CN102532533B - 一种聚(天冬氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种聚(天冬氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物，其特征在于，所述聚(天冬氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物具有式(1)所示的结构，其中，n为15-30，x为10-120，y为10-120，z为10-120，A为具有式(2)所示结构的基团；本发明还提供一种聚(天冬氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的制备方法及其在制备药物组合物中的应用。本发明的两亲性聚(天冬氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的纳米胶束既可以作为水溶性药物载体，也可以作为脂溶性药物载体，适用类型广泛，并且能够有效地延长药效，提高了生物利用度和生物活性。
Description
技术领域
本发明涉及一种聚(天冬氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物及其制备方法，以及在制备药物组合物中的应用。
背景技术
聚天冬氨酸(PASP)是一种带有羧酸侧链的聚合氨基酸，是天冬氨酸单体的氨基和羧基缩水而成的聚合物，有α和β两种构型。天然的聚氨基酸中聚天冬氨酸片段都是以α构型存在的，而合成的聚天冬氨酸中大部分是α和β两种构型的混合物(王海平，海霞，李春梅等，聚天冬氨酸的研究及应用进展，河北师范大学学报/自然科学版，2008，32(4)：517)。
热缩聚得到的聚天冬氨酸，因其结构主链上的肽键易受微生物、真菌等作用而断裂，最终降解产物是对环境无害的水和二氧化碳。利用昆明种小鼠急性毒性实验、Ames实验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核实验研究聚天冬氨酸的一般毒性与致突变性，结果显示：聚天冬氨酸既无毒性也无致突变作用。因此，聚天冬氨酸是生物降解性好的、环境友好型、可以进入人体的化学品(郭艳玲，赵军，任翔宇等，两亲性接枝聚天冬氨酸的合成与降解性能研究，天津科技大学学报，2008，23(3)：49-51)。
聚天冬氨酸通常有两种生产方法：第一种是L-天冬氨酸法。由L-天冬氨酸在一定条件下缩聚、水解、中和而成。第二种是马来酸酐法。马来酸酐的铵盐经缩聚、水解、中和制得聚天冬氨酸(方莉，谭天伟，聚天门冬氨酸的合成及其应用，化工进展，2001(3)：24-28)。水处理用和农业用聚天冬氨酸可以用此法生产。
聚天冬氨酸在医药领域的应用很广泛。在聚合物胶束聚乙二醇-聚天冬氨酸中包埋抗肿瘤药顺铂，其中寡聚天冬氨酸可以起到稳定胶束的作用，从而使该胶束可以用作药物载体(张宏娟，张灿，平其能.聚合物胶束作为药用载体的研究与应用，药学进展，2002，26(6)：326-329)。聚天冬氨酸通过阻止含胺胍基物质的电生理学的变化来保护小管细胞。聚天冬氨酸对庆大霉素干扰耳蜗磷脂组织代谢有抑制作用。
聚乳酸(PLA)是最早获得美国FDA批准认可能进入人体的可生物降解高分子材料。它的生物相容性好、可以在体内生物降解，因此很适宜于用作药物载体材料，被用作药物缓释材料和外科修复材料(Slager J，Domb AJ，Stereocomplexes based on poly(lactic acid)and insulin：formulation and releasestudies.Biomaterials，2002，23(22)：4389-4396)。然而，PLA的均聚物却存在不少的缺陷。首先PLA属于聚酯，为疏水性物质，降低了其生物相容性；其次在自然条件下降解周期较难控制，而高分子药物的控制缓释体系对不同药物的要求使其载体材料应具有不同的降解速率；最后，乳酸缩聚制备的产物相对分子量分布较宽，聚乳酸制品有性脆、力学强度较低等缺陷。
在聚乳酸链段中引入亲水性的链段，可以使聚乳酸的性能有很大的改善(Hu Zhiguo，Fan Xiaoshan，Guisheng Zhang.Synthesis and characterization ofglucose-grafted biodegradable amphiphilic glycopolymers P(AGE-glucose)-b-PLA.Carbohydrate Polymers.2010，79：119-124)。聚乳酸可以由丙交酯(L-丙交酯、D-丙交酯、D，L-丙交酯)自身聚合而成，也可由亲水性材料和丙交酯反应，直接形成含有聚乳酸的两亲性接枝共聚物。
磷脂酰乙醇胺是磷脂质的一种，亦曾称为脑磷酯。在生物界所存在的磷脂中，磷脂酰乙醇胺的含量仅次于卵磷酯，在大肠菌中，其约占总磷脂的80％。磷脂是生物膜的重要组分，是维持生命活动的基础物质(吕俊，吕灿群，豚鼠组织中磷脂酰乙醇胺生物合成能力的比较，皖南医学院学报，2005，24(3)：167)。磷脂酰乙醇胺生物是生物相容性材料，对疏水性和含有蒽环的药物有很好的包载效果。但磷脂酰乙醇胺疏水性太强，作为药物载体有一定的局限性。
国内科研人员将末端带羧基的二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)与PEG的衍生物结合于脂质体中，制成长循环脂质体，再通过其羧基与配体上羟基的酯化作用，将膀胱癌单克隆抗体或小鼠免疫球蛋白与脂质体表面偶联，制成免疫脂质体。体外靶细胞杀伤活性检测和小鼠组织分布试验表明，该免疫脂质体可选择性杀伤人膀胱癌细胞，减少脂质体在肝、脾中的分布，延长血中滞留时间(脂质体的应用及研究进展(二)医药化工，2004，5：40.；V.P.Torchilin，T.S.Levchenko，A.N.Lukyanov，B.A.Khaw，A.L.Klibanov，R.Rammohan，G.P.Samokhin，K.R.Whiteman.p-Nitrophenylcarbonyl-PEG-PE-liposomes：fast and simple attachment of specific ligands，including monoclonalantibodies，to distal ends of PEG chains via p-nitrophenylcarbonyl groups.Biochimica et Biophysica Acta，2001，397-411)。
两亲性聚合物胶束属于纳米缔合胶体体系，是一种新型的药物载体，具有很高的内核载药容量和独特的体内分布特征。两亲性聚合物在结构上可以划分出亲水部分和疏水部分。由于这种独特的化学结构，在水溶液中能形成具有球形内核-外壳结构的聚合物胶束，其疏水部分构成内核，亲水部分形成外壳(Adams ML，Lavasanifar A，Kwon GS.Amphiphilic block copolymersfor drug delivery.Journal of Pharmaceutical Sciences，2003，92(7)：1343-1355)。内核可以作为疏水性药物的容器，将药物增溶在核心，降低毒副作用，外壳可对药物起保护作用，提高药物的稳定性。在难溶性药物、大分子药物和基因治疗药物载体给药方面具有独特的优势。
发明内容
本发明的目的在于克服聚乳酸和磷脂酰乙醇胺亲水性差的缺点，利用聚天冬氨酸的亲水性和生物相容性，提供一种新型的两亲性聚(天冬氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物。
本发明的另一个目的在于提供所述两亲性聚(天冬氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的制备方法和应用。
本发明提供了一种聚(天冬氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物，其特征在于，所述聚(天冬氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物具有式(1)所示的结构，
其中，n为15-30，x为10-120，y为10-120，z为10-120，A为具有式(2)所示结构的基团，
其中，R和R’各自独立地为碳原子数为15-21的烃基。
本发明还提供了一种聚(天冬氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)在惰性气体保护下，在搅拌条件下，使天冬氨酸与丙交酯接触，得到含有具有式(3)所示结构的聚(天冬氨酸-co-乳酸)接枝聚合物的第一产物，
(2)在含氮杂原子的六元杂环化合物的存在下，在第一有机溶剂中，将第一产物与4-硝基苯氯甲酸酯接触，或者从第一产物分离出未反应的反应物，将分离出未反应的反应物的第一产物与4-硝基苯氯甲酸酯接触，得到含有具有式(4)所示结构的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯甲酸酯接枝聚合物的第二产物；所述第一有机溶剂为能够溶解含氮杂原子的六元杂环化合物、具有式(3)所示结构的聚(天冬氨酸-co-乳酸)接枝聚合物和4-硝基苯氯甲酸酯且不与含氮杂原子的六元杂环化合物、具有式(3)所示结构的聚(天冬氨酸-co-乳酸)接枝聚合物或4-硝基苯氯甲酸酯进行反应的有机溶剂，
(3)在烷基胺的存在下，在第二有机溶剂中，使第二产物与具有式(5)所示结构的磷脂酰乙醇胺接触，或者去除第二产物中的第一有机溶剂，使去除第一有机溶剂后的第二产物与具有式(5)所示结构的磷脂酰乙醇胺接触，得到含有具有式(1)所示结构的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的第三产物，将第三产物与三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液接触，或者去除第三产物中的第二有机溶剂，将去除第二有机溶剂后的第三产物与三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液接触，所述第二有机溶剂为能够溶解烷基胺、具有式(4)所示结构的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯甲酸酯接枝聚合物、具有式(5)所示结构的磷脂酰乙醇胺且不与烷基胺、具有式(4)所示结构的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯甲酸酯接枝聚合物或具有式(5)所示结构的磷脂酰乙醇胺进行反应的有机溶剂，
A为具有式(2)所示结构的基团，
其中，在式(1)、式(3)和式(4)中，n为15-30，x为10-120，y为10-120，z为10-120，在式(2)和式(5)中，R和R’各自独立地为碳原子数为15-21的烃基。
此外本发明还提供了由上述方法制备得到的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物以及上述聚(天冬氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物或由上述方法制备得到聚(天冬氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的应用。
本发明提供的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物同时具有亲水和疏水两部分，亲水部分为聚天冬氨酸部分，疏水部分为聚乳酸和磷脂酰乙醇胺部分。在水溶液中可以自组装成聚(天冬氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的纳米结构，亲水片段形成外壳，疏水片段形成内核，构成独特的核-壳结构。因此，本发明的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物生物相容性效果好，可以作为药物载体，且易于被人体接受，可以在人体内代谢。
本发明的两亲性聚(天冬氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的纳米胶束既可以作为水溶性药物载体，也可以作为脂溶性药物载体，适用类型广泛，并且能够有效地延长药效，提高了生物利用度和生物活性。与其它种类的高分子药物载体相比，由于聚(天冬氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物含有聚天冬氨酸链段和聚乳酸链段，具有可生物降解、良好生物相容性和生物亲和性、无毒、易于化学改性等优点。利用本发明的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物作为载体，与阿霉素和紫杉醇制成的药物组合物对肿瘤细胞，尤其是肺癌细胞、宫颈癌细胞和肝癌细胞都有较强的杀伤力，并能够持续释放，此外，药物释放还具有pH敏感性。
附图说明
图1a为本发明一种实施方式中的天冬氨酸的红外光谱图；图1b为本发明一种实施方式中的聚(天冬氨酸-co-乳酸)接枝聚合物的红外光谱图；图1c为本发明一种实施方式中的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯接枝聚合物的红外光谱图；图1d为本发明一种实施方式中的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的红外光谱图。
图2a为核磁谱图库(Spectral Database for Organic Compounds SDBS)中天冬氨酸的核磁共振氢谱；图2b为本发明一种实施方式中的聚(天冬氨酸-co-乳酸)接枝聚合物的核磁共振氢谱；图2c为本发明一种实施方式中的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的核磁共振氢谱。
图3a为核磁谱图库(Spectral Database for Organic Compounds SDBS)中天冬氨酸的核磁共振碳谱；图3b为本发明一种实施方式中的聚(天冬氨酸-co-乳酸)接枝聚合物的核磁共振碳谱；图3c为本发明一种实施方式中的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的核磁共振碳谱。
图4a为本发明一种实施方式中的二棕榈酰磷脂酰乙醇胺的核磁共振磷谱图；图4b为本发明一种实施方式中的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的核磁共振磷谱图。
图5为本发明一种实施方式中的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物纳米粒子的透射电镜图。
图6为本发明一种实施方式中的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物纳米粒子粒径分布图。
图7为本发明一种实施方式中的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的水溶液中芘的荧光发射光谱图。
图8为本发明一种实施方式中的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物纳米粒子的临界胶束浓度图。
图9为聚(天冬氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物与阿霉素形成的药物组合物(简写为Polymer/DOX NPs)的透射电镜图。
图10为聚(天冬氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物与紫杉醇形成的药物组合物(简写为Polymer/PTx NPs)的透射电镜图。
图11为Polymer/PTx NPs和PTx的体外释放曲线图。
具体实施方式
本发明提供一种聚(天冬氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物，其特征在于，所述聚(天冬氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物具有式(1)所示的结构，
其中，n、x、y和z为平均聚合度，本发明中，n、x、y和z都是通过投料比和重均分子量计算获得，为了得到具备更好的负载药物能力的聚合物，优选地，n为15-30，进一步优选为22-23；x为10-120，进一步优选为10-105；y为10-120，进一步优选为10-105；z为10-120，进一步优选为10-105；A为具有式(2)所示结构的基团，
其中，R和R’各自独立地为碳原子数为15-21的烃基。
根据本发明，所述聚(天冬氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的重均分子量优选为4000-27000，进一步优选为4200-25100；所述R和R’可以各自独立地为碳原子数为15、17的烷基或碳原子数为17且含有一个不饱和双键的烃基，优选地，所述R和R’同时为C15H31、C17H35或CH3(CH2)7CH＝CH(CH2)7-，最优选地，所述R和R’同时为C15H31。
根据本发明，所述聚(天冬氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物在水溶液中可以形成颗粒，在以药物载体为目的的前提下，优选颗粒的颗粒直径为80-200纳米，进一步优选为90-160纳米。
本发明还提供一种聚(天冬氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的制备方法，该方法如前所述，优选地，步骤(1)中，所述惰性气体可以为本领域常规的各种惰性气体，如氮气和元素周期表第零族元素的气体，本发明中，所述惰性气体优选为氮气。步骤(3)中，式(1)、式(3)和式(4)中，n、x、y、z的取值范围和R和R’的优选基团与上述描述相同的，在此不再赘述。
根据本发明，可以将第一产物直接用于下步反应，也可以将第一产物进行初步的纯化再用于下步反应，如，可以从第一产物中分离掉未反应的反应物，第一产物为浅棕色液体，从第一产物分离出未反应的反应物的方法可以为，将第一产物溶于第三有机溶剂中，过滤去除未反应的反应物，然后将第三有机溶剂去除，得到第一固体产物，再将所得第一固体产物进行水洗，干燥后固体可以在20-30℃下真空干燥24-48小时。
根据本发明，由于天冬氨酸在高温下可以自身聚合形成聚天冬氨酸，丙交酯可以直接和聚天冬氨酸上的羟基反应，因此，通常地，反应物中丙交酯过量，优选地，步骤(1)中，天冬氨酸与丙交酯的摩尔比为1∶1-10，进一步优选为1∶2-5，因此，所述过滤去除未反应的反应物主要指未反应的丙交酯，所述去除第三有机溶剂的方法可以为本领域常规的方法，如旋转蒸发法。
以每克第一产物为基准，所述第三有机溶剂的用量优选为0.5-2毫升，所述第三有机溶剂可以为本领域各种有机溶剂，只要满足为具有式(3)所示结构的聚(天冬氨酸-co-乳酸)接枝聚合物的良溶剂，同时为未反应的反应物，即丙交酯的不良溶剂的条件即可，本发明中，所述第三有机溶剂优选为N，N-二甲基甲酰胺。
根据本发明，所述天冬氨酸优选为L-天冬氨酸，所述丙交酯优选为L-丙交酯，所述L-天冬氨酸和L-丙交酯均可通过商购获得，如L-天冬氨酸和L-丙交酯均可购自Alfar Aesar公司。
根据本发明，所述天冬氨酸和丙交酯接触的条件包括，温度可以为150-200℃，优选为160-180℃，时间可以为16-26小时，优选为18-24小时。为了得到具备更好性能的产品，优选先在较高的温度180℃下反应2-5小时，然后在相对较低的温度160℃下反应13-21小时。
根据本发明，步骤(2)中，所述第一产物或分离出未反应的反应物的第一产物中含有的具有式(3)所示结构的聚(天冬氨酸-co-乳酸)接枝聚合物与4-硝基苯氯甲酸酯的重量比优选为2-5∶1；以第一产物或分离出未反应的反应物的第一产物中含有的每克具有式(3)所示结构的聚(天冬氨酸-co-乳酸)接枝聚合物为基准，所述含氮杂原子的六元杂环化合物的用量优选为0.02-2克，所述含氮杂原子的六元杂环化合物优选为4-二甲氨基吡啶和/或吡啶；当所述含氮杂原子的六元杂环化合物为4-二甲氨基吡啶时，4-二甲氨基吡啶与第一产物的重量比优选为1∶20-50，当所述含氮杂原子的六元杂环化合物为吡啶时，以第一产物或分离出未反应的反应物的第一产物中含有的每克具有式(3)所示结构的聚(天冬氨酸-co-乳酸)接枝聚合物为基准，所述吡啶的用量优选为0.5-2毫升。
根据本发明，以第一产物或分离出未反应的反应物的第一产物中含有的每克具有式(3)所示结构的聚(天冬氨酸-co-乳酸)接枝聚合物为基准，所述第一有机溶剂的用量3-20毫升，优选为3-10毫升，在满足上述要求的前提下，所述第一有机溶剂优选为氯仿和/或二氯甲烷，进一步优选为氯仿；所述第一产物或分离出未反应的反应物的第一产物与4-硝基苯氯甲酸酯接触的条件包括，温度优选为-10℃至0℃，时间优选为6-10小时。
根据本发明，优选条件下，所述接触均在避光条件下进行，所述第二产物或去除第一有机溶剂后的第二产物中含有的具有式(4)所示结构的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯甲酸酯接枝聚合物与具有式(5)所示结构的磷脂酰乙醇胺的重量比优选为5-50∶1，所述具有式(5)所示结构的磷脂酰乙醇胺可以选自二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油脂酰磷脂酰乙醇胺和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺中的一种或多种，进一步优选为二棕榈酰磷脂酰乙醇胺和/或二油脂酰磷脂酰乙醇胺，最优选为二棕榈酰磷脂酰乙醇胺；以所述第二产物或去除第一有机溶剂后的第二产物中含有的每克具有式(4)所示结构的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯甲酸酯接枝聚合物为基准，所述有机胺的用量优选为0.1-0.5毫升，所述有机胺优选为三乙胺；以所述第二产物或去除第一有机溶剂后的第二产物中含有的每克具有式(4)所示结构的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯甲酸酯接枝聚合物为基准，所述第二有机溶剂的用量3-20毫升，优选为3-10毫升，所述第二有机溶剂优选为氯仿和/或二氯甲烷，进一步优选为氯仿；所述第二产物或去除第一有机溶剂后的第二产物与磷脂酰乙醇胺接触的条件包括，温度优选为20-30℃，时间优选为15-20小时。
根据本发明，步骤(3)中，以所述第三产物或去除第二有机溶剂的第三产物中含有的每克具有式(1)所示结构的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物为基准，所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液的用量优选为5-50毫升，所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液中三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的pH值为8-9，在满足上述pH条件下，本发明对所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液中三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的浓度没有特别的限定；所述第三产物或去除第二有机溶剂的第三产物与三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液接触的条件包括，温度优选为15-25℃，时间优选为15-20小时。
根据本发明，各个步骤中得到的产物可以直接用于下步反应，也可以经过初步提纯再进行下步反应，如，步骤(2)中，可以直接用第二产物进行反应，也可以用去除第一有机溶剂的第二产物进行反应，所述去除第二产物中的第一有机溶剂的方法可以为本领域各种能够从产物中去除有机溶剂的方法，如旋转蒸发法，将蒸发掉至少部分有机溶剂的第二产物在乙醚/石油醚混合溶剂中沉淀，得到第二固体产物；同样地，步骤(3)中，所述去除第三产物中的第二有机溶剂的方法也可以为旋转蒸发法，然后将去除至少部分第二有机溶剂的第三产物在乙醚/石油醚混合溶剂中沉淀，得到第三固体产物，得到的第二固体产物和第三固体产物还可以进一步进行水洗和干燥，所述干燥的条件可以为，在20-30℃下真空干燥24-48小时。其中，所述乙醚/石油醚的比例可以为常规的用于沉淀剂的比例，例如可以为1-3∶1。
根据本发明，步骤(3)中还可以包括将所述第二产物或去除第三有机溶剂的第二产物与三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液接触所得的产物在10-25℃的蒸馏水中避光透析24-48小时。
根据本发明，得到的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物能够制备成纳米颗粒，制备的方法有多种，例如，可以将聚(天冬氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物溶于有机溶剂中，如丙酮，在搅拌条件下，将溶有聚(天冬氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的有机溶剂滴加到水中，形成乳液，依次去除乳液中的有机溶剂和水，得到聚(天冬氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的纳米颗粒，也可以将得到的乳液装入透析袋中透析，用水做为透析液，透析36-48小时后得到聚(天冬氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的纳米颗粒。根据本发明，聚(天冬氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物形成的纳米颗粒的颗粒直径优选为90-160纳米，临界胶束浓度优选为1.0×10-4毫克/毫升-8.5×10-5毫克/毫升。
根据本发明，所述聚(天冬氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物制备成的纳米颗粒可以通过常规的冻干法冻干保存。
本发明还提供由上述方法制备得到的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物。
作为一种两亲性的聚合物，本发明中的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物可以作为药物载体，在制备药物组合物中得到广泛的应用。
所述制备药物组合物的方法有很多种，可以为本领域各种制备药物制剂的方法，只要能将药物负载到聚(天冬氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物载体上即可，例如，当药物为水溶性药物时，所述将药物负载在载体上的方法可以包括以下两种方法中的任意一种，
方法(一)双乳法：包括(1)将药物的水溶液、载体与第一有机溶剂混合，制成初乳液；(2)将初乳液与含有表面活性剂的水溶液A混合，制成复乳液；(3)在搅拌条件下，将复乳液与含有表面活性剂的水溶液B混合，得到第一混合液；(4)去除第一混合液中的第一有机溶剂和水；
方法(二)纳米沉淀法：包括(1)在搅拌条件下，将载体和第二有机溶剂的混合溶液逐滴加入到药物的水溶液中，得到乳液；(2)去除乳液中的第二有机溶剂和水。
所述药物为脂溶性药物时，所述将药物负载在载体上的方法可以包括以下两种方法中的任意一种，
方法(一)溶剂蒸发法：包括(1)在搅拌条件下，将药物、载体和第一有机溶剂的混合溶液与表面活性剂的水溶液混合，得到第一乳液；(2)用机械法将第一乳液破碎；(3)去除第一乳液中的第一有机溶剂和水；
方法(二)纳米沉淀法：包括(1)在搅拌条件下，将药物、载体和第二有机溶剂的混合溶液逐滴加入水中，得到第二乳液；(2)去除第二乳液中的第二有机溶剂和水。
所述水溶性药物例如可以是阿霉素、环磷酰胺、长春新碱、氟尿嘧啶等，所述，所述脂溶性药物例如可以是紫杉醇、水鬼蕉碱、氢化可的松等。
根据本发明的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物作为载体形成的药物组合物，对肿瘤细胞，尤其是肺癌细胞、宫颈癌细胞和肝癌细胞都有较强的杀伤力，并表现出显著的缓释促凋亡作用。
下面，通过实施例对本发明的内容作更详细的描述。
本发明实施例中的重均分子量是通过美国沃特斯515+2410的凝胶渗透色谱(GPC)测得的，溶剂为四氢呋喃。红外光谱检测在美国珀金-埃尔默公司，型号为Spectrum one的红外光谱仪上完成。
核磁共振氢谱和核磁共振碳谱通过瑞士布鲁克公司，型号为AV400的核磁共振谱仪获得，天冬氨酸的核磁共振氢谱和碳谱的检测条件包括：重水为内标，所用溶剂为重水；聚(天冬氨酸-co-乳酸)接枝聚合物、聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的核磁共振氢谱和碳谱二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的核磁共振磷谱的检测条件包括：氯仿为内标，溶剂为氘代氯仿。其他的测试仪器为：动态光散射(Zetasizer NanoZS)、透射电镜(美国FEI，TECNAI G220S-TWIN，200kV)及荧光光谱(美国珀金-埃尔默公司，型号为LS-55)。
实施例1
(1)将L-天冬氨酸(3.33克，0.025mol)(Alfar Aesar公司，98重量％，分析纯)，L-丙交酯(7.2克，0.05mol)(Alfar Aesar公司，97重量％，分析纯)加入到50毫升的单口圆底烧瓶中，抽真空1小时去除氧气，通入氮气，并在氮气保护下在180℃油浴下搅拌反应，溶液变成黄色透明状液体。反应2.5小时后，温度降到160℃反应21小时，反应液为粘稠状的浅棕色液体。从油浴中取出并冷却，产生黄褐色固体，溶于15毫升N，N-二甲基甲酰胺(北京化工厂，分析纯)中，过滤去除未反应的丙交酯。滤液在250毫升的去离子水中沉淀，用100毫升去离子水水洗三次。在25℃真空干燥箱中干燥36小时，得到棕色固体产物聚(天冬氨酸-co-乳酸)接枝聚合物8.4克，经计算得n＝22，x＝20，y＝20，z＝20。
(2)将2.0克聚(天冬氨酸-co-乳酸)接枝聚合物加入到6毫升氯仿中，制备聚(天冬氨酸-co-乳酸)接枝聚合物的氯仿溶液；将1.0克的4-硝基苯氯甲酸酯(Alfar Aesar公司，97重量％)和0.1克的4-二甲氨基吡啶(Alfar Aesar公司，99重量％)用5毫升氯仿溶解，制备4-硝基苯氯甲酸酯和4-二甲氨基吡啶氯仿溶液；将5毫升的4-硝基苯氯甲酸酯、4-二甲氨基吡啶与氯仿的混合溶液滴加到聚(天冬氨酸-co-乳酸)接枝聚合物的氯仿溶液中，然后再加入1毫升的吡啶(北京化工厂，分析纯)，在0℃下反应6小时，得到棕黄色透明的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯接枝聚合物粗产物溶液。将该粗产物溶液在25℃下旋转蒸发除去部分氯仿，然后在200毫升乙醚/石油醚(体积比为2∶1)混合溶液中沉淀、并用乙醚/石油醚(体积比为2∶1)混合溶液洗涤(50毫升×3次)。将得到的产物在25℃真空干燥箱中干燥36小时，得到棕黄色固体产物聚(天冬氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯接枝聚合物2.55克。
(3)将2.0克聚(天冬氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯接枝聚合物加入到6毫升的氯仿中，制备聚(天冬氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯接枝聚合物的氯仿溶液；在6毫升氯仿中加入0.04克的二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(Avanti公司，97重量％)，0.3毫升的三乙胺和6毫升的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯接枝聚合物的氯仿溶液，在25℃下，氮气存在下避光反应20小时，将粗产物溶液在25℃下旋转蒸发除去部分氯仿，然后在200毫升乙醚/石油醚(体积比为1∶1)混合溶液中沉淀、并用乙醚/石油醚(体积比为1∶1)混合溶液洗涤(50毫升×3次)。将得到的纯化产物在25℃真空干燥箱中干燥36小时，得到聚(天冬氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物粗产物1.88克。将1.0克所述聚(天冬氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物粗产物添加到50毫升、pH＝8.5的Tris-HCl缓冲溶液中，在25℃下，在氮气存在下避光反应15小时，然后在透析袋中，用1升的25℃蒸馏水中避光透析48小时，得到纯化后的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物0.89克。最后产物冷冻干燥保存。
(4)将0.01克纯化后的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物溶于2毫升丙酮中，得到聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物溶液，在25℃下，将聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物溶液滴加到磁力搅拌的10毫升水中，搅拌30分钟，形成乳液；用旋转蒸发仪除去乳液中的丙酮；以12,000rpm转速，在25℃下，离心5分钟，除去上清液，得到聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物纳米粒子。
经检测，聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物纳米粒子具有规整的圆球性结构；颗粒直径为109±9.8纳米，重均分子量为6600Da。
图1a、图1b、图1c、图1d分别为实施例1中的天冬氨酸、聚(天冬氨酸-co-乳酸)接枝聚合物、聚(天冬氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯接枝聚合物、聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的红外光谱图。
与图1a比较，图1b中在～1751cm-1附近出现一个新的吸收峰，这是聚乳酸分支中的酯羰基(C＝O)的伸缩振动峰；在～3631cm-1附近是N-H和-OH的伸缩振动峰；在～2996cm-1和～2941cm-1附近是-CH2的伸缩振动峰；在～1660cm-1附近是酰胺基I谱带的峰；在～1452cm-1为-CH3的变形振动峰；在～1184cm-1和～1264cm-1双峰是聚合物上C-O-C的伸缩振动峰；由此可知，丙交酯与天冬氨酸反应生成聚(天冬氨酸-co-乳酸)接枝聚合物。与图1b相比较，图1c中～3411cm-1为N-H的伸缩振动峰(聚(天冬氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯接枝聚合物中没有羟基)；～1722cm-1为4-硝基苯氯甲酸酯上C＝O的伸缩振动峰。由此可知，4-硝基苯氯甲酸酯与聚(天冬氨酸-co-乳酸)接枝聚合物反应生成聚(天冬氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯接枝聚合物。与图1c相比较，图1d中～2673cm-1为P-OH伸缩振动峰。由此可知，二棕榈酰磷脂酰乙醇胺与聚(天冬氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯反应生成聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物。
图2a为实施例1中的天冬氨酸的核磁共振氢谱；图2b为实施例1中的聚(天冬氨酸-co-乳酸)接枝聚合物的核磁共振氢谱；图2c为实施例1中的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的核磁共振氢谱。
与图2a相比较，图2b中～4.2ppm和～5.1ppm代表聚天冬氨酸中的次甲基(-CH)和PLA及其重复单元中的次甲基上的氢原子；～1.2ppm和～1.4ppm代表PLA及其重复单元中的甲基(-CH3)上的氢原子；～8.0ppm代表聚天冬氨酸上连接聚乳酸的N-H上的氢原子。由此可知，丙交酯与天冬氨酸反应生成聚(天冬氨酸-co-乳酸)接枝聚合物。与图2b相比较，图2c中～0.9ppm代表DPPE末端甲基(-CH3)上的氢原子；1.2～1.6ppm代表DPPE上的亚甲基(-CH2)上的氢原子；8.3～8.7ppm代表DPPE上-NH中的氢原子；～9.1ppm代表DPPE上羟基(-OH)上的氢原子。由此可知，DPPE成功接枝到聚合物上生成聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物。
图3a为实施例1中的天冬氨酸的核磁共振碳谱；图3b为实施例1中的聚(天冬氨酸-co-乳酸)接枝聚合物的核磁共振碳谱；图3c为实施例1中聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的核磁共振碳谱。
与图3a相比较，图3b中～165ppm和～170ppm为聚天冬氨酸及PLA链中C＝O上的碳原子；～68ppm和～70ppm为PLA及其重复单元中的-CH上的碳原子；～17ppm和～20ppm为PLA及其重复单元中的-CH3上的碳原子。由此可知，丙交酯与天冬氨酸反应生成聚(天冬氨酸-co-乳酸)接枝聚合物。与图3b相比较，图3c中在～9.0ppm为DPPE末端甲基(-CH3)上的碳原子；～40ppm为DPPE上的亚甲基(-CH2)上的碳原子；170～175ppm为DPPE上羰基(C＝O)上的碳原子。由此可知，DPPE成功接枝到聚合物上生成聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物。
图4a、图4b分别为实施例1中的二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的核磁共振磷谱图。
图4a中DPPE的磷谱出峰位置约在-1.22ppm处，图4b中聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的磷谱出峰位置约在-0.08ppm处，说明发生了化学位移。由此可知，DPPE成功接枝到聚合物上生成聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物。
由红外、核磁谱图分析可知，采用本发明的方法制备可以得到目标化合物聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物。
图5为实施例1中的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物纳米粒子的透射电镜图。
图6为实施例1中的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物纳米粒子光散射示意图。
图7为实施例1中的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物纳米粒子的荧光光谱图，分别代表浓度(单位为毫克/毫升)为0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00005、0.00001、0.0000001的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的水溶液中芘的荧光发射光谱(由于聚合物自身没有荧光，在不同浓度聚合物的水溶液中加入浓度为0.0001毫克/毫升的芘的溶液，检测芘在不同浓度聚合物水溶液中的荧光发射强度)。
图8为实施例1中的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物纳米粒子的临界胶束浓度图，其中，横坐标为聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物浓度(单位为毫克/毫升)的对数值，纵坐标为聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物在391纳米处的吸光值与377纳米处吸光值的比值。
由图5和图6可知，聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物纳米粒子具有规整的圆球性结构，粒子大小在109±9.8纳米；由图7和图8可知，荧光光谱测定胶束的临界胶束浓度为6.2×10-5毫克/毫升。
实施例2
(1)将L-天冬氨酸(3.33克，0.025mol)(AlfarAesar公司，98重量％，分析纯)，L-丙交酯(7.2克，0.05mol)(Alfar Aesar公司，97重量％，分析纯)加入到50毫升的单口圆底烧瓶中，抽真空1小时去除氧气，通入氮气，并在氮气保护下在180℃油浴下搅拌反应，溶液变成黄色透明状液体。反应3小时后，温度降到150℃反应23小时，反应液为粘稠状的浅棕色液体。从油浴中取出并冷却，产生黄褐色固体，溶于20毫升的N，N-二甲基甲酰胺(北京化工厂，分析纯)中，过滤除去未反应的丙交酯。滤液在250毫升的去离子水中沉淀，用100毫升去离子水水洗三次。在20℃真空干燥箱中干燥48小时，得到棕色固体产物聚(天冬氨酸-co-乳酸)接枝聚合物8.9克，经计算得n＝22，x＝20，y＝20，z＝20。
(2)将聚(天冬氨酸-co-乳酸)接枝聚合物1.0克加入到3毫升氯仿中，制备聚(天冬氨酸-co-乳酸)接枝聚合物的氯仿溶液；将0.2克的4-硝基苯氯甲酸酯(Alfar Aesar公司，97重量％)和0.02克的4-二甲氨基吡啶(Alfar Aesar公司，99重量％)用3毫升氯仿溶解，制备4-硝基苯氯甲酸酯和4-二甲氨基吡啶氯仿溶液；将3毫升的4-硝基苯氯甲酸酯、4-二甲氨基吡啶和氯仿的混合溶液滴加到聚(天冬氨酸-co-乳酸)接枝聚合物的氯仿溶液中，然后再加入2毫升的吡啶(北京化工厂，分析纯)，在-10℃下反应10小时，得到棕黄色透明的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯接枝聚合物粗产物溶液。将该粗产物溶液在20℃下旋转蒸发除去部分氯仿，然后在150毫升乙醚/石油醚(体积比为2∶1)混合溶液中沉淀、并用乙醚/石油醚(体积比为2∶1)混合溶液洗涤(50毫升×3次)。将得到的产物在20℃真空干燥箱中干燥48小时，得到棕黄色固体产物聚(天冬氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯接枝聚合物1.02克。
(3)将1.0克聚(天冬氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯接枝聚合物加入到5毫升的氯仿中，制备聚(天冬氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯接枝聚合物的氯仿溶液；在5毫升氯仿中加入0.2克的二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(Avanti公司，97％)、0.1毫升的三乙胺和5毫升的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯接枝聚合物的氯仿溶液，在20℃下，氮气存在下，避光反应15小时，将粗产物溶液在20℃下旋转蒸发除去部分氯仿，然后在150毫升乙醚/石油醚(体积比为1∶1)混合溶液中沉淀、并用乙醚/石油醚(体积比为1∶1)混合溶液洗涤(50毫升×3次)。将得到的纯化产物在20℃真空干燥箱中干燥48小时，得到聚(天冬氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物粗产物0.88克。将0.8克所述聚(天冬氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物粗产物添加到30毫升、pH＝8的Tris-HCl缓冲溶液中，在20℃下，在氮气存在下，避光反应20小时，然后在透析袋中，用1升的20℃的蒸馏水中避光透析36小时，得到纯化后的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物0.69克。最后产物冷冻干燥保存。
(4)将0.1克纯化后的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物溶于5毫升的N，N-二甲基甲酰胺中，搅拌的同时滴加20毫升去离子水中，形成的带蓝光乳液，将该乳液装入透析袋中，放入1升去离子水中透析48小时得到聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物纳米粒子。
经检测，所得到的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的重均分子量为6933Da。聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物纳米粒子具有规整的圆球性结构；颗粒直径为117±8.1纳米；荧光光谱测定胶束的临界胶束浓度为8.5×10-5毫克/毫升。
实施例3
(1)将L-天冬氨酸(6.66克，0.05mol)(Alfar Aesar公司，98重量％，分析纯)，L-丙交酯(7.2克，0.05mol)(Alfar Aesar公司，97重量％，分析纯)加入到100毫升的单口圆底烧瓶中，抽真空1小时去除氧气，通入氮气，并在氮气保护下在190℃油浴下搅拌反应，溶液变成黄色透明状液体。反应5小时后，温度降到160℃反应16小时，反应液为粘稠状的浅棕色液体。从油浴中取出并冷却，产生黄褐色固体，溶于10毫升的N，N-二甲基甲酰胺(北京化工厂，分析纯)中，过滤除去未反应的丙交酯。滤液在300毫升的去离子水中沉淀，用50毫升去离子水水洗三次。在30℃真空干燥箱中干燥24小时，得到棕色固体产物聚(天冬氨酸-co-乳酸)接枝聚合物11.1克，经计算得n＝22，x＝10，y＝10，z＝10。
(2)将2.0克聚(天冬氨酸-co-乳酸)接枝聚合物加入到20毫升氯仿中，制备聚(天冬氨酸-co-乳酸)接枝聚合物的氯仿溶液；将0.8克的4-硝基苯氯甲酸酯(AlfarAesar公司，97重量％)和0.05克的4-二甲氨基吡啶(AlfarAesar公司，99重量％)用5毫升氯仿溶解，制备4-硝基苯氯甲酸酯和4-二甲氨基吡啶氯仿溶液；将5毫升的4-硝基苯氯甲酸酯和4-二甲氨基吡啶的混合氯仿溶液滴加到聚(天冬氨酸-co-乳酸)接枝聚合物的氯仿溶液中，然后再加入2毫升的吡啶(北京化工厂，分析纯)，在-4℃下反应8小时，得到棕黄色透明的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯接枝聚合物粗产物溶液。将该粗产物溶液在20℃下旋转蒸发除去部分氯仿，然后在250毫升乙醚/石油醚(体积比为2∶1)混合溶液中沉淀、并用乙醚/石油醚(体积比为2∶1)混合溶液洗涤(100毫升×3次)。将得到的纯化产物在20℃真空干燥箱中干燥24小时，得到2.38g棕黄色固体聚(天冬氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯接枝聚合物。
(3)将2.0克聚(天冬氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯接枝聚合物加入到20毫升的氯仿中，制备聚(天冬氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯接枝聚合物的氯仿溶液；在5毫升氯仿中加入0.1克的二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(Avanti公司，97％)、0.5毫升的三乙胺和5毫升的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯接枝聚合物的氯仿溶液，在30℃，氮气下避光反应18小时，将粗产物溶液在30℃下旋转蒸发除去部分氯仿，然后在250毫升乙醚/石油醚(体积比为1∶1)混合溶液中沉淀、并用乙醚/石油醚(体积比为1∶1)混合溶液洗涤(100毫升×3次)。将得到的纯化产物在30℃真空干燥箱中干燥24小时，得到聚(天冬氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物粗产物1.9克。将1.8克所述聚(天冬氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物粗产物添加到10毫升，pH为9的Tris-HCl缓冲溶液中，在15℃下，在氮气下避光反应18小时，然后在透析袋中，用1升的15℃蒸馏水中避光透析24小时，得到纯化后的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物1.65克。最后产物冷干保存。
(4)将0.1克纯化后的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物溶于3毫升的四氢呋喃中，在搅拌条件下，滴加到15毫升去离子水中，形成带蓝光乳液，将该乳液装入透析袋中，放入1升去离子水中透析36小时得到聚(天冬氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物纳米粒子。
经检测，所得到的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的重均分子量为4200Da。聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物纳米粒子具有规整的圆球性结构；颗粒直径为97±6.9纳米；荧光光谱测定胶束的临界胶束浓度为4.5×10-5毫克/毫升。
实施例4
(1)将L-天冬氨酸(1.33克，0.01mol)(AlfarAesar公司，98重量％，分析纯)，L-丙交酯(14.4克，0.1mol)(Alfar Aesar公司，97重量％，分析纯)加入到100毫升的单口圆底烧瓶中，抽真空1小时去除氧气，通入氮气，并在氮气保护下在180℃油浴下搅拌反应，溶液变成黄色透明状液体。反应3小时后，温度降到150℃反应13小时，反应液为粘稠状的浅棕色液体。从油浴中取出并冷却，产生黄褐色固体，溶于30毫升的N，N-二甲基甲酰胺(北京化工厂，分析纯)中，过滤未反应的丙交酯。滤液在300毫升的去离子水中沉淀，用100毫升去离子水水洗三次。在25℃真空干燥箱中干燥48小时，得到棕色固体产物聚(天冬氨酸-co-乳酸)接枝聚合物12.6克，经计算得n＝23，x＝105，y＝105，z＝105。
(2)将聚(天冬氨酸-co-乳酸)接枝聚合物2.0克加入到10毫升氯仿中，制备聚(天冬氨酸-co-乳酸)接枝聚合物的氯仿溶液；将0.7克的4-硝基苯氯甲酸酯(Alfar Aesar公司，97重量％)和0.06克的4-二甲氨基吡啶(Alfar Aesar公司，99重量％)用5毫升氯仿溶解，制备4-硝基苯氯甲酸酯和4-二甲氨基吡啶氯仿溶液；将5毫升4-硝基苯氯甲酸酯、4-二甲氨基吡啶和氯仿的混合溶液滴加到聚(天冬氨酸-co-乳酸)接枝聚合物的氯仿溶液中，然后再加入1.5毫升的吡啶(北京化工厂，分析纯)，在0℃下反应6小时，得到棕黄色透明的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯接枝聚合物粗产物溶液。将该粗产物溶液在20℃下旋蒸除去部分氯仿，然后在250毫升乙醚/石油醚(体积比为1∶1)混合溶液中沉淀、并用乙醚/石油醚(体积比为1∶1)混合溶液洗涤(100毫升×3次)。将得到的纯化产物在25℃真空干燥箱中干燥24小时，得到2.2g棕黄色固体聚(天冬氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯接枝聚合物。
(3)将1.0克聚(天冬氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯接枝聚合物加入到5毫升的氯仿中，制备聚(天冬氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯接枝聚合物的氯仿溶液；在5毫升氯仿中加入0.025克的二油脂酰磷脂酰乙醇胺(Avanti公司，97％)、0.5毫升的三乙胺和5毫升的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯接枝聚合物的氯仿溶液，在25℃，氮气下避光反应16小时，将粗产物溶液在30℃下旋转蒸发除去部分氯仿，然后在150毫升乙醚/石油醚(体积比为1∶1)混合溶液中沉淀、并用乙醚/石油醚(体积比为1∶1)混合溶液洗涤(100毫升×3次)。将得到的纯化产物在25℃真空干燥箱中干燥48小时，得到聚(天冬氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯-二油脂酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物粗产物0.9克。将0.8克所述聚(天冬氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯-二油脂酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物粗产物添加到10毫升，pH＝9的Tris-HCl缓冲溶液中，在25℃在氮气下避光反应16小时，然后在透析袋中，1升的20℃蒸馏水中避光透析48小时，得到纯化后的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二油脂酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物0.7克。最后产物冷冻干燥保存。
(4)将0.1克纯化后的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二油脂酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物溶于5毫升的二甲基亚砜中，搅拌的同时滴加20毫升去离子水中，形成的带蓝光乳液，将该乳液装入透析袋中，放入1升去离子水中透析48小时得到聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二油脂酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物纳米粒子。经检测，所得到的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二油脂酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的重均分子量为25010Da。聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二油脂酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物纳米粒子具有规整的圆球性结构；颗粒直径为145±9.4纳米；荧光光谱测定胶束的临界胶束浓度为1.0×10-4毫克/毫升。
实施例5
采用双乳化法，用聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺共聚物对阿霉素进行负载，得到药物组合物。
(1)将2.5毫克实施例1制得的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺共聚物溶于1.5毫升二氯甲烷中，将0.125毫克阿霉素溶于0.125毫升水中，将二者混合，采用超声破碎仪超声破碎3分钟，制成初乳液；(2)将初乳液与3毫升的浓度为2重量％的聚乙烯醇PVA水溶液混匀，并用超声细胞破碎仪超声破碎3分钟，形成复乳液；(3)将复乳液与10毫升的浓度为0.3重量％PVA水溶液混合，并涡旋振荡5分钟；(4)室温下用旋转蒸发仪除去上步混合液中的二氯甲烷；(5)以13,000rpm的转速，室温下，将去除了二氯甲烷的混合液离心10分钟；(6)离心得到的沉淀用蒸馏水洗三次。
用透射电子显微镜(TEM)等测试仪器对得到的纳米粒子进行表征。结果见图9。颗粒直径为212±12.6纳米。
测试实施例1
药液1的制备：将实施例5制得的药物组合物用PBS进行稀释，得到以阿霉素计，浓度分别为10μM、1μM、0.1μM、0.01μM、0.001μM的不同浓度的药液1。
药液2的制备：除了不加入阿霉素以外，其它按照实施例1的方法制备聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺共聚物纳米颗粒，并按照药液1的制备方法，将所得到的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺共聚物纳米颗粒用PBS进行稀释，使所得的不同浓度药液2中的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺共聚物浓度与相应浓度药液1中的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺共聚物浓度相同。
药液3的制备：将阿霉素用PBS进行稀释，得到浓度分别为10μM、1μM、0.1μM、0.01μM、0.001μM的不同浓度的药液3。
对得到的药液1-3进行宫颈癌HeLa细胞的活性测定，按照CCK-8试剂盒的说明书进行测定，其中，Dox表示游离的阿霉素；Polymer/Dox NPs表示负载了阿霉素的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺共聚物；Polymer NPs表示未负载的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺共聚物。不同浓度10μM、1μM、0.1μM、0.01μM、0.001μM的Polymer NPs作用24小时后的细胞活力分别为98％、101.1％、103.5％、102％、93％，作用48小时后的细胞活力分别为98.7％、94.1％、99.7％、106.2％、99.5％；不同浓度10μM、1μM、0.1μM、0.01μM、0.001μM的Polymer/Dox NPs作用24小时后的细胞活力分别为6％、38.8％、89.8％、99.3％、97.8％，作用48小时后的细胞活力分别为0.4％、8.2％、74.4％、93.9％、98.6％；不同浓度10μM、1μM、0.1μM、0.01μM、0.001μM的Dox作用24小时后的细胞活力分别为3.8％、19.2％、43.2％、96％、101.5％，作用48小时后的细胞活力分别为0.3％、0.4％、10％、104.2％、107.2％。
实施例6
采用乳化溶剂蒸发法，用聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺共聚物对紫杉醇药物进行负载，得到药物组合物。
(1)将20毫克聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺共聚物溶于3毫升二氯甲烷中，将2毫克紫杉醇溶于2毫升二氯甲烷中，将二者混合，混合液加入到20毫升的浓度为0.5重量％的表面活性剂聚乙烯醇(PVA)的水溶液中，在室温25℃下，磁力搅拌10分钟；(2)将上述溶液用超声细胞破碎仪进行反应3分钟，形成乳液；(3)室温25℃下，用旋转蒸发仪除去乳液中的二氯甲烷；(4)以13,000rpm的转速，在室温25℃下，将去除二氯甲烷的乳液离心10分钟。(5)离心得到的沉淀用蒸馏水洗三次。
用动态光散射力度分析仪和透射电子显微镜(TEM)等测试仪器对制备的纳米粒子进行表征，如图13所示，颗粒直径为210.3±12.5纳米。
测试实施例2
按照测试实施例1的方法制备药液1-药液3，不同的是，其中的药物阿霉素换为紫杉醇。
对得到的药液1-药液3进行宫颈癌HeLa细胞的活性测定，按照CCK-8试剂盒(日本同仁化学研究所)的说明书进行测定，其中，PTx表示游离的紫杉醇；Polymer/PTx NPs表示负载了紫杉醇的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺共聚物；Polymer NPs表示未负载的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺共聚物。不同浓度1μM、0.1μM、0.01μM、0.001μM的Polymer NPs作用24小时后的细胞活力分别为100.2％、92.1％、100.1％、104.3％，作用48小时后的细胞活力分别为88.3％、93.2％、107％、100％；不同浓度1μM、0.1μM、0.01μM、0.001μM的Polymer/Dox NPs作用24小时后的细胞活力分别为42.2％、35.3％、64.7％、106.1％，作用48小时后的细胞活力分别为8.2％、7.4％、27.8％、98.3％；不同浓度1μM、0.1μM、0.01μM、0.001μM的Dox作用24小时后的细胞活力分别为30.1％、35.8％、44.2％、90.4％，作用48小时后的细胞活力分别为11.5％、10.2％、10％、103.2％。
从两个测试例结果可以看出，聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺共聚物对肿瘤细胞基本没有杀伤作用，载药纳米粒子的杀伤细胞能力与浓度成正比，并且与单纯药物对细胞的杀伤程度相当。说明载药纳米粒子仍然具有广谱抗癌活性。从时间效应上来看，在药物相同浓度条件下，48小时作用后纳米粒子抑制细胞活性的程度比24小时效果增强，表现出持续释放的效果。
测试实施例3
采用透析法，研究了药物组合物的在不同pH值缓冲液的体外释放曲线。取含有0.2毫克紫杉醇的药物组合物或0.2毫克紫杉醇(先用少量聚氧乙烯蓖麻油/乙醇(1∶1)溶解)混悬在5毫升去离子水中，加入透析袋(12000Da)中。将透析袋放置于50毫升离心管中，离心管内加入不同pH值的磷酸盐缓冲液35毫升，置于37℃水浴振荡器中，100rpm。在特定的时间，取出3毫升释放液，并同时补加等量的释放介质。采用紫外分光光度计测定227nm的吸收值确定释放液中的紫杉醇的含量。
在pH5.2和pH7.4磷酸盐缓冲液中的体外释放结果如图11所示。其中，红色和黑色分别表示PTx，即游离的紫杉醇，在pH5.2和pH7.4缓冲液的释放曲线；蓝色和绿色分别表示Polymer/PTx NPs，即负载了紫杉醇的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺共聚物，在pH5.2和pH7.4缓冲液的释放曲线。从实验结果可以看出，药物组合物在不同pH值的释放速度都低于游离的紫杉醇，而且其药物释放具有pH敏感性，在pH5.2的释放速度高于pH7.4的释放速度，这有利于药物组合物在血液循环中的稳定存在，从而降低紫杉醇带来的系统毒性。此外，由于肿瘤细胞内的pH值低于正常细胞的pH值，这种药物释放的酸敏感性有利于其在肿瘤细胞内的药物释放。
Claims (10)
1.一种聚(天冬氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物，其特征在于，所述聚(天冬氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物具有式（1）所示的结构，
其中，n为15-30，x为10-120，y为10-120，z为10-120，A为具有式（2）所示结构的基团，
其中，R和R’各自独立地为碳原子数为15-21的烃基。
2.根据权利要求1所述的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物，其中，所述聚(天冬氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的重均分子量为4000-27000，所述R和R’各自独立地为碳原子数为17且含有一个不饱和双键的烃基或碳原子数为15或17的烷基。
3.一种聚(天冬氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
（1）在惰性气体保护下，在搅拌条件下，使天冬氨酸与丙交酯接触，得到含有具有式（3）所示结构的聚(天冬氨酸-co-乳酸)接枝聚合物的第一产物，
（2）在含氮杂原子的六元杂环化合物的存在下，在第一有机溶剂中，将第一产物与4-硝基苯氯甲酸酯接触，或者从第一产物分离出未反应的反应物，将分离出未反应的反应物的第一产物与4-硝基苯氯甲酸酯接触，得到含有具有式（4）所示结构的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯甲酸酯接枝聚合物的第二产物；所述第一有机溶剂为能够溶解含氮杂原子的六元杂环化合物、具有式（3）所示结构的聚(天冬氨酸-co-乳酸)接枝聚合物和4-硝基苯氯甲酸酯且不与含氮杂原子的六元杂环化合物、具有式（3）所示结构的聚(天冬氨酸-co-乳酸)接枝聚合物或4-硝基苯氯甲酸酯进行反应的有机溶剂，
（3）在烷基胺的存在下，在第二有机溶剂中，使第二产物与具有式（5）所示结构的磷脂酰乙醇胺接触，或者去除第二产物中的第一有机溶剂，使去除第一有机溶剂后的第二产物与具有式（5）所示结构的磷脂酰乙醇胺接触，得到含有具有式（1）所示结构的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的第三产物，将第三产物与三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）缓冲溶液接触，或者去除第三产物中的第二有机溶剂，将去除第二有机溶剂后的第三产物与三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液接触，所述第二有机溶剂为能够溶解烷基胺、具有式（4）所示结构的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯甲酸酯接枝聚合物、具有式（5）所示结构的磷脂酰乙醇胺且不与烷基胺、具有式（4）所示结构的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯甲酸酯接枝聚合物或具有式（5）所示结构的磷脂酰乙醇胺进行反应的有机溶剂，
A为具有式（2）所示结构的基团，
其中，在式（1）、式（3）和式（4）中，n为15-30，x为10-120，y为10-120，z为10-120，在式（2）和式（5）中，R和R’各自独立地为碳原子数为15-21的烃基。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，从第一产物分离出未反应的反应物的方法包括将第一产物溶于第三有机溶剂中，过滤去除未反应的反应物，然后将第三有机溶剂去除，得到第一固体产物，以每克第一产物为基准，所述第三有机溶剂的用量为0.5-2毫升，所述第三有机溶剂为具有式（3）所示结构的聚(天冬氨酸-co-乳酸)接枝聚合物的良溶剂，同时为未反应的反应物的不良溶剂，其中，所述第三有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中，步骤（1）中，天冬氨酸与丙交酯的摩尔比为1:1-10，所述天冬氨酸为L-天冬氨酸，所述丙交酯为L-丙交酯；所述接触的条件包括，温度为150-200℃，时间为16-26小时。
6.根据权利要求3或4所述的方法，其中，步骤（2）中，所述第一产物或分离出未反应的反应物的第一产物中含有的具有式（3）所示结构的聚(天冬氨酸-co-乳酸)接枝聚合物与4-硝基苯氯甲酸酯的重量比为2-5:1；以第一产物或分离出未反应的反应物的第一产物中含有的每克具有式（3）所示结构的聚(天冬氨酸-co-乳酸)接枝聚合物为基准，所述含氮杂原子的六元杂环化合物的用量为0.02-2克，所述含氮杂原子的六元杂环化合物为4-二甲氨基吡啶和/或吡啶；以第一产物或分离出未反应的反应物的第一产物中含有的每克具有式（3）所示结构的聚(天冬氨酸-co-乳酸)接枝聚合物为基准，所述第一有机溶剂的用量为3-20毫升，所述第一有机溶剂为氯仿和/或二氯甲烷；所述第一产物或分离出未反应的反应物的第一产物与4-硝基苯氯甲酸酯接触的条件包括，温度为-10℃至0℃，时间为6-10小时。
7.根据权利要求3或4所述的方法，其中，步骤（3）中，所述接触均在避光条件下进行，所述第二产物或去除第一有机溶剂后的第二产物中含有的具有式（4）所示结构的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯甲酸酯接枝聚合物与具有式（5）所示结构的磷脂酰乙醇胺的重量比为5-50:1，所述具有式（5）所示结构的磷脂酰乙醇胺选自二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油脂酰磷脂酰乙醇胺和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺中的一种或多种；以所述第二产物或去除第一有机溶剂后的第二产物中含有的每克具有式（4）所示结构的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯甲酸酯接枝聚合物为基准，所述烷基胺的用量为0.1-0.5毫升，所述烷基胺为三乙胺；以所述第二产物或去除第一有机溶剂后的第二产物中含有的每克具有式（4）所示结构的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯甲酸酯接枝聚合物为基准，所述第二有机溶剂的用量为3-20毫升，所述第二有机溶剂为氯仿和/或二氯甲烷；所述第二产物或去除第一有机溶剂后的第二产物与磷脂酰乙醇胺接触的条件包括，温度为20-30℃，时间为15-20小时；
步骤（3）中，以所述第三产物或去除第二有机溶剂的第三产物中含有的每克具有式（1）所示结构的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物为基准，所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液的用量为5-50毫升，所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液中三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的pH值为8-9；所述第三产物或去除第二有机溶剂的第三产物与三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液接触的条件包括温度为15-25℃，时间为15-20小时。
8.根据权利要求3所述的方法，其中，步骤（3）中，所述去除第二产物中的第一有机溶剂的方法为将第二产物进行旋转蒸发，然后在乙醚/石油醚混合溶剂中沉淀，得到第二固体产物；
步骤（3）中，所述去除第三产物中的第二有机溶剂的方法为将第三产物进行旋转蒸发，然后在乙醚/石油醚混合溶剂中沉淀，得到第三固体产物。
其中，步骤（3）中还包括将所述第三产物或去除第二有机溶剂的第三产物与三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液接触所得的产物在10-25℃的蒸馏水中避光透析24-48小时。
9.由权利要求3-8中任意一项所述的方法制备得到的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物。
10.权利要求1、2和9中任意一项所述的聚(天冬氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物在制备药物组合物中的应用。
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Granted publication date: 20130619 Termination date: 20201216 |
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