CN114377141B - 一种药物递送载体及其抗肿瘤应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种药物递送载体及其抗肿瘤应用。具体地，本发明提供一种递送载体，其特征在于，所述的递送载体包括纳米粒和白蛋白，所述纳米粒的纳米材料包括PEG‑PCL‑PEI；所述的白蛋白修饰所述纳米粒。本发明所述的递送载体能够用于负载药物形成载药纳米颗粒的药物复合物，所述的载药纳米颗粒能够有效地通过胞吞和胞吐转运作用从肿瘤血管渗入到肿瘤部位，能够有效的被肿瘤细胞吸收和摄取，具有溶酶体逃逸和避免溶酶体降解能力，具有优异的长时间血液清除半衰期和系统生物安全性高等优势，能够显著提高药物的抗肿瘤效果。

Description

一种药物递送载体及其抗肿瘤应用
技术领域
本发明涉及药物领域，具体涉及一种药物递送载体及其抗肿瘤应用。
背景技术
肿瘤严重威胁生命健康，对抗肿瘤药物及其递送载体的研究成为当今的研究热点。
现有的抗癌药物的抗肿瘤效果差的重要原因是由于抗癌药物的肿瘤血管渗透性差和难以被肿瘤细胞吸收和摄取等等原因，从而大大限制了抗肿瘤药物的治疗效果。尤其是对血管低渗透性的肿瘤，由于肿瘤血管内皮细胞组织良好且紧密堆积，血管内皮细胞间隙小，即便是药物递送到这些肿瘤的血管时，由于药物受到组织良好且紧密堆积的肿瘤血管内皮细胞的阻碍，难以有效的透过血管内皮细胞间隙到达肿瘤部位微环境中，因此，现有的抗肿瘤药物在用于治疗血管渗透性低肿瘤时，通过传统的肿瘤通透性和滞留效应(Enhanced Permeability and Retention，EPR effect)无法有效从肿瘤血管的间隙渗透到肿瘤部位，进而无法有效的发挥抗肿瘤效果。此外，对肿瘤而言，即便抗肿瘤药物从肿瘤血管渗透进入肿瘤部位，然而肿瘤细胞对抗肿瘤药物的吸收和摄取能力，导致抗肿瘤效果降低，从而无法有效的发挥药物的抗肿瘤效果。还有，抗肿瘤药物容易在溶酶体中聚集，且溶酶体中的多种酶将药物降解，降低药物在肿瘤细胞内的稳定性，从而降低药物的抗肿瘤效果。
虽然纳米载体为化疗药物提供了许多替代策略，然而，现有载药纳米颗粒存在许多缺点，例如，在静脉注射给药后，容易发生突然释放且血液循环时间短，从而产生较大的系统性副作用、生物安全性低如容易发生溶血和无法有效的在肿瘤部位聚集，此外，现有载药纳米颗粒也无法有效通过EPR effect从肿瘤血管间隙渗透进入肿瘤部位(尤其是对于血管低渗透性肿瘤)且肿瘤对载药纳米颗粒摄取能力差，从而无法有效实现抗肿瘤效果。还有，现有载药纳米颗粒也容易在溶酶体中聚集，溶酶体中的多种酶将纳米颗粒及其负载的药物降解，降低药物在肿瘤细胞内的稳定性，从而降低药物的抗肿瘤效果。
因此，本领域迫切需要开发一种提高抗肿瘤药物治疗效果的递送载体。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高抗肿瘤药物治疗效果的递送载体。
本发明的第一方面提供一种递送载体，所述的递送载体包括纳米粒和白蛋白，所述纳米粒的纳米材料包括PEG-PCL-PEI；
所述的白蛋白修饰所述纳米粒。
优选地，所述的白蛋白修饰在所述纳米粒的表面。
优选地，所述的白蛋白修饰在所述纳米材料上。
优选地，所述的PEG-PCL-PEI为纳米粒的双亲性纳米材料。
优选地，所述的PEG-PCL-PEI的结构如下：
Figure BDA0003487130440000021
优选地，所述m为30-60，较佳地35-55，更佳地40-50，更佳地43-47。
优选地，所述n为40-80，较佳地50-70，更佳地55-65，更佳地56-62，更佳地56-60。
优选地，所述y为35-48，较佳地35-45，更佳地37-45，更佳地39-43，更佳地40-42。
优选地，所述PEG的分子量为1500-2500，较佳地1800-2200，更佳地1900-2100，更佳地2000。
优选地，所述PEG-PCL的分子量7000-8400，较佳地7400-8000，更佳地7500-7900，更佳地7600-7800，更佳地7700。
优选地，所述PEI的分子量为1200-2500，较佳地1300-2300，更佳地1600-2000，更佳地1700-1900，更佳地1800。
优选地，所述的PEG-PCL-PEI为8500-12000，较佳地9000-11000，更佳地9200-10000，更佳地9300-9800，更佳地9400-9600，最佳地9500。
优选地，所述的PEG-PCL-PEI的PDI为0.8-1.2，较佳地1.0-1.2，更佳地1.05-1.13，最佳地1.08。
优选地，所述的PEG-PCL-PEI的CMC为0.7-0.74nM，较佳地0.71-0.73，最佳地0.723。
优选地，所述的PEG-PCL-PEI通过实施例1所述的方法制备。
优选地，所述的PEG-PCL-PEI的的1H-NMR如说明书图1E所示。
优选地，所述纳米粒的纳米材料还包括泊洛沙姆。
优选地，所述的泊洛沙姆为纳米粒的双亲性纳米材料。
优选地，所述泊洛沙姆选自下组：泊洛沙姆F68、泊洛沙姆188，或其组合。
优选地，所述的白蛋白包括血清白蛋白。
优选地，所述的白蛋白来源于人或非人哺乳动物。
优选地，所述的非人哺乳动物包括小鼠、大鼠、狗、兔、羊、牛。
优选地，所述的递送载体包括用于递送药物的递送载体。
优选地，所述的药物包括抗肿瘤药物。
优选地，所述的药物包括负电荷药物。
优选地，所述的抗肿瘤药物包括化药和/或基因药物。
优选地，所述的抗肿瘤药物包括被溶酶体酶降解的药物。
优选地，所述的抗肿瘤药物的作用靶点在细胞质内或细胞核内。
优选地，所述的抗肿瘤药物包括三氧化二砷。
优选地，所述的药物包括基因。
优选地，所述的递送载体包括基因递送载体。
优选地，所述的基因选自下组：DNA、RNA，或其组合。
优选地，所述的基因包括TRAIL(肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体)基因。
优选地，所述的肿瘤包括人源肿瘤(如人肿瘤)。
优选地，所述的肿瘤包括低渗透性肿瘤。
优选地，所述的肿瘤包括肿瘤血管低渗透性的肿瘤。
优选地，所述的肿瘤包括实体瘤。
优选地，所述的肿瘤包括肿瘤血管低渗透性的实体肿瘤。
优选地，所述的肿瘤包括肝癌。
优选地，所述的肿瘤包括人肝癌。
优选地，所述的肝癌的癌细胞包括HuH7细胞和/或HepG2细胞。
优选地，所述的肿瘤包括胰腺癌。
优选地，所述的肿瘤包括肿瘤通透性和滞留效应(Enhanced Permeability andRetention，EPR effect)差的肿瘤。
优选地，所述的肿瘤血管低渗透性包括药物从肿瘤血管渗透到达肿瘤部位低。
优选地，所述的肿瘤血管低渗透性包括药物从肿瘤血管内皮细胞间隙渗透到达肿瘤部位低。
优选地，所述的肿瘤血管低渗透性的肿瘤血管包括选自下组的一种或多种特征：
(a)所述的肿瘤的血管内皮细胞组织良好且紧密堆积；和/或
(b)肿瘤的血管内皮细胞间隙小。
优选地，所述的药物负载在所述纳米粒中。
优选地，所述的药物包括通过肿瘤血管内皮细胞间隙渗透到达肿瘤部位的药物。
优选地，所述的药物仅仅通过肿瘤血管内皮细胞间隙渗透到达肿瘤部位的药物。
优选地，所述的药物仅仅通过被动扩散从肿瘤血管内皮细胞间隙渗透到达肿瘤部位的药物。
优选地，所述的药物仅仅通过通透性和滞留效应(Enhanced Permeability andRetention，EPR effect)从肿瘤血管内皮细胞间隙渗透到达肿瘤部位的药物。
优选地，所述的纳米粒为核-壳结构。
优选地，所述的纳米粒包括PEG-PCL-PEI形成的核壳结构。
优选地，所述的纳米粒包括PEG-PCL-PEI自组装形成的核壳结构。
优选地，所述的纳米粒包括PEG-PCL-PEI和泊洛沙姆形成的核壳结构。
优选地，所述的纳米粒包括PEG-PCL-PEI和泊洛沙姆自组装形成的核壳结构。
优选地，所述的PEG-PCL-PEI为10-30重量份，较佳地15-25重量份，更佳地18-22重量份，最佳地20重量份。
优选地，所述的泊洛沙姆为40-60重量份，较佳地45-55重量份，更佳地48-52重量份，最佳地50重量份。
优选地，所述的PEG-PCL-PEI与所述泊洛沙姆的重量比为1:1-5，较佳地1:2-4，更佳地1:2-3，更佳地1:2.3-2.7，最佳地1:2.5。
优选地，所述的白蛋白为10-30重量份，较佳地15-25重量份，更佳地18-22重量份，最佳地20重量份。
优选地，所述的白蛋白与所述泊洛沙姆的重量比为1:1-5，较佳地1:2-4，更佳地1:2-3，更佳地1:2.3-2.7，最佳地1:2.5。
本发明的第二方面提供一种制备如本发明第一方面所述的递送载体的方法，所述的方法包括步骤：
(1)将PEG-PCL-PEI溶解在有机溶剂中，得到有机相；
(2)将有机相与水相混合，除去有机溶剂，得到分散液；
(3)将分散液与白蛋白水溶液混合后，搅拌混合，得到递送载体。
优选地，所述步骤(1)中，所述的有机溶剂选自下组：丙酮、甲醇，或其组合。
优选地，所述步骤(1)中，所述的有机溶剂包括丙酮和甲醇。
优选地，所述的丙酮与甲醇的体积比为0.5-5：1，较佳地1-3:1，最佳地2:1。
优选地，所述步骤(1)中，所述的有机相中，PEG-PCL-PEI的浓度为5-15mg/ml，较佳地8-12mg/ml，最佳地10mg/ml。
优选地，所述步骤(2)中，所述的水相与所述有机相的体积比为2-8：1，较佳地3-7：1，更佳地5:1。
优选地，所述步骤(2)中，所述的水相用碱调节pH＝9-11，较佳地9.5-10.5，更佳地10。
优选地，所述的碱包括氢氧化钠。
优选地，所述的碱包括0.8-0.12mM氢氧化钠。
优选地，所述步骤(2)中，所述的水相包括水。
优选地，所述步骤(2)中，所述的水相包括水和泊洛沙姆。
优选地，所述的水相中，所述泊洛沙姆的含量为0.1-1.0wt％，较佳地0.3-0.7wt％，最佳地0.5wt％，以水相的重量计。
优选地，所述步骤(2)中，有机相与水相混合是在搅拌条件下进行混合。
优选地，所述步骤(2)中，将有机相与水相混合，用酸调节混合液的pH至7.2-7.6(较佳地7.4)，除去有机溶剂，得到分散液。
优选地，所述的酸包括盐酸。
优选地，所述的酸包括0.8-0.12mM盐酸。
优选地，所述步骤(3)中，所述分散液与所述白蛋白水溶液的体积比为0.5-1.5：0.5-1.5，较佳地0.8-1.2：0.8-1.2，最佳地1:1。
优选地，所述步骤(3)中，所述白蛋白水溶液中，所述白蛋白的浓度为0.8-5mg/ml，更佳地1-3mg/ml，更佳地1.5-2.5mg/ml，最佳地2mg/ml。
本发明的第三方面提供一种如本发明的第一方面所述的递送载体的用途，用于制备负载药物的药物复合物，所述的递送载体用于：(i)促进药物复合物跨肿瘤血管渗透；(ii)促进药物复合物在肿瘤细胞部位的富集和/或渗透；(iii)促进药物复合物被肿瘤细胞吸收和摄取；(iv)改善药物复合物和/药物被肿瘤细胞溶酶体的降解；(v)增强药物复合物对肿瘤治疗效果；和/或(vi)提高药物复合物的血液清除半衰期。
优选地，所述的药物复合物为载药纳米颗粒。
优选地，所述的药物负载在所述递送载体中
优选地，所述的药物负载在所述纳米粒中。
优选地，所述的药物的重量份为0.2-2重量份，较佳地0.5-1.5重量份，更佳地0.8-1.2重量份，最佳地1重量份。
优选地，所述的PEG-PCL-PEI与所述药物的重量比为10-30:1，较佳地15-25:1，更佳地18-22:1，最佳地20:1。
优选地，所述的药物复合物的粒径为80-120nm，较佳地90-110nm，更佳地90-105nm。
优选地，所述的药物复合物的电位为-20至-1mv，较佳地-15至-5mv。
优选地，所述的改善包括避免、降低、克服和/或抑制。
优选地，所述的治疗包括靶向治疗。
优选地，所述的(i)促进药物复合物跨肿瘤血管渗透包括促进药物复合物跨肿瘤血管渗透进入肿瘤部位。
优选地，所述的(i)促进药物复合物跨肿瘤血管渗透包括促进药物复合物通过胞吞和/或胞吐转运作用跨肿瘤血管渗透。
优选地，所述的(i)促进药物复合物跨肿瘤血管渗透包括促进药物复合物通过胞吞和/或胞吐转运作用跨肿瘤血管渗透进入肿瘤部位。
优选地，所述的递送载体用于：改善药物复合物和/药物被肿瘤细胞溶酶体的降解，增强药物复合物和/药物在在肿瘤细胞内稳定性。
优选地，所述的药物包括抗肿瘤药物。
优选地，所述的药物包括负电荷药物。
优选地，所述的抗肿瘤药物包括化药和/或基因药物。
优选地，所述的抗肿瘤药物包括被溶酶体酶降解的药物。
优选地，所述的抗肿瘤药物的作用靶点在细胞质内或细胞核内。
优选地，所述的抗肿瘤药物包括三氧化二砷。
优选地，所述的药物包括基因。
优选地，所述的递送载体包括基因递送载体。
优选地，所述的基因选自下组：DNA、RNA，或其组合。
优选地，所述的基因包括TRAIL(肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体)基因。
优选地，所述的药物负载在所述纳米粒中。
优选地，所述的肿瘤包括人源肿瘤(如人肿瘤)。
优选地，所述的肿瘤包括低渗透性肿瘤。
优选地，所述的肿瘤包括肿瘤血管低渗透性的肿瘤。
优选地，所述的肿瘤包括实体瘤。
优选地，所述的肿瘤包括肿瘤血管低渗透性的实体肿瘤。
优选地，所述的肿瘤包括肝癌。
优选地，所述的肿瘤包括人肝癌。
优选地，所述的肝癌的癌细胞包括HuH7细胞和/或HepG2细胞。
优选地，所述的肿瘤包括胰腺癌。
优选地，所述的肿瘤包括肿瘤通透性和滞留效应(Enhanced Permeability andRetention，EPR effect)差的肿瘤。
优选地，所述的肿瘤血管低渗透性包括药物从肿瘤血管渗透到达肿瘤部位低。
优选地，所述的肿瘤血管低渗透性包括药物从肿瘤血管内皮细胞间隙渗透到达肿瘤部位低。
优选地，所述的肿瘤血管低渗透性的肿瘤血管包括选自下组的一种或多种特征：
(a)所述的肿瘤的血管内皮细胞组织良好且紧密堆积；和/或
(b)肿瘤的血管内皮细胞间隙小。
优选地，所述的药物包括通过肿瘤血管内皮细胞间隙渗透到达肿瘤部位的药物。
优选地，所述的药物仅仅通过肿瘤血管内皮细胞间隙渗透到达肿瘤部位的药物。
优选地，所述的药物仅仅通过被动扩散从肿瘤血管内皮细胞间隙渗透到达肿瘤部位的药物。
优选地，所述的药物仅仅通过通透性和滞留效应(Enhanced Permeability andRetention，EPR effect)从肿瘤血管内皮细胞间隙渗透到达肿瘤部位的药物。
优选地，所述的药物复合物的剂型为固体制剂、液体制剂或半固体制剂。
优选地，所述的药物复合物的剂型为注射制剂、口服制剂或外用制剂。
优选地，所述的注射制剂为注射制剂。
优选地，所述的注射制剂为静脉注射制剂或动脉注射制剂。
优选地，静脉注射制剂为头静脉注射制剂、手背静脉注射制剂或足背静脉注射制剂。
本发明的第四方面提供一种药物复合物，所述的药物复合物包括如本发明的第一方面提供所述的递送载体；和药物。
优选地，所述的药物复合物为载药纳米颗粒。
优选地，所述的药物负载在所述递送载体中
优选地，所述的药物负载在所述纳米粒中。
优选地，所述的药物的重量份为0.2-2重量份，较佳地0.5-1.5重量份，更佳地0.8-1.2重量份，最佳地1重量份。
优选地，所述的PEG-PCL-PEI与所述药物的重量比为10-30:1，较佳地15-25:1，更佳地18-22:1，最佳地20:1。
优选地，所述的药物复合物的粒径为80-120nm，较佳地90-110nm，更佳地90-105nm。
优选地，所述的药物复合物的电位为-20至-1mv，较佳地-15至-5mv。
优选地，所述的药物复合物的剂型为固体制剂、液体制剂或半固体制剂。
优选地，所述的药物复合物的剂型为注射制剂、口服制剂或外用制剂。
优选地，所述的注射制剂为静脉注射制剂或动脉注射制剂。
优选地，静脉注射制剂为头静脉注射制剂、手背静脉注射制剂或足背静脉注射制剂。
优选地，所述的药物包括抗肿瘤药物。
优选地，所述的药物包括负电荷药物。
优选地，所述的抗肿瘤药物包括化药和/或基因药物。
优选地，所述的抗肿瘤药物包括被溶酶体酶降解的药物。
优选地，所述的抗肿瘤药物的作用靶点在细胞质内或细胞核内。
优选地，所述的抗肿瘤药物包括三氧化二砷。
优选地，所述的药物包括基因。
优选地，所述的递送载体包括基因递送载体。
优选地，所述的基因选自下组：DNA、RNA，或其组合。
优选地，所述的基因包括TRAIL(肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体)基因。
优选地，所述的药物负载在所述纳米粒中。
优选地，所述的肿瘤包括人源肿瘤(如人肿瘤)。
优选地，所述的肿瘤包括低渗透性肿瘤。
优选地，所述的肿瘤包括肿瘤血管低渗透性的肿瘤。
优选地，所述的肿瘤包括实体瘤。
优选地，所述的肿瘤包括肿瘤血管低渗透性的实体肿瘤。
优选地，所述的肿瘤包括肝癌。
优选地，所述的肿瘤包括人肝癌。
优选地，所述的肝癌的癌细胞包括HuH7细胞和/或HepG2细胞。
优选地，所述的肿瘤包括胰腺癌。
优选地，所述的肿瘤包括肿瘤通透性和滞留效应(Enhanced Permeability andRetention，EPR effect)差的肿瘤。
优选地，所述的肿瘤血管低渗透性包括药物从肿瘤血管渗透到达肿瘤部位低。
优选地，所述的肿瘤血管低渗透性包括药物从肿瘤血管内皮细胞间隙渗透到达肿瘤部位低。
优选地，所述的肿瘤血管低渗透性的肿瘤血管包括选自下组的一种或多种特征：
(a)所述的肿瘤的血管内皮细胞组织良好且紧密堆积；和/或
(b)肿瘤的血管内皮细胞间隙小。。
优选地，所述的药物包括通过肿瘤血管内皮细胞间隙渗透到达肿瘤部位的药物。
优选地，所述的药物仅仅通过肿瘤血管内皮细胞间隙渗透到达肿瘤部位的药物。
优选地，所述的药物仅仅通过被动扩散从肿瘤血管内皮细胞间隙渗透到达肿瘤部位的药物。
优选地，所述的药物仅仅通过通透性和滞留效应(Enhanced Permeability andRetention，EPR effect)从肿瘤血管内皮细胞间隙渗透到达肿瘤部位的药物。
本发明的第五方面提供一种制备如本发明的第四方面所述的药物复合物的方法，所述的方法包括步骤：
(1)将PEG-PCL-PEI溶解在有机溶剂中，得到有机相；
(2)将有机相与水相混合后，除去有机溶剂，得到分散液；
(3)将分散液与白蛋白水溶液混合后，搅拌混合，得到递送载体。
优选地，所述步骤(2)中，所述的水相中含有药物。
优选地，所述步骤(2)中，所述的水相中，所述药物的浓度为0.01-1mg/ml，较佳地0.05-0.5mg/ml，更佳地0.05-0.3mg/ml，更佳地0.08-0.12mg/ml，最佳地0.1mg/ml。
优选地，所述的步骤(1)如上本发明第一方面所述。
优选地，所述的步骤(2)如上本发明第一方面所述。
优选地，所述的步骤(3)如上本发明第一方面所述。
本发明的第六方面提供一种制备如本发明的第四方面所述的药物复合物的用途，用于制备组合物，所述的组合物用于预防和/或治疗肿瘤。
优选地，所述的组合物为药物组合物。
优选地，所述的药物组合物还包括药学上可接受的载体。
优选地，所述的组合物为固体制剂、液体制剂或半固体制剂。
优选地，所述的组合物为注射制剂、口服制剂或外用制剂。
优选地，所述的注射制剂为注射制剂。
优选地，所述的注射制剂为静脉注射制剂或动脉注射制剂。
优选地，静脉注射制剂为头静脉注射制剂、手背静脉注射制剂或足背静脉注射制剂。
优选地，所述的肿瘤包括人源肿瘤(如人肿瘤)。
优选地，所述的肿瘤包括低渗透性肿瘤。
优选地，所述的肿瘤包括肿瘤血管低渗透性的肿瘤。
优选地，所述的肿瘤包括实体瘤。
优选地，所述的肿瘤包括肿瘤血管低渗透性的实体肿瘤。
优选地，所述的肿瘤包括肝癌。
优选地，所述的肿瘤包括人肝癌。
优选地，所述的肝癌的癌细胞为HuH7细胞和/或HepG2细胞。
优选地，所述的肿瘤包括胰腺癌。
优选地，所述的肿瘤包括肿瘤通透性和滞留效应(Enhanced Permeability andRetention，EPR effect)差的肿瘤。
优选地，所述的肿瘤血管低渗透性包括药物从肿瘤血管渗透到达肿瘤部位低。
优选地，所述的肿瘤血管低渗透性包括药物从肿瘤血管内皮细胞间隙渗透到达肿瘤部位低。
优选地，所述的肿瘤血管低渗透性的肿瘤血管包括选自下组的一种或多种特征：
(a)所述的肿瘤的血管内皮细胞组织良好且紧密堆积；和/或
(b)肿瘤的血管内皮细胞间隙小。。
优选地，所述的治疗包括抑制、减轻、缓解、逆转或根除。
本发明的第七方面提供一种组合物，所述的组合物包括如本发明的第一方面所述的递送载体、和/或如本发明的第四方面所述的药物复合物。
优选地，所述的组合物为药物组合物。
优选地，所述的药物组合物还包括药学上可接受的载体。
优选地，所述的组合物为固体制剂、液体制剂或半固体制剂。
优选地，所述的组合物为注射制剂、口服制剂或外用制剂。
优选地，所述的注射制剂为注射制剂。
优选地，所述的注射制剂为静脉注射制剂或动脉注射制剂。
优选地，静脉注射制剂为头静脉注射制剂、手背静脉注射制剂或足背静脉注射制剂。
本发明的第八方面提供一种预防和/或治疗肿瘤的方法，所述的方法包括步骤：
给所需对象施用如本发明的第四方面所述的药物复合物，从而预防和/或治疗肿瘤。
优选地，所述的对象为人或非人哺乳动物。
优选地，所述的非人哺乳动物为小鼠、大鼠、狗、兔、羊、牛。
优选地，所述的施用为注射施用、口服施用或外用施用。
优选地，所述注射施用为静脉施用或动脉施用。
优选地，所述注射施用为头静脉注射施用、手背静脉注射施用或足背静脉注射施用。
在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。
附图说明
图1为聚合物的合成和表证；图1A为聚合物PEG-PCL-PEI的合成路线；图1B-1E为各聚合物的1H-NMR图谱(图1B：PEG-PCL，图1C：PEG-PCL-COCHCH2，图1D：PEI，图1E：PEG-PCL-PEI)。
图2为聚合物的分子量和荧光探针Cy5标记的聚合物的荧光波谱强度；图2A为聚合物分子量分布曲线；图2B为荧光探针Cy5标记的聚合物荧光扫描图谱。
图3为系列浓度聚合物溶液中芘的荧光扫描图谱(图3A为PEG-PCL，图3B为PEG-PCL-PEI)和系列浓度聚合物(图3C为PEG-PCL，图3D为PEG-PCL-PEI)溶液中芘在I338/I333荧光强度比值和浓度对数值的趋势线。
图4为CATONP和AATONP颗粒的粒径、电位、形态和染料标记的荧光色谱；其中，图4A为CATONP颗粒的粒径和电位；图4B为CATONP颗粒的TEM图；图4C为Cy5标记的CATONP颗粒的荧光色谱；图4D为AATONP颗粒的粒径和电位；图4E为AATONP颗粒的TEM图；图4F为Cy5和Cy5.5标记的AATONP颗粒的荧光色谱。
图5为ATO-sol和AATONP颗粒在不同缓冲介质(pH＝7.4、6.0或5.0)中的药物ATO的释放曲线，其中，图5A为ATO-sol的释放曲线；图5B为AATONP颗粒的释放曲线。
图6为PEG-PCL-PEI、AATONP或CATONP颗粒对兔红细胞的溶血结果。
图7为HepG2细胞对AATONP、CATONP和ATO-sol的摄取。
图8为共聚焦激光扫描镜测定HepG2细胞对AATONPCy5的细胞摄取，其中，蓝色和绿色区域分别对应于用Hoechst 33342和
Figure BDA0003487130440000081
Green DND26染色的细胞核和溶酶体，红色荧光是AATONPCy5；比例尺＝50μm。
图9为MTT法测定AATONP、ATO-sol或空白NP对HuH7和HepG2肿瘤的抑制效果。
图10为荷瘤小鼠的血液清除和生物分布；其中，图10A为HuH7荷瘤小鼠尾静脉注射AATONPCy5或ATO-sol后血液中ATO浓度与时间的变化；图10B为ATO-sol和AATONPCy5在HuH7荷瘤小鼠中的各组织生物分布；图10C为在12h实验结束时，AATONPCy5在小鼠体内的荧光成像；图10D为在12h实验结束时，AATONPCy5给药小鼠的解剖的组织的荧光成像；*:P<0.05,**:P<0.01。
图11为AATONPCy5尾静脉注射后在HuH7荷瘤小鼠中的实时肿瘤血管外渗；其中，图11A为AATONPCy5尾静脉注射1h后，CLSM测定AATONPCy5在肿瘤和血管中的分布；图11B肿瘤血管的超微结构的TEM图。
图12为PBS、Genexol/PM、ATO-sol和AATONP的体内抗HuH7肿瘤活性及组织学检测；其中，图12A为PBS、Genexol/PM、ATO-sol和AATONP给药后，荷瘤小鼠的肿瘤体积随时间的变化；图12B为PBS、Genexol/PM、ATO-sol和AATONP给药后，荷瘤小鼠的体重随时间的变化；图12C为14天实验结束时，每组小鼠的皮下肿瘤的照片；图12D为14天实验结束时，PBS、Genexol/PM、ATO-sol和AATONP组小鼠解剖的肿瘤照片；图12E为14天实验结束时，PBS、Genexol/PM、ATO-sol和AATONP组小鼠解剖的肿瘤的重量；**:P<0.01,***:P<0.001。
图13为PBS、Genexol/PM、ATO-sol和AATONP治疗HuH7荷瘤小鼠后，HuH7肿瘤的组织病理学分析；其中图13A为不同组药物处理后的肿瘤的苏木精-伊红(H&E)染色，Ki67蛋白的免疫组织化学(IHC)染色和TdT介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)染色；图13B为不同组药物处理后的肿瘤经Ki67蛋白的免疫组织化学(IHC)染色后，肿瘤中Ki67的平均积分光密度(IOD)；图13C为不同组药物处理后的肿瘤经TUNEL染色后，肿瘤中TUNEL的平均荧光强度。比例尺＝100μm：*:P<0.05，***:P<0.001。
具体实施方式
本发明开发一种递送载体，所述的递送载体包括纳米粒和白蛋白，所述纳米粒的纳米材料包括PEG-PCL-PEI；所述的白蛋白修饰所述纳米粒。本发明所述的递送载体能够用于负载药物形成载药纳米颗粒的药物复合物，所述的载药纳米颗粒能够有效地通过胞吞和/或胞吐转运作用从肿瘤血管渗入的肿瘤部位，能够有效的被肿瘤细胞吸收和摄取，具有溶酶体逃逸和避免溶酶体降解能力，具有优异的长时间血液清除半衰期和系统生物安全性性高等优势，能够显著提高药物的抗肿瘤效果。
术语
如本文所用，术语“包括”、“包含”与“含有”可互换使用，不仅包括开放式定义，还包括半封闭式、和封闭式定义。换言之，所述术语包括了“由……构成”、“基本上由……构成”。
如本文所用，术语“HuH7细胞”是指肝癌细胞。
如本文所用，术语“HepG2细胞”是肝癌细胞。
如本文所用，术语“PEG”为聚乙二醇单甲醚。
如本文所用，术语“PCL”为聚己内酯。
如本文所用，术语“PEI”为聚乙烯亚胺。
如本文所用，术语“PEG-PCL-PEI”为聚乙二醇-聚己内酯-聚乙烯亚胺。
如本文所用，术语“CMC”是指临界胶束浓度。
如本文所用，术语“PDI”是聚合物分散性指数(Polymer dispersity index)。
如本文所用，术语“CLSM”是指激光扫描共聚焦显微镜。
如本文所用，术语“TEM”是指透射电子显微镜。
在本发明中，术语“预防”表示预防疾病和/或它的附随症状的发作或者保护对象免于获得疾病的方法。
本发明所述的“治疗”包括抑制、减轻、缓解、逆转或根除疾病的进展，并不需要100％抑制、消灭和逆转。在一些实施方案中，与不存在本发明所述的药物复合物时观察到的水平相比，本发明所述药物复合物将肿瘤及其并发症减轻、抑制和/或逆转了例如至少约10％、至少约30％、至少约50％、或至少约80％、或至少约90％、或至少约95％，或约100％。
在本发明中，术语“肿瘤”、“癌”和“癌症”可互换使用。
如本文所用，术语“IC50”是指半抑制浓度(50％inhibiting concentration)，即达到50％抑制效果时抑制剂的浓度。
药物
本发明所述的药物没有特别的限制，优选地，本发明所述的药物包括抗肿瘤。
本发明所述的药物可以包括负电荷药物。
在本发明的一个优选例中，所述的抗肿瘤药物包括化药和/或基因药物。
在本发明的一个优选例中，所述的抗肿瘤药物包括被溶酶体酶降解的药物。
在本发明的一个优选例中，所述的抗肿瘤药物的作用靶点在细胞质内或细胞核内。
代表性地，所述的抗肿瘤药物包括三氧化二砷。
代表性地，所述的药物包括基因。优选地，所述的基因选自下组：DNA、RNA，或其组合。优选地，所述的基因包括TRAIL(肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体)基因。
在本发明的一个优选例中，所述的药物包括通过肿瘤血管内皮细胞间隙渗透到达肿瘤部位的药物。
优选地，所述的药物仅仅通过肿瘤血管内皮细胞间隙渗透到达肿瘤部位的药物。
优选地，所述的药物仅仅通过被动扩散从肿瘤血管内皮细胞间隙渗透到达肿瘤部位的药物。
优选地，所述的药物仅仅通过通透性和滞留效应(Enhanced Permeability andRetention，EPR effect)从肿瘤血管内皮细胞间隙渗透到达肿瘤部位的药物。
肿瘤
本发明所述的肿瘤可以为人源肿瘤(如人肿瘤)或非人哺乳动物肿瘤。
在本发明的一个优选例中，所述的肿瘤包括低渗透性肿瘤。
在本发明的一个优选例中，所述的肿瘤包括肿瘤血管低渗透性的肿瘤。
在本发明的一个优选例中，所述的肿瘤包括实体瘤。
优选地，所述的肿瘤包括肿瘤血管低渗透性的实体肿瘤。
代表性地，所述的肿瘤包括肝癌。例如，所述的肿瘤包括人肝癌。
典型地，所述的肝癌的癌细胞包括HuH7细胞和/或HepG2细胞。
典型地，所述的肿瘤包括胰腺癌。
在本发明的一个优选例中，所述的肿瘤包括肿瘤通透性和滞留效应(EnhancedPermeability and Retention，EPR effect)差的肿瘤。
在本发明的一个优选例中，所述的肿瘤血管低渗透性包括药物从肿瘤血管渗透到达肿瘤部位低。
在本发明的一个优选例中，所述的肿瘤血管低渗透性包括药物从肿瘤血管内皮细胞间隙渗透到达肿瘤部位低。
在本发明的一个优选例中，所述的肿瘤血管低渗透性的肿瘤血管包括选自下组的一种或多种特征：
(a)所述的肿瘤的血管内皮细胞组织良好且紧密堆积；和/或
(b)肿瘤的血管内皮细胞间隙小。
递送载体、制备方法及其用途
本发明提供一种递送载体，所述的递送载体包括纳米粒和白蛋白，所述纳米粒的纳米材料包括PEG-PCL-PEI；
所述的白蛋白修饰所述纳米粒。
在本发明的一个优选例中，所述的白蛋白修饰在所述纳米粒的表面。例如，所述的白蛋白修饰在所述纳米材料上。
在本发明的一个优选例中，所述的PEG-PCL-PEI的结构如下：
Figure BDA0003487130440000111
优选地，所述m为30-60，较佳地35-55，更佳地40-50，更佳地43-47。
优选地，所述n为40-80，较佳地50-70，更佳地55-65，更佳地56-62，更佳地56-60。
优选地，所述y为35-48，较佳地35-45，更佳地37-45，更佳地39-43，更佳地40-42。
优选地，所述PEG的分子量为1500-2500，较佳地1800-2200，更佳地1900-2100，更佳地2000。
优选地，所述PEG-PCL的分子量7000-8400，较佳地7400-8000，更佳地7500-7900，更佳地7600-7800，更佳地7700。
优选地，所述PEI的分子量为1200-2500，较佳地1300-2300，更佳地1600-2000，更佳地1700-1900，更佳地1800。
优选地，所述的PEG-PCL-PEI为8500-12000，较佳地9000-11000，更佳地9200-10000，更佳地9300-9800，更佳地9400-9600，最佳地9500。
优选地，所述的PEG-PCL-PEI的PDI为0.8-1.2，较佳地1.0-1.2，更佳地1.05-1.13，最佳地1.08。
优选地，所述的PEG-PCL-PEI的CMC为0.7-0.74nM，较佳地0.71-0.73，最佳地0.723。
在本发明的一个优选例中，所述的PEG-PCL-PEI通过实施例1所述的方法制备。
在本发明的一个优选例中，所述的PEG-PCL-PEI的的1H-NMR如说明书图1E所示。
在本发明的一个优选例中，所述纳米粒的纳米材料还包括泊洛沙姆。
优选地，所述的泊洛沙姆为纳米粒的双亲性纳米材料。
优选地，所述泊洛沙姆选自下组：泊洛沙姆F68、泊洛沙姆188，或其组合。
在本发明的一个优选例中，所述的白蛋白包括血清白蛋白。
优选地，所述的白蛋白来源于人或非人哺乳动物。例如所述的非人哺乳动物包括小鼠、大鼠、狗、兔、羊、牛。
优选地，所述的递送载体包括用于递送药物的递送载体。
在本发明的一个优选例中，所述的药物负载在所述纳米粒中。
在本发明的一个优选例中，所述的纳米粒为核-壳结构。
代表性地，所述的纳米粒包括PEG-PCL-PEI形成的核壳结构。
代表性地，所述的纳米粒包括PEG-PCL-PEI自组装形成的核壳结构。
代表性地，所述的纳米粒包括PEG-PCL-PEI和泊洛沙姆形成的核壳结构。
代表性地，所述的纳米粒包括PEG-PCL-PEI和泊洛沙姆自组装形成的核壳结构。
在本发明的一个优选例中，所述的PEG-PCL-PEI为10-30重量份，较佳地15-25重量份，更佳地18-22重量份，最佳地20重量份。
在本发明的一个优选例中，所述的泊洛沙姆为40-60重量份，较佳地45-55重量份，更佳地48-52重量份，最佳地50重量份。
在本发明的一个优选例中，所述的PEG-PCL-PEI与所述泊洛沙姆的重量比为1:1-5，较佳地1:2-4，更佳地1:2-3，更佳地1:2.3-2.7，最佳地1:2.5。
在本发明的一个优选例中，所述的白蛋白为10-30重量份，较佳地15-25重量份，更佳地18-22重量份，最佳地20重量份。
在本发明的一个优选例中，述的白蛋白与所述泊洛沙姆的重量比为1:1-5，较佳地1:2-4，更佳地1:2-3，更佳地1:2.3-2.7，最佳地1:2.5。
本发明还提供一种本发明所述的递送载体的制备方法，所述的方法包括步骤：
(1)将PEG-PCL-PEI溶解在有机溶剂中，得到有机相；
(2)将有机相与水相混合，除去有机溶剂，得到分散液；
(3)将分散液与白蛋白水溶液混合后，搅拌混合，得到递送载体。
具体地，本发明所述的递送载体的制备方法如上本发明第一方面所述。
代表性地，本发明所述的递送载体通过如本发明实施例所述的方法制备。
本发明还提供一种本发明所述的递送载体的用途，用于制备负载药物的药物复合物，所述的递送载体用于：(i)促进药物复合物跨肿瘤血管渗透；(ii)促进药物复合物在肿瘤细胞部位的富集和/或渗透；(iii)促进药物复合物被肿瘤细胞吸收和摄取；(iv)改善药物复合物和/药物被肿瘤细胞溶酶体的降解；(v)增强药物复合物对肿瘤治疗效果；和/或(vi)提高药物复合物的血液清除半衰期。
优选地，所述的药物复合物为载药纳米颗粒。
优选地，所述的药物负载在所述递送载体中
优选地，所述的药物负载在所述纳米粒中。
优选地，所述的药物的重量份为0.2-2重量份，较佳地0.5-1.5重量份，更佳地0.8-1.2重量份，最佳地1重量份。
优选地，所述的PEG-PCL-PEI与所述药物的重量比为10-30:1，较佳地15-25:1，更佳地18-22:1，最佳地20:1。
在本发明的一个优选例中，所述的药物复合物的粒径为80-120nm，较佳地90-110nm，更佳地90-105nm。
在本发明的一个优选例中，所述的药物复合物的电位为-20至-1mv，较佳地-15至-5mv。
在本发明的一个优选例中，所述的改善包括避免、降低、克服和/或抑制。
在本发明的一个优选例中，所述的治疗包括靶向治疗。
在本发明的一个优选例中，所述的(i)促进药物复合物跨肿瘤血管渗透包括促进药物复合物跨肿瘤血管渗透进入肿瘤部位。
在本发明的一个优选例中，所述的(i)促进药物复合物跨肿瘤血管渗透包括促进药物复合物通过胞吞和/或胞吐转运作用跨肿瘤血管渗透。
优选地，所述的(i)促进药物复合物跨肿瘤血管渗透包括促进药物复合物通过胞吞和/或胞吐转运作用跨肿瘤血管渗透进入肿瘤部位。
在本发明的一个优选例中，所述的递送载体用于：改善药物复合物和/药物被肿瘤细胞溶酶体的降解，增强药物复合物和/药物在在肿瘤细胞内稳定性。
药物复合物、制备方法及其用途
本发明提供一种药物复合物，所述的药物复合物包括如本发明第一方面所述的递送载体；和药物。
在本发明的一个优选例中，所述的药物复合物为载药纳米颗粒。
在本发明的一个优选例中，所述的药物负载在所述递送载体中
在本发明的一个优选例中，所述的药物负载在所述纳米粒中。
在本发明的一个优选例中，所述的药物的重量份为0.2-2重量份，较佳地0.5-1.5重量份，更佳地0.8-1.2重量份，最佳地1重量份。
优选地，所述的PEG-PCL-PEI与所述药物的重量比为10-30:1，较佳地15-25:1，更佳地18-22:1，最佳地20:1。
优选地，所述的药物复合物的粒径为80-120nm，较佳地90-110nm，更佳地90-105nm。
优选地，所述的药物复合物的电位为-20至-1mv，较佳地-15至-5mv。
本发明还提供一种制备本发明所述的药物复合物的方法，所述的方法包括步骤：
(1)将PEG-PCL-PEI溶解在有机溶剂中，得到有机相；
(2)将有机相与水相混合后，除去有机溶剂，得到分散液；
(3)将分散液与白蛋白水溶液混合后，搅拌混合，得到递送载体。
优选地，所述步骤(2)中，所述的水相中含有药物。
具体地，所述的步骤(1)、(2)和(3)如上本发明第一方面所述。
本发明还提供一种制备本发明所述的药物复合物在用于预防和/或治疗肿瘤方面中的用途。
组合物和剂型
本发明还提供一种组合物，本发明所述的组合物可以包括本发明所述的递送载体、和/或本发明所述的药物复合物。
优选地，所述的组合物为药物组合物。本发明所述的药物组合物还可以包括药学上可接受的载体。
如本文所用“药学上可接受的载体”是指一种或多种相容性固体、半固体、液体或凝胶填料，它们适合于人体或动物使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”是指药物组合物中的各组分和药物的活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低药效。
应理解，在本发明中，所述的药学上可接受的载体没有特别的限制，可选用本领域常用材料，或用常规方法制得，或从市场购买得到。药学可接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙甲基纤维素、羧甲基纤维素钠等)、明胶、滑石粉、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油、等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如吐温)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、缓冲剂、螯合剂、增稠剂、pH调节剂、透皮促进剂、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、抑菌剂、无热原水等。
在本发明中，药物复合物和组合物的剂型包括但不限于口服制剂、注射制剂、外用制剂。代表性地，组合物的剂型包括但不限于片剂、注射剂、输液剂、膏剂、凝胶剂、溶液剂、微球、膜剂。
优选地，所述的注射制剂为注射制剂。
优选地，所述的注射剂为静脉注射制剂或动脉注射制剂。
优选地，静脉注射剂为头静脉注射制剂、手背静脉注射制剂或足背静脉注射制剂。
药物制剂应与给药方式相匹配，优选的给药方式为口服给药、注射给药(如瘤内注射)，使用时，是将治疗有效量的药物施用于所需对象(如人或非人哺乳动物)。如本文所用，术语“治疗有效量”，是指对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。本领域的普通技术人员应该理解，所述的“治疗有效量”可随着药物组合物的形式、给药途径、所用药物的辅料、疾病的严重程度以及与其他药物联合用药等情况的不同而有所不同。
活性成分的安全有效日使用剂量通常至少约0.1mg，而且在大多数情况下不超过约2500mg。较佳地，该剂量是1mg-500mg；当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是在熟练医师技能范围之内的。
本发明的主要优异技术效果包括：
1.本发明开发了一种递送载体，所述的递送载体能够用于负载药物形成载药纳米颗粒的药物复合物，所述的载药纳米颗粒能够有效地通过胞吞和/或胞吐转运作用从肿瘤血管渗入的肿瘤部位，载药纳米颗粒通过胞吞和/或胞吐转运作用从肿瘤血管外渗到肿瘤能够有效克服肿瘤血管内皮细胞组织良好且紧密堆积导致的抗肿瘤药物的肿瘤通透性和滞留效应(Enhanced Permeability and Retention，EPR effect)差带来的抗肿瘤药物难以有效的透过血管内皮细胞间隙到达肿瘤部位的问题，从而发挥和提高抗肿瘤药物对血管低渗透性(EPR effect差)的肿瘤治疗效果，因此，胞吞和/或胞吐转运作用能够显著提高载药纳米颗粒从血管低渗透性肿瘤的肿瘤血管渗透在肿瘤部位的能力，从而提高抗肿瘤药物在肿瘤部位的聚集和抗肿瘤(尤其是是血管低渗透性肿瘤)效果。
2.本发明所述的递送载体负载药物形成载药纳米颗粒的药物复合物能够有效的被肿瘤细胞吸收和摄取，进入肿瘤细胞，且有效地避免肿瘤溶酶体的滞留和降解，增强药物的抗肿瘤效果。
3.本发明所述的递送载体负载药物形成载药纳米颗粒的药物复合物进入肿瘤细胞内具有溶酶体逃逸和避免溶酶体降解能力，从而避免载药纳米颗粒及其负载的药物被溶酶体中的酶降解，增强载药纳米颗粒和药物在肿瘤细胞内稳定性，从而提高药物的抗肿瘤治疗效果。
4.本发明所述的递送载体负载药物形成载药纳米颗粒的药物复合物具有优异的长时间血液清除半衰期，且在血液中缓慢释放药物，不发生药物突释现象，有利于提高载药纳米颗粒在肿瘤血管部位的聚集，增强载药纳米颗粒通过胞吞和/或胞吐转运作用从肿瘤血管渗入的肿瘤部位。由于肿瘤血管内皮细胞组织良好且紧密堆积，载药纳米颗粒可通过胞吞和/或胞吐转运作用从血管渗透进入细胞微环境，载药纳米颗粒的长时间血液清除半衰期能够显著提高载药纳米颗粒通过胞吞和/或胞吐转运作用从肿瘤血管渗入到肿瘤部位的量，提高靶向治疗效果，降低抗肿瘤药物在正常组织细胞中的聚集和副作用。
5.发明所述的递送载体溶血耐受性强，系统生物安全性性高。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，以下具体实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实施例。
实施例1
1.材料
1.1 PEG-PCL-PEI载体材料的制备
PEG-PCL-PEI(分子量：9500，PDI：1.08，CMC：0.723nM)和Cy5标记的PEG-PCL-PEI(荧光接枝率为3.9％)的制备和表证如下：
1.1.1 PEG-PCL和PEG-PCL-PEI的合成
聚乙二醇单甲醚(PEG，分子量为2000)和已内酯严格除水后使用，取50mL圆底烧瓶加热抽真空干燥后，在氮气保护下依次加入PEG(2g，1mmol)、己内酯(10mL，90mmol)、辛酸亚锡(0.82g，2mmol)，于110℃搅拌反应24h，冷却后将混合物溶解在少量二氯甲烷中，用冰乙醚沉淀三次，最后砂芯漏斗过滤，固体抽真空干燥得到PEG-PCL 6g，产率75％。
取PEG-PCL(2g，0.25mmol)溶解于无水的二氯甲烷20mL中，加入无水的三乙胺1mL，氮气保护，缓慢滴加丙烯酰氯80μL，室温搅拌反应6h后，饱和食盐水萃取3次，每次20mL，有机相旋蒸浓缩后，用冰乙醚沉淀，砂芯漏斗过滤，固体抽真空干燥得到PEG-PCL-COCHCH21.2g，产率60％。
取PEG-PCL-COCHCH2(1g，0.125mmol)和PEI(0.36g，0.2mmol)溶解于10mL DMF中，加入1mL吡啶，60℃搅拌反应12h，将反应液倒入截留分子量为10KDa透析袋，首先于DMF中透析24h，后转移到纯水中透析24h，最后经冷冻干燥得到淡黄色固体PEG-PCL-PEI 0.8g，产率65％。
通过核磁共振仪测定所得产物的核磁共振氢谱(1H-NMR)，采用凝胶色谱仪测定所得聚合物的分子量及分子量分布曲线。采用荧光法测定PEG-PCL和PEG-PCL-PEI的临界胶束浓度(CMC)：以芘为荧光探针，溶于丙酮配制20μg·mL-1母液，取离心管，每管加入100μL母液，自然挥干丙酮后，加入1mL一系列浓度的聚合物混悬液，最终芘浓度为2μg·mL-1，室温置于摇床中摇动过夜，酶标仪测定聚合物混悬液中芘的荧光光谱，固定最大发射波长为390nm，扫描芘在300～360nm激发光谱图，计算各浓度下激发光谱图338nm和333nm荧光强度的比值(I338/I333)，绘制聚合物浓度与I338/I333曲线，计算曲线拐点处浓度为聚合物CMC。
1.1.2荧光标记的PEG-PCL和PEG-PCL-PEI的合成
取PEG-PCL(1g，0.125mmol)、BOC-丙氨酸(189mg，1mmol)、EDC(48mg，0.25mmol)和NHS(30mg，0.25mmol)溶于10mL二氯甲烷中，室温搅拌反应12h，冰乙醚沉淀后，固体溶于20mL二氯甲烷中，加入2mL三氟乙酸搅拌1h，饱和食盐水萃取3次，每次20mL，有机相旋蒸浓缩后，用冰乙醚沉淀，固体抽真空干燥，得到氨基修饰的PEG-PCL-COCH2CH2NH2(PEG-PCL-NH2)0.45g，产率41％。
分别取PEG-PCL-NH2和PEG-PCL-PEI各200mg，分别溶于5mL的DMF中，各加入Cy5-NHS1mg和0.75mg(按照理论摩尔接枝率5％投料)，避光45℃搅拌反应24h，将反应液倒入截留分子量为3.5KD透析袋中，首先于DMF透析12h，后转移到纯水中透析24h，最后经冷冻干燥得到蓝色固体粉末即Cy5标记的PEG-PCL(PEG-PCL-Cy5)和Cy5标记的PEG-PCL-PEI(PEG-PCL-PEI-Cy5)。使用低分子量3.5KD透析膜进行透析纯化。经酶标仪扫描荧光波谱强度，按摩尔比计算，PEG-PCL-Cy5和PEG-PCL-PEI-Cy5荧光接枝率分别约为3.2％和3.9％。
1.1.3材料的表征
聚合物的合成和表证如图1所示，其中图1A为聚合物PEG-PCL-PEI的合成路线，图1B为PEG-PCL的1H-NMR图谱(CDCl3，400Hz，δ)：1.38(-COCH2CH2CH2CH2CH2O-，100.77H)，1.63(-COCH2CH2CH2CH2CH2O-，200.45H)，2.29(-OCO-CH2-，99.89H)，3.38(CH3-O-，3H)，3.65(-CH2CH2-O-，180.55H)，4.06(-CH2-OCO-，98.23H)，通过聚乙二醇上单甲氧基的三个氢为基准，推算出合成的PEG-PCL的分子量为7700(2K+100/2*114＝7700)。图1C为PEG-PCL-COCHCH2的1H-NMR图谱，峰位和大小与图1B一致，多出的一组峰为反应结合丙烯酰的三个氢，5.5～6.5(-OCO-CHCH2，3.59H)。图1D为PEI的1H-NMR，其分子量为1800，积分约为170个氢，2.56(-CH2CH2-NH-，170H)。图1E为最终合成得到的PEG-PCL-PEI的1H-NMR，1H-NMR(CD3OD，400Hz，δppm)：由于单甲氧基与甲醇的溶剂峰重合，因而采用聚乙二醇主链上的180个氢作为基准进行校正计算，1.29(-COCH2CH2CH2CH2CH2O-，100.41H)，1.53(-COCH2CH2CH2CH2CH2O-，199.87H)，2.27(-OCO-CH2-，98.54H)，3.55(-CH2CH2-O-，180H)，3.96(-CH2-OCO-，99.39H)，2.50(-CH2CH2-NH-，195H)，分子量为9500。
各聚合物的分子量及分子量分布曲线如图2的图2A所示，PEG-PCL-PEI分子量分布均一，PDI为1.08。选用荧光探针Cy5对PEG-PCL和PEG-PCL-PEI进行荧光标记，经酶标仪扫描荧光波谱强度，按摩尔比计算，PEG-PCL-Cy5和PEG-PCL-PEI-Cy5荧光接枝率分别约为3.2％和3.9％(如图2B所示)。
采用荧光法测定聚合物的CMC，以338nm和333nm荧光强度的比值(I338/I333)与聚合物浓度拟合曲线，曲线拐点处浓度为聚合物CMC。实验结果如图3所示，由图3的图3A和图3B可知，随着PEG-PCL或PEG-PCL-PEI聚合物浓度的逐渐增大，芘的激发光强度迅速增大，最大激发波长逐渐由333nm红移至338nm，PEG-PCL在浓度为0.2nmol·L-1附近开始出现荧光强度的突变，PEG-PCL-PEI在浓度为1nmol·L-1附近出现明显的荧光强度的突变。通过对I338/I333与聚合物浓度拟合曲线，计算拐点处的浓度，如图3C和图3D可知，PEG-PCL和PEG-PCL-PEI的CMC值分别为0.303和0.723nmol·L-1。
1.2其它材料与试剂
泊洛沙姆F68(Poloxamer F68)购自BASF(德国)。
DMEM培养基、胰蛋白酶溶液和胎牛血清(FBS)购自Gibco(美国)。
小鼠白蛋白为小鼠血清白蛋白，购自Sigma-Aldrich。
3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2-H-溴化四唑(MTT)购自Sigma-Aldrich。
Cy5.5标记小鼠白蛋白(标记摩尔率为2％)。
Cy5的英文为Cyanine 5。
Cy5.5的英文为Cyanine 5.5。
TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(Cat No.11684817910)购自Roche。
Figure BDA0003487130440000161
Green DND26(Cat No.L7526)和Hoechst 33342(Cat No.R37605)购自Thermo Fisher Scientific。
Ki67抗体(Cat No.27309-1-AP)购自Proteintech Group(美国)
三氧化二砷的英文Arsenic trioxide，简称ATO。
0.5wt％泊洛沙姆F68水溶液中，泊洛沙姆F68的重量百分比为0.5％。
2.细胞培养和动物模型
人源肝癌HuH7和HepG2细胞由中国科学院提供并在培养基中培养。
通过在雄性BALB/c裸鼠(6周龄)的皮下接种1×108个HuH7细胞(0.1mL细胞悬液)构建HuH7荷瘤小鼠。所有动物实验均经动物伦理委员会批准。
3.颗粒的制备
ATO储备溶液(ATO-sol)的配制：将三氧化二砷(ATO)溶于氢氧化钠(0.1mM,pH＝10)溶液中，得到ATO浓度为10mg/mL的ATO储备溶液。
小鼠白蛋白水溶液的配制：将小鼠白蛋白溶于去离子水中，得到小鼠白蛋白浓度为2mg/mL的小鼠白蛋白水溶液，测定小鼠白蛋白水溶液的pH＝7.4。
3.1 CATONP颗粒的制备
将20mg PEG-PCL-PEI溶解在2mL丙酮/甲醇混合溶剂中(丙酮与甲醇的体积比＝2:1)中，得到有机相。
将10mL 0.5wt％泊洛沙姆F68水溶液(采用0.1mM氢氧化钠调节pH＝10)与0.1mLATO储备溶液混合，得到水相。
将水相加入到圆底烧瓶中，用注射器取有机相，在磁力搅拌(500rmp)下将有机相缓慢滴加到水相中后，继续搅拌20min，搅拌后，将盐酸(0.1mM)加入到混合液中以将混合液的pH调节至7.4，用旋转蒸发仪在45℃下减压旋转蒸发除去有机溶剂，然后向圆底烧瓶添加去离子水使得圆底烧瓶的水溶液的体积为10mL，得到CATONP分散液，冷冻干燥备用。
3.2 AATONP颗粒的制备
将上述“3.1CATONP颗粒的制备”制备的CATONP分散液与小鼠白蛋白水溶液(小鼠白蛋白浓度为2mg/mL)以等体积比混合后，涡旋振荡10s，20℃室温静置5min，得到AATONP分散液，冷冻干燥备用。
3.3.Cy5标记的CATONP(CATONPCy5)颗粒的制备
CATONPCy5的制备方法同“3.1CATONP颗粒的制备”，不同点在于：用Cy5标记的PEG-PCL-PEI替换PEG-PCL-PEI，从而制备得到CATONPCy5。
3.4.Cy5标记的AATONP(AATONPCy5)颗粒的制备
AATONPCy5的制备方法同“3.2AATONP颗粒的制备”，不同点在于：用Cy5标记的PEG-PCL-PEI替换PEG-PCL-PEI，从而制备得到AATONPCy5。
3.5.Cy5.5和Cy5双标记的AATONP(ACy5.5ATONPCy5)颗粒的制备
ACy5.5ATONPCy5的制备方法同“3.2AATONP颗粒的制备”，不同点在于：用Cy5.5标记的小鼠白蛋白替换小鼠白蛋白和用Cy5标记的PEG-PCL-PEI替换PEG-PCL-PEI，从而制备得到ACy5.5ATONPCy5。
3.6.空白NP(blank NP)颗粒的制备
空白NP的制备方法同“3.2AATONP颗粒的制备”，不同点在于，不加入ATO，从而得到空白NP(blank NP)。
4.颗粒的表证
4.1粒径、电位、形态、包封和载药量测定方法
将颗粒样品(100μL)转移到低容量一次性比色皿(ZEN0040)中，使用配备4mW He-Ne激光器、波长为633nm的Zetasizer Nano(Nano ZS90，Malvern Instrument Ltd.Inc.)进行粒径测定。
将颗粒样品(100μL)在1.5mL离心管中用900μL去离子水稀释，并转移到样品池(DTS1070)中，使用Zetasizer Nano进行zeta电位测定。
CATONP和AATONP的形态在100目铜网上用2wt％醋酸双氧铀水溶液染色，并使用透射电子显微镜(TEM，JEM-1230，JEOL)拍照。
使用电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-OES)(Agilent-5100,AgilentTechnologies)检测ATO的浓度。光谱条件如下：1100W射频功率，等离子流量50L/min，辅助气流量0.5L/min，雾化器流量0.3L/min，泵速50L/min，稳定延迟时间5s，清洗时间30s，高纯氩气为载气，189nm砷元素分析线。使用以下公式计算纳米颗粒中三氧化二砷(ATO)的包封率(EE)和载药量(DL)：
“EE＝纳米颗粒中ATO量/总ATO量”
“DL＝纳米颗粒中ATO量/(纳米颗粒中ATO+聚合物)的量”。
4.2粒径、电位、形态、包封和载药量测定结果
CATONP分散液和AATONP分散液均呈均匀的浅蓝色悬浮液，没有明显的粘连或聚集。
CATONP和AATONP颗粒的粒径、电位、形态和染料标记的荧光色谱图4所示。
Zetasizer Nano测定CATONP颗粒和AATONP颗粒的粒径和电位分别如图4A和图4D所示，CATONP颗粒的粒径的多分散指数为0.17，AATONP颗粒的粒径的多分散指数为0.18。从图4A和图4D可以看出，经白蛋白修饰后，粒径增大，zeta电位降低，白蛋白修饰屏蔽了带正电荷的CATONP。
CATONP颗粒和AATONP颗粒的TEM图分别如图4B和图4E所示，从图4B图4E可以看出，AATONP颗粒表现为白蛋白点状颗粒
Cy5(Ex/Em:640/670nm)和Cy5.5(Ex/Em:670/710nm)的一对荧光共振能量转移(FRET)染料分别与PEG-PCL-PEI和白蛋白共价结合。一旦在640nm激发，CATONPCy5将在670nm附近具有强激发波长，而Cy5.5标记的白蛋白(白蛋白Cy5.5)只能在670nm而不是640nm激发。如果Cy5和Cy5.5的距离小于10nm，Cy5的激发波长将转换为Cy5.5的发射波长，导致在710nm处产生强激发波长。当Cy5.5标记的白蛋白吸附到CATONPCy5上时，ACy5.5ATONPCy5在640和670nm激发后在710nm处有强荧光，但在670nm处有弱荧光，表明发生了强烈的荧光共振能量转移(FRET)并形成了白蛋白修饰(如图4C和图4F)。
ICP-OES法测定AATONP颗粒中ATO的包封率(EE)和载药量(DL)分别为92.75±3.83％和4.39±0.26％。
5.体外药物释放试验
使用透析方法研究ATO-sol和AATONP在不同缓冲介质(pH＝7.4、6.0或5.0)中的体外药物释放行为。
将ATO-sol或AATONP分散液(均含1mg ATO)倒入透析管(Mw cut-off 3.5kDa)，向透析管中加入500mL培养基(含2wt％甘露醇和2wt％甘油的不同pH的PBS缓冲液，在37℃下摇动(60rmp)，在不同时间点收集样品(1mL)，同时加入1mL新鲜介质，使用ICP-OES测量样品中的ATO的浓度。
ATO-sol和AATONP颗粒在不同缓冲介质(pH＝7.4、6.0或5.0)中的药物ATO的释放曲线如图5所示。
从图5的图5A和图5B中可以看出，ATO-sol在pH＝7.4、6.0或5.0释放介质中释放迅速，具有突释现象，4h时药物累积释放率超过70％，8h时药物累积释放率约为90％，随着pH值的降低，ATO-sol的释放速率降低。与ATO-sol相比，AATONP的释放行为较慢，没有突释现象，具有缓释效果，特别地，随着pH值的降低，ATO的释放速率显着增加，在pH7.4、6.0或5.0下，12h时AATONP的ATO累积释放量分别为51.3％、74.5％和83.5％，表明AATONP具有良好的pH响应特性。
AATONP的体外释放数据分别进一步拟合为零级动力学、一级动力学和Higuchi模型(如表1所示)。AATONP在PBS(pH7.4)中的释放行为最符合Higuchi模型，相关系数最高(R2＝0.9072)，表明AATONP颗粒的ATO释放符合缓释特性。
表1ATO-sol和AATONP在pH 7.4释放介质中的释放拟合曲线方程
Figure BDA0003487130440000181
血液的pH约7.4左右，而肿瘤微环境和肿瘤部位中偏酸，AATONP在血液环境中释放度低且释放缓慢，没有突释现象，可以降低AATONP在血液循环中药物释放量，从而降低AATONP的药物系统性副作用，而AATONP到达偏酸性的肿瘤微环境和肿瘤部位，AATONP药物释放量加快，从而增强对肿瘤细胞的杀伤作用，因此，AATONP具有优异的pH响应释放行为，从而降低药物的系统副作用和增强对肿瘤细胞的杀伤效果。
6.溶血试验
PEG-PCL-PEI、AATONP或CATONP用PBS稀释(pH为7.4)至不同浓度，然后在900μL不同稀释度的样品中加入100μL兔红细胞溶液(108个细胞/mL)，将混合液在37℃下振荡(60rmp)20min，然后以5000rpm离心5min。将上清液(200μL)放入标准石英池中，使用酶标仪(M2,Molecular Devices)在540nm处测定吸光度。为了确定AATONP是否具有溶血作用，分别使用PBS缓冲液(PBS的pH为7.4)和去离子水作为阴性对照(0％溶血)和阳性对照(100％溶血)。
通过使用兔红细胞研究了PEG-PCL-PEI、CATONP和AATONP的溶血特性，如图6所示，随着PEG-PCL-PEI浓度的增加，PEG-PCL-PEI、AATONP和CATONP均表现出溶血活性，当PEG-PCL-PEI聚合物浓度高于0.5mM时，PEG-PCL-PEI聚合物和CATONP的溶血率达到5％以上，安全性差，然而，即使在1mM的高PEG-PCL-PEI聚合物浓度下，AATONP溶血率也低于5％，表明AATONP具有优异的生物相容性，安全性高。
7.细胞摄取和亚细胞分布
7.1细胞摄取
AATONP、CATONP和ATO-sol的细胞摄取分别通过ICP-OES和共聚焦激光扫描进行测定。为了测定HepG2细胞的摄取效率，将HepG2细胞以每孔100,000个的密度接种到96孔板上，并在37℃下孵育12h。然后，将培养基更换为2mL含有AATONP、CATONP和ATO-sol(均相当于ATO的浓度1μg/mL)的新鲜培养基，然后进一步孵育0.25h、0.5h、1h、1.5h、2h或3h。为了量化细胞摄取，将细胞用PBS洗涤3次，并使用RIPA裂解缓冲液裂解，然后，通过ICP-OES确定ATO浓度和细胞摄取效率。
HepG2细胞对AATONP、CATONP和ATO-sol的摄取如图7所示，从图7中可以看出，HepG2细胞对AATONP、CATONP和ATO-sol的摄取量以时间依赖性方式增加。ATO-sol的细胞摄取缓慢并在120min达到峰值，AATONP和CATONP的细胞摄取快，趋势相似，白蛋白修饰不影响细胞摄取效率，在15min内，大约50％的AATONP被HepG2细胞摄取，并在60min时达到最摄取量
7.2亚细胞分布
HepG2细胞在共聚焦培养皿(1mL培养基中100,000个细胞)中培养12h，弃去培养基，加入1mL新鲜培养基(含有0.2μL
Figure BDA0003487130440000191
Green DND26溶液和40μL Hoechst33342)，孵育30min后弃去染色液，用PBS清洗培养皿，然后加入含有100μL AATONPCy5的新鲜培养基，通过共聚焦激光扫描镜(NikonA1R)观察不同时间细胞内分布。
共聚焦激光扫描镜测定HepG2细胞对AATONPCy5的细胞摄取如图8所示，从图8中可以看出，HepG2细胞对AATONP摄取非常迅速，在30min时，大量AATONP粘附在肿瘤细胞的膜表面(红色圆圈)并进入细胞，在1h时，AATONP被HepG2细胞完全内化并分布在溶酶体中(绿色和红色重合，黄色)，在2h时，AATONP逃出溶酶体并扩散到细胞质以促进ATO的释放和与靶部位的作用，可以看出，AATONP具有溶酶体逃逸和避免溶酶体降解能力，从而避免AATONP及其负载的药物被溶酶体中的酶降解，增强AATONP和药物在肿瘤细胞内稳定性，从而提高药物的治疗效果。
8.细胞毒性试验
使用MTT方法测定AATONP、ATO-sol或空白NP(blank NP)对HuH7和HepG2细胞系的抗肿瘤效果。
将HuH7或HepG2细胞(180μL培养基，9,000个细胞)接种在96孔板中并预孵育12h。随后向细胞培养物中加入一系列梯度浓度的AATONP分散液、ATO-sol或空白NP，孵育48h后，加入MTT(20μL，5mg/mL)再孵育5h，弃去培养基后，加入DMSO(200μL)溶解形成的甲臜盐，轻轻摇动后，使用酶标仪(M2，Molecular Devices)在570nm处检测吸光度。
MTT法测定AATONP、ATO-sol或空白NP分散液对HuH7和HepG2肿瘤的抑制效果如图9所示，从图9A和图9B中可以看出，随着ATO浓度的增加，细胞活力逐渐降低，AATONP和ATO-sol对HuH7细胞的IC50值依次分别为6.33μM和4.39μM，对HepG2细胞的IC50值分别为5.58μM和3.77μM。
9.荷瘤小鼠的血液清除和生物分布
HuH7荷瘤小鼠尾静脉注射AATONPCy5分散液或ATO-sol(ATO的给药剂量均为5mg/kg)。在给药后的5min、30min、1h、2h、4h、6h、8h和12h的时间点分别取小鼠眼眶静脉丛血(50μL)，然后加入肝素溶液(50μL,1mg/mL)。在12h实验结束时，使用成像系统(IVIS LuminaII，PerkinElmer)对AATONPCy5的小鼠体内实时分布进行拍照和分析，然后使用二氧化碳处死小鼠，解剖组织(肿瘤、肠、肺、脾、肾、脑、心和肝)、洗涤、称重、在裂解缓冲液中消化并用硝酸硝化组织。使用ICP-OES测定器官和血液中的ATO含量。
荷瘤小鼠的血液清除和生物分布如图10所示。
ATO-sol和AATONP的血液清除率是通过检测不同时间点的血清ATO浓度来确定的，结果如图10A所示，从图10A中可以看出，AATONP的血液清除速度显著慢于ATO-sol，尾静脉注射后1h，ATO-sol的血浓度为注射制剂量的20％左右，而AATONP的血浓度保持在注射制剂量的50％左右。AATONP的曲线下面积(AUC)和消除半衰期(T1/2)分别比ATO-sol高2.78倍和3.17倍，表明AATONP能够显著延长ATO血液循环时间，增强体内抗肿瘤效果。
ATO-sol和AATONP在HuH7荷瘤小鼠各组织中的生物分布如图10B所示，从图10B中可以看出，AATONP在肿瘤中的浓度显着高于ATO-sol。与ATO-sol相比，AATONP显着降低了心脏、肾脏和肝脏等组织毒副作用。
体内和解剖的组织的成像分别如图10C和图10D所示，从图10C和图10D进一步分析了AATONPCy5的生物分布，从图10C和图10D中可以看出，AATONPCy5在HuH7肿瘤中大量积累，与图10B的结果一致。
10.体内血管外渗和肿瘤聚集
在小鼠腹部血管旁接种HuH7肿瘤(0.05mL Matrigel溶液，1×108个HuH7细胞)。6天后，肿瘤体积长到约45mm3。沿着腹部中线小心剪断皮肤(注意不要剪断血管)，使用背皮褶室将肿瘤固定在
Figure BDA0003487130440000201
的载玻片上，小鼠尾静脉注射AATONPCy5分散液(ATO的给药剂量为5mg/kg)，并在注射1h时使用CLSM对肿瘤血管进行拍照。同时，还评估用胞吐作用抑制剂EXO1(4mg/kg)尾静脉注射预处理小鼠1h作为对照实验。实验结束时，用2.5％戊二醛溶液对小鼠进行心脏灌注，解剖肿瘤，减薄至约2×2×2体积，置于2mL灌注液中，在4℃培养48h，对肿瘤血管进行解剖、固定、染色和脱水，并使用TEM进一步分析血管微观结构。
CLSM测定AATONPCy5在HuH7荷瘤小鼠中的实时肿瘤血管外渗如图11所示。
从图11A中可以看出，AATONPCy5静脉注射1h后，AATONPCy5的荧光从肿瘤毛细血管中渗出并保留在肿瘤间充质中，这种血管外渗趋势被Vesicular trafficking抑制剂EXO-1抑制，EXO-1抑制使得AATONPCy5的荧光局限在血管内，表明AATONPCy5通过胞吞和胞吐转运作用从肿瘤血管外渗到肿瘤中，而不是通过肿瘤血管的渗漏间隙外渗到肿瘤中。
从图11B的TEM观察AATONPCy5注射给药的解剖肿瘤血管发现，大量囊泡分布在AATONPCy5处理的肿瘤血管壁上，以向内或向外开口为特征的小窝(囊泡的原始或最终状态)散布在血管壁的两侧边缘，而以完整圆形为特征的囊泡-液泡细胞器(胞吞转运体中囊泡的成熟状态)散在在血管壁内侧，相比之下，在用胞吐抑制剂EXO1预处理后，血管壁上几乎没有小窝或囊泡-液泡细胞器。结果表明AATONPCy5是通过胞吞和胞吐转运作用从肿瘤血管外渗到肿瘤中。
AATONP通过胞吞和胞吐转运作用从肿瘤血管外渗到肿瘤部位能够有效克服肿瘤血管内皮细胞组织良好且紧密堆积导致的抗肿瘤药物的肿瘤通透性和滞留效应(EnhancedPermeability and Retention，EPR effect)差带来的抗肿瘤药物难以有效的透过血管内皮细胞间隙到达肿瘤部位的问题，从而发挥和提高对血管低渗透性(即EPR effect)差)的肿瘤治疗效果。因此，胞吞和胞吐转运作用能够显著提高AATONP从肿瘤血管外渗到肿瘤的能力，从而提高抗肿瘤(尤其是是血管低渗透性的肿瘤)效果。
11.体内抗肿瘤活性及组织学检测
在HuH7荷瘤小鼠中进一步试验了AATONP的体内抗肿瘤活性。
将HuH7肿瘤体积长到大约150mm3(接种后约7天)的荷瘤小鼠随机分配到4组(n＝6)。Genexol/PM(载有紫杉醇的聚乙二醇-聚乳酸聚合物胶束)是一种临床使用的纳米药物，被选为肝癌治疗的阳性对照。PBS、Genexol/PM(紫杉醇的给药剂量为5mg/kg)、ATO-sol(ATO的给药剂量为5mg/kg)和AATONP分散液(ATO的给药剂量为5mg/kg)分别每两天尾静脉内注射一次，总共注射五次。每隔一天用卡尺测量肿瘤的宽度和长度并计算为体积(V＝长度×宽度×宽度/2)。14天实验结束后，对小鼠实施安乐死，切除肿瘤，清洗，称重计算抑瘤率：抑瘤率＝(PBS组肿瘤重量-实验组肿瘤重量)/PBS组肿瘤重量×100％，且通过苏木精-伊红(H&E)染色，Ki67蛋白的免疫组织化学(IHC)染色和TdT介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)对肿瘤切片的组织学进行分析。
PBS、Genexol/PM、ATO-sol和AATONP的体内抗HuH7肿瘤活性及组织学检测如图12所示。
从图12A中可以看出，使用PBS的小鼠的肿瘤体积的快速生长，与使用PBS的小鼠相比，对于ATO-sol、Genexol/PM和AATONP治疗组，小鼠的肿瘤生长受到抑制，特别地，AATONP能够完全抑制肿瘤的生长。从图12B中可以看出，ATO-sol组在治疗过程中体重明显下降，表明ATO-sol的毒副作用高，而AATONP的毒副作用低，安全性高。在给药结束时，对每组小鼠的皮下肿瘤进行拍照(如图12C)，可以看出，AATONP治疗的小鼠的肿瘤几乎被根除。在给药结束后，处死小鼠，收集肿瘤并加权(图12D和图12E)，可以看出，AATONP表现出显著高于ATO-sol和Genexol/PM的肿瘤抑制活性。与PBS组相比，AATONP的平均抑瘤率为89.4％，显著高于ATO-sol(58.8％)和Genexol/PM(65.1％)。
苏木精-伊红(H&E)染色，Ki67蛋白的免疫组织化学(IHC of Ki67)染色和TdT介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)对肿瘤切片的组织学分析结果如图13所示。从图13A和图13B中可以看出，H&E染色显示PBS组中的肿瘤具有间隔致密的细胞，而AATONP治疗的肿瘤中的细胞显示出广泛的核收缩和大量碎片；Ki67蛋白的免疫组织化学(IHC)染色显示与ATO-sol和Genexol/PM组相比，AATONP组大大减少了肿瘤中Ki67阳性细胞的数量(P<0.05)，即AATONP显著抑制了肿瘤细胞的增值；TUNEL染色法用于DNA片段的原位检测，以评估药物诱导的细胞凋亡，TUNEL分析结果显示(图13C)，AATONP组肿瘤中的凋亡细胞(以绿色荧光显示)显著多于ATO-sol和Genexol/PM组(P<0.05)，且AATONP治疗组肿瘤的凋亡细胞分布于整个肿瘤实质，表明AATONP对肿瘤具有深入渗透能力，可诱导整个肿瘤中的细胞发生凋亡。
统计分析
所有实验至少重复3次。数据表示为平均值±标准偏差，并通过使用学生t检验和单向方差分析进行分析。在所有测试中，GraphPad Prism 8(GraphPad Software Inc.，CA，USA)用于统计分析，统计显着性设为p<0.05，*:P<0.05，**:P<0.01,***:P<0.001。
以上所述是本发明针对一种案例设计的实施方案，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下还可以作出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

Claims (19)

1.一种药物复合物，其特征在于，所述的药物复合物包括纳米粒和白蛋白，所述纳米粒的纳米材料包括PEG-PCL-PEI；
所述的白蛋白修饰所述纳米粒；
所述的PEG-PCL-PEI的结构如下：
Figure FDA0004247259580000011
所述m为30-60；
所述n为40-80；
所述y为35-48；
所述的药物复合物为负载药物的药物复合物；
所述的药物为三氧化二砷。
2.一种制备如权利要求1所述的药物复合物的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：
(1)将PEG-PCL-PEI溶解在有机溶剂中，得到有机相；
(2)将有机相与水相混合，除去有机溶剂，得到分散液，其中，所述的水相中含有药物；
(3)将分散液与白蛋白水溶液混合后，搅拌混合，得到药物复合物。
3.如权利要求1所述的药物复合物的用途，其特征在于，用于制备药物，所述的药物用于：(i)促进药物复合物跨肿瘤血管渗透；(ii)促进药物复合物在肿瘤细胞部位的富集和/或渗透；(iii)促进药物复合物被肿瘤细胞吸收和摄取；(iv)改善药物复合物被肿瘤细胞溶酶体的降解；(v)增强药物复合物对肿瘤治疗效果；和/或(vi)提高药物复合物的血液清除半衰期。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的改善包括避免、降低、克服和/或抑制。
5.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的(i)促进药物复合物跨肿瘤血管渗透包括促进药物复合物通过胞吞和/或胞吐转运作用跨肿瘤血管渗透进入肿瘤部位。
6.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤包括肿瘤血管低渗透性的肿瘤。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤血管低渗透性的肿瘤血管包括选自下组的一种或多种特征：
(a)所述的肿瘤的血管内皮细胞组织良好且紧密堆积；和/或
(b)肿瘤的血管内皮细胞间隙小。
8.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤包括肿瘤通透性和滞留效应差的肿瘤。
9.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤包括肝癌。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的肝癌的癌细胞包括HuH7细胞和/或HepG2细胞。
11.一种如权利要求1所述的药物复合物的用途，其特征在于，用于制备组合物，所述的组合物用于预防和/或治疗肿瘤。
12.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤包括肿瘤血管低渗透性的肿瘤。
13.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤血管低渗透性的肿瘤血管包括选自下组的一种或多种特征：
(a)所述的肿瘤的血管内皮细胞组织良好且紧密堆积；和/或
(b)肿瘤的血管内皮细胞间隙小。
14.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤包括肿瘤通透性和滞留效应差的肿瘤。
15.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤包括肝癌。
16.如权利要求15所述的用途，其特征在于，所述的肝癌的癌细胞包括HuH7细胞和/或HepG2细胞。
17.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述的组合物为注射制剂，所述的注射制剂为静脉注射制剂或动脉注射制剂。
18.一种组合物，其特征在于，所述的组合物包括如权利要求1所述的药物复合物。
19.如权利要求18所述的组合物，其特征在于，所述的组合物为注射制剂，所述的注射制剂为静脉注射制剂或动脉注射制剂。
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