PTX/H,20mg/kg PTX);
图15为荷瘤小鼠给药治疗21天后内脏组织HE染色(1)生理盐水组;(2) BC-QT空白胶束组;(3)PTX低剂量+VRP(PTX/L+VRP,5mg/kg PTX+25 mg/kg VRP);(4)PTX低剂量组(PTX/L,5mg/kg PTX);(5)PTX高剂量组(PTX/H 20mg/kg PTX);(6)载有PTX的BC-QT-PTX胶束低剂量组 (BC-QT-PTX/L,5mg/kg PTX);(7)载有PTX的BC-QT-PTX胶束高剂量组(BC-QT-PTX/H,20mg/kg PTX),400×。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步详细说明,以便本领域技术人员参照说明文字能够据以实施,但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
需要说明的是,下述实施方案中所述实验方法,如无特殊说明,均为常规方法,所述试剂和材料,如无需特殊说明,均可从商业途径获得。
所述的槲皮素、琥珀酸酐、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐 (EDC·HCl)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)和乙醇均为分析纯,整个实验用水均为蒸馏水。紫杉醇的液相检测条件统一在生物利用度实验中说明。
实施例1
口服紫杉醇-聚合物胶束的制备方法:
(1)将0.155g槲皮素和0.05g琥珀酸酐溶于2mL二甲基亚砜中,水浴40 ℃,搅拌,反应12h;
(2)加入0.1g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐,搅拌活化 15min,再加入0.08g 4-二甲氨基吡啶,反应15min,充分活化羧基端;
(3)将步骤(2)中的反应液加入细菌纤维素溶液中,TBAA溶液浓度为 15%,使用量为3mL,细菌纤维素的质量为0.081g,室温搅拌反应24h;
(4)反应结束后将反应液滴加入乙醇中,除去未反应的槲皮素及其衍生物,离心获得沉淀后,再利用乙醇清洗3次,充分除去催化剂及其副产物,并离心获得沉淀;
(5)将沉淀置于蒸馏水中,充分搅拌溶解,离心,除去未反应的细菌纤维素,上清液冷冻干燥,收获冻干物为BC-QT聚合物;
(6)称取步骤(5)获得的BC-QT聚合物10mg,搅拌溶解于10mL蒸馏水中,使其浓度为1mg/mL;
(7)称取紫杉醇储备液1mL,浓度为3mg/mL,用注射器将其注入步骤(6) 的BC-QT溶液中,储备液溶剂为乙醇;
(8)用超声细胞破碎仪超声15min,功率为270W(工作时间5s间歇3s),随后,磁力搅拌,除去乙醇,液体经3000rpm离心10min,上清液冷冻干燥即获得口服紫杉醇聚合物胶束。
利用HPLC法检测紫杉醇的含量,计算紫杉醇的载药量和包封率,紫杉醇的载药量和包封率分别为9.12%和85.73%。
实施例2
口服紫杉醇-聚合物胶束的制备方法:
(1)将0.312g槲皮素和0.101g琥珀酸酐溶于5mL二甲基亚砜中,水浴 40℃,搅拌,反应18h;
(2)加入0.15g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐,搅拌活化 15min,再加入0.01g 4-二甲氨基吡啶,反应20min,充分活化羧基端;
(3)将步骤(2)中的反应液加入细菌纤维素溶液中,TBAA溶液浓度为 18%,使用量为3mL,细菌纤维素的质量为0.081g,室温搅拌反应28h;
(4)反应结束后将反应液滴加入乙醇中,除去未反应的槲皮素及其衍生物,离心获得沉淀后,再利用乙醇清洗3次,充分除去催化剂及其副产物,并离心获得沉淀;
(5)将沉淀置于蒸馏水中,充分搅拌溶解,离心,除去未反应的细菌纤维素,上清液冷冻干燥,收获冻干物为BC-QT聚合物;
(6)称取步骤(5)获得的BC-QT聚合物20mg,搅拌溶解于10mL蒸馏水中,使其浓度为1mg/mL;
(7)称取紫杉醇储备液2mL,浓度为3mg/mL,用注射器将其注入步骤(6) 的BC-QT溶液中,储备液溶剂为乙醇;
(8)用超声细胞破碎仪超声15min,功率为270W(工作时间5s间歇3s),随后,磁力搅拌,除去乙醇,液体经5000rpm离心10min,上清液冷冻干燥即获得口服紫杉醇聚合物胶束。
利用HPLC法检测紫杉醇的含量,计算紫杉醇的载药量和包封率,紫杉醇的载药量和包封率分别为12.37%和79.65%。
实施例3
口服紫杉醇-聚合物胶束的制备方法:
(1)将0.467g槲皮素和0.151g琥珀酸酐溶于8mL二甲基亚砜中,水浴 40℃,搅拌,反应20h;
(2)加入0.2g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐,搅拌活化 15min,再加入0.12g 4-二甲氨基吡啶,反应15min,充分活化羧基端;
(3)将步骤(2)中的反应液加入细菌纤维素溶液中,TBAA溶液浓度为 20%,使用量为3mL,细菌纤维素的质量为0.081g,室温搅拌反应24h;
(4)反应结束后将反应液滴加入乙醇中,除去未反应的槲皮素及其衍生物,离心获得沉淀后,再利用乙醇清洗3次,充分除去催化剂及其副产物,并离心获得沉淀;
(5)将沉淀置于蒸馏水中,充分搅拌溶解,离心,除去未反应的细菌纤维素,上清液冷冻干燥,收获冻干物为BC-QT聚合物;
(6)称取步骤(5)获得的BC-QT聚合物10mg,搅拌溶解于10mL蒸馏水中,使其浓度为1mg/mL;
(7)称取紫杉醇储备液1mL,浓度为3mg/mL,用注射器将其注入步骤(6) 的BC-QT溶液中,储备液溶剂为乙醇;
(8)用超声细胞破碎仪超声10min,功率为450W(工作时间5s间歇3s),随后,磁力搅拌,除去乙醇,液体经5000rpm离心10min,上清液冷冻干燥即获得口服紫杉醇聚合物胶束。
利用HPLC法检测紫杉醇的含量,计算紫杉醇的载药量和包封率,紫杉醇的载药量和包封率分别为13.53%和92.65%。
实施例4
口服紫杉醇-聚合物胶束的制备方法:
(1)将0.622g槲皮素和0.205g琥珀酸酐溶于10mL二甲基亚砜中,水浴 40℃,搅拌,反应16h;
(2)加入0.380g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐,搅拌活化15min,再加入0.242g 4-二甲氨基吡啶,反应15min,充分活化羧基端;
(3)将步骤(2)中的反应液加入细菌纤维素溶液中,TBAA溶液浓度为 20%,使用量为7mL,细菌纤维素的质量为0.162g,室温搅拌反应24h;
(4)反应结束后将反应液滴加入乙醇中,除去未反应的槲皮素及其衍生物,离心获得沉淀后,再利用乙醇清洗5次,充分除去催化剂及其副产物,并离心获得沉淀;
(5)将沉淀置于蒸馏水中,充分搅拌溶解,离心,除去未反应的细菌纤维素,上清液冷冻干燥,收获冻干物为BC-QT聚合物;
(6)称取步骤(5)获得的BC-QT聚合物10mg,搅拌溶解于10mL蒸馏水中,使其浓度为1mg/mL;
(7)称取紫杉醇储备液1mL,浓度为3mg/mL,用注射器将其注入步骤(6) 的BC-QT溶液中,储备液溶剂为乙醇;
(8)用超声细胞破碎仪超声10min,功率为300W(工作时间5s间歇3s),随后,磁力搅拌,除去乙醇,液体经5000rpm离心10min,上清液冷冻干燥即获得口服紫杉醇聚合物胶束。
利用HPLC法检测紫杉醇的含量,计算紫杉醇的载药量和包封率,紫杉醇的载药量和包封率分别为24.62%和95.68%。
实施例5
口服紫杉醇-聚合物胶束的制备方法:
(1)将0.311g槲皮素和0.110g琥珀酸酐溶于5mL二甲基亚砜中,水浴 40℃,搅拌,反应16h;
(2)加入0.19g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐,搅拌活化 15min,再加入0.12g 4-二甲氨基吡啶,反应15min,充分活化羧基端;
(3)将步骤(2)中的反应液加入细菌纤维素溶液中,TBAA溶液浓度为 20%,使用量为7mL,细菌纤维素的质量为0.162g,室温搅拌反应24h;
(4)反应结束后将反应液滴加入乙醇中,除去未反应的槲皮素及其衍生物,离心获得沉淀后,再利用乙醇清洗5次,充分除去催化剂及其副产物,并离心获得沉淀;
(5)将沉淀置于蒸馏水中,充分搅拌溶解,离心,除去未反应的细菌纤维素,上清液冷冻干燥,收获冻干物为BC-QT聚合物;
(6)称取步骤(5)获得的BC-QT聚合物10mg,搅拌溶解于10mL蒸馏水中,使其浓度为1mg/mL;
(7)称取紫杉醇储备液3mL,浓度为1mg/mL,用注射器将其注入步骤(6) 的BC-QT溶液中,储备液溶剂为乙醇;
(8)用超声细胞破碎仪超声20min,功率为270W(工作时间5s间歇3s),随后,磁力搅拌,除去乙醇,液体经5000rpm离心10min,上清液冷冻干燥即获得口服紫杉醇聚合物胶束。
利用HPLC法检测紫杉醇的含量,计算紫杉醇的载药量和包封率,紫杉醇的载药量和包封率分别为11.44%和75.68%。
实施例6
口服紫杉醇-聚合物胶束的制备方法:
(1)将0.622g槲皮素和0.201g琥珀酸酐溶于12mL二甲基亚砜中,水浴 40℃,搅拌,反应18h;
(2)加入0.4g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐,搅拌活化 15min,再加入0.25g 4-二甲氨基吡啶,反应15min,充分活化羧基端;
(3)将步骤(2)中的反应液加入细菌纤维素溶液中,TBAA溶液浓度为 22%,使用量为5mL,细菌纤维素的质量为0.162g,室温搅拌反应24h;
(4)反应结束后将反应液滴加入乙醇中,除去未反应的槲皮素及其衍生物,离心获得沉淀后,再利用乙醇清洗5次,充分除去催化剂及其副产物,并离心获得沉淀;
(5)将沉淀置于蒸馏水中,充分搅拌溶解,离心,除去未反应的细菌纤维素,上清液冷冻干燥,收获冻干物为BC-QT聚合物;
(6)称取步骤(5)获得的BC-QT聚合物20mg,搅拌溶解于20mL蒸馏水中,使其浓度为1mg/mL;
(7)称取紫杉醇储备液1mL,浓度为3mg/mL,用注射器将其注入步骤(6) 的BC-QT溶液中,储备液溶剂为乙醇;
(8)用超声细胞破碎仪超声20min,功率为270W(工作时间5s间歇3s),随后,磁力搅拌,除去乙醇,液体经5000rpm离心10min,上清液冷冻干燥即获得口服紫杉醇聚合物胶束。
利用HPLC法检测紫杉醇的含量,计算紫杉醇的载药量和包封率,紫杉醇的载药量和包封率分别为24.37%和96.71%。
以下均为实例6制备的口服紫杉醇-聚合物胶束进行实验
图1中BC-QT聚合物在1661cm-1和1564cm-1两处展现出QT的红外特征峰,另外,出现在1736cm-1处的新峰,应归因于BC与SA之间形成的O-C=O 峰。除此之外,BC-QT红外光谱中3450-3200cm-1的宽峰范围减小,峰型更加明显,这说明BC在与QT连接后,改变了原有结构中的氢键分布。
图2和图3可知,BC-QT-PTX在蒸馏水中复溶后,水溶性良好,纳米粒分散均匀,较稳定。由于载药的缘故,载药胶束的粒径要大于空白胶束的粒径,分别为112.6±4.3nm和88.3±5.6nm。
图4可以看出PTX在2θ°为5.56、8.92、10.08、10.76、11.20、12.36和13.88 处显示出强烈的峰,并在15°-30°之间出现了一些弱峰。在BC-QT和PTX物理混合物的XRD图谱中仍然可以看到PTX的结晶性质,前三个较为明显的衍射峰依次为2θ°=5.86、8.92和13.8。但是,BC-QT-PTX胶束中没有PTX的衍射峰,说明PTX以无定形态存在于聚合物胶束中。
图5中的AFM,SEM和TEM对BC-QT和BC-QT-PTX纳米胶束进行了尺寸测试和形貌观察。可以看出,BC-QT在负载PTX前后都呈现球形状态, BC-QT-PTX显示出黑色的核心部分,放大后(红色框部分)看到了明显的核壳结构。BC-QT载体包围在PTX的周围,显示的是白色的短小纤维状,负载的紫杉醇则是黑色纳米粒。
以下均为实例6制备的口服紫杉醇-聚合物胶束进行实验
聚合物生物安全性评价
方法:通过测试BC-QT聚合物对斑马鱼的发育毒性,有助于我们使用聚合物前,更好的了解其生物安全性。斑马鱼(AB品系)成鱼购自南京EZERINKA 有限公司。斑马鱼的繁育和胚胎收集按照标准程序进行。将成年斑马鱼饲养在经过活性炭过滤的水体中,水温维持在28±1℃,盐度500±50μs/cm,pH为 6.5-7.5,光照/黑暗周期(h)14:10,每日喂食两次新鲜孵化已脱膜的丰年虾。
成鱼在交配前需分开饲养,胚胎收集的前一晚,将成年雄鱼和雌鱼按照1:1 的比例转移至交配盒中,并用隔板将其隔开。次日光照1h后取出隔板,使其交配产卵,产卵约1h后收集受精卵,用标准的斑马鱼E3培养液冲洗后置于 E3培养液中,并放于28.5℃的恒温光照培养箱中培养。待胚胎发育到3h时,在解剖显微镜下观察胚胎发育情况,选取发育正常的胚胎进行后续实验。
选出的发育正常斑马鱼胚胎,每组50个,放入平皿中,加入适量纯净水配制的不同浓度的BC-QT聚合物(10-0.01mg/mL),纯净水作为阴性对照。胚胎给药后,放入28.5℃恒温培养箱中孵化培育,每日都需按时观察,实验观察时间终点为96h。观察过程中主要统计以下现象。
(1)胚胎死亡率。主要记录不同浓度的BC-QT聚合物处理的斑马鱼胚胎在 24h后死亡胚胎的数量,胚胎已死亡的判断标准为,斑马鱼胚胎变白或者失去透明性,并且计算死亡率。
(2)胚胎孵化率。使用体视显微镜,仔细观察不同浓度的聚合物在不同的作用时间段已经孵化的斑马鱼胚胎,计数并统计孵化率。
(3)心脏毒性。在体视显微镜下拨动斑马鱼以让其保持侧卧位,头部朝向左侧,两眼尽量重叠,头部及尾部保持在同一水平,以充分暴露心脏及心包部位,便于观察。在体视显微镜下观察活体有无心包水肿,显微镜照相系统拍照。体视显微镜下由同一人计数幼鱼心率(n=5),每尾幼鱼每次计数30s,再乘以2获得幼鱼每分钟心跳次数。
(4)胚胎发育形态的观察。体视显微镜下活体观察,发育畸形观察指标包括脊柱畸形(脊柱弯曲或尾短弯曲)、卵黄囊异常(水肿或吸收延迟)、出血、眼部水肿及游泳浮囊未充盈。
结果:如图6所示。图6A中显示,不同浓度处理后的胚胎均有死亡,包括空白组,说明实验所用胚胎之间存在个体差异,具有不同的生存活力,在发育过程中,活力低下的将会自然死亡,死亡率约14.0%。最高剂量10mg/mL作用下,死亡率为52.0%,在浓度≤5mg/mL时,并未观察到胚胎的大量死亡,空白组相比,无明显差异。表明BC-QT聚合物在超过一定剂量时对斑马鱼胚胎具有一定的毒副作用。处理24h后存活下来的胚胎开始向幼鱼阶段孵化,作用到72 h后,除10mg/mL和5mg/mL两个浓度有少量胚胎未脱膜外,剩余浓度处理的胚胎全部成功脱膜,发育成完整的幼鱼。96h后,观察到存活胚胎全部成功孵化。图6D为与不同浓度BC-QT聚合物共同孵育的斑马鱼胚胎在24,48,72和 96h时的发育情况。图6B为BC-QT聚合物对斑马鱼胚胎孵化率的影响结果,我们得知聚合物浓度在10mg/mL时对胚胎有一定的毒性作用,造成大部分胚胎死亡,所以胚胎孵化率只有48.0%。其他浓度的孵化率与空白组比较无明显差异。且在体式显微镜下观察发现,此浓度下孵化出的幼鱼出现畸形状态,如图6E所示。图6E(ⅰ)中,展示的是卵黄囊异常(白色方框标记处)的幼鱼,心脏发育不全,脊柱稍有变形,尾尖向下弯曲。图6E(ⅱ)中,幼鱼严重畸形,脊柱完全向上翘起,身体发育不完全,呈退化趋势,心包也呈现有水肿状态。图6E (ⅲ)中的幼鱼心包出血外,脊柱整体向下弯曲。图6E(ⅳ)中的幼鱼发现心包和眼部均有水肿。其他浓度以及空白组中,观察到的幼鱼均发育正常,未发现畸形态。另外,图6C显示,斑马鱼与不同浓度的BC-QT聚合物共孵育96h 后,各浓度下斑马鱼的心率无明显差异,均在150-160bpm范围内,与空白组相比(156bpm),实验组未发现心率失常现象。且各浓度下孵育后的斑马鱼心脏跳动有力且节奏均匀,具有较好的收缩能力,并未观察到心脏跳动异常。因此,结果表明BC-QT聚合物对斑马鱼的心率并无影响,不会造成心率异常现象。显然,BC-QT在高浓度对存活胚胎的孵化率及心率影响较小,但对斑马鱼胚胎的发育产生了严重的副作用,造成幼鱼的畸形发育,且展现出一定的心脏毒性。综合斑马鱼胚胎模型的毒性测试结果可以得知,在安全浓度范围内,BC-QT聚合物可以作为一种药物传递系统。
BC-QT-PTX在胃肠道中的稳定性和释放考察
方法:将1mL BC-QT-PTX胶束(含有0.4mg PTX)和3.2mg胃蛋白酶置于纤维素膜透析袋(分子量=3500)中,并在37℃下浸入200mL模拟胃液(SGF, pH=1.2,7mL HCl,5mL吐温80,2g NaCl,3.2g胃蛋白酶,加水至1L,pH 通过NaOH调节至1.2±0.5)中,并以速度振荡100r/min。在SGF中孵育2h后,将10mg胰蛋白酶加入透析管中。然后将透析管转移到200mL模拟肠液中 (SIF,pH=6.8,6.8g KH2PO4,分别使用0.2M NaOH 118mL和10.0g胰蛋白酶,5mL吐温80,加水至1L)。以规定的时间间隔(0.25、0.5、0.75、1、2、 3、4、6、8、12、24、36和48h)取出1mL透析培养基,更换等体积的新鲜培养基(SGF或SIF)。取出样品中加入1mL的甲醇,0.22μm滤膜过滤,通过 HPLC方法分析溶液中PTX的量。每种制剂的释放重复三次。
为考察BC-QT-PTX纳米胶束在胃肠道及入血后的稳定性,将BC-QT-PTX 纳米胶束分别与SGF,SIF和pH=7.4的PBS缓冲液37℃下孵育24h,测试其粒径的大小以及通过TEM观察胶束的形态。
结果:图7中游离PTX和BC-QT-PTX纳米胶束分别在12h内累积释放出 39.7%和16.4%的PTX(图7A)。在12h后,游离的PTX释放速度开始减慢,至48h时总计释放45.8%,若想达到更多的释放需要更久的时间,这与PTX的极度亲脂性有关。BC-QT-PTX纳米胶束的释放规律与PTX较为相似,在12h 前的突然释放,可能是由于吸附在胶束表面的药物和药物扩散到胶束表面附近引起的,图7A的TEM图片部分中红色框内和绿色框中所示。直至48h胶束内药物累积释放25.1%,与PTX相比,胶束延缓了药物的释放时间,这可能是胶束内核核分子间的氢键等因素造成的。这说明BC-QT-PTX胶束在胃肠液中具有一定的稳定性,在进入血液循环前可以维持较好的胶束形态。另外,将 BC-QT-PTX胶束置于不同介质(胃液,pH=1.2;肠液,pH=6.4;血液pH=7.4) 24h后,通过DLS测定其粒径变化,并用TEM采集了胶束的形态特征进一步观察胶束的稳定性。图7B-D看出,从胃液到血液,胶束的粒径在113.4nm-133.7 nm之间变化,说明胶束粒径受到pH的影响,这归因于BC-QT聚合物中的琥珀酸残基(-COOH)。但TEM的图像中观察到,BC-QT-PTX胶束在各种缓冲介质中处理后大部分仍保持完整的球形结构,没有明显的损坏迹象(ⅰ,ⅱ和ⅲ)。这可能是胶束制备过程中,超声的空化效应增强了链的缠结,疏水基团聚集形成致密疏水微区,将药物包裹在颗粒内部。
Caco-2细胞摄取和机制研究
方法:(1)细胞摄取:将荧光染料尼罗红(NR)和PTX同时负载于聚合物胶束(BC-QT-NP)。简而言之,将NR和PTX同时溶于乙醇中,滴加入BC-QT 水溶液中,冰浴下超声20min后,避光挥发除去乙醇,3000r/min离心10min,冷冻干燥以获得BC-QT-NP胶束。通过荧光分光光度计测试NR的含量,用于细胞摄取实验。
Caco-2细胞以每孔1×105个细胞的密度接种于6孔细胞培养板中,达到80%的融合后用于细胞内化实验。将2mL NR或BC-QT-NP(NR,10μg/mL)胶束的PBS分散液加入板孔中,37℃下孵育1和4h。用pH 7.4PBS洗涤细胞3次,以去除游离的NR和未被摄取的BC-QT-NP胶束,并用2mL 4%多聚甲醛固定 30min。用PBS洗涤3次后,用DAPI染色15min,然后通过倒置荧光显微镜观察。与此同时,使用流式细胞仪分析细胞中的荧光强度。将NR或BC-QT-NP 胶束处理后的细胞,用PBS洗涤细胞3次,0.25%胰蛋白酶消化,离心后重悬于 PBS中进行流式细胞术测定,并用BD软件处理。
(2)细胞摄取机制:Caco-2细胞以每孔1×105个细胞的密度接种于6孔细胞培养板中,达到80%的融合后用于实验。将细胞与200μL制霉菌素(30 μg/mL),氯丙嗪(10μg/mL),盐酸阿米洛利(100μM)和叠氮化钠(0.1%, w/v)预孵育0.5h。然后加入PBS稀释的200μLBC-QT-NP胶束(NR最终浓度为10μg/mL)。37℃温育2h后,将细胞用PBS洗涤3次,0.25%胰蛋白酶消化后,以1500rpm离心5min,然后重悬于PBS中。通过流式细胞仪检测Caco-2 细胞悬液中NR的荧光强度,并用BD软件处理。
结果:图8A中,Caco-2细胞在相同NR浓度处理1h和4h后,BC-QT-NP 胶束处理的细胞荧光强度都高于游离NR组。随着摄取时间延长,两组细胞中的荧光强度均有所增加,说明胶束在Caco-2细胞的内化过程中是呈时间依赖性的。通过流式细胞术对NR内化效率进行定量测定(图8B)。BC-QT将难溶性药物包裹在其疏水核心中扰乱了药物与P-gp之间的接触,从而避免了P-gp的外流。
图8C所示,被氯丙嗪处理过的Caco-2细胞,相对摄取率降低至约68.7%,表明网格蛋白介导的内吞摄取途径参与载药胶束的内化过程。其次,制霉菌素抑制的小窝蛋白介导的摄取途径也受到影响,相对摄取率约为72.4%。显而易见的是,叠氮钠作为能量代谢抑制剂,抑制效果最为突出,相对吸收率下降至 48.5%,说明细胞摄取胶束时需要消耗ATP,这也可侧面抑制P-gp外排。最后,盐酸阿米洛利抑制的大胞饮作用介导的内吞作用中,摄取率约为92.3%,对于细胞的摄取无明显抑制作用,表明摄取过程中可能不会有巨噬细胞的增多。由此表明,BC-QT-PTX可以通过多种途径被摄取,进入肠道上皮细胞。
生物利用度测试
方法:将18只雄性SD大鼠随机分为以下3组(n=6),并接受相同口服剂量的不同配方的PTX:(1)PTX(20mg/kg PTX);(2)紫杉醇+维拉帕米(20 mg/kg PTX+25mg/kg维拉帕米);(3)载有PTX的BC-QT-PTX胶束(20mg/kg PTX)。所有口服制剂均在给药前用水稀释。口服后0.25、0.5、0.75、1、2、4、 6、8、12和24h从眼眶后神经丛采集血样(0.5mL)于带有肝素钠的离心管中,然后以10,000rpm离心将上清液血浆级分保存在-20℃直至分析。
通过HPLC测定PTX的血浆浓度。精密吸取每个时间点的血浆200μL,在血浆中加入0.8mL甲醇-乙腈(1:1)混合溶液,涡旋5min,有效沉淀血浆中的蛋白,超声20min,充分提取每个血浆样品中的PTX。为了将血浆中的PTX进行浓缩,将得到的甲醇-乙腈溶液在温和的氮气流动下蒸发干燥,得到残渣,再向残渣中加入100μL甲醇重新分散,涡旋3min后再超声10min,待残渣被充分溶解后,将残渣的甲醇溶液在10000r/min下离心10min,然后取10μL上清液注入HPLC系统中,测定并计算该时间点下的血药浓度结果:大鼠口服PTX,PTX+VRP和BC-QT-PTX后血浆中PTX的浓度与时间曲线如图9所示,药代动力学参数总结在表1中。PTX的Cmax值为0.19μg/mL, AUC0-24h为1.83mg/L*h。PTX与VRP共同给药后,PTX的血药浓度和生物利用度明显增加,它们分别是0.25μg/mL和2.28mg/L*h,Tmax为2h,表明VRP 降低了P-gp的外排作用,增加了PTX在肠道中的吸收。而BC-QT-PTX胶束的 Cmax(1.02μg/mL)和AUC0-24h(7.62mg/L*h)分别是原药PTX的5.36和4.16倍。这在于BC-QT胶束赋予了PTX较小的粒径和亲水外壳,在消化液中具有更高的饱和溶解度,使胃肠道与血液之间的药物浓度梯度增加,提高PTX的吸收。其次,可以看到,胶束负载的紫杉醇的Tmax值为2h,造成延迟的原因可能在于胶束可以远离P-gp的识别和QT对P-gp产生了一定的抑制作用。与此同时, BC-QT共聚物的生物粘附性,让PTX在肠道停留更长的时间,从而导致清除率 (CLz/F)降低。总体而言,BC-QT聚合物通过增加溶解度和渗透性提高了PTX 的生物利用度。
表3房室模型参数
聚合物胶束体内分布监测
方法:(1)模型鼠的建立:雌性C57BL/6小鼠的体重约为20-25g,年龄为 8-12周,用于体内分布和治疗研究。将它们放在SPF条件下的通风聚丙烯笼中,平均温度为22℃,每天暴露于12h的光照和12h的黑暗中。所有小鼠随意接受食物和水的标准实验室饮食。在实验前使动物适应至少1周。通过皮下注射在小鼠右侧腋下植入107个LLC细胞。当肿瘤体积达到约150mm3时,作为模型鼠进行体内分布检测和肿瘤治疗。
(2)体内观测:将PTX和DiR以质量比25:1溶解在乙醇中,缓慢滴加入 1mg/mL的BC-QT溶液中,冰浴超声20min,黑暗中将乙醇挥发,离心除去游离的PTX和染料,上清液冻干后测定染料DiR的含量。将小鼠随机分为2组(n =3),实验前断食12h,自由喂水。将游离的DiR和BC-QT-PTX/DiR用生理盐水分散或溶解,以1mg/kg DiR的剂量通过口服方式给药,给药体积不超过200 μL。按照预设的时间点1、2、4、6、8、12、24和48h将小鼠麻醉,通过IVIS LuminaSeries III活体成像系统,记录小鼠全身的荧光成像情况。实验结束后,取出小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和肿瘤,用于体外的成像和定量分析。使用Living Image软件进行定量分析,所有小鼠均在同一台仪器和相同的设置下,在780nm激发波长下所获成像图。DiR的荧光强度用于计算负载PTX 的胶束的生物分布。
结果:C57BL/6荷瘤小鼠灌胃BC-QT-PTX/DiR胶束,游离的DiR作为对照以便使用IVIS进行成像。LLC细胞荷瘤鼠的全身成像如图10A所示,口服游离DiR的荷瘤小鼠的腹部区域在1h有明显的的荧光,随着时间的增加,荧光逐渐变弱。相比之下,口服BC-QT-PTX/DiR胶束的小鼠腹部荧光在2h达到峰值,解剖后胃肠道的荧光图像(图10B)中可以看到,由于BC-QT胶束的粘附作用,增加了药物在消化系统中的停留时间,将进一步促进药物在肠道中的吸收,这与生物利用度的测试结果相符。之后两组小鼠腹部区域的荧光由于吸收或消除作用逐渐脱离胃肠系统。但在12h内,口服胶束的小鼠全身整体荧光仍可以维持较高的强度(图10D),这归因于进入血液的游离DiR分子可以迅速从体内清除。而经过胶束负载后的DiR延长了在体内的循环时间。这暗示胶束负载后的PTX,通过EPR效应可有效的在肿瘤部中进行积累,以达到更好的治疗效果。整体成像结束后,将小鼠进行解剖,在小鼠的离体心脏、肝脏、脾脏、肺、肾和肿瘤中观察到荧光(图10C),意味着被吸收的BC-QT-PTX/DiR胶束迁移到了这些器官。值得注意的是,与胶束负载的DiR相比,游离的DiR在内脏器官中具有较高的荧光强度,尤其是肝脏和脾脏(图10E),这可能是由两个原因造成的。首先,荧光成像是平面的,体内深层器官或组织被采集的信号将会衰减很多,所以在整体成像过程中不能很好的定位荧光的分布。其次,已经进入肝脏和脾脏等一些组织或器官的DiR分子可能在体内停留的时间更长。在 BC-QT-PTX/DiR从离体的肿瘤组织中可以看到明显的荧光,游离DiR的小鼠肿瘤区域的荧光强度保持较弱,表明游离的DiR不能自行在肿瘤中积累,且在肝脏的代谢过程中,更多的被排除体外。
紫杉醇聚合物胶束抗肿瘤作用
方法:(1)诱导肿瘤细胞的凋亡研究:细胞凋亡由Annexin V-FITC/PI试剂盒对药物处理后的细胞进行双染色确定。将LLC细胞以每孔2×105个细胞的密度接种在6孔板中。培养12h后,除去原有培养基,加入含有PTX、PTX+VRP 和BC-QT-PTX纳米胶束的新鲜培养基,PTX的浓度为50μg/mL。分别孵育24h 后,除去孔板中的培养基,PBS洗涤细胞2次,加入适量不含EDTA的胰酶细胞消化液进行细胞消化。室温孵育至轻轻吹打可以使细胞脱落,吸取消化液,加入新鲜培养基停止消化。转移至离心管内,1500r/min离心5min,弃去上清。按照试剂盒说明书对细胞进行染色处理,然后通过流式细胞仪进行检测。
(2)C57BL/6荷瘤小鼠抗肿瘤治疗:小鼠模型的建立与体内分布研究相同。选择35只模型荷瘤鼠,将小鼠随机分为7组(n=5)。并接受相同口服剂量的不同配方的PTX进行治疗:(1)生理盐水组;(2)BC-QT空白胶束组;(3)PTX 低剂量+VRP(PTX/L+VRP,5mg/kg PTX+25mg/kg VRP);(4)PTX低剂量组 (PTX/L,5mg/kg PTX);(5)PTX高剂量组(PTX/H 20mg/kgPTX);(6)载有PTX的BC-QT-PTX胶束低剂量组(BC-QT-PTX/L,5mg/kg PTX);(7)载有PTX的BC-QT-PTX胶束高剂量组(BC-QT-PTX/H,20mg/kg PTX)。每隔一天直到21天。同时监测肿瘤体积和小鼠体重。通过等式V=(L×W2)/2计算肿瘤体积,其中L代表垂直于长度的最长直径,W代表垂直于长度的最短直径。治疗结束后,用4%的多聚甲醛溶液进行灌注,收集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、以及肿瘤组织,清洗干净后浸泡于4%的多聚甲醛溶液,石蜡包埋。组织切片用苏木精和伊红(H&E)染色,然后研究抗肿瘤作用和体内不同PTX制剂的安全性。
结果:图11中,处理24h后,空白组凋亡率8.74%,暴露于PTX、PTX+VRP 和BC-QT-PTX纳米胶束的细胞凋亡率分别是23.52%,22.81%和84.89%,我们观察到加入P-gp抑制剂VRP增加PTX在细胞中的积累,提高抗癌效率,但 BC-QT-PTX组表现出最高的诱导细胞凋亡能力。首先,BC-QT聚合物因其具有亲水外壳可以减少P-gp的流出作用,同时BC-QT-PTX胶束粒子直径较小,更易于细胞的摄取,并通过缓释功能进一步降低P-gp的外排效率。
图12中,药物治疗组均显示出对肿瘤生长的显著抑制,肿瘤体积明显小于生理盐水组。我们在治疗组中设计了PTX低剂量和高剂量组,当PTX从低剂量增加至高剂量时,肿瘤的生长速度所减慢,但肿瘤体积的变化没有显著性差异。在PTX低剂量的基础上,加入商品化的P-gp抑制剂VRP来考察P-gp在外排作用上对PTX吸收的影响。可以发现,PTX/L+VRP组的肿瘤增长趋势比单一的 PTX/L组减缓很多,甚至低于PTX/H组。这样的结果表明,口服的PTX会受到肠道表皮细胞上P-gp的外排泵作用,影响在消化道中的吸收,阻碍了PTX进入体内循环,降低了抗癌功效。BC-QT-PTX/L组与PTX/L+VRP组的肿瘤增长速度相差无几,这表明,BC-QT-PTX提高了紫杉醇的生物利用度后也提高了抗肿瘤作用。提高胶束治疗剂量,BC-QT-PTX/H表现出最强的抑制肿瘤生长效果,小鼠体内的肿瘤生长速度基本得到控制,与盐水相比,效果鲜明。
治疗21天后,取出小鼠体内肿瘤,评价肿瘤生长抑制效果。可以清楚看到 BC-QT-PTX成功抑制了肿瘤的生长。另外,通过肿瘤体积计算各组的肿瘤抑制率如表2所示,PTX/L+VRP、PTX/L、PTX-H、BC-QT-PTX/L和BC-QT-PTX/H 组的最终肿瘤抑制率分别是64.27%、47.94%、58.67%、68.06和93.54%。
表2不同治疗组的肿瘤抑制率
在治疗21天后,切下肿瘤以进行病理检查。来自不同组小鼠的代表性组织切片显示在图13中。生理盐水组表现出肿瘤细胞如大细胞的典型病理特征。相反,其他PTX制剂显示出大量的癌细胞缓解,例如肿瘤凝结坏死,细胞核碎裂和细胞间空白。与其他组相比,BC-QT-PTX纳米胶束组表现出最有效的抗肿瘤活性,为该制剂在体内的有效抗肿瘤活性提供了实质性证据。
通过研究体重、总体健康状况、行为和特定器官的组织病理学来评估所有治疗组的安全性。在过程中,发现PTX组的小鼠活动量较小,背部毛发多呈现聚集状态,没有光泽,腹部毛发较少,但胶束治疗组未观察到类似现象。图14 中,PTX/H组的小鼠体重在前三天明显减轻,同时,BC-QT-PTX胶束两组中,治疗动物体重无明显变化。但PTX低剂量与维拉帕米的联合给药中,15天以后出现了明显的毒副作用,体重下降较快。这些结果表明,BC-QT-PTX显著降低了PTX在体内的毒性,同时增加其治疗效果。肾脏和肝脏的组织学研究显示没有与任何基于偶联物的治疗相关的病理组织变化(图15),证实了BC-QT-PTX 的体内安全性。与盐水组相比,空白BC-QT胶束和BC-QT-PTX纳米胶束组的小鼠心脏,肝脏,脾脏,肺和肾脏胞浆与细胞核分界明显,细胞排列紧凑,没有发现明显的损伤和病变特征。而PTX/H和PTX/L+VRP组内,肝脏细胞受损,细胞核减少,并且脾脏的切片中发现少量的出血点。BC-QT-PTX可以降低对正常细胞的毒副作用,同时提高PTX的抗肿瘤疗效。
这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
尽管本发明的实施例已经公开如上,但它仅仅是本发明一部分实施方案,而不是全部实施例,还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例,这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (9)
1.一种可供口服的紫杉醇-聚合物胶束及其制备方法,其特征在于,以细菌纤维素-槲皮素两亲性聚合物作为口服给药胶束,以紫杉醇为模型药物,制备方法包括:将细菌纤维素-槲皮素溶于水中,紫杉醇溶于乙醇中,两相混合,超声后,除去乙醇,离心,上清液冻干,即得紫杉醇口服胶束。
2.如权利要求1所述的口服的紫杉醇-聚合物胶束及其制备方法,其特征在于,聚合物与紫杉醇的质量比为10:0.5~10:3.5,聚合物的浓度为0.05~2.5mg/mL。
3.如权利要求1所述的口服的紫杉醇-聚合物胶束及其制备方法,其特征在于,紫杉醇口服胶束的粒径为90~150nm,紫杉醇的含量为5~28wt%。
4.如权利要求1所述的口服的紫杉醇-聚合物胶束及其制备方法,其特征在于,超声功率为45~540W,时间为5~35min。
5.如权利要求1所述的口服的紫杉醇-聚合物胶束及其制备方法,其特征在于,离心速度3000-5000rpm,时间为5~15min。
6.如权利要求1中所述的聚合物,其特征在于,细菌纤维素-槲皮素两亲性聚合物的亲水端为细菌纤维素,疏水端为槲皮素,制备方法包括:以琥珀酸酐对槲皮素进行羟基羧基化,按照比例将槲皮素和琥珀酸酐溶解在二甲基亚砜(DMSO)中,40℃水浴反应12h;在通过1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)作用下使羧基反应活性增强,与细菌纤维素的羟基酯化反应;结束后,将反应液滴加入乙醇中,搅拌,离心,获得沉淀物再用乙醇清洗,所得固形物溶解于水中,离心除去不溶物,上清液冻干后获得细菌纤维素-槲皮素聚合物。
7.如权利要求6中所述的聚合物,其特征在于,参与反应的细菌纤维素溶剂在在四丁基醋酸铵(TBAA)与二甲基亚砜(DMSO)体系中,TBAA的质量分数为8%-40%。
8.如权利要求6中所述的聚合物,其特征在于,1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)的比列为摩尔比1:0.5~1:1.5。
9.如权利要求6中所述的聚合物,其特征在于,细菌纤维素与槲皮素的的摩尔比为1:0.5~1:3.5。
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