CN103936979B - 一种聚(谷氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及具有式（1）所示的结构的聚(谷氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物，其中，n为20-60，x为15-100，y为15-100，接枝率为90-170%，A为具有式（2）所示结构的基团；本发明还提供一种聚(谷氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的制备方法及其在制备药物组合物中的应用。本发明的两亲性聚(谷氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的纳米胶束既可以作为水溶性药物载体，也可以作为脂溶性药物载体，适用类型广泛，并且能够有效地延长药效，提高了生物利用度和生物活性。式（1）式（2）。
Description
技术领域
本发明涉及一种聚(谷氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物及其制备方法，以及在制备药物组合物中的应用。
背景技术
聚谷氨酸(polyglutamicacid,PGA),是由L-谷氨酸（L-Glu）等通过γ-酰胺键结合形成的一种高分子氨基酸聚合物,在体内可被溶酶体酶降解为内源性物质谷氨酸,不易产生积蓄和毒副作用。它的分子链上具有活性较高的侧链羧基(-COOH),易于和一些药物结合生成稳定的复合物,是一类理想的体内可生物降解的医药用高分子材料。聚谷氨酸（PGA）最早从日本纳豆中分离提取出来,通过化学合成和微生物聚合都可以得到。传统的肽合成法是将氨基酸逐个连接形成多肽,肽合成过程一般包括基团保护、反应物活化、偶联和脱保护。PGA微生物生物合成的研究主要集中在芽孢杆菌属的细菌B.anthracis和B.anthracisATCC9945a、B.licheniformisATCC9945等菌株上(Sanda,F.;Fujiyama,T.;Endo,T.,Chemicalsynthesisofpoly‐γ‐glutamicacidbypolycondensationofγ‐glutamicaciddimer:Synthesisandreactionofpoly‐γ‐glutamicacidmethylester.JournalofPolymerSciencePartA:PolymerChemistry2001,39(5),732-741;原敏夫,上田诚之助.PGA生产的基因解析[J].发酵与工业，1985,43(10):910-9181）。
聚谷氨酸具有良好的生物亲和性和生物降解性，作为药物载体可提供药物缓释性、靶向性，提高药物水溶性，降低药物不良反应，从而提高药物疗效。聚谷氨酸作为生物黏合剂可用于控制组织的持续性渗血或密封气体和机体内液体的渗漏，也可应用于大动脉切割的修补，是一种新型、安全无害的生物胶带。
聚乳酸（PLA）是最早获得美国FDA批准认可能进入人体的可生物降解高分子材料。是以乳酸(lacticacid,LA)为单体经化学合成的新型生物降解性高分子材料。PLA具有无毒、无刺激性及生物相容性良好的特点,可经生物分解、吸收,其强度高、可塑性好因此很适宜于用作药物载体材料，被用作药物缓释材料和外科修复材料。然而，PLA具有高结晶度、大分子链中不含可反应活性基团、不具有亲水性、降解周期较长、力学韧性较差等特性，限制了它在医用领域的广泛应用。在聚乳酸链段中引入亲水性的链段，可以使聚乳酸的性能有很大的改善(Hu,Z.;Fan,X.;Zhang,G.,Synthesisandcharacterizationofglucose-graftedbiodegradableamphiphilicglycopolymersP(AGE-glucose)-<i>b</i>-PLA.CarbohydratePolymers2010,79(1),119-124.)。将氨基酸链段引入聚乳酸，制备的共聚物将兼具两类聚合物的优良性能,而且可以在聚合物链上引入可供进一步修饰的官能团（Zhang,G.;Zhang,R.;Wen,X.;Li,L.;Li,C.,MicellesBasedonBiodegradablePoly(l-glutamicacid)-b-PolylactidewithParamagneticGdIonsChelatedtotheShellLayerasaPotentialNanoscaleMRI-VisibleDeliverySystem.Biomacromolecules2007,9(1),36-42；Lu,D.;Ren,Z.;Zhou,T.;Wang,S.;Lei,Z.,Synthesisandcharacterizationofamphiphilicbiodegradablepoly(glutamicacid‐co‐lacticacid‐co‐glycolicacid)bydirectpolycondensation.JournalofAppliedPolymerScience2008,107(6),3638-3643.）。
磷脂酰乙醇胺是磷脂质的一种，亦曾称为脑磷酯。在生物界所存在的磷脂中，磷脂酰乙醇胺的含量仅次于卵磷酯，在大肠菌中，其约占总磷脂的80%。磷脂是生物膜的重要组分，是维持生命活动的基础物质（吕俊，吕灿群，豚鼠组织中磷脂酰乙醇胺生物合成能力的比较，皖南医学院学报，2005，24(3)：167），并且作为生物相容性材料，对疏水性和含有蒽环的药物有很好的包载效果。二棕榈酰磷脂酰乙醇胺（DPPE）是磷脂的一种，在生物界存在的磷脂中，磷脂酰乙醇胺的含量仅次于卵磷酯，由于具备良好的生物相容性及生物可降解性，DPPE是常用的作为药物载体的材料之一。DPPE中两个长链脂肪酸构成的磷脂类分子具有较强的疏水作用，可使胶束结构更稳定，而且有研究表明磷脂的长脂肪链可嵌合到阿霉素的蒽醌环中，从而增加对药物的包载量（Kim,T.Y.;Kim,D.W.;Chung,J.Y.;Shin,S.G.;Kim,S.C.;Heo,D.S.;Kim,N.K.;Bang,Y.J.,PhaseIandpharmacokineticstudyofGenexol-PM,acremophor-free,polymericmicelle-formulatedpaclitaxel,inpatientswithadvancedmalignancies.Clinicalcancerresearch2004,10(11),3708-3716.）。因此二棕榈酰磷脂酰乙醇胺（DPPE）很适宜于用作药物载体材料，在药物的控制释放等方面广泛应用。
发明内容
本发明的目的在于克服聚乳酸和磷脂酰乙醇胺亲水性差的缺点，利用聚谷氨酸的亲水性和生物相容性，提供一种新型的两亲性聚(谷氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物。
本发明提供了一种聚(谷氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物，其中，所述聚(谷氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物具有式（1）所示的结构，
式（1），
其中，n为20-60，x为15-100，y为15-100，A为具有式（2）所示结构的基团，
式（2），
其中，R和R’各自独立地为碳原子数为10-25的烃基，所述聚(谷氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的重均分子量为11000-53000Da，接枝率为90-170%。
本发明还提供了一种聚(谷氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的制备方法，该方法包括以下步骤：
（1）在惰性气体保护下，使谷氨酸与丙交酯接触，得到含有具有式（3）所示结构的聚(谷氨酸-co-乳酸)接枝聚合物的第一产物，
式（3）；
（2）在含氮杂原子的六元杂环化合物的存在下，在第一有机溶剂中，将第一产物与4-硝基苯氯甲酸酯接触，或者从第一产物分离出未反应的反应物，将分离出未反应的反应物的第一产物与4-硝基苯氯甲酸酯接触，得到含具有式（4）所示结构的聚（谷氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯甲酸酯接枝聚合物的第二产物；所述第一有机溶剂为能够溶解含氮杂原子的六元杂环化合物、具有式（3）所示结构的聚(谷氨酸-co-乳酸)接枝聚合物和4-硝基苯氯甲酸酯且不与含氮杂原子的六元杂环化合物、具有式（3）所示结构的聚(谷氨酸-co-乳酸)接枝聚合物或4-硝基苯氯甲酸酯进行反应的有机溶剂，
式（4）；
（3）在烷基胺的存在下，在第二有机溶剂中，使第二产物与具有式（5）所示结构的磷脂酰乙醇胺接触，或者去除第二产物中的第一有机溶剂，使去除第一有机溶剂后的第二产物与具有式（5）所示结构的磷脂酰乙醇胺接触，，得到含有具有式（1）所示结构的聚(谷氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的第三产物，将第三产物与三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液接触，或者去除第三产物中的第二有机溶剂，将去除第二有机溶剂后的第三产物与三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液接触，所述第二有机溶剂为能够溶解烷基胺、具有式（4）所示结构的聚(谷氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯甲酸酯接枝聚合物、具有式（5）所示结构的磷脂酰乙醇胺且不与烷基胺、具有式（4）所示结构的聚(谷氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯甲酸酯接枝聚合物或具有式（5）所示结构的磷脂酰乙醇胺进行反应的有机溶剂
式（5），
式（1），
A为具有式（2）所示结构的基团，
式（2），
其中，在式（1）、式（3）和式（4）中，n为20-60，x为15-100，y为15-100，在式（2）和式（5）中，R和R’各自独立地为碳原子数为10-25的烃基。
本发明提供的聚(谷氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物同时具有亲水和疏水两部分，亲水部分为聚谷氨酸部分，疏水部分为聚乳酸和磷脂酰乙醇胺部分。在水溶液中可以自组装成聚(谷氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的纳米结构，亲水片段形成外壳，疏水片段形成内核，构成独特的核-壳结构。因此，本发明的聚(谷氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物生物相容性效果好，可以作为药物载体，且易于被人体接受，可以在人体内代谢。本发明的两亲性聚(谷氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的纳米胶束既可以作为水溶性药物载体，也可以作为脂溶性药物载体，适用类型广泛，并且能够有效地延长药效，提高了生物利用度和生物活性。与其它种类的高分子药物载体相比，由于聚(谷氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物含有聚谷氨酸链段、聚乳酸链段和磷脂酰乙醇胺链段，具有可生物降解、良好生物相容性和生物亲和性、无毒、易于化学改性等优点。因此，本发明中的这种聚(谷氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的制备方法具有广泛的应用性。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1a为本发明实施例1中的谷氨酸的红外光谱图；图1b为本发明实施例1中的聚(谷氨酸-co-乳酸)接枝聚合物的红外光谱图；图1c为本发明实施例1中的聚(谷氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯接枝聚合物的红外光谱图；图1d为本发明实施例1中的聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的红外光谱图。
图2a为核磁谱图库（SpectralDatabaseforOrganicCompoundsSDBS）中谷氨酸的核磁共振氢谱；图2b为本发明实施例1中的聚(谷氨酸-co-乳酸)接枝聚合物的核磁共振氢谱；图2c为本发明实施例1中的聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的核磁共振氢谱。
图3a为谷氨酸的核磁共振碳谱；图3b为本发明实施例1中的聚(谷氨酸-co-乳酸)接枝聚合物的核磁共振碳谱；图3c为本发明实施例1中的聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的核磁共振碳谱。
图4a为本发明实施例1中的二棕榈酰磷脂酰乙醇胺的核磁共振磷谱图；图4b为本发明实施例1中的聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的核磁共振磷谱图。
图5为本发明实施例1中的聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物纳米粒子的透射电镜图。
图6为本发明实施例1中的聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物纳米粒子粒径分布图。
图7为本发明实施例1中的聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的水溶液中芘的荧光发射光谱图。
图8为本发明一种实施方式中的聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物纳米胶束的临界胶束浓度图。
图9、图10为本发明测试实施例1中载有阿霉素的聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物纳米粒子的对宫颈癌HeLa细胞生长抑制作用图。
图11为本发明测试实施例2中载有阿霉素的聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物纳米粒子体外释放图。
具体实施方式
本发明提供一种聚(谷氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物，其中，所述聚(谷氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物具有式（1）所示的结构，
式（1），
其中，n为20-60，x为15-100，y为15-100，A为具有式（2）所示结构的基团，
式（2）
其中，R和R’各自独立地为碳原子数为10-25的烃基，所述聚(谷氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的重均分子量为11000-53000Da，接枝率为90-170%。
本发明中，n、x和y都是通过投料比和重均分子量计算获得，为了得到具备更好的负载药物能力的聚合物，优选地，n为20-30，x为70-90，y为70-90，接枝率为110-140%，R和R’各自独立地为碳原子数为15-21的烃基，所述聚(谷氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的重均分子量为30000-45000Da。
根据本发明，所述聚(谷氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物在水溶液中可以形成颗粒，所述颗粒的颗粒直径可以在较大范围内变化，在以药物载体为目的的前提的下，优选颗粒的颗粒直径为150-220纳米，进一步优选为180-210纳米。
本发明还提供一种聚(谷氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的制备方法，其中，该方法包括以下步骤：
（1）在惰性气体保护下，使谷氨酸与丙交酯接触，得到含有具有式（3）所示结构的聚(谷氨酸-co-乳酸)接枝聚合物的第一产物，
式（3）；
（2）在含氮杂原子的六元杂环化合物的存在下，在第一有机溶剂中，将第一产物与4-硝基苯氯甲酸酯接触，或者从第一产物分离出未反应的反应物，将分离出未反应的反应物的第一产物与4-硝基苯氯甲酸酯接触，得到含具有式（4）所示结构的聚（谷氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯甲酸酯接枝聚合物的第二产物；所述第一有机溶剂为能够溶解含氮杂原子的六元杂环化合物、具有式（3）所示结构的聚(谷氨酸-co-乳酸)接枝聚合物和4-硝基苯氯甲酸酯且不与含氮杂原子的六元杂环化合物、具有式（3）所示结构的聚(谷氨酸-co-乳酸)接枝聚合物或4-硝基苯氯甲酸酯进行反应的有机溶剂，
式（4）；
（3）在烷基胺的存在下，在第二有机溶剂中，使第二产物与具有式（5）所示结构的磷脂酰乙醇胺接触，或者去除第二产物中的第一有机溶剂，使去除第一有机溶剂后的第二产物与具有式（5）所示结构的磷脂酰乙醇胺接触，，得到含有具有式（1）所示结构的聚(谷氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的第三产物，将第三产物与三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）缓冲溶液接触，或者去除第三产物中的第二有机溶剂，将去除第二有机溶剂后的第三产物与三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液接触，所述第二有机溶剂为能够溶解烷基胺、具有式（4）所示结构的聚(谷氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯甲酸酯接枝聚合物、具有式（5）所示结构的磷脂酰乙醇胺且不与烷基胺、具有式（4）所示结构的聚(谷氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯甲酸酯接枝聚合物或具有式（5）所示结构的磷脂酰乙醇胺进行反应的有机溶剂
式（5），
式（1），
A为具有式（2）所示结构的基团，
式（2），
其中，在式（1）、式（3）和式（4）中，n为20-60，x为15-100，y为15-100，在式（2）和式（5）中，R和R’各自独立地为碳原子数为10-25的烃基。
优选地，步骤（1）中，所述惰性气体可以为本领域常规的各种惰性气体，如氮气和元素周期表第零族元素的气体，本发明中，所述惰性气体优选为氮气。式（1）、式（3）和式（4）中，n、x、y的取值范围与上述描述相同的，在此不再赘述。
根据本发明，可以将第一产物直接用于下步反应，也可以将第一产物进行初步的纯化再用于下步反应，如，可以从第一产物中分离掉未反应的反应物，第一产物为浅棕色液体，从第一产物分离出未反应的反应物的方法可以为，将第一产物溶于第三有机溶剂中，过滤去除未反应的反应物，然后将第三有机溶剂去除，得到第一固体产物，再将所得第一固体产物进行水洗，干燥后固体可以在20-30℃下真空干燥24-48小时。
根据本发明，由于谷氨酸在高温下可以自身聚合形成聚谷氨酸，丙交酯可以直接和聚谷氨酸上的羟基反应，因此，通常地，反应物中丙交酯过量，优选地，步骤（1）中，谷氨酸与丙交酯的摩尔比为1:5-10，进一步优选为1:5，因此，所述过滤去除未反应的反应物主要指未反应的丙交酯，所述用于去除步骤（1）接触所得混合物中未反应的反应物的有机溶剂的方法可以为本领域常规的方法，如旋转蒸发法。
以每克第一产物为基准，所述第三有机溶剂的用量优选为0.5-2毫升，所述第三有机溶剂可以为本领域各种有机溶剂，只要满足为具有式（3）所示结构的聚(谷氨酸-co-乳酸)接枝聚合物的良溶剂，同时为未反应的反应物，即丙交酯的不良溶剂的条件即可，本发明中，所述第三有机溶剂优选为N,N-二甲基甲酰胺。
根据本发明，所述谷氨酸优选为L-谷氨酸，所述丙交酯优选为L-丙交酯，所述L-谷氨酸和L-丙交酯均可通过商购获得，如L-谷氨酸和L-丙交酯均可购自AlfarAesar公司。
根据本发明，所述谷氨酸和丙交酯接触的条件包括：温度可以为140-180℃，优选为150-170℃，时间可以为21-30小时，优选为24小时。为了得到具备更好性能的产品，优选先在较高的温度170℃下反应2-6小时，然后在相对较低的温度150℃下反应15-24小时。
根据本发明，步骤（2）中，所述第一产物或分离出未反应的反应物的第一产物中含有的具有式（3）所示结构的聚(谷氨酸-co-乳酸)接枝聚合物与4-硝基苯氯甲酸酯的重量比优选为2-4:1；以第一产物或分离出未反应的反应物的第一产物中含有的每克具有式（3）所示结构的聚(谷氨酸-co-乳酸)接枝聚合物为基准，所述含氮杂原子的六元杂环化合物的用量优选为0.25-1克，所述含氮杂原子的六元杂环化合物优选为4-二甲氨基吡啶和/或吡啶；当所述含氮杂原子的六元杂环化合物为4-二甲氨基吡啶时，4-二甲氨基吡啶与第一产物的重量比优选为1:20-40，当所述含氮杂原子的六元杂环化合物为吡啶时，以第一产物或分离出未反应的反应物的第一产物中含有的每克具有式（3）所示结构的聚(谷氨酸-co-乳酸)接枝聚合物为基准，所述吡啶的用量优选为0.05-0.1毫升。
根据本发明，以每克具有式（3）所示结构的聚(谷氨酸-co-乳酸)接枝聚合物为基准，所述步骤（1）中用于谷氨酸与丙交酯接触的有机溶剂的用量3-15毫升，优选为5-10毫升，在满足上述要求的前提下，所述步骤（1）中用于谷氨酸与丙交酯接触的有机溶剂优选为氯仿和/或二氯甲烷，进一步优选为氯仿；所述具有式（3）所示结构的聚(谷氨酸-co-乳酸)接枝聚合物与4-硝基苯氯甲酸酯接触的条件包括：温度优选为-10℃至0℃，时间优选为6-10小时。
根据本发明，优选条件下，所述接触均在避光条件下进行，所述第二产物或去除第一有机溶剂后的第二产物中含有的具有式（4）所示结构的聚(谷氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯甲酸酯接枝聚合物与具有式（5）所示结构的磷脂酰乙醇胺的重量比优选为5-50:1，优选为20-60:1，所述具有式（5）所示结构的磷脂酰乙醇胺可以选自二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油脂酰磷脂酰乙醇胺和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺中的一种或多种，进一步优选为二棕榈酰磷脂酰乙醇胺和/或二油脂酰磷脂酰乙醇胺，最优选为二棕榈酰磷脂酰乙醇胺；以所述第二产物或去除第一有机溶剂后的第二产物中含有的每克具有式（4）所示结构的聚(谷氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯甲酸酯接枝聚合物为基准，所述有机胺的用量优选为0.1-0.5毫升，进一步优选为0.3-0.5毫升，所述有机胺优选为三乙胺；以所述第二产物或去除第一有机溶剂后的第二产物中含有的每克具有式（4）所示结构的聚(谷氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯甲酸酯接枝聚合物为基准，所述第二有机溶剂的用量3-20毫升，优选为3-10毫升，所述第二有机溶剂优选为氯仿和/或二氯甲烷，进一步优选为氯仿；所述第二产物或去除第一有机溶剂后的第二产物与磷脂酰乙醇胺接触的条件包括，温度优选为20-30℃，时间优选为15-24小时。
根据本发明，步骤（3）中，以所述第三产物或去除第二有机溶剂的第三产物中含有的每克具有式（1）所示结构的聚(谷氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物为基准，所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液的用量优选为5-50毫升，所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液中三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的pH值为8-9，在满足上述pH条件下，本发明对所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液中三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的浓度没有特别的限定；所述第三产物或去除第二有机溶剂的第三产物与三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液接触的条件包括，温度优选为15-25℃，时间优选为15-24小时。
根据本发明，各个步骤中得到的产物可以直接用于下步反应，也可以经过初步提纯再进行下步反应，如，步骤（2）中，可以直接用第二产物进行反应，也可以用去除第一有机溶剂的第二产物进行反应，所述去除第二产物中的第一有机溶剂的方法可以为本领域各种能够从产物中去除有机溶剂的方法，如旋转蒸发法，将蒸发掉至少部分有机溶剂的第二产物在乙醚/石油醚混合溶剂中沉淀，得到第二固体产物；同样地，步骤（3）中，所述去除第三产物中的第二有机溶剂的方法也可以为旋转蒸发法，然后将去除至少部分第二有机溶剂的第三产物在乙醚/石油醚混合溶剂中沉淀，得到第三固体产物，得到的第二固体产物和第三固体产物还可以进一步进行水洗和干燥，所述干燥的条件可以为，在20-30℃下真空干燥24-48小时。其中，所述乙醚/石油醚的比例可以为常规的用于沉淀剂的比例，例如可以为1-3:1。
根据本发明，步骤（3）中还可以包括将所述第二产物或去除第三有机溶剂的第二产物与三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液接触所得的产物在10-25℃的蒸馏水中避光透析24-48小时。
根据本发明，得到的聚(谷氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物能够制备成纳米颗粒，制备的方法有多种，例如，可以将聚(谷氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物溶于有机溶剂中，如丙酮，在搅拌条件下，将溶有聚(谷氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的有机溶剂滴加到水中，形成乳液，依次去除乳液中的有机溶剂和水，得到聚(谷氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的纳米颗粒，也可以将得到的乳液装入透析袋中透析，用水做为透析液，透析36-48小时后得到聚(谷氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的纳米颗粒。根据本发明，聚(谷氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物形成的纳米颗粒的颗粒直径优选为90-160纳米，临界胶束浓度优选为1.0×10-4毫克/毫升-8.5×10-5毫克/毫升。
根据本发明，所述聚(谷氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物制备成的纳米颗粒可以通过常规的冻干法冻干保存。
本发明还提供由上述方法制备得到的聚(谷氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物。
作为一种两亲性的聚合物，本发明中的聚(谷氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物可以作为药物载体，在制备药物组合物中得到广泛的应用。
所述制备药物组合物的方法有很多种，可以为本领域各种制备药物制剂的方法，只要能将药物负载到聚(谷氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物载体上即可，例如，当药物为水溶性药物时，所述将药物负载在载体上的方法可以包括以下两种方法中的任意一种，
方法（一）双乳法：包括（1）将药物的水溶液、载体与第一有机溶剂混合，制成初乳液；（2）将初乳液与含有表面活性剂的水溶液A混合，制成复乳液；（3）在搅拌条件下，将复乳液与含有表面活性剂的水溶液B混合，得到第一混合液；（4）去除第一混合液中的第一有机溶剂和水；
方法（二）纳米沉淀法：包括（1）在搅拌条件下，将载体和第二有机溶剂的混合溶液逐滴加入到药物的水溶液中，得到乳液；（2）去除乳液中的第二有机溶剂和水。
所述药物为脂溶性药物时，所述将药物负载在载体上的方法可以包括以下两种方法中的任意一种，
方法（一）溶剂蒸发法：包括（1）在搅拌条件下，将药物、载体和第一有机溶剂的混合溶液与表面活性剂的水溶液混合，得到第一乳液；（2）用机械法将第一乳液破碎；（3）去除第一乳液中的第一有机溶剂和水；
方法（二）纳米沉淀法：包括（1）在搅拌条件下，将药物、载体和第二有机溶剂的混合溶液逐滴加入水中，得到第二乳液；（2）去除第二乳液中的第二有机溶剂和水。
所述水溶性药物例如可以是阿霉素、环磷酰胺、长春新碱、氟尿嘧啶等，所述，所述脂溶性药物例如可以是紫杉醇、水鬼蕉碱、氢化可的松等。
根据本发明的聚(谷氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物作为载体形成的药物组合物，对肿瘤细胞，尤其是肺癌细胞、宫颈癌细胞和肝癌细胞都有较强的杀伤力，并表现出显著的缓释促凋亡作用。
下面结合实施例具体说明本发明。
（1）本发明实施例中的重均分子量是通过美国沃特斯515+2410的凝胶渗透色谱（GPC）测得的，溶剂为四氢呋喃。红外光谱检测在美国珀金-埃尔默公司，型号为Spectrumone的红外光谱仪上完成。
（2）核磁共振氢谱和核磁共振碳谱通过瑞士布鲁克公司，型号为AV400的核磁共振谱仪获得，谷氨酸的核磁共振碳谱的检测条件包括：重水为内标，所用溶剂为重水；聚(谷氨酸-co-乳酸)接枝聚合物、聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的核磁共振氢谱和碳谱二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的核磁共振磷谱的检测条件包括：氯仿为内标，溶剂为氘代氯仿。其他的测试仪器为：动态光散射（ZetasizerNanoZS）、透射电镜（美国FEI,TECNAIG220S-TWIN，200kV）及荧光光谱（美国珀金-埃尔默公司，型号为LS-55）；
（3）、动态光散射：
采用购自马尔文公司的型号为NanoZS的动态光散射仪对所得接枝聚合物纳米粒子的粒径分布进行测定。
（4）、透射电镜：
采用购自美国FEI公司的型号为TecnaiG220S-TWIN的透射电镜对所得聚(谷氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺纳米粒子的形貌进行测定，其中，测试电压为200kV。
（5）、以下实施例中，样品的接枝率采用重量法测定，按照以下公式计算接枝率：
其中，m1为聚谷氨酸-co-乳酸的质量；m2为聚(谷氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的质量；
（6）、荧光光谱：
采用购自美国珀金-埃尔默公司的型号为LS-55的荧光光谱仪对聚乙烯亚胺和所得聚乙烯亚胺-脂肪族聚酯接枝聚合物纳米粒子的荧光性能进行测试。
实施例1
本实施例用来说明聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的合成
（1）将L-谷氨酸（1.47克，0.01mol）（AlfarAesar公司，98重量%，分析纯），L-丙交酯（7.2克，0.05mol）（AlfarAesar公司，97重量%，分析纯）加入到50毫升的单口圆底烧瓶中，抽真空1小时去除氧气，通入氮气，并在氮气保护下在170℃油浴下搅拌反应，溶液变成黄色透明状液体。反应6小时后，温度降到150℃反应24小时，反应液为粘稠状的浅棕色液体。从油浴中取出并冷却，产生黄褐色固体，溶于15毫升N,N-二甲基甲酰胺（北京化工厂，分析纯）中，过滤去除未反应的丙交酯。滤液在250毫升的去离子水中沉淀，用100毫升去离子水水洗三次。在25℃真空干燥箱中干燥36小时，得到棕色固体产物聚(谷氨酸-co-乳酸)接枝聚合物8.4克，经计算得n=20，x=80，y=80。
（2）将2克聚(谷氨酸-co-乳酸)接枝聚合物加入到5毫升氯仿中，制备聚(谷氨酸-co-乳酸)接枝聚合物的氯仿溶液；将1.0克的4-硝基苯氯甲酸酯（AlfarAesar公司，97重量%）和0.1克的4-二甲氨基吡啶（AlfarAesar公司，99重量%）用5毫升氯仿溶解，制备4-硝基苯氯甲酸酯和4-二甲氨基吡啶氯仿溶液；将5毫升的4-硝基苯氯甲酸酯、4-二甲氨基吡啶与氯仿的混合溶液滴加到聚(谷氨酸-co-乳酸)接枝聚合物的氯仿溶液中，然后再加入1毫升的吡啶（北京化工厂，分析纯），在0℃下反应6小时，得到棕黄色透明的聚(谷氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯接枝聚合物粗产物溶液。将该粗产物溶液在25℃下旋转蒸发除去部分氯仿，然后在200毫升乙醚/石油醚（体积比为2:1）混合溶液中沉淀、并用乙醚/石油醚（体积比为2:1）混合溶液洗涤（100毫升×2次）。将得到的产物在25℃真空干燥箱中干燥36h，得到棕黄色固体产物聚(谷氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯接枝聚合物2.42克。
（3）将2.0克聚(谷氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯接枝聚合物加入到5毫升的氯仿中，制备聚(谷氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯接枝聚合物的氯仿溶液；在5毫升氯仿中加入0.05克的二棕榈酰磷脂酰乙醇胺（Avanti公司，97重量%），0.3毫升的三乙胺和5毫升的聚(谷氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯接枝聚合物的氯仿溶液，在25℃下，氮气存在下避光反应20小时，将粗产物溶液在25℃下旋转蒸发除去部分氯仿，然后在200毫升乙醚/石油醚（体积比为1:1）混合溶液中沉淀、并用乙醚/石油醚（体积比为1:1）混合溶液洗涤（50毫升×3次）。将得到的纯化产物在25℃真空干燥箱中干燥36小时，得到聚(谷氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物粗产物1.45克。将1.0克所述聚(谷氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物粗产物添加到50毫升、pH=8.5的Tris-HCl缓冲溶液中，在25℃下，在氮气存在下避光反应15小时，然后在透析袋中，用1L的25℃蒸馏水中避光透析48小时，得到纯化后的聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物0.79克。最后产物冷冻干燥保存。
（4）将0.01克纯化后的聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物溶于2毫升丙酮中，得到聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物溶液，在25℃下，将聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物溶液滴加到磁力搅拌的10毫升水中，搅拌30分钟，形成乳液；用旋转蒸发仪除去乳液中的丙酮；以12,000转/分钟，在25℃下，离心5分钟，除去上清液，得到聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物纳米粒子。
经检测，聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物纳米粒子具有规整的圆球性结构；颗粒直径为184±9.8纳米，重均分子量为24800Da，接枝率为110%。
图1a、图1b、图1c、图1d分别为实施例1中的谷氨酸、聚(谷氨酸-co-乳酸)接枝聚合物、聚(谷氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯接枝聚合物、聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的红外光谱图。
与图1a比较，图1b中在～1751cm-1附近出现一个新的吸收峰，这是聚乳酸分支中的酯羰基（C=O）的伸缩振动峰；在～3381cm-1附近是N–H和–OH的伸缩振动峰；；在～1660cm-1附近是酰胺基I谱带的峰；在～1195cm-1和～1283cm-1双峰是聚合物上C–O–C的伸缩振动峰；由此可知，丙交酯与谷氨酸反应生成聚(谷氨酸-co-乳酸)接枝聚合物。与图1b相比较，图1c中～678cm-1表明苯环的存；～1594and～1339cm-1对应硝基伸缩峰；～3,411cm-1表明羟基的存在。由此可知，4-硝基苯氯甲酸酯与聚(谷氨酸-co-乳酸)接枝聚合物反应生成聚(谷氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯接枝聚合物。与图1c相比较，图1d中～2675cm-1为P–OH伸缩振动峰。由此可知，二棕榈酰磷脂酰乙醇胺与聚(谷氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯反应生成聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物。
图2a为实施例1中的谷氨酸的核磁共振氢谱；图2b为实施例1中的聚(谷氨酸-co-乳酸)接枝聚合物的核磁共振氢谱；图2c为实施例1中的聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的核磁共振氢谱。
与图2a相比较，图2b中～4.2ppm和～5.1ppm代表聚谷氨酸中的次甲基（–CH）和PLA及其重复单元中的次甲基上的氢原子；～1.2ppm和～1.4ppm代表PLA及其重复单元中的甲基（–CH3）上的氢原子；～8.0ppm代表聚谷氨酸上连接聚乳酸的N–H上的氢原子。由此可知，丙交酯与谷氨酸反应生成聚(谷氨酸-co-乳酸)接枝聚合物。与图2b相比较，图2c中～0.9ppm代表DPPE末端甲基（–CH3）上的氢原子；1.2～1.6ppm代表DPPE上的亚甲基（–CH2）上的氢原子；～8.1ppm代表DPPE上–NH中的氢原子；～9.1ppm代表DPPE上羟基（–OH）上的氢原子。由此可知，DPPE成功接枝到聚合物上生成聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物。
图3a为实施例1中的谷氨酸的核磁共振碳谱；图3b为实施例1中的聚(谷氨酸-co-乳酸)接枝聚合物的核磁共振碳谱；图3c为实施例1中聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的核磁共振碳谱。
与图3a相比较，图3b中～162ppm和～169ppm为聚谷氨酸及PLA链中C=O上的碳原子；～67ppm和～69ppm为PLA及其重复单元中的-CH上的碳原子；～17ppm和～20ppm为PLA及其重复单元中的-CH3上的碳原子。由此可知，丙交酯与谷氨酸反应生成聚(谷氨酸-co-乳酸)接枝聚合物。与图3b相比较，图3c中在～9.0ppm为DPPE末端甲基（–CH3）上的碳原子；～40ppm为DPPE上的亚甲基（–CH2）上的碳原子；～170ppm为DPPE上羰基（C=O）上的碳原子。由此可知，DPPE成功接枝到聚合物上生成聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物。
图4a、图4b分别为实施例1中的二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的核磁共振磷谱图。
图4a中DPPE的磷谱出峰位置约在-1.22ppm处，图4b中聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的磷谱出峰位置约在～0.56ppm处，说明发生了化学位移。由此可知，DPPE成功接枝到聚合物上生成聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物。
由红外、核磁谱图分析可知，采用本发明的方法制备可以得到目标化合物聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物。
图5为实施例1中的聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物纳米粒子的透射电镜图。
图6为实施例1中的聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物纳米粒子光散射示意图。
图7为实施例1中的聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物纳米粒子的荧光光谱图，分别代表浓度（单位为毫克/毫升）为0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001的聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的水溶液中芘的荧光发射光谱（由于聚合物自身没有荧光，在不同浓度聚合物的水溶液中加入浓度为0.0001毫克/毫升的芘的溶液，检测芘在不同浓度聚合物水溶液中的荧光发射强度）。
图8为实施例1中的聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物纳米粒子的临界胶束浓度图，其中，横坐标为聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物浓度（单位为毫克/毫升）的对数值，纵坐标为聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物在391纳米处的吸光值与377纳米处吸光值的比值。
由图5和图6可知，聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物纳米粒子具有规整的圆球性结构，粒子大小在184±9.8纳米；由图7和图8可知，荧光光谱测定胶束的临界胶束浓度为1.0×10-5毫克/毫升。
测试实施例1
药液1的制备：将实施例1制得的药物组合物用PBS进行稀释，得到以阿霉素计，浓度分别为10μg/ml、5μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml、0.001μg/ml的不同浓度的药液1。
药液2的制备：除了不加入阿霉素以外，其它按照实施例1的方法制备聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺共聚物纳米颗粒，并按照药液1的制备方法，将所得到的聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺共聚物纳米颗粒用PBS进行稀释，使所得的不同浓度药液2中的聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺共聚物浓度与相应浓度药液1中的聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺共聚物浓度相同。
药液3的制备：将阿霉素用PBS进行稀释，得到浓度分别为10μg/ml、5μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml、0.001μg/ml的不同浓度的药液3。
对得到的药液1-3进行宫颈癌HeLa细胞的活性测定，按照CCK-8试剂盒的说明书进行测定，结果如图9、图10所示，其中，Dox表示游离的阿霉素；Polymer/DoxNPs表示负载了阿霉素的聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺共聚物；PolymerNPs表示未负载的聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺共聚物。不同浓度10μg/ml、5μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml、0.001μg/ml的PolymerNPs作用24小时后的细胞活力分别为96%、101%、101%、102%、103%、93%，作用48小时后的细胞活力分别为98%、95%、94%、101%、103%、92%；不同浓度10μg/ml、5μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml、0.001μg/ml的Polymer/DoxNPs作用24小时后的细胞活力分别为60%、68%、79%、84%、88%、91%，作用48小时后的细胞活力分别为2%、6%、27%、50%、63%、75%；不同浓度10μg/ml、5μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml、0.001μg/ml的Dox作用24小时后的细胞活力分别为-22%、27%、42%、57%、71%、73%，作用48小时后的细胞活力分别为2%、8%、23%、36%、63%、71%。
测试例结果可以看出，聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺共聚物对肿瘤细胞基本没有杀伤作用，载药纳米粒子的杀伤细胞能力与浓度成正比，并且与单纯药物对细胞的杀伤程度相当。说明载药纳米粒子仍然具有广谱抗癌活性。从时间效应上来看，在药物相同浓度条件下，48小时作用后纳米粒子抑制细胞活性的程度比24小时效果增强，表现出持续释放的效果。
测试实施例2
采用透析法，研究了药物组合物在不同pH值缓冲液的体外释放曲线。将20毫克两亲性聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺共聚物，溶解在二氯甲烷中，称取盐酸阿霉素，用去离子水溶解，制备成1毫克/毫升的盐酸阿霉素溶液。将200微升盐酸阿霉素溶液（0.2毫克Dox）加入到共聚物溶液中，选用双乳法制备载药纳米粒子。制备两组相同比例的载药纳米粒子，分别用5毫升的磷酸盐缓冲溶液（pH=5.0、pH=7.4）进行分散。加入透析袋（3500Da）中,将透析袋放置于50毫升离心管，离心管内加入不同pH值得磷酸盐缓冲液35毫升，至于37℃水浴震荡器内，110rpm。在特定时间内，取出3毫升释放液，并同时补加等量的释放介质。采用分光光度计测定480nm的吸收值确定释放液中的阿霉素的含量。
在pH5.0和pH7.4磷酸盐缓冲液中的体外释放结果如图11所示。其中，黑色和红色分别表示Polymer/DoxNPs，即负载了阿霉素的聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺共聚物，在pH5.0和pH7.4缓冲液的释放曲线。从实验结果可以看出，药物释放具有pH敏感性，在pH5.0的释放速度高于pH7.4的释放速度，这有利于药物组合物在血液循环中的稳定存在，从而降低阿霉素带来的系统毒性。此外，由于肿瘤细胞内的pH值低于正常细胞的pH值，这种药物释放的酸敏感性有利于其在肿瘤细胞内的药物释放。
实施例2
（1）将L-谷氨酸（1.47克，0.01mol）（AlfarAesar公司，98重量%，分析纯），L-丙交酯（7.2克，0.05mol）（AlfarAesar公司，97重量%，分析纯）加入到50毫升的单口圆底烧瓶中，抽真空1小时去除氧气，通入氮气，并在氮气保护下在170℃油浴下搅拌反应，溶液变成黄色透明状液体。反应3小时后，温度降到140℃反应18小时，反应液为粘稠状的浅棕色液体。从油浴中取出并冷却，产生黄褐色固体，溶于20毫升的N,N-二甲基甲酰胺（北京化工厂，分析纯）中，过滤除去未反应的丙交酯。滤液在250毫升的去离子水中沉淀，用100毫升去离子水水洗三次。在20℃真空干燥箱中干燥48小时，得到棕色固体产物聚(谷氨酸-co-乳酸)接枝聚合物8.2克，经计算得n=20，x=75，y=75。
（2）将聚(谷氨酸-co-乳酸)接枝聚合物1.0克加入到10毫升氯仿中，制备聚(谷氨酸-co-乳酸)接枝聚合物的氯仿溶液；将0.25克的4-硝基苯氯甲酸酯（AlfarAesar公司，97重量%）和0.025克的4-二甲氨基吡啶（AlfarAesar公司，99重量%）用10毫升氯仿溶解，制备4-硝基苯氯甲酸酯和4-二甲氨基吡啶氯仿溶液；将10毫升的4-硝基苯氯甲酸酯、4-二甲氨基吡啶和氯仿的混合溶液滴加到聚(谷氨酸-co-乳酸)接枝聚合物的氯仿溶液中，然后再加入2毫升的吡啶（北京化工厂，分析纯），在-10℃下反应12h，得到棕黄色透明的聚(谷氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯接枝聚合物粗产物溶液。将该粗产物溶液在20℃下旋转蒸发除去部分氯仿，然后在150毫升乙醚/石油醚（体积比为1:1）混合溶液中沉淀、并用乙醚/石油醚（体积比为1:1）混合溶液洗涤（50毫升×3次）。将得到的产物在20℃真空干燥箱中干燥48h，得到棕黄色固体产物聚(谷氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯接枝聚合物1.12克。
（3）将1.0克聚(谷氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯接枝聚合物加入到10毫升的氯仿中，制备聚(谷氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯接枝聚合物的氯仿溶液；在10毫升氯仿中加入0.15克的二棕榈酰磷脂酰乙醇胺（Avanti公司，97%）、0.1毫升的三乙胺和10毫升的聚(谷氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯接枝聚合物的氯仿溶液，在20℃下，氮气存在下，避光反应15小时，将粗产物溶液在25℃下旋转蒸发除去部分氯仿，然后在150毫升乙醚/石油醚（体积比为2:1）混合溶液中沉淀、并用乙醚/石油醚（体积比为2:1）混合溶液洗涤（50毫升×3次）。将得到的纯化产物在20℃真空干燥箱中干燥48小时，得到聚(谷氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物粗产物0.84克。将0.8克所述聚(谷氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物粗产物添加到30毫升、pH=8的Tris-HCl缓冲溶液中，在20℃下，在氮气存在下，避光反应20小时，然后在透析袋中，用1L的25℃的蒸馏水中避光透析36小时，得到纯化后的聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物0.62克。最后产物冷冻干燥保存。
（4）将0.1克纯化后的聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物溶于5毫升的N,N-二甲基甲酰胺中，搅拌的同时滴加20毫升去离子水中，形成的带蓝光乳液，将该乳液装入透析袋中，放入1升去离子水中透析48小时得到聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物纳米粒子。
经检测，所得到的聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的重均分子量为31500Da。聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物纳米粒子具有规整的圆球性结构；颗粒直径为199±8.1纳米；接枝率为140%。荧光光谱测定胶束的临界胶束浓度为3.5×10-4毫克/毫升。
实施例3
（1）将L-谷氨酸（2.94克，0.02mol）（AlfarAesar公司，98重量%，分析纯），L-丙交酯（7.2克，0.05mol）（AlfarAesar公司，97重量%，分析纯）加入到50毫升的单口圆底烧瓶中，抽真空1小时去除氧气，通入氮气，并在氮气保护下在180℃油浴下搅拌反应，溶液变成黄色透明状液体。反应9小时后，温度降到150℃反应20小时，反应液为粘稠状的浅棕色液体。从油浴中取出并冷却，产生黄褐色固体，溶于10毫升的N,N-二甲基甲酰胺（北京化工厂，分析纯）中，过滤除去未反应的丙交酯。滤液在250毫升的去离子水中沉淀，用50毫升去离子水水洗三次。在30℃真空干燥箱中干燥24小时，得到棕色固体产物聚(谷氨酸-co-乳酸)接枝聚合物9.7克，经计算得n=40，x=90，y=90。
（2）将2.0克聚(谷氨酸-co-乳酸)接枝聚合物加入到8毫升氯仿中，制备聚(谷氨酸-co-乳酸)接枝聚合物的氯仿溶液；将0.5克的4-硝基苯氯甲酸酯（AlfarAesar公司，97重量%）和0.05克的4-二甲氨基吡啶（AlfarAesar公司，99重量%）用8毫升氯仿溶解，制备4-硝基苯氯甲酸酯和4-二甲氨基吡啶氯仿溶液；将8毫升的4-硝基苯氯甲酸酯和4-二甲氨基吡啶的混合氯仿溶液滴加到聚(谷氨酸-co-乳酸)接枝聚合物的氯仿溶液中，然后再加入3毫升的吡啶（北京化工厂，分析纯），在-4℃下反应8小时，得到棕黄色透明的聚(谷氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯接枝聚合物粗产物溶液。将该粗产物溶液在25℃下旋转蒸发除去部分氯仿，然后在300毫升乙醚/石油醚（体积比为2:1）混合溶液中沉淀、并用乙醚/石油醚（体积比为3:1）混合溶液洗涤（100毫升×3次）。将得到的纯化产物在30℃真空干燥箱中干燥24h，得到2.38g棕黄色固体聚(谷氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯接枝聚合物。
（3）将2.0克聚(谷氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯接枝聚合物加入到8毫升的氯仿中，制备聚(谷氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯接枝聚合物的氯仿溶液；在8毫升氯仿中加入0.1克的二棕榈酰磷脂酰乙醇胺（Avanti公司，97%）、0.5毫升的三乙胺和8毫升的聚(谷氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯接枝聚合物的氯仿溶液，在30℃，氮气下避光反应36小时，将粗产物溶液在25℃下旋转蒸发除去部分氯仿，然后在300毫升乙醚/石油醚（体积比为3:1）混合溶液中沉淀、并用乙醚/石油醚（体积比为3:1）混合溶液洗涤（100毫升×3次）。将得到的纯化产物在30℃真空干燥箱中干燥24小时，得到聚(谷氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物粗产物1.9克。将1.8克所述聚(谷氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物粗产物添加到10毫升，pH为9的Tris-HCl缓冲溶液中，在15℃下，在氮气下避光反应24小时，然后在透析袋中，用1L的25℃蒸馏水中避光透析24小时，得到纯化后的聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物1.65克。最后产物冷干保存。
（4）将0.1克纯化后的聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物溶于3毫升的四氢呋喃中，在搅拌条件下，滴加到15毫升去离子水中，形成带蓝光乳液，将该乳液装入透析袋中，放入1升去离子水中透析36小时得到聚(谷氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯氯甲酸酯-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物纳米粒子。
经检测，所得到的聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的重均分子量为46000Da。聚(谷氨酸-co-乳酸)-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺接枝聚合物纳米粒子具有规整的圆球性结构；颗粒直径为212±6.9纳米；荧光光谱测定胶束的临界胶束浓度为5.5×10-4毫克/毫升，接枝率为125%。
Claims (11)
1.一种聚(谷氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物，其特征在于，所述聚(谷氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物具有式(1)所示的结构，
其中，n为20-60，x为15-100，y为15-100，A为具有式(2)所示结构的基团，
其中，R和R’各自独立地为碳原子数为10-25的烃基，所述聚(谷氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的重均分子量为11000-53000Da，接枝率为90-170％。
2.根据权利要求1所述的聚合物，其中，n为20-30，x为70-90，y为70-90，接枝率为110-140％，R和R’各自独立地为碳原子数为15-21的烃基，所述聚(谷氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的重均分子量为30000-45000Da。
3.根据权利要求1或2所述的聚合物，其中，所述接枝聚合物的颗粒直径为150-220纳米。
4.一种聚(谷氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)在惰性气体保护下，使谷氨酸与丙交酯接触，得到含有具有式(3)所示结构的聚(谷氨酸-co-乳酸)接枝聚合物的第一产物，
(2)在含氮杂原子的六元杂环化合物的存在下，在第一有机溶剂中，将第一产物与4-硝基苯氯甲酸酯接触，或者从第一产物分离出未反应的反应物，将分离出未反应的反应物的第一产物与4-硝基苯氯甲酸酯接触，得到含具有式(4)所示结构的聚(谷氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯甲酸酯接枝聚合物的第二产物；所述第一有机溶剂为能够溶解含氮杂原子的六元杂环化合物、具有式(3)所示结构的聚(谷氨酸-co-乳酸)接枝聚合物和4-硝基苯氯甲酸酯且不与含氮杂原子的六元杂环化合物、具有式(3)所示结构的聚(谷氨酸-co-乳酸)接枝聚合物或4-硝基苯氯甲酸酯进行反应的有机溶剂，
(3)在烷基胺的存在下，在第二有机溶剂中，使第二产物与具有式(5)所示结构的磷脂酰乙醇胺接触，或者去除第二产物中的第一有机溶剂，使去除第一有机溶剂后的第二产物与具有式(5)所示结构的磷脂酰乙醇胺接触，得到含有具有式(1)所示结构的聚(谷氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物的第三产物，将第三产物与三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液接触，或者去除第三产物中的第二有机溶剂，将去除第二有机溶剂后的第三产物与三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液接触，所述第二有机溶剂为能够溶解烷基胺、具有式(4)所示结构的聚(谷氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯甲酸酯接枝聚合物、具有式(5)所示结构的磷脂酰乙醇胺且不与烷基胺、具有式(4)所示结构的聚(谷氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯甲酸酯接枝聚合物或具有式(5)所示结构的磷脂酰乙醇胺进行反应的有机溶剂，
A为具有式(2)所示结构的基团，
其中，在式(1)、式(3)和式(4)中，n为20-60，x为15-100，y为15-100，在式(2)和式(5)中，R和R’各自独立地为碳原子数为10-25的烃基。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，在步骤(2)中，从第一产物中分离出未反应的反应物的方法包括将第一产物溶于第三有机溶剂中，过滤去除未反应的反应物，然后将第三有机溶剂去除，以每克第一产物为基准，所述第三有机溶剂的用量为0.5-2毫升，所述第三有机溶剂为具有式(3)所示结构的聚(谷氨酸-co-乳酸)接枝聚合物的良溶剂，同时为未反应的反应物的不良溶剂。
6.根据权利要求4所述的方法，其中，步骤(1)中，谷氨酸与丙交酯的摩尔比为1：5-10，所述谷氨酸为L-谷氨酸，所述丙交酯为L-丙交酯；所述接触的条件包括：温度为140-180℃，时间为16-30小时。
7.根据权利要求4所述的方法，其中，步骤(2)中，所述第一产物或分离出未反应的反应物的第一产物中含有的具有式(3)所示结构的聚(谷氨酸-co-乳酸)接枝聚合物与4-硝基苯氯甲酸酯的重量比为2-5:1；以第一产物或分离出未反应的反应物的第一产物中含有的每克具有式(3)所示结构的聚(谷氨酸-co-乳酸)接枝聚合物为基准，所述含氮杂原子的六元杂环化合物的用量为0.02-2克，所述含氮杂原子的六元杂环化合物为4-二甲氨基吡啶和/或吡啶；以第一产物或分离出未反应的反应物的第一产物中含有的每克具有式(3)所示结构的聚(谷氨酸-co-乳酸)接枝聚合物为基准，所述第一有机溶剂的用量为3-20毫升，所述第一有机溶剂为氯仿和/或二氯甲烷；所述第一产物或分离出未反应的反应物的第一产物与4-硝基苯氯甲酸酯接触的条件包括：温度为-10℃至0℃，时间为6-12小时。
8.根据权利要求4所述的方法，其中，步骤(3)中，所述接触均在避光条件下进行，所述第二产物或去除第一有机溶剂后的第二产物中含有的具有式(4)所示结构的聚(谷氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯甲酸酯接枝聚合物与具有式(5)所示结构的磷脂酰乙醇胺的重量比为5-50:1，所述具有式(5)所示结构的磷脂酰乙醇胺选自二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油脂酰磷脂酰乙醇胺和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺中的一种或多种；以所述第二产物或去除第一有机溶剂后的第二产物中含有的每克具有式(4)所示结构的聚(谷氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯甲酸酯接枝聚合物为基准，所述有机胺的用量为0.1-0.5毫升，所述有机胺为三乙胺；以所述第二产物或去除第一有机溶剂后的第二产物中含有的每克具有式(4)所示结构的聚(谷氨酸-co-乳酸)-4-硝基苯甲酸酯接枝聚合物为基准，所述第二有机溶剂的用量为3-20毫升，所述第二有机溶剂为氯仿和/或二氯甲烷；所述第二产物或去除第一有机溶剂后的第二产物与磷脂酰乙醇胺接触的条件包括：温度为20-30℃，时间为15-20小时；
步骤(3)中，以所述第三产物或去除第二有机溶剂的第三产物中含有的每克具有式(1)所示结构的聚(谷氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物为基准，所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液的用量为5-50毫升，所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液中三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的pH值为8-9；所述第三产物或去除第二有机溶剂的第三产物与三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液接触的条件包括：温度为15-25℃，时间为15-20小时。
9.根据权利要求4所述的方法，其中，步骤(3)中，所述去除第二产物中的第一有机溶剂的方法为将第二产物进行旋转蒸发，然后在乙醚/石油醚混合溶剂中沉淀；
步骤(3)中，所述去除第三产物中的第二有机溶剂的方法为将第三产物进行旋转蒸发，然后在乙醚/石油醚混合溶剂中沉淀，
其中，步骤(3)中还包括将所述第三产物与三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液接触所得的产物或去除第二有机溶剂的第三产物与三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液接触所得的产物在10-25℃的蒸馏水中避光透析24-48小时。
10.由权利要求4-9中任意一项所述的方法制备得到的聚(谷氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物。
11.权利要求1-3和10中任意一项所述的聚(谷氨酸-co-乳酸)-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物在制备药物组合物中的应用。
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