CN109761915B - 靶向mct1转运体的5-氟尿嘧啶成酯前药 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药领域，涉及靶向MCT1转运体的5‑氟尿嘧啶成酯前药，具体涉及包括不同碳链长度的含有单羧酸酯的5‑氟尿嘧啶口服前药的合成，以及其在药物传递和治疗中的应用。本发明设计合成了不同碳链长度含有单羧酸酯的5‑氟尿嘧啶口服前药，将该前药用于靶向MCT1转运体，从而实现稳定性好、毒副作用低、渗透性高和口服生物利用度高的效果。同时，以不含羧酸的成酯前药作为对照，考察含有或不含有单羧酸的前药在化学性质以及体内外实验等方面的差异，以及前药是否能通过靶向MCT1转运体进而改善原有5‑氟尿嘧啶渗透性差以及口服生物利用度低的缺点。得到了最佳的口服前药，满足临床中对口服制剂的迫切需求。

Description

靶向MCT1转运体的5-氟尿嘧啶成酯前药

技术领域

本发明属于医药领域，涉及靶向MCT1转运体的5-氟尿嘧啶成酯前药，具体涉及包括不同碳链长度的含有单羧酸酯的5-氟尿嘧啶口服前药的合成，用于靶向MCT1转运体，以及其在药物传递和治疗中的应用。

背景技术

癌症严重威胁着全人类的健康，据世界卫生组织(WHO)统计，全球每年有超过800万人死于癌症。化疗是癌症治疗中最常用和最有效的策略之一，尤其是对于那些不能通过手术切除和转移扩散的肿瘤。但大部分化疗药是细胞毒性药物，且存在溶解度低、稳定性差、治疗窗窄和药动学性质不佳等缺点。而现有的制剂策略递送效率低，肿瘤靶向性较差，导致化疗临床效果不佳且毒副作用严重。例如，5-FU口服吸收不规则，需采用静脉给药。吸收后分布于全身体液，肝和肿瘤组织中浓度较高，主要在肝代谢灭活，变为CO₂和尿素，分别由呼气和尿液排出，t_1/2为10～20min。对消化系统癌(食管癌、胃癌、肠癌、胰腺癌、肝癌)和乳腺癌疗效较好，对宫颈癌、卵巢癌、绒毛膜上皮癌、膀胱癌、头颈部肿瘤也有效。对骨髓和消化道毒性较大，出现血性腹泻应立即停药，可引起脱发、皮肤色素沉着，偶见肝、肾损害。因此，如何改善化疗药物的不良性质并提高递送效率是临床上亟待解决的难题。

近年来，具有靶向转运体作用的前体药物在药物传递领域的广泛应用极大地丰富了抗肿瘤药物的递送策略，且已经有药物成功上市，如抗病毒药物伐昔洛韦是目前已上市的较成功的PEPT1靶向前药。在后期的研究中对抗病毒药物更昔洛韦进行前药策略改造用于靶向PEPT1也有较好的效果。前体药物本身没有生物活性或活性很低，经过体内代谢后变为有活性的物质。前药策略可以通过巧妙的结构修饰来改善化疗药物的不良性质，包括溶解度低，稳定性差，毒副作用大等。此外，靶向转运体的口服前药的构建可以显著改善药物的药动学性质，提高药物的口服生物利用度，提高药物膜渗透性，并能够通过主动靶向增加药物的细胞摄取，控制药物的释放速度，降低毒副作用。

单羧酸转运蛋白在含有单羧酸的物质通过细胞膜的转运中起着至关重要的作用。单羧酸转运蛋白家族已被证明由14个成员组成，其中MCT1能够介导代谢中质子链的转运。亲水实验和拓扑预测MCT家族每个成员的结构均可能由10到12个α-螺旋跨膜域组成，其中MCT1的结构已通过实验证明在红细胞中由12个α-螺旋跨膜域组成，其C末端和N末端均位于细胞质中。MCT1在体内广泛分布，因此它在一元羧酸的转运中起着非常重要的作用。之前的报道显示MCT1存在于狗，绵羊和人的肠道中。此外，一些报道证实MCT1的表达水平随着肠道的延伸而增加。因此，设计靶向肠道的口服前药在理论上具有可行性，且现有技术中没有报道本发明设计合成的靶向肠道MCT1转运体的前药。

发明内容

本发明所解决的技术问题是提供一种靶向MCT1转运体的5-氟尿嘧啶成酯前药，将该前药靶向MCT1转运体，可以实现稳定性好、毒副作用低、渗透性高和口服生物利用度高的效果。

本发明的目的是设计和合成不同碳链长度(如己二酸、辛二酸和正己酸)含有单羧酸酯的5-氟尿嘧啶前药以及末端不含有羧酸的对照前药，探讨不同碳链长度以及碳链末端是否含有羧基对前药的稳定性、膜渗透性、药动学、细胞毒性以及细胞药效、细胞摄取和转运以及体内安全性产生的影响，综合筛选出效果最佳的前药，为开发通过靶向转运体进而促进口服药物递送和响应提供新的策略和更多的选择，满足临床中对口服制剂的迫切需求。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

本发明所述的不同碳链长度含有单羧酸酯的5-氟尿嘧啶前药，选择5-氟尿嘧啶作为模拟药物，并将二元羧酸或单羧酸通过酯键相连，其结构通式为：

n＝0-20，优选为2-20，更优选为4或6。

本发明优选如下结构的5-氟尿嘧啶前药，选择5-氟尿嘧啶作为模拟药物，并将(a)己二酸或(b)辛二酸与其通过酯键相连。其结构式为：

本发明同时以不含有单羧酸酯的5-氟尿嘧啶的前药，即将5-氟尿嘧啶以(c)正己酸相连合成对照前药作为对照来评价单羧酸的前药在化学性质以及体内外试验效果，其结构式为：

本发明还提供了不同碳链长度含有单羧酸酯的5-氟尿嘧啶前药的合成方法，包括如下步骤：首先将5-氟尿嘧啶的N1位羟甲基化，然后与经过活化的羧酸成酯，得到最终产物。

具体地，所述的前药1、2和3通过如下方法合成：

将5-氟尿嘧啶加入甲醛溶液中，合适温度下(40-60℃)搅拌一定的时间(3-6h)，将所得产物进行减压蒸馏，用乙腈将减压蒸馏得到的产物溶解。然后将己二酸或辛二酸或正己酸在冰浴条件下和HATU、TEA共同搅拌，然后将乙腈溶解的产物加入到此反应液中室温搅拌。

本发明中所述的5-氟尿嘧啶可以用其他结构类似的抗癌药物以及抗代谢药物代替，如氟尿嘧啶类化合物、核苷类化合物等。

己二酸可以用其他二元羧酸替代，如丁二酸、辛二酸、癸二酸所代替。

对照药物正己酸可用其他含有单羧酸的药物代替，如丁酸、辛酸、癸酸等代替。

本发明以末端不含有羧酸的前药作为对照，考察含有或不含有单羧酸的前药在化学性质以及体内外实验等方面的差异，以及前药是否能通过靶向MCT1转运体进而改善原有5-氟尿嘧啶渗透性差以及口服生物利用度低的缺点。以及对前药稳定性、膜渗透性、药动学、细胞毒性以及细胞药效、细胞摄取和转运以及体内安全性产生的影响。

靶向转运体的单羧酸链的成酯前药的肠灌流试验结果表明：回肠和结肠中前药HDA-5-FU和OA-5-FU的吸收速率常数(K_a)和表观渗透系数(P_app)高于5-FU；靶向转运体的单羧酸链的成酯前药的药动学试验结果表明：三种前药的生物利用度都有不同程度地增加；靶向转运体的单羧酸链的成酯前药的细胞摄取试验结果表明：相对与母药来看，三个小分子前药的细胞摄取均有增加，显示出良好的细胞摄取性。

本发明具有以下有益效果：(1)设计合成了不同碳链长度含有单羧酸酯的5-氟尿嘧啶前药以及碳链末端不含有羧基的对照前药，合成方法简单易行；(2)考察了不同化学桥连前药在稳定性、膜渗透性、药动学、细胞毒性以及细胞药效、细胞摄取和转运以及体内安全性产生的影响。综合筛选出效果最佳的化学桥连前药，为开发通过靶向转运体进而促进口服药物递送和响应提供新的策略和更多的选择，满足临床中对口服制剂的迫切需求。

附图说明

图1为本发明实施例1的己二酸5-氟尿嘧啶单酯前药(HDA-5-FU)的¹HNMR谱图和质谱图。

图2为本发明实施例2的辛二酸5-氟尿嘧啶单酯前药(OA-5-FU)的¹HNMR谱图和质谱图。

图3为本发明实施例3的正己酸5-氟尿嘧啶酯前药(HA-5-FU)的¹HNMR谱图和质谱图。

图4为本发明实施例1和例2的肠灌流试验图。

图5为本发明实施例1和例2以及例3的血药浓度-时间曲线图。

图6为本发明实施例1和例2以及例3的细胞摄取试验图。*代表存在显著性差异，**代表显著性差异更大。

图7为本发明实施例1和例2以及例3的细胞转运试验图。*代表存在显著性差异，**代表显著性差异更大。

图8为本发明实施例2的体内安全性试验。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将发明限制在所述的实施例范围之中。

实施例1：己二酸5-氟尿嘧啶单酯前药(HDA-5-FU)的合成

合成路线包括两个步骤。第一步，将适量5-氟尿嘧啶和37％甲醛溶液加入到50ml茄形烧瓶中，并在55℃的油浴中搅拌以溶解5-氟尿嘧啶。然后继续搅拌4小时。反应完成后，得到无色透明液体，减压蒸馏除去过量的水，得到无色粘性液体。第二步，将己二酸，HATU和TEA置于含有15ml无水乙腈的50ml茄形烧瓶中，将该烧瓶在冰浴中搅拌1小时。1小时后，将第一步的产物溶解在无水乙腈中并加入到反应溶液中，然后使反应烧瓶在室温下反应5小时。反应完成后，在减压下蒸馏出反应溶液，然后用乙酸乙酯萃取。加入少量水以除去过量的5-氟尿嘧啶和HATU，最后用饱和氯化钠溶液洗涤有机层。最后，通过制备液相纯化获得产物。

采用质谱法以及核磁共振氢谱法来确定实施例1中前药的结构，结果如图1所示。核磁共振选用的溶剂为氘代DMSO，波谱解析结果如下：

MS(ESI):m/z 287.3[M-H]^-.¹H NMR(600MHz,DMSO)δ11.99(d,J＝4.6Hz,1H),8.13(d,J＝6.5Hz,1H),5.56(s,2H),2.36(t,J＝7.0Hz,2H),2.21(t,J＝6.9Hz,2H),1.57–1.45(m,4H).

实施例2：辛二酸5-氟尿嘧啶单酯前药(OA-5-FU)的合成

将适量5-氟尿嘧啶和37％甲醛溶液加入到50ml茄形烧瓶中，并在55℃的油浴中搅拌以溶解5-氟尿嘧啶。然后继续搅拌4小时。反应完成后，得到无色透明液体，减压蒸馏除去过量的水，得到无色粘性液体。第二步，将辛二酸，HATU和TEA置于含有15ml无水乙腈的50ml茄形烧瓶中，将该烧瓶在冰浴中搅拌1小时。1小时后，将第一步的产物溶解在无水乙腈中并加入到反应溶液中，然后使反应烧瓶在室温下反应5小时。反应完成后，在减压下蒸馏出反应溶液，然后用乙酸乙酯萃取。加入少量水以除去过量的5-氟尿嘧啶和HATU，最后用饱和氯化钠溶液洗涤有机层。最后，通过制备液相纯化获得产物。

采用质谱法以及核磁共振氢谱法来确定实施例2中前药的结构，结果如图2所示。核磁共振选用的溶剂为氘代DMSO，波谱解析结果如下：

MS(ESI):m/z 315.4[M-H]^-.¹H NMR(600MHz,DMSO)δ12.03–11.94(m,2H),8.14(d,J＝6.5Hz,1H),5.56(s,2H),2.33(t,J＝7.4Hz,2H),2.18(t,J＝7.4Hz,2H),1.60–1.38(m,4H),1.31–1.20(m,4H).

实施例3：正己酸5-氟尿嘧啶酯前药(HA-5-FU)的合成

将适量5-氟尿嘧啶和37％甲醛溶液加入到50ml茄形烧瓶中，并在55℃的油浴中搅拌以溶解5-氟尿嘧啶。然后继续搅拌4小时。反应完成后，得到无色透明液体，减压蒸馏除去过量的水，得到无色粘性液体。第二步，将正己酸，HATU和TEA置于含有15ml无水乙腈的50ml茄形烧瓶中，将该烧瓶在冰浴中搅拌1小时。1小时后，将第一步的产物溶解在无水乙腈中并加入到反应溶液中，然后使反应烧瓶在室温下反应5小时。反应完成后，在减压下蒸馏出反应溶液，然后用乙酸乙酯萃取。加入少量水以除去过量的5-氟尿嘧啶和HATU，最后用饱和氯化钠溶液洗涤有机层。最后，通过制备液相纯化获得产物。

采用质谱法以及核磁共振氢谱法来确定实施例3中前药的结构，结果如图3所示。核磁共振选用的溶剂为氘代DMSO，波谱解析结果如下：

MS(ESI):m/z 257[M-H]^-.¹H NMR(600MHz,DMSO)δ11.99(s,1H),8.14(d,J＝5.3Hz,1H),5.57(s,2H),2.33(t,J＝6.9Hz,2H),1.58–1.45(m,2H),1.26(m,J＝12.6Hz,4H),0.85(t,J＝6.1Hz,3H).

实施例4：靶向转运体的单羧酸链的成酯前药的肠灌流试验

将药物溶解于MES缓冲液中，形成含有0.5mM的药物溶液。首先，用20％的乌拉坦麻醉SD大鼠，找到回肠和结肠进行插管。在给药20分钟之前，将肠道和管用空白MES缓冲液饱和一段时间。分别在15，30，45，60，75，90分钟收集流出液并称重。同时，要对入口灌注液进行称重，称量入口灌流液的减少量。将收集的样品与甲醇以1：3的比例混合，涡旋2分钟，以13,000rpm离心10分钟，取上清液进行HPLC检测。并计算吸收速率常数K_a和表观渗透系数P_app。

从图2中可以看出，回肠和结肠中前药HDA-5-FU和OA-5-FU的吸收速率常数(K_a)和表观渗透系数(P_app)高于5-FU，并且前药OA-5-FU在结肠中的吸收速率常数(K_a)是5-FU的3.9倍，表观渗透系数(P_app)是5-FU的3.3倍。该结果表明通过前药策略修饰的5-FU可以增加肠上皮细胞的吸收和穿透。为了进一步证明前药增加的吸收和渗透性是由于肠MCT1转运蛋白的靶向，进行了MCT1表达抑制实验。槲皮素是MCT1的竞争性抑制剂。从图4中可以看出，加入槲皮素的组具有较低的吸收速率常数(K_a)和表观渗透系数(P_app)。结果表明，前药的吸收和渗透性的增加可能是有MCT1的靶向作用。

实施例5：靶向转运体的单羧酸链的成酯前药的药动学试验

将体重200-220g的雄性SD大鼠随机分成5组(每组5只)，给药前禁食12h，自由饮水。5-FU和前药以等效5-FU的剂量口服给药，一组静脉注射给予5-FU计算绝对生物利用度。口服给药组分别在0.083，0.167，0.25，0.5，1，2，4，8，12和24小时取血样，静脉给药组为0.033，0.083，0.167，0.25，0.5，1，2，4，8，12和24小时取血样。收集血样并置于-80冰箱中等待测试。

使用沉淀的蛋白质方法处理血浆样品。将50μl血浆，50μl内标，100μl甲醇加入到ep管中，涡旋3分钟，并以13000rpm离心10分钟。将上清液在37℃，氮气下干燥，用15:85(v：v)甲醇和水再溶解，涡旋3分钟，以13000rpm离心10分钟，取上清液进样，使用液质进行测样。

从结果可看出灌胃后5-FU及其前药的达峰时间小于20分钟，表明前药和5-FU被肠快速吸收到血液中。与5-FU的9.3％相比，三种前药的生物利用度都有不同程度地增加(HDA-5-FU 15.0％，OA-5-FU 37.6％，HA-5-FU 11.8％)。值得注意的是，前药OA-5-FU的生物利用度比5-FU的生物利用度高4倍，表明修饰的5-FU通过增加膜渗透性和靶向性显着增加5-FU的口服吸收。与前药OA-5-FU相比，由于酶稳定性的不同以及靶向性和与MCT1的亲和性不同，前药HDA-5-FU和HA-5-FU生物利用度的提高没有OA-5-FU效果好。因此，OA-5-FU是该研究的三个小分子前药中的优选靶向前药。

实施例6：靶向转运体的单羧酸链的成酯前药的细胞摄取试验

将Caco-2细胞以每孔1×10⁴个接种在24孔板中。前7天每隔一天更换一次液体培养基，7天后每天更换培养基，直至培养第15天。为了使细胞高度表达MCT1，在第7天更换含有丁酸的培养基。试验在15天后进行，分别考察时间，药物浓度和抑制剂对药物摄入的影响。时间对药物摄取影响的实验在5，10，15，30，45和60分钟进行，药物浓度对药物摄取影响的实验在药物浓度为0.25，0.5，1，2，5mM时进行，抑制剂对摄取实验的影响中抑制剂浓度设定为2.5mM。具体操作如下，除去原有培养基后，用37℃的PBS洗涤细胞3次，然后在37℃培养箱中培养30分钟。给药后，细胞也在37℃培养箱中培养，然后用冷的PBS溶液快速洗涤细胞3次，用纯净水收集细胞并超声破碎。通过BCA方法测定蛋白质的浓度，并通过UPLC-MS/MS方法测定前药及母药的浓度。从图6可看出，前药和母药均具有一定的时间和浓度依赖性。摄取结果显示，相对与母药来看，三个小分子前药的细胞摄取均有增加，其中前药OA-5-FU的细胞摄取最高，显示出良好的细胞摄取性。

实施例7：靶向转运体的单羧酸链的成酯前药的细胞转运试验

为了考察前药的Caco-2细胞膜渗透性，进行了Transwell实验。该实验检测了药物AL→BP侧和BP→AL侧的渗透性，以及抑制剂对前药渗透性的影响。以每孔1×10⁴个细胞接种在12孔板中。将0.5ml含有细胞的培养基置于室中，并在外面放置1.5ml空白培养基。从前一周开始每隔一天更换正常培养基，每天更换含有丁酸的培养基7天，直至培养21天。选择具有大于250Ω·cm 2的良好TEER值的Caco-2细胞用于前药跨膜转运实验。对于AL→BP实验，用37℃HBSS缓冲液洗涤Caco-2细胞单层3次，然后在37℃培养箱中孵育30分钟，然后吸出HBSS缓冲液并在肠腔侧加入0.5ml的5-FU或前药溶液。在基底侧加入1.5ml的HBSS缓冲液。将携带

膜的12孔板在恒温培养箱中孵育。在5，15，30，45，60，90和120分钟时从BL侧取出适量的HBSS缓冲液，并加入等量空白HBSS缓冲液。将样品储存在-80℃的低温冰箱中，并通过UPLC/MS/MS进行测试。对于BP→AL实验，将5-FU或前药溶液加入到基底侧1.5ml，并向肠腔侧加入0.5ml的HBSS缓冲液。将携带Transwell膜的12孔板在恒温培养箱中孵育。在5，15，30，45，60，90和120分钟时从AP侧取出适量HBSS缓冲液，并加入等量空白HBSS缓冲液。将样品储存在-80℃的低温冰箱中，并通过UPLC/MS/MS进行测试。最后，使用表观渗透系数方程计算药物的细胞渗透性结果。从图7可以看出，前药在AL→BP侧的细胞渗透性也均有提高，其中前药OA-5-FU的细胞转运效果最好，说明该前药的渗透性最好。

实施例8：靶向转运体的单羧酸链的成酯前药的体内安全性试验

将昆明小鼠随机分成3组。根据40mg/kg的剂量，灌胃给予PBS，5-FU和前药OA-5-FU。连续胃内给药后7天，取出小鼠的十二指肠，空肠，回肠和结肠，置于10％福尔马林中保存用于组织学分析。免疫化学染色过程通过嵌入，脱蜡，染色，脱水和密封等步骤完成，最后进行镜检得出结果。

在之前的报告中可以看出，MCT1转运蛋白几乎遍布全身。所以靶向MCT1的转运蛋白可能具有器官毒性。对小鼠的十二指肠，空肠，回肠和结肠进行组织学染色。从染色结果可以看出(图8)在5-FU组中，十二指肠，空肠和回肠组织中发生炎性细胞浸润，并且少量炎症细胞浸润在结肠组织中，肠绒毛变短。在PBS和前药组的十二指肠，空肠，回肠以及结肠中未观察到显着毒性。这表明前药可以降低5-FU的肠道毒性，提高药物在体内的安全性。

Claims (4)

1.如下的靶向MCT1转运体的5-氟尿嘧啶成酯前药在制备靶向MCT1转运体的药物中的应用：

2.如下的靶向MCT1转运体的5-氟尿嘧啶成酯前药在制备抗肿瘤药物中的应用：

3.如权利要求1或2所述的靶向MCT1转运体的5-氟尿嘧啶成酯前药的应用，其特征在于，

采用如下方法制备：

首先将5-氟尿嘧啶的N1位羟甲基化，然后与经过活化的羧酸成酯，得到最终产物。

4.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的5-氟尿嘧啶成酯前药和药学上可接受的载体或赋形剂组成药物组合物。

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