CN111363062A - 一种tpgs修饰的羧甲基壳聚糖-大黄酸偶联物及其合成工艺和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种如式Ⅰ所示的TPGS修饰的羧甲基壳聚糖‑大黄酸偶联物，其中，A和B分别独立选自大黄酸或TPGS；n＝436～512。本发明还提供了该偶联物的合成工艺，以及偶联物在制备载药胶束中的应用。本发明制备的TPGS修饰的羧甲基壳聚糖‑大黄酸偶联物在水中能自组装成胶束；该胶束对紫杉醇有非常高的载药量，粒径小；显著促进紫杉醇在胃肠道的吸收；载药胶束抗肿瘤作用显著，能抑制肿瘤的产生的抗药耐药作用，且毒副作用小。

Description

一种TPGS修饰的羧甲基壳聚糖-大黄酸偶联物及其合成工艺 和用途

技术领域

本发明涉及一种TPGS修饰的羧甲基壳聚糖-大黄酸偶联物及其合成工艺和用途。

背景技术

聚合物胶束(Polymeric micelles，PMs)由两亲性聚合物组装而成，是当聚合物浓度超过临界胶束浓度后自发形成的热力学稳定体系。聚合物胶束具有典型的壳－核结构及纳米级粒径，其性质稳定、增溶能力强、生物相容性好、耐稀释等特点，使其较多应用于水难溶性药物(尤其是抗肿瘤药物)的递送。

紫杉醇(PTX)以其独特的微管解聚抑制机制对多种癌症有显著的疗效。目前已被USFDA批准用于治疗非小细胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌等。但是，PTX的水溶性差、渗透性差、口服生物利用度低，其口服给药受到严重阻碍。故以聚合物胶束为载体的口服递药系统，增加PTX的溶解度，降低对胃肠道的刺激性，提高PTX口服生物利用度。

但是，现有技术中的药物载体面临药物包封率低、吸收差和产生抗药耐药的问题。因此研究一种包封率高、人体吸收好，且减少抗药耐药产生的药物载体具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种TPGS修饰的羧甲基壳聚糖-大黄酸偶联物及其合成工艺和用途。

本发明提供了一种TPGS修饰的羧甲基壳聚糖-大黄酸偶联物，它的结构如式Ⅰ所示：

其中，A和B分别独立选自大黄酸或TPGS；

n＝436～512。

进一步地，所述偶联物中，大黄酸的摩尔取代度为6.44±0.83％；TPGS的摩尔取代度为0.28±0.06％。

本发明还提供了一种制备前述偶联物的方法，它包括以下步骤：

(1)TPGS-SA中间体的合成：称取TPGS、丁二酸酐(SA)和4-二甲氨基吡啶，并滴加三乙胺，加适量吡啶溶解，室温下搅拌24h，除去吡啶，残留物用适量二氯甲烷溶解，静置，离心，取上层液体，挥干，得淡黄色胶状物；取淡黄色胶状物，去离子水溶解，搅拌过夜，透析72h，离心去除沉淀，上清液冻干，得淡黄色疏松TPGS-SA粗品；

(2)溶液配制和活化：称取羧甲基壳聚糖，蒸馏水溶解至浓度为0.1mmol/mL，备用；称取TPGS-SA粗品，蒸馏水溶解至浓度为0.05mmol/mL，在TPGS-SA溶液中加入EDC·HCl，活化20min后，加入NHS，备用；取大黄酸粉末，1％NaHCO₃溶液加热使其溶解至浓度为0.1mmol/mL，冷却至室温，加入EDC·HCl，活化20min后，加入NHS，备用；

(3)TPGS修饰的羧甲基壳聚糖-大黄酸偶联物的合成：将活化后的TPGS-SA溶液和大黄酸溶液在搅拌下加入羧甲基壳聚糖溶液中，避光反应24h，加95％乙醇沉淀，抽滤，洗至滤液近无色，取沉淀物溶解于水中，探头超声，透析，再次探头超声，0.8μm滤膜滤过，滤液冷冻干燥，即得；

其合成路线如下所述：

其中，A和B分别独立选自大黄酸或TPGS；

n＝436～512。

进一步地，所述步骤(1)中，TPGS、丁二酸酐、4-二甲氨基吡啶和三乙胺投料量摩尔比为1:2:1:1；

和/或，所述步骤(1)中，除去吡啶使用旋蒸法；

和/或，所述步骤(1)中，离心速度为4000r/min，时间为10min；

和/或，所述步骤(2)中，TPGS-SA粗品、EDC·HCl和NHS的摩尔比为1:3:1；

和/或，所述步骤(2)中，大黄酸粉末、EDC·HCl和NHS的摩尔比为1:3:1；

和/或，所述步骤(3)中，TPGS-SA溶液、大黄酸溶液和羧甲基壳聚糖溶液的体积比为1:1:1；

和/或，所述步骤(3)中，探头超声在冰水浴中进行，探头超声时间为30min。

本发明还提供了前述偶联物在制备载药胶束中的应用。

进一步地，所述偶联物的临界胶束浓度为54.33μg/mL。

进一步地，所述的载药胶束的其平均载药量为41.64±4.02％，平均包封率为84.32±12.01％。

进一步地，所述药物为难溶性药物。

进一步地，所述难溶性药物为紫杉醇。

本发明制备的TPGS修饰的羧甲基壳聚糖-大黄酸偶联物在水中能自组装成胶束；该胶束对紫杉醇有非常高的载药量，粒径小；显著促进紫杉醇在胃肠道的吸收；载药胶束抗肿瘤作用显著，能抑制肿瘤的产生的抗药耐药作用，且毒副作用小。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为TPGS、CMCS、R和TPGS-CR偶联物的FT-IR图谱；a为TPGS，b为CMCS，c为R，d为TPGS-CR偶联物。

图2为TPGS、TPGS-SA、CMCS、R和TPGS-CR偶联物的¹H-NMR图谱；a为TPGS，b为TPGS-SA，c为CMCS，d为R，e为TPGS-CR偶联物。

图3为对照组、TPGS-CR偶联物、γ-生育酚和TPGS的HPLC色谱图；a为对照组，b为TPGS-CR偶联物，c为γ-生育酚，d为TPGS。

图4为TPGS-CR偶联物临界胶束浓度测定图。

图5为TPGS-CR纳米胶束的粒径与形态的DLS粒径图、TEM图和AFM图；a为DLS粒径图，b为TEM图，c为AFM图。

图6为载紫杉醇的TPGS-CR纳米胶束的粒径与形态的DLS粒径图、TEM图和AFM图；a为DLS粒径图，b为TEM图，c为AFM图。

图7为TPGS-CR偶联物和载PTX的TPGS-CR纳米胶束的MCF-7/Taxol细胞毒。

图8为PTX制剂在不同肠段的吸收速率常数(K_a)和表观渗透系数(P_eff)；A为吸收速率常数；B为表观渗透系数。

图9为给予各制剂后荷瘤小鼠的肿瘤体积变化(n＝8)。

图10为给予各制剂后荷瘤小鼠的体重变化(n＝8)。

具体实施方式

1、缩写词

TPGS：聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯；PMs：聚合物胶束(Polymeric micelles)；CMCS：羧甲基壳聚糖；R：大黄酸(Rhein)；TPGS-CR偶联物(TPGS-CR conjugate)：TPGS修饰的羧甲基壳聚糖-大黄酸偶联物；PTX-loaded CR PMs：载紫杉醇的TPGS修饰的羧甲基壳聚-大黄酸偶联物胶束；PTX：紫杉醇(paclitaxel)；

泰素(紫杉醇的市售制剂)；EL：聚氧乙烯蓖麻油；EtOH：无水乙醇；Ver：维拉帕米(verapamil)；SA：丁二酸酐；EDC·HCl：1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐；NHS：N-羟基琥珀酰亚胺；DMAP：4-二甲氨基吡啶；TEA：三乙胺。

2、仪器与材料

仪器：JY92-2D超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；ALPHA1-2LD冷冻干燥机(德国Christ公司)；NICOMPTM 380ZLS激光粒径测定仪(美国Santa Bbarbara公司)；Bruker AVANCE III 500核磁共振波谱仪(瑞士Bruker公司)；原子力显微镜5500(美国Agilent)；Nicolet iS50傅立叶变换红外光谱仪(美国Thermo Fisher公司)；Thermo 311细胞培养箱(美国Thermo公司)；Infinite M200PRO多功能酶标仪(瑞士TECAN公司)。

材料：聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯(BASF公司)；丁二酸酐(上海麦克林生化科技有限公司)；O-羧甲基壳聚糖(青岛弘海生物技术有限公司，分子量10万)；大黄酸(陕西澳源生物技术有限公司)；紫杉醇(上海中西三维药业有限公司)；维拉帕米(武汉远成共创科技有限公司)；4-二甲氨基吡啶(阿拉丁试剂有限公司)；1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl，上海晶纯生化科技股份有限公司)；N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，上海晶纯生化科技股份有限公司)；透析袋(上海绿鸟科技发展有限公司，MWCO1000)；胎牛血清(Excell bio公司)；噻唑蓝(MTT，北京索莱宝科技有限公司)。

3、TPGS-CR偶联物的合成路线图

TPGS-CR偶联物的合成路线如下所示，在DMAP与TEA催化下，通过丁二酸酐(SA)开环，与TPGS合成TPGS-SA，得到产物呈淡黄色，具有较好的水溶性。在CMCS上有大量氨基，R分子上有羧基，TPGS-SA通过SA的开环反应使其结构末端带上羧基，在EDC与NHS催化下，通过酰化反应，TPGS与R以酰胺键连接在CMCS分子主链上，合成TPGS-CR偶联物。

TPGS-CR偶联物的合成路线图：

其中，A和B分别独立选自大黄酸或TPGS；

n＝436～512。

实施例1TPGS-CR偶联物的合成

1、TPGS-SA中间体合成

称取TPGS、丁二酸酐(SA)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)，置于西林瓶中，滴加三乙胺(TEA)，投料量以摩尔比TPGS:SA:DMAP:TEA＝1:2:1:1计，加适量吡啶溶解。室温下磁力搅拌24h后，旋蒸除去吡啶。旋蒸残留物用适量二氯甲烷溶解，静置，以4000r/min离心10min，取上层液体挥干，得淡黄色胶状物。取该胶状物加适量水溶解，磁力搅拌过夜，透析72h，离心去除沉淀，上清液冻干，得淡黄色疏松TPGS-SA粗品。

2、TPGS-CR偶联物合成

称取CMCS置反应瓶中，加入5mL蒸馏水溶胀后搅拌至溶解，使CMCS浓度为0.1mmol/mL溶液。取称取TPGS-SA粗品，加入5mL蒸馏水溶解至浓度为0.05mmol/mL，加入143.8mgEDC·HCl，活化20min后，加入28.8mgNHS。另取142.1mgR粉末置广口瓶中，加入5mL1％NaHCO₃溶液，加热使溶解，冷却至室温，加入287.6mgEDC·HCl，活化20min后，加入57.7mgNHS。将上述分别活化后的TPGS-SA溶液5mL和R溶液5mL搅拌下加入5mLCMCS溶液中，避光搅拌反应24h后，加95％乙醇沉淀，抽滤，洗至滤液近无色，取沉淀物溶解于水中，在冰水浴中探头超声30min，透析3天。结束透析后，再次探头超声，用0.8μm滤膜滤过，滤液冷冻干燥，得到TPGS-CR偶联物。

以下通过试验例具体说明本发明的有益效果。

试验例1TPGS-CR偶联物的结构表征

1、试验方法

(1)傅立叶变换红外光谱(FT-IR)

采用压片法制备样品。取TPGS、R、CMCS和TPGS-CR偶联物，分别加入适量KBr，于红外灯下研磨混合，压制成薄片，测定样品FT-IR光谱。

(2)核磁共振氢谱(¹H-NMR)

取TPGS、TPGS-SA、CMCS、R溶解于D₂O中；TPGS-CR偶联物先溶解于D₂O中，后加入等量DMSO-d₆。样品用核磁共振仪测定其¹H-NMR谱。

2、试验结果

(1)FT-IR

各合成原料及产物的FT-IR图谱如图1所示。

图1中，a为TPGS的FT-IR谱图，1737cm^-1处强吸收峰为羰基的谱带，1112cm^-1处为PEG链上C-O单键的伸缩振动。b为CMCS的FT-IR谱图，3439cm^-1处是-NH和-OH的伸缩振动峰，2922cm^-1为-CH的伸缩振动峰，1594cm^-1处为羧基上的-C＝O伸缩振动吸收峰，1410cm^-1处峰为-OH和-CH的环变形振动吸收峰，1067cm^-1处峰为-C-O伸缩振动吸收峰。c为R的FT-IR谱图，3061cm^-1，1693cm^-1为分别为羧基上的羟基与羰基的吸收峰。d为TPGS-CR偶联物的FT-IR谱图，与CMCS谱图相比，3350cm^-1处-NH和-OH的伸缩振动吸收峰强度减弱，在1706cm^-1处出现TPGS羰基的伸缩振动峰和1054cm^-1处的PEG链上的C-O峰；并且于1628cm^-1、1589cm^-1处出现酰胺谱带，说明TPGS、R上的羰基转变成为酰胺键上的羰基，TPGS、R已以酰胺键接枝于CMCS结构上，生成TPGS-CR偶联物。

(2)¹H-NMR

各合成原料、中间产物及产物的¹H-NMR图谱如图2所示。

图2中，a为TPGS的¹H-NMR图谱，δ0.80ppm为生育酚上甲基上的氢，δ0.99-1.46ppm为生育酚亚甲基上的氢，δ1.80、1.91、2.08ppm处和δ2.35ppm处则分别为生育酚苯环上氢所产生信号及苯并二氢吡喃环4位亚甲基上氢所产生信号。δ2.68、2.76ppm处为TPGS丁二酸酐链上2个亚甲基上氢的信号峰。而TPGS-SA(图2中b所示)在δ2.66ppm处出现新的氢信号，且δ2.74ppm处信号增强，此为丁二酸酐上亚甲基的氢产生的信号。说明了TPGS经SA的开环反应与其连接成功，使其在结构末端上带上羧基。

图2中，c为CMCS的¹H-NMR图谱，δ4.7ppm为溶剂(D₂O)峰，δ2.00ppm CMCS上脱乙酰度不完全的乙酰氨基(-NHCOH₃)的质子峰，δ3.55-3.85ppm是CMCS糖环上的质子峰(H-3，H-4，H-5，H-6)，δ3.03ppm为CMCS糖环上C2-H质子峰。在TPGS-CR偶联物的¹H-NMR图谱(图2中e所示)中，δ8.39ppm处及附近出现了R苯环上的质子信号特征峰；δ0.80ppm、δ1.0-1.5ppm处出现TPGS的生育酚结构上甲基以及亚甲基特征信号峰，因此可以推断，R与TPGS已接枝在CMCS上，TPGS-CR偶联物合成成功。

试验例2TPGS-CR偶联物中R和TPGS的取代度测定

1、试验方法

(1)TPGS-CR偶联物中R的取代度测定

取TPGS-CR偶联物10mg，加蒸馏水溶解，冰水浴探头超声10min，加水定容至10mL，取500μL溶液，加甲醇2.5mL，混匀，用UV法于431nm波长处测定其吸光度。

(2)TPGS-CR偶联物中TPGS的取代度测定

①测定条件：

采用HPLC法测定TPGS-CR偶联物中TPGS的取代度。色谱柱：Inertsil ODS-SP(4.6×150mm，5μm)，流动相：甲醇-水(99:1)，流速：1.0mL/min，柱温：30℃，检测波长：290nm，进样量：20μL。

取TPGS-CR偶联物20mg，置圆底烧瓶中，加入50％乙醇溶液(每1L乙醇溶液中加酚酞试液0.25mL)15mL，加维生素C 22.5mg，γ-生育酚250μg、氢氧化钾0.125g，置于集热式磁力搅拌器中，加热回流至样品完全溶解，继续回流1h，趁热逐滴加稀盐酸至粉红色消失。冷至室温，加50％乙醇溶液15mL清洗试管内壁，加石油醚5mL，密塞，混匀，取上层溶液4mL，置EP管中，减压挥干后加0.5mL甲醇，涡旋1min，10000rpm离心10min，取上清液进行测定。

②专属性实验：

制备不含TPGS的载体，按照前述“①测定条件”进行测定，考察各组分对测定是否有干扰。

不含TPGS载体的制备方法：称取适量的CMCS置反应瓶中，加入10mL蒸馏水溶胀。取反应量的R粉末置广口瓶中，加入10mL 1％NaHCO₃溶液，加热使溶解，冷却至室温，加入EDC·HCl，活化20min，再加入NHS(R:EDC:NHS＝1:3:1，摩尔比例)，将此混合液搅拌下加入CMCS溶液中(混合液:CMCS溶液＝1:1，体积比)，避光搅拌反应24h后，醇沉(95％乙醇)，抽滤，用95％乙醇洗至滤液近无色，得反应产物并将其溶解于水中，冰水浴探头超声20min，离心10min(3500r/min)，上清液过膜(0.8μm)，将得到的滤液透析三天。结束透析，冰水浴探头超声，离心10min(3500r/min)，上清液过膜(0.8μm)，滤液-20℃冰箱预冻，冷冻干燥，得到CR偶联物。

上述不含TPGS载体的制备方法已发表论文：Xiaoying Wang,YangliGuo,LiangzhenQiu,Xiaying Wang,Tonglei Li,Lifeng Han,HuizhiOuyang,Wei Xu,KedanChu*.Preparation and evaluation of carboxymethyl chitosan-rhein polymericmicelles with synergistic antitumor effect for oral delivery of paclitaxel[J].Carbohydrate Polymers,2019,206:121–131.

③标准曲线的制备：

精密称取TPGS标准品200mg，置于10mL容量瓶中，用50％乙醇溶解后定容至刻度，摇匀，得浓度为20mg/mL的储备液。分别从储备液中移取0.1、0.125、0.25、0.5、1.0、1.5mL，置10mL容量瓶中，用50％乙醇稀释至刻度，得浓度为3.0、2.0、1.0、0.5、0.25、0.2mg/mL的标准溶液。分别取标准溶液1mL，按照前述“①测定条件”进行测定，并以TPGS的浓度为横坐标，TPGS水解产物与γ-生育酚的响应值的比值(R)为纵坐标，绘制内标标准曲线。

④回收率实验

制备浓度为1.0mg/mL的标准溶液，加入不含TPGS的纳米胶束，平行6份，按照前述“①测定条件”进行测定，记录峰面积，计算回收率。

⑤精密度实验

制备浓度为1.0mg/mL的标准溶液在同一天连续测6次及3天连续测定，按照前述“①测定条件”进行测定，记录峰面积。分别计算日内差、日间差。

2、取代度的计算方法

TPGS-CR偶联物上的R和TPGS的摩尔取代度(DS，mol％)根据取代度公式计算。R的摩尔取代度(DS_R，mol％)，根据公式(1)计算；TPGS的摩尔取代度(DS_TPGS，mol％)，根据公式(2)计算。

式中，m_T为TPGS接枝在TPGS-CR偶联物上的量(g)；m_R为R接枝在TPGS-CR偶联物上的量(g)；m_TCR为测定时称取的TPGS-CR偶联物的量(g)，Mc为CMCS的平均分子量，M_R为R的分子量，M_T为TPGS的分子量。

3、试验结果

TPGS-CR偶联物中TPGS的取代度测的HPLC图谱如图3所示。TPGS碱水解的产物α-生育酚的保留时间为9.73min，γ-生育酚的保留时间为8.35min，图谱峰形较好，能与邻峰很好的分离(R>1.5)。其余物质对α-生育酚与内标物γ-生育酚的测定无干扰。，将不同浓度TPGS水解产物峰与γ-生育酚的响应值的比值R对TPGS浓度进行线性回归，绘制内标标准曲线。得线性回归方程为R＝0.7833C+0.0275，r＝0.9999，TPGS碱水解的产物α-生育酚在0.2～3.0mg/mL内具有良好线性关系。该方法的回收率为98.28±4.09％；日内、日间精密度分别为0.03％、0.17％，回收率与精密度良好。

合成的产物TPGS-CR偶联物，经测定，R的摩尔取代度为6.44±0.83％；TPGS的摩尔取代度为0.28±0.06％。

试验例3TPGS-CR偶联物临界胶束浓度测定

1、试验方法

芘(Pyrene，Py)是一种疏水性荧光物，其荧光光谱会随周围对环境极性的改变而发生变化。当两亲性高分子的浓度达到临界胶束浓度(critical micelle concentration，CMC)以上时，胶束形成，芘进入胶束的疏水内核的非极性环境中激发光谱中波段红移，从333nm移至338nm。故采用芘作为荧光探针测定TPGS-CR偶联物的CMC。配制称取适量芘，用丙酮溶解，加至10mL棕色容量瓶中，挥干溶剂后，加入2000、1000、500、250、100、50、20、10、5、1、0.5、0.1μg/mL系列梯度TPGS-CR偶联物水溶液，水浴超声30min，于摇床中孵育过夜，使芘的最终浓度为6×10^-7mol/L。采用酶标仪测定系列梯度TPGS-CR偶联物水溶液中芘的激发光谱，并记录其在338nm和333nm处的荧光值，即I₃₃₈和I₃₃₃，以I₃₃₈/I₃₃₃为纵坐标TPGS-CR偶联物浓度对数值为横坐标作图，计算CMC值。

2、试验结果

图4为TPGS-CR偶联物临界胶束浓度测定结果。

以芘的荧光比值I₃₃₈/I₃₃₃对TPGS-CR偶联物浓度的对数值作图，图中斜率发生变化的点为临界点。结果表明，TPGS-CR偶联物水溶液浓度较低时，I₃₃₈/I₃₃₃基本不变；当其浓度增大到54.33μg/mL时，I₃₃₈/I₃₃₃逐渐增大，说明此时偶联物在水中已经形成胶束，芘被包裹在疏水内核中。因此，确定TPGS-CR偶联物的CMC值为54.33μg/mL。

试验例4TPGS-CR偶联物粒径、分布及电位测定

1、试验方法

取TPGS-CR偶联物20mg，加入4mL水，冰浴探头超声分散10min，过0.8μm滤膜，即得TPGS-CR偶联物的自组装胶束溶液。取不同投料比合成的TPGS-CR偶联物，加水稀释至1mg·mL^-1，用动态激光粒径仪(DLS)测定胶束粒径、分布与Zeta电位。

2、试验结果

TPGS-CR偶联物在水中自组装成TPGS-CR纳米胶束，经DLS法测定其粒径为121.6±18.8nm，-6.13±9.15mV。

试验例5TPGS-CR纳米胶束载药实验

1、试验方法

色谱柱：Inertsil ODS-SP(4.6×150mm，5μm)，流动相：甲醇-水(69:31)，流速：1.0mL/min，柱温：30℃，检测波长：227nm，进样量：20μL。

取TPGS-CR偶联物18mg，加蒸馏水2.6mL，冰水浴探头超声10min至均匀分散。取PTX粉末12.86mg溶于0.43mL无水乙醇中，然后逐滴加至TPGS-CR纳米胶束溶液中，剧烈搅拌20min，冰水浴探头超声30min，透析24h后，冰水浴探头超声20min后用0.8μm滤膜滤过，并将滤液冻干，得载紫杉醇的TPGS-CR胶束冻干粉末。精密称取2mg载紫杉醇的TPGS-CR胶束冻干粉末，加水冰浴探头超声溶解，0.8μm滤膜滤过。取滤液置1mL至10mL容量瓶中，用甲醇稀释定容，破坏胶束结构。使用HPLC测定PTX含量，并按公式(3)和(4)计算载药量与包封率：

包封率＝m₁/m₂×100％ (3)

载药量＝m₁/m₃×100％ (4)

式中，m₁为载入胶束中的PTX的量，m₂为PTX的投药量，m₃为载PTX的TPGS-CR胶束的质量。

2、试验结果

透析法制备得到载PTX的TPGS-CR纳米胶束，HPLC法测定其平均载药量为41.64±4.02％，平均包封率为84.32±12.01％。载PTX的TPGS-CR纳米胶束的粒径为216.83±23.84nm，PDI为0.134±0.002，电位为-21.94±1.67mV。

试验例6形态学研究

1、试验方法

(1)透射电镜观察(TEM)

用透射电镜(Transmission Electron Microscope，TEM)观察和表征TPGS-CR胶束粒子和载紫杉醇的TPGS-CR纳米胶束的大小和形态。取TPGS-CR胶束溶液和载紫杉醇的TPGS-CR纳米胶束，加水稀释，用2％的磷钨酸溶液负染30s，自然干燥，用透射电镜观察。

(2)原子力显微镜观察(AFM)

采用原子力显微镜(Atomic Force Microscopy，AFM)观察TPGS-CR偶联物组装成的纳米胶束和载紫杉醇的TPGS-CR纳米胶束的形态特征。取TPGS-CR胶束溶液和载紫杉醇的TPGS-CR纳米胶束，加水稀释后，滴加于云母片上，待溶液自然晾干后，将云母片置AFM中，采用轻敲模式(40N·m^-1)，振幅5，进行扫描，观测胶束形态特征。

2、试验结果

TPGS-CR纳米胶束的TEM图见图5b、AFM图见图5c，图中可见TPGS-CR纳米胶束近似球型，形态圆整，粒径与DLS(图5a)测量结果一致。

载紫杉醇的TPGS-CR纳米胶束的TEM图见图6b、AFM图见图6c，图中可见载紫杉醇的TPGS-CR纳米胶束近似球型，形态圆整，粒径与DLS(图6a)测量结果一致。

试验例7细胞毒实验

1、试验方法

通过MTT法评估TPGS-CR偶联物及载PTX的TPGS-CR纳米胶束的细胞毒性。MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)为水溶性四唑盐染料，活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使其还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)，从而对细胞存活量进行检测。取对数生长期的耐Taxol的MCF-7细胞(MCF-7/Taxol细胞)，调整细胞浓度为5×10⁴个细胞/mL，以每孔100μL接种于96孔板中，于37℃，5％CO₂培养箱中孵育。24h后各加入1～10000nmol/L的8种浓度TPGS-CR偶联物、EL+无水乙醇(1:1)、

和载PTX的TPGS-CR纳米胶束溶液，每个浓度平行6孔。以加入不含药物的新鲜培养介质作为空白组(control)。分别于加药后24、48、72h，将培养板取出，每孔加入100μL MTT溶液(0.5mg/mL)，37℃培养箱中继续孵育4h后取出，小心吸取上清液。每孔加入150μL的DMSO溶解蓝紫色结晶物。用酶标仪在570nm处测定吸光值。并根据各孔的吸光度值按公式(5)计算细胞的存活率。

Cell viability(％)＝(A_sample-A_blank)/(A_control-A_blank)×100 (5)

式中，A_sample是含细胞给药组的吸光度，A _Control是用空白培养基处理的细胞的吸光度，A_blank是空白培养基组的吸光度。

2、试验结果

通过MTT实验初步评价TPGS-CR偶联物的安全性及载PTX的TPGS-CR纳米胶束的细胞毒性。实验结果如图7所示，在实验浓度范围内，TPGS-CR偶联物在24、48和72h细胞存活率在79％以上，表现出较好的安全性。载PTX的TPGS-CR纳米胶束对MCF-7/Taxol细胞表现出明显的时间依赖性和浓度依赖性。与

相比，载PTX的TPGS-CR纳米胶束在24h时细胞毒性弱于

但随时间的延长，载PTX的TPGS-CR纳米胶束表现出强于

的细胞毒性，其48h和72h的IC50值为45.12nmol/L和15.76nmol/L，明显低于

组的IC50值(93.43nmol/L、24.07nmol/L)。并且

的空白溶剂(EL+EtOH)表现随浓度递增的杀伤力，特别是在浓度为10000nmol/L的给药剂量时，EL+EtOH在24、48和72h的细胞存活率分别为49.32％、59.0％和30.62％。说明在高浓度时

的细胞毒性较大程度上是由于其溶剂引起的。而载PTX的TPGS-CR纳米胶束所呈现的较强的细胞杀伤作用可能与TPGS-CR偶联物结构中具有P-糖蛋白抑制和逆转多药耐药作用的TPGS相关。

试验例8在体肠吸收实验

1、试验方法

大鼠禁食12h，不禁水。腹腔注射乌拉坦溶液对大鼠进行麻醉。将大鼠腹面朝上固定在手术台上，沿腹中线开口约3cm打开腹腔，找到十二指肠、空肠、回肠及结肠并各选约10cm做为实验肠段，在每个肠段的始末端各剪一个“V”型小口，插入输液管，并做好肠段及进出口标记，并用棉线结扎，大鼠腹部伤口处用浸有生理盐水的脱脂棉覆盖并于红外灯下保温。缓缓推注生理盐水将肠内容物清洗干净后将输液管进口端接上恒流泵，以0.2mL/min的流速的空白K-R液预饱和灌流管路和肠段30min。然后以0.2mL/min流速灌注药液，以充满整个管路和肠段后滴出第一滴药液的时刻作为零时刻，每15min收集的灌流液进行紫杉醇和酚红含量检测，试验持续120min。实验结束后处死大鼠，截取相应肠段，测量其长度和周长。按下列公式(6)和(7)计算吸收速率常数(K_a)和表观渗透系数(P_eff)。

式中，C_pin和C_pout分别表示进出肠道的灌注液中药物的浓度(μg/mL)；C_PRin和C_PRout分别表示进出肠道的灌注液中酚红的浓度(μg/mL)；ν为灌流速度(0.2mL/min)；r和l分别为灌流肠段的半径和长度(cm)。

2、在体肠吸收灌流液中样品PTX浓度和酚红浓度的测定

灌流液中PTX浓度的测定：精密吸取0.2mL大鼠灌流液，加入甲醇0.8mL，涡旋2min，在14000r/min下离心20min，取上清，HPLC法测定并带入PTX标准曲线计算PTX浓度。

HPLC测定紫杉醇的色谱条件：色谱柱为Inertsil ODS-SP(4.6×150mm，5μm)，流动相为甲醇-水(69:31)，流速为1.0mL/min，柱温30℃，检测波长为227nm，进样量20μL。

灌流液中酚红浓度的测定：取灌流液0.2mL，加入0.1mol/mL的NaOH溶液3.8mL涡旋0.5min混合显色，紫外-可见分光光度法于559nm处测定并代入酚红标准曲线计算酚红浓度。

3、试验结果

不同PTX制剂在体肠吸收的K_a和P_eff见图8。载PTX的TPGS-CR纳米胶束使PTX在全肠段吸收速率常数K_a均有不同程度提高，十二指肠、空肠、回肠、结肠的吸收速率常数K_a分别是

组的2.92、2.66、1.30、1.22倍，载PTX的TPGS-CR纳米胶束在十二指肠吸收最多，其次是空肠、回肠，结肠；PTX在十二指肠、空肠和回肠肠段具有较高的表观渗透系数P_eff，十二指肠、空肠和回肠段的表观渗透系数P_eff分别是是

组的2.99、2.77和1.29倍。该结果表明载PTX的TPGS-CR纳米胶束能显著提高PTX在肠道中的吸收。

在载PTX的TPGS-CR纳米胶束中加入维拉帕米后。其吸收速率常数K_a和表观渗透系数P_eff无明显差异，说明载PTX的TPGS-CR纳米胶束促进PTX在肠道吸收的机理可能是由于药物被包载于胶束内核中，从而避免了P-gp蛋白的外排，故在加入P-gp抑制剂维拉帕米后，其吸收无显著差异。而在

中加入TPGS-CR偶联物后，PTX的吸收速率常数Ka与表观渗透系数Peff在空肠段显著提高，说明非包载PTX的TPGS-CR偶联物也具有一定的促吸收作用。

试验例9药效学实验

吸取H-22腹水瘤小鼠肝腹水，加生理盐水稀释5倍，每只0.1mL接种于小鼠右腋下。接种后一周左右，待小鼠瘤体积长至150-180cm³时随机分成5组，每组8只，开始给药。实验分组及给药剂量：(1)对照组(生理盐水)；(2)

(20mg/kg)；(3)

+维拉帕米(20mg/kg+25mg/kg)；(4)

+TPGS-CR偶联物(20mg/kg+30mg/kg)；(5)载PTX的TPGS-CR纳米胶束(20mg/kg)。以第一次给药记为第0天，分别在第0，2，4，6，8天口服给药，共给药5次，隔天测肿瘤长径及短径，按照公式(8)计算肿瘤体积。隔天测定荷瘤小鼠重量，绘制小鼠体重变化曲线，以此衡量药物对小鼠的毒性作用。第9天处死小鼠，解剖取肿瘤组织，称重，按公式(9)计算抑瘤率，评价疗效。

V_tumor＝(a²×b)/2 (8)

式中，a为肿瘤短径，b为肿瘤长径。绘制肿瘤生长体积-时间曲线。

IR＝(W_saline-W_drug)/W_saline×100％ (9)

式中，IR为抑瘤率，W_drug为给药组瘤重，W_saline为对照组(生理盐水组)瘤重。

2、试验结果

荷瘤小鼠灌胃给予各组PTX制剂后，肿瘤生长曲线见图9。由图可知，载PTX的TPGS-CR纳米胶束组的肿瘤体积生长速度和趋势明显小于生理盐水组。第9天时，各给药组抑瘤效果与生理盐水组比均具有显著差异。

组、

+维拉帕米组、

+TPGS-CR偶联物组和载PTX的TPGS-CR纳米胶束组肿瘤体积分别是生理盐水组的61.08％、61.48％、49.51％和41.60％。载PTX的TPGS-CR纳米胶束对肿瘤有较好的抑制作用。与

组以及

+维拉帕米组相比，

+TPGS-CR偶联物组对肿瘤生长抑制作用更强，可能是由于TPGS-CR偶联物能够促进PTX在肠道中的吸收。

第9天处死荷瘤小鼠剖离肿瘤组织，称重计算抑瘤率。结果见表1，各给药组对肿瘤均有一定抑制作用。其中载PTX的TPGS-CR纳米胶束组瘤重最小，抑瘤率达到44.00％，是

组抑瘤率的1.50倍，抑瘤效果较好。该结果与肿瘤生长曲线的结果较一致。

表1荷瘤小鼠的肿瘤重量和抑瘤率

给药后，荷瘤小鼠体重变化曲线见图10。由图可知，载PTX的TPGS-CR纳米胶束组小鼠体重不断增加，较

组、

+维拉帕米组体重增加明显，说明荷瘤小鼠在经过载PTX的TPGS-CR纳米胶束治疗后，不仅肿瘤生长得到抑制，并且生长状态得到改善。

+TPGS-CR偶联物组小鼠体重也明显增加，说明TPGS-CR偶联物能够抑制

中PTX及其增溶剂的毒副作用。

药效学研究结果表明，载PTX的TPGS-CR纳米胶束能够提高PTX的抗肿瘤效果，并能够降低PTX的毒副作用。

综上，本发明制备的TPGS修饰的羧甲基壳聚糖-大黄酸偶联物在水中能自组装成胶束；该胶束对紫杉醇有非常高的载药量，粒径小；显著促进紫杉醇在胃肠道的吸收；载药胶束抗肿瘤作用显著，能抑制肿瘤的产生的抗药耐药作用，且毒副作用小。

Claims (9)

1.一种TPGS修饰的羧甲基壳聚糖-大黄酸偶联物，其特征在于：它的结构如式Ⅰ所示：

其中，A和B分别独立选自大黄酸或TPGS；

n＝436～512。

2.根据权利要求1所述的偶联物，其特征在于：所述偶联物中，大黄酸的摩尔取代度为6.44±0.83％；TPGS的摩尔取代度为0.28±0.06％。

3.一种制备权利要求1或2所述偶联物的方法，其特征在于：它包括以下步骤：

(1)TPGS-SA中间体的合成：称取TPGS、丁二酸酐(SA)和4-二甲氨基吡啶，并滴加三乙胺，加适量吡啶溶解，室温下搅拌24h，除去吡啶，残留物用适量二氯甲烷溶解，静置，离心，取上层液体，挥干，得淡黄色胶状物；取淡黄色胶状物，去离子水溶解，搅拌过夜，透析72h，离心去除沉淀，上清液冻干，得淡黄色疏松TPGS-SA粗品；

(2)溶液配制和活化：称取羧甲基壳聚糖，蒸馏水溶解至浓度为0.1mmol/mL，备用；称取TPGS-SA粗品，蒸馏水溶解至浓度为0.05mmol/mL，在TPGS-SA溶液中加入EDC·HCl，活化20min后，加入NHS，备用；取大黄酸粉末，1％NaHCO₃溶液加热使其溶解至浓度为0.1mmol/mL，冷却至室温，加入EDC·HCl，活化20min后，加入NHS，备用；

(3)TPGS修饰的羧甲基壳聚糖-大黄酸偶联物的合成：将活化后的TPGS-SA溶液和大黄酸溶液在搅拌下加入羧甲基壳聚糖溶液中，避光反应24h，加95％乙醇沉淀，抽滤，洗至滤液近无色，取沉淀物溶解于水中，探头超声，透析，再次探头超声，0.8μm滤膜滤过，滤液冷冻干燥，即得；

其合成路线如下所述：

其中，A和B分别独立选自大黄酸或TPGS；

n＝436～512。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，TPGS、丁二酸酐、4-二甲氨基吡啶和三乙胺投料量摩尔比为1:2:1:1；

和/或，所述步骤(1)中，除去吡啶使用旋蒸法；

和/或，所述步骤(1)中，离心速度为4000r/min，时间为10min；

和/或，所述步骤(2)中，TPGS-SA粗品、EDC·HCl和NHS的摩尔比为1:3:1；

和/或，所述步骤(2)中，大黄酸粉末、EDC·HCl和NHS的摩尔比为1:3:1；

和/或，所述步骤(3)中，TPGS-SA溶液、大黄酸溶液和羧甲基壳聚糖溶液的体积比为1:1:1；

和/或，所述步骤(3)中，探头超声在冰水浴中进行，探头超声时间为30min。

5.权利要求1或2所述偶联物在制备载药胶束中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述偶联物的临界胶束浓度为54.33μg/mL。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的载药胶束的其平均载药量为41.64±4.02％，平均包封率为84.32±12.01％。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述药物为难溶性药物。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述难溶性药物为紫杉醇。

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